Figures

Fig.1: Schémas des différents stades de la méiose d'une cellule végétale.
1. Interphase et prophase de la division réductionnelle d'une cellule végétale (2n=4); 2. (a)
Métaphase avec crossing-over, (b) anaphase et (c) télophase de la division réductionnelle,
suivi de (d) l'anaphase et de (e) la télophase de la division équationnelle. Les chromosomes
homologues sont de couleurs différentes et les chromatides sœurs d'un chromosome de
même couleur. 3. Autre possibilité de division réductionnelle (puis de division
équationnelle): au cours de la méiose 1, le mélange des informations héréditaires est le fruit
non seulement de la recombinaison chromosomique et mais aussi du mélange des
chromosomes d'origines paternelle (en bleu) et maternelle (en rouge).
http://www.afblum.be/bioafb/meiose/meiose.htm
Fig.2: Ségrégation de deux gènes (A et B) lors de la méiose.
1.
2.
3.
Tableau 1: Les différents types de maladies génétiques.
Type de
Transmission
Description
Exemple
Autosomique
Dominante
Une personne atteinte a 50% de risque de
transmettre la maladie à ses enfants.
Maladie de Huntington,
Achondroplasie
Autosomique
Récessive
Des parents sains mais porteurs d’un allèle
muté ont 25% de risque à chaque grossesse
d’avoir un enfant atteint.
Drépanocytose,
Mucoviscidose
Dominante liée à l’X
Pour une mutation dominante d’un gène du
chromosome X, le risque de transmission
diffère selon le sexe: un homme atteint ne
transmet pas la maladie à son fils, une femme
atteinte a 50% de risque de la transmettre à ses
enfants.
Maladie de Fabry
Récessive liée à l’X
Egalement dues à des mutations d’un gène du
chromosome X, les hommes sont plus souvent
atteints. Une femme atteinte à 50% de risque
d’avoir un fils atteint ou une fille porteuse.
Hémophilie A, Maladie
de Duchenne,
Daltonisme
Mitochondriale
De transmission maternelle, ces maladies
résultent de mutation de l’ADN mitochondrial.
Vu que seuls les ovocytes apportent les
mitochondries de l’embryon, seules les
femmes peuvent les transmettre.
Neuropathie optique de
Leber
Fig.3: Transmission d’une maladie autosomique récessive.
Eddie Baret © Alliance Sanfilippo
Fig.4: Coefficient de consanguinité ou mesure de la proportion de gènes
hérités de manière homozygote entre deux individus.
First cousins
Double first cousins
Half first cousins
First cousins Second cousins
once removed
Degree of Relationship
Proportion of Genes
in Common
Coefficient of Inbreeding
in Child (F)
Monozygotic twins
NA
1
NA
Parent-child
1st
1/2
1/4
Brother-sister (including
dizygotic twins)
1st
1/2
1/4
Brother-half sister
2nd
1/4
1/8
Uncle-niece or aunt-nephew
2nd
1/4
1/8
Half uncle-niece
3rd
1/8
1/16
First cousins
3rd
1/8
1/16
Double first cousins
2nd
1/4
1/8
Half first cousins
4th
1/16
1/32
First cousins once removed
4th
1/16
1/32
Second cousins
5th
1/32
1/64
Type
Coefficients de consanguinité pour les descendants d'un certain nombre de croisements consanguins. Si une personne
est consanguine à travers plus d'une ligne de descente, les coefficients distincts sont sommés afin de trouver son
coefficient de consanguinité total. NA, non applicable.
Fig. 5: Divisions des cellules progénitrices neuronales.
a. Expansion latérale par division symétrique d’un progéniteur apical donnant lieu à deux
progéniteurs. b,c. Croissance radiale. b. Division asymétrique neuronale d’un progéniteur
apical donnant soit un neurone soit un autre progéniteur, ou 3. Division asymétrique
différenciative d’un progéniteur apical produisant un progéniteur apical et un progéniteur
basal qui génère ensuite deux neurones.
a.
b.
c.
Fish et al. J Cell Science, 2008
Fig6a. Le cycle cellulaire.
Représentation schématique des quatre phases du cycle cellulaire. R représente la possibilité
qu’a la cellule de sortir du cycle cellulaire et d’entrer en phase de quiescence en cas de
carence par exemple.
http://www.ateurope.org/fr/ataxie-telangiectasie/le-gene-atm/cycle-cellulaire.html
Fig6b. Représentation des différentes étapes de la mitose.
http://edusofad.com/www/demo/wged-scp/demo/scie1m01a3.php
Fig.7: Activation du point de contrôle G2 / M après des dommages de l'ADN.
En réponse aux dommages de l'ADN, la voie de signalisation ATM/ATR est activée, ce qui
conduit à la phosphorylation et à l'activation de Chk1 et Chk2 et à la phosphorylation
inhibitrice subséquente de Cdc25. Cdc25 phosphorylé est séquestré dans le cytoplasme par la
protéine 14-3-3, ce qui empêche l'activation du complexe cyclinB/Cdk1 par Cdc25 et
provoque l'arrêt en G2. La voie ATM/ATR active également la signalisation dépendante de
p53. Cela contribue au maintien de l'arrêt en G2 par la régulation positive de 14-3-3 qui
séquestre Cdk1 dans le cytoplasme. De plus, p53 induit l’activation de p21, un inhibiteur de
CDK qui se lie et inhibe le complexe cyclinB/Cdk1. P: phosphorylation.
X
Wang et al. Molecular Cancer, 2009
Fig.8: Le point de surveillance métaphase-anaphase ou SAC.
Lors de la transition métaphase-anaphase, le complexe APC/CCdc20 ubiquitine la sécurine. La
dégradation de la sécurine active la séparase qui clive ensuite la sous unité Scc1 de la
cohésine permettant la ségrégation des chromosomes. Si les chromatides-soeurs ne sont pas
correctement attachées au fuseau mitotique, le complexe APC/C est inhibé, menant à la
stabilisation de la sécurine, à la préservation de la cohésion entre les chromatides-soeurs, et à
un délai du commencement de l’anaphase.
Rajnish Bharadwaj et al. Oncogene 2004
Fig.9: Mouvements interkinétiques du noyau au sein du neuroépithélium.
Les noyaux des précurseurs neuraux effectuent une migration apico-basale en relation avec
les différentes phases du cycle cellulaire. Les figures de mitose sont toujours adjacentes à la
lumière du tube neural et les cellules en phase S ont leurs noyaux localisés dans la moitié
basale du neuroépithélium. Après la cytocinèse, les cellules filles peuvent soit entrer dans un
nouveau cycle cellulaire soit quitter le cycle cellulaire et migrer vers la zone sousventriculaire pour se différencier.
http://tel.archives-ouvertes.fr/docs/00/06/54/02/PDF/pdffinal2.pdf
Fig.10: Elongation, pseudostratification et précision de clivage des progéniteurs apicaux.
1. Chez la drosophile, une rotation à 90° du fuseau mitotique est nécessaire aux divisions
asymétriques neuronales. 2. La rotation à 90° du fuseau mitotique n’est pas observée chez les
mammifères. Les constituants de la membrane apicale étant répartis sur une plus petite
surface, une déviation minime de l’axe du fuseau mitotique suffit à rendre leur répartition
dans les cellules-filles asymétrique, et conduit à une division neuronales. La membrane
plasmique apicale et ses domaines corticaux correspondants sont représentés par des lignes
bleues, la membrane plasmique basolatérale et ses domaines corticaux correspondants sont
représentés par des lignes rouges. Les noyaux interphasiques sont représentés en gris et les
chromatides sœurs sont représentées en bleu foncé. Les rectangles noirs représentent les
complexes jonctionnels et les points jaunes indiquent les centrosomes. Pour plus de clarté,
seuls les microtubules astraux du fuseau mitotique sont représentés (lignes noires).
1.
2.
Fish et al. J Cell Science, 2008
Fig.11: Patients atteints de microcéphalie primaire (MCPH).
Patient MCPH5
Bond et al., AJHG, 2003
Patients MCPH6
Leal et al., JMG, 2003
Patient MCPH3
Hassan et al., BMC
Medical Genetics, 2007
Patients MCPH5
Jamieson et al., AJHG, 2000
Tableau 2: Les causes de Microcéphalie.
Environnementale
TORCH, Tératogènes, hypoxie, etc.
Début
postnatal
Maladie métaboliques, Syndrome de Rett, etc.
Chromosomique
Syndromique
Autres
Syndrome de SmithLemli- Opitz, Syndrome
de Rubinstein-Taybi,
etc.
Architecture
cérébrale
anormale
Holoprosencéphalie,
Lissencéphalie,
Agénésie du corps
calleux, etc.
Architecture
cérébrale normale
« Microcephalia
vera »
Autosomique récessif :
MCPH, Autres modes
d’hérédité
Génétique
Congénitale
Nonsyndromique
Fig.12: Rôle de BRIT1 dans la réponse aux dommages de l’ADN.
BRIT1 agit comme une protéine clé de réparation de l’ADN à plusieurs niveaux. En plus de
sa fonction dans le recrutement de nombreuses protéines tels que ATM et ATR aux sites de
dommages, BRIT1 peut modifier la structure des chromosomes via son interaction avec
SWI/SNF ou la condensine II. BRIT1 est également directement impliqué dans la réparation
de l’ADN par interaction directe avec les protéines RAD51 et BRCA2.
Lin et al., Yonsei Med. J., 2010
Fig.13: Biogenèse des centrioles.
PLK4 déclenche la biogenèse des centrioles et co-localise au centrosome avec CEP152. La
formation des procentrioles commence à la phase S par le recrutement de SAS6 par CEP152 et
PLK4, CEP135 et STIL, qui sont nécessaires pour former la structure symétrique des centrioles.
CENPJ joue un rôle dans l’allongement des centrioles. En G2, le centriole fille atteint
l'allongement et la maturation complète grâce au recrutement de plusieurs molécules (dont
PCTN, CEP192, CDK5RAP2 et ASPM) qui sont nécessaires pour la nucléation des
microtubules, la stabilité et la focalisation du matériel péricentriolaire. Grâce à l'action concertée
de molécules telles que NEK2, les deux centrosomes se séparent. Quand une cellule sort de
mitose, les centrioles dans le centrosome se désengagent sous l'action de PLK1 et de la séparase.
Formation des procentrioles
Elongation
CENPJ
CEP135
PLK4
SAS6
PLK4
CEP152
Nek2
CEP152
CENPJ
STIL
Sortie de Mitose
Début G1
Désengagement des centrioles
S
G2
Maturation des centrosomes et Séparation
CEP192
PLK4
CEP152
ASPM
PCNT
CDK5RAP2
Début d’anaphase
Gène
ASPM, STIL, CEP135, CDK5RAP2
CENPJ, CEP152
PCTN
Mitose
Phénotype associé à la perte de fonction
MCPH
MCPH, MCPH + Nanisme (Seckel)
MCPH + Nanisme (MOPD2)
Fig. 14: Homozygosity Mapping.
Les allèles des loci proches du locus de la maladie sont hérités avec la mutation (*) :
Les marqueurs polymorphes à ces loci sont homozygotes chez les enfants atteints.
1 3
*
4 7
6 5
3 3
**
7 7
5 5
Fig.15: GS-FLX 454 pyrosequencer.
1. Préparation d’une banque ADN simple brin (ADNsb) avec deux adaptateurs (A et B).
2. Amplification clonale des molécules d’ADN simple brin. 3. Séquençage dans des plaques
picotitrées. 4 . Analyse des images et détermination de la séquence d’ADN.
1.
2.
3.
4.
Fig.16: Exome Sequencing.
L'ADN génomique double brin est fragmenté par sonication. Des adaptateurs sont ensuite
attachés aux fragments d'ADN, qui sont hybridées à une puce de capture conçu pour cibler
uniquement les exons. Les exons ciblés sont alors enrichis, élués et amplifiés par PCR.
L’ADN cible amplifié est alors prêt pour le séquençage à haut débit.
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Tableau 3: Dilution des anticorps utilisés en western-blot et en immunofluorescence.
Les caractéristiques et les références de chaque anticorps utilisés sont listés ci-dessous.
Les peptides dessiné à partir de la protéine CASC5 ont la séquence suivante : N-term :
MDGVSSEANEENDNI - C-term : IKIDEMDKILKKIDN
Nom de l’anticorps
Western-Blotting
Immunofluorescence
Anti-CASC5 rabbit polyclonal antibody
(Bethyl, catA300-805A)
1:2000
/
Anti-CASC5 rabbit polyclonal antibody
(Abcam, ab70537)
1:2000
/
Anti-Blinkin mouse monoclonal antibody
31F299
1:50
1:50
1:1000
1:1000
/
/
Anti-Zwint-1 rabbit polyclonal antibody
(Abcam, ab84367)
/
1:200
Anti-BUBR1 mouse monoclonal antibody
(Abcam, ab54894)
/
1:100
Anti-ASPM rabbit polyclonal antibody
(Bethyl, catIHC-00058)
/
1:1000
Anti-CEP152 rabbit polyclonal antibody
(Bethyl, catA302-480A)
/
1:200
Anti-PCTN rabbit polyclonal antibody
(Covance, pRb-432C)
/
1:1000
Polyclonal Antibodies against costumed
peptides of CASC5 protein (Eurogentec)
N-term peptide: (AA 1-15)
C-term peptide: (AA 2036-2050)
Fig.17: Pedigrees de nos trois familles MCPH.
Les familles E,S et Y sont des familles consanguines provenant de trois petits villages du
Nord-Est du Maroc.
Famille E
Famille S
E1 E2 E3 E4
S1 S2
Famille Y
Y1
Fig.18: IRM cérébrale du proband E1.
IRM cérébrale du proband E1 montrant un petit cerveau avec des lobes frontaux plus petits,
des gyrations simplifiées et une épaisseur normale du cortex. Le tronc cérébral et le cervelet
sont de taille normale pour l’âge du patient.
Fig.19: Homozygosity mapping et déséquilibre de liaison.
Les flèches à deux têtes indiquent les régions homozygotes pour chacune de nos trois
familles. Le rectangle blanc représente la région homozygote commune à nos trois
familles de 3,7 Mb. Le rectangle noir représente l’haplotype de 2,7 Mb partagé par nos
trois familles, délimité par les premiers SNPs non concordants de chaque coté. Les deux
rectangles contiennent CASC5 mais pas CEP152 localisé respectivement à 40.9Mb et
49Mb sur le chromosome 15.
Chrom 15q
S
34.7Mb
Y
E
Cen
36.4Mb
38.2Mb
39.2Mb - (rs11858412)
CASC5 (40.9Mb)
41.9Mb - (rs9944249 )
CEP152 (49Mb)
53.2Mb
97.5Mb
Tel
Fig.20: Classement des gènes candidats par le programme Endeavour.
Légende : Une couleur de fond aléatoire est attribuée aux 16 premiers candidats, les candidats
avec un rang global > 16 ont une couleur de fond blanc. Les candidats écrits en rouge ont obtenu
un score de dissemblance maximum (les plus dissemblables aux gènes modèles). Les candidats
barrés n'ont pas été trouvés pour la source de données consultée (données manquantes).
Fig.21: Calcul des rapports Ka/Ks chez les primates (humain vs. macaque, première
colonne) et chez les rongeurs (souris vs. rat, deuxième colonne). Des rapports plus élevés
reflètent une évolution plus rapide. La troisième colonne est le rapport entre le Ka/Ks chez
les primates et les rongeurs. Un rapport plus grand que 1 indique une évolution accélérée
dans la lignée d’Homo Sapiens. MCPH1, CDK5RAP2, CENPJ et ASPM sont des gènes
connus responsables de microcéphalie primaire.
Gene
MCPH1
CDK5RAP2
CENPJ
ASPM
RAD51
NUSAP1
CASC5
FAM82C
CHAC1
VPS18
ZFYVE19
EIF2AK4
Human vs Macaque
0.6160
0.6866
0.5430
0.4940
0.4338
0.8070
0.9398
0.2241
0.0856
0.0187
1.0606
0.0792
Mouse vs Rat
0.5406
0.4073
0.3699
0.3691
0.4495
0.4442
0.5759
0.1364
0.1231
0.0319
0.3290
0.1087
Primate/Rodent
1.1394
1.6857
1.4679
1.3383
0.9650
1.8167
1.6318
1.6429
0.6953
0.5862
3.2237
0.7286
CASC5a
CASC5b
CASC5c
CASC5d
VPS18a
VPS18b
IVDa
IVDb
IVDc
IVDd
IVDe
IVDf
ZFYVE19
EIF2AK4a
EIF2AK4b
NUSAP1a
NUSAP1b
OIP5
RAD51a
RAD51b
BUB1B
FAM82C
CHAC1
C15orf23
ITPKA
RTF1a
RTF1b
RTF1c
TYRO3a
TYRO3b
GPR176a
GPR176b
BMF
PAK6a
PAK6b
INOC1a
INOC1b
DISP2
DNAJC17
NDUFAF1
SRP14
SPINT1a
SPINT1b
DLL4
THBS1a
THBS1b
THBS1c
THBS1d
THBS1e
THBS1f
THBS1g
LTKa
LTKb
PLCB2a
PLCB2b
BAHD1
RPAP1
GCHFR
RHOV
CCDC32a
CCDC32b
CCDC32c
PPP1R14D
EXDL1
FSIP1
RPUSD2
CHST14
CTL
E3
S1
CTL
E3
S1
CTL
E3
S1
Fig.22: Etude transcriptomique.
Heatmap généré avec le programme GenePattern, comparant l’expression de tous les gènes
contenus dans l’intervalle de liaison de 2.7 Mb, aussi bien que CEP152, dans des
lymphoblastes contrôles et des patients E3 et S1. Les carrés rouges indiquent la plus forte
expression, les carrés bleu foncés indiquent la plus faible expression. Certains transcrits
sont ciblés par plusieurs sondes annotées comme a, b, c, d.
CEP152a
CEP152b
CEP152c
CEP152d
Fig.23: Le réseau KMN permet la liaison du kinétochore aux microtubules.
Représentation de la surface d’un kinétochore, composé de nucléosomes centromériques
(CENP-A et l'histone H3 diméthylé). Le complexe CCAN s’assemble sur cette interface et
permet la liaison du kinétochore au complexe Mis12 via l’interaction directe entre CENP-C et
NNF1 (non représenté). Le réseau KMN, composé de CASC5, du complexe Mis12 et Ndc80,
possède deux activités de liaison aux microtubules: l’une par CASC5 et l'autre par Ndc80.
Complexe
NDC80
NSL1
Complexe
MIS12
DSN1
MIS12
NNF1
Microtubule
CCAN complex
D’après Ruchaud et al., Nat. Rev. Mol. Cel. Bio., 2007
Fig. 24: Régulation de l’attachement du kinétochore aux microtubules.
L’attachement du kinétochore aux microtubules est régulé par le degré de phosphorylation du
réseau KMN. Un gradient de phosphorylation de AURKB émane du centromère intérieure. 1.
Lorsque la tension est présente, le kinétochore est étiré par rapport à son état de repos de telle
sorte que le complexe Ndc80 est positionné de manière distale du centromère. 2. Lors d’un
défaut d’attachement, AURKB phosphoryle des substrats multiples (y compris le réseau
KMN) qui sont alors proche du centromère intérieur où réside AURKB. Dans ce cas, la
phosphorylation complète du réseau KMN entraine son inactivation et le détachement du
kinétochore. 3. Lorsque aucune tension n'est présente, le complexe Ndc80 est plus proximale
du centromère, résultant en des niveaux de phosphorylation plus élevés.
1. Tension
Phosphorylation minimale
Réseau KMN ON
2. Défaut d’attachement
Phosphorylation intermédiaire
Activité du réseau KMN partielle
Aurora B
Complexe NDC80
Gradient de phosphorylation
Réseau KMN
KNL1
Résidu phosphorylé
Welburn et al., Mol. Cel., 2010
Complexe
Mis12
3. Pas de tension
Phosphorylation complète
Réseau KMN OFF
Fig.25: Schéma de la protéine CASC5.
La plus longue isoforme de la protéine CASC5 compte 2342 acides aminés et 27 exons
codants. La mutation trouvée chez nos patients est indiqué par la flèche. L’astérisque
représente le codon stop dans l'exon 19 induit par l’excision de l'exon 18 et le décalage du
cadre de lecture subséquent. Les domaines connus d'interactions avec ses partenaires sont
représentés.
PP1
1
Motifs MELT
57 151 250
1076
Site de phosphorylation
spécifique à la protéine humaine
RVSF
motifs
Zwint-1
Domaine de
liaison aux
microtubules
Domaines de
localisation au
kinétochore
1981
hMis12
complex
2108
p.M2041I
(c.6125 G>A)
2342
*
Fig.26: Schéma de l’activation du complexe SAC au kinétochore.
Au kinétochore non-attaché, MPS1 phosphoryle CASC5. CASC5 phosphorylé lie alors
BUB1 et BUB3 et recrute BUBR1 et le complexe RZZ. Ensemble, ces protéines recrutent
l’hétérodimère MAD1 et MAD2. Ce complexe catalyse la conversion de MAD2 ‘ouvert’ en
MAD2 ‘fermé’, qui peut alors s’associer avec CDC20. CDC20 et MAD2 forme alors le
complexe MCC avec BUBR1 et BUB3 qui inhibe le complexe APC/C.
CASC5
Arrêt du cycle cellulaire
en métaphase
Inhibition du
complexe APC/C
Fig.27: Séquences Sanger de l’exon 18 de CASC5.
Le proband de la famille S (S3) est homozygote pour l’allèle muté et le contrôle (Ctl) est
un contrôle non apparenté homozygote pour l’allèle sauvage.
S3
Ctl
I
Fig.28: Conservation de la Met2041 à travers différentes espèces.
ATG
ATA
Mammal cons.
Human
Pan Troglodytes
Nomascus leucogenys
Pongo abelii
Callithrix jacchus
Equus caballus
Ailuropoda melanoleuca
Sus scrofa
Canis lupus familiaris
Oryctolagus cuniculus
Mustela putorius furo
Mus musculus
Rattus norvegicus
Loxodonta africana
Bos taurus
NEREKLQIKIDEMDKILKKIDNCLTEMETE
NEREKLQIKIDEMDKILKKIDNCLTEMETE
NEREKLQIKIDEMDKILKKIDNCLTEMETE
NEREKLQTKIDEMDKILKKIDNCLTEVEIE
NEREKLHMRIDEMDNILKKIDNCLTAVEIE
NEREKLQIRIDEMDNILKKIENSLTEVEIE
NEREKLQIRIDQMDNILKKMDDCLTEVEIE
NERKKLQIRIDEMDNILKKIENCLAEVEIE
NQREKLQIRIDEMDDILKKISNCLTDVEKE
NEKNKLQIKINEMDTILKKINNCLAEVETE
NEREKLQIRMDEMENVLKKIENCLTEVEIE
EKRKLQIKINEMDTILKKINNCLTAVEIE
NEREKLQIRMREMDNILKKIDDCLTKVEIE
SEREKLHKRINEMDNTLKKIDNYLTEVEIE
Fig.29: Disparition de trois ESE au niveau de la mutation c.6125 G>A.
Séquence normale :
Séquence mutée :
Fig.30: Défaut d’épissage du transcrit CASC5 en lignées lymphoblastoïdes.
PCR sur de l’ARN extrait de nos cellules lymphoblastoïdes de patients rétrotranscrit en
ADNc. Les amorces utilisées ciblent l’exon 17,18 et 19 du gène CASC5. P: Père non atteint
(famille E); Pt : Patient E3; C1-C4: Contrôles non apparentés; RT+ ,-: Contrôles positif et
négatif de rétrotranscription. Les flèches indiquent les amorces.
Patients
gene
Exon17
Exon18
Exon19
320bp
c.6125 G>A
wt mRNA
316b
Exon17
Exon18
mut mRNA 228b
Exon17
Exon19
Exon19
230bp
P
Pt
C1 C2
C3
C4 RT+ RT-
Fig.31: Vérification du défaut d’épissage du transcrit CASC5 par la technique des
minigènes.
Des cellules HeLa sont transfectées avec des vecteurs contenant deux exons entourant notre
exon d’intérêt. L’un des vecteurs contient l’exon 18 muté (EM), l’autre contient l’exon 18
sauvage (EWT). V : Vecteur vide.
V
EM
EWT
EM
EWT
EM
EWT
Fig.30: Défaut d’épissage du transcrit CASC5 en lignées lymphoblastoïdes.
PCR sur de l’ARN extrait de nos cellules lymphoblastoïdes de patients rétrotranscrit en ADNc.
Les amorces utilisées ciblent l’exon 17,18 et 19 du gène CASC5. P: Père non atteint (famille
E); Pt : Patient E3; C1-C4: Contrôles non apparentés; RT+ ,-: Contrôles positif et négatif de
rétrotranscription. Les flèches indiquent les amorces.
Patients
gene
Exon17
Exon18
Exon19
320bp
c.6125 G>A
wt mRNA
316b
Exon17
Exon18
mut mRNA 228b
Exon17
Exon19
Exon19
230bp
P
Pt
C1 C2
C3
C4 RT+ RT-
Fig.31: Vérification du défaut d’épissage du transcrit CASC5 par la technique des
minigènes.
Des cellules HeLa sont transfectées avec des vecteurs contenant deux exons entourant notre
exon d’intérêt. L’un des vecteurs contient l’exon 18 muté (EM), l’autre contient l’exon 18
sauvage (EWT). V : Vecteur vide.
V
EM
EWT
EM
EWT
EM
EWT
Fig.32: Détection de la protéine CASC5 en lignées cellulaires humaines.
Les quantités de lysats cellulaires (WCL) de HEK293T, d’HELA et d’HTB10 indiquées sont
séparées sur gel SDS-PAGE. CASC5 a été détecté par western blot avec un anticorps
commercial anti-CASC5 (Bethyl).
HTB10
HELA
HEK
WCL Input (µg) 200 100 50 200 100 50 200 100 50
250kDa
HEK293T
Fig.33: Détection de la protéine CASC5 chez nos patients.
300µg de lysats cellulaires provenant des pères de la famille E et S (UP) et des enfants
atteints E3 et S1 (Pt) sont séparées sur gel SDS-PAGE. CASC5 a été détecté par western
blot avec un anticorps commercial anti-CASC5 (Bethyl).
UP
Pt
250kDa
Fig.34: Détection de la protéine CASC5 avec deux anticorps dirigés contre sa partie Net C-terminal.
100µg de lysats cellulaires provenant du père de la famille E (P) et du patients E3 (Pt) ont
été séparés sur gel SDS-PAGE. CASC5 a été détecté par western blot avec deux anticorps
polyclonaux dirigés contre des peptides de CASC5 (C-term à gauche; N-term à droite).
C-term
N-term
250kDa
C
P
Pt
P
Pt
Fig.35: Etude de l’expression et de la localisation de CASC5 en fibroblaste.
Immunofluorescence sur une culture de fibroblastes du patient E3 et d’un contrôle. La
protéine CASC5 est marquée en rouge, la tubuline alpha en vert et l’ADN en bleu
(Hoechst). L’image de droite (Merged) est une superposition des trois couleurs. L’anticorps
dirigé contre CASC5 est un anticorps monoclonal de souris (31F2).
Patient atteint (E3)
Contrôle
CASC5
α-Tub + Hoechst
Merged
α-Tub + Hoechst
Merged
Fig.36: Etude de l’expression et de la localisation de partenaires de CASC5 et d’autres
protéines responsables de microcéphalie primaire.
Immunofluorescence sur une culture de fibroblastes du patient E3 et d’un contrôle. Les
protéines d’intérêt sont marquées en rouge, la tubuline alpha en vert et l’ADN en bleu
(Hoechst). L’image de droite (Merged) est une superposition des trois couleurs.
Patient atteint (E3)
Contrôle
ZWINT
BUBR1
ASPM
CEP152
PCTN
α-Tub + Hoechst
Merged
α-Tub + Hoechst
Merged
Tableau 4: Variants codant trouvés dans notre locus MCPH4 de 2.7Mb.
Un seul variant reste après avoir écarté du séquençage FLX un artefact non confirmé par
séquençage Sanger (nc). (Profondeur> 20, nombre de lectures> 90%).
Start Pos
End Pos
40939223
41757019
41672634
41245926
40266049
40313391
40226745
40330814
41829480
40328915
40328825
40751805
41815766
41819617
41689482
41689416
41813529
40583810
41106176
41149411
41476715
41634837
41148449
40939223
41757019
41672634
41245926
40266049
40313391
40226745
40330814
41829480
40328915
40328825
40751805
41815766
41819617
41689482
41689416
41813529
40583810
41106176
41149411
41476715
41634838
41148449
Ref
Bases
G
A
G
A
C
T
C
A
G
G
C
G
T
C
C
C
G
T
G
G
AC
C
Var
Bases
A
A
G
A
G
T
C
T
G
A
C
A
C
C
T
A
T
T
G
C
A
GA
T
Ref
AA
M
Q
*
E
E
G
I
K
L
L
P
Q
Q
R
R
R
R
R
S
T
T
T
Y
Var
AA
I
T
*
E
G
G
I
K
L
L
A
K
E
G
H
L
R
R
A
T
T
D
Y
Region
Name
CASC5
RTF1
NUSAP1
CHAC1
EIF2AK4
EIF2AK4
EIF2AK4
SRP14
RPAP1
SRP14
SRP14
BAHD1
RPAP1
RPAP1
NDUFAF1
NDUFAF1
RPAP1
PLCB2
ZFYVE19
SPINT1
EXD1
NUSAP1
SPINT1
Known SNP
Info db135
nc
rs7168431
rs11557249
rs2307105
rs3207297
rs566792
rs7321
rs721772
rs8208
rs7535
rs3803357
rs8027526
rs11630901
rs1899
rs3204853
rs3743031
rs62021888
rs690347
rs690458
rs690733
rs7178777
rs659232
Fig.37: Compilation des variants observés par séquençage FLX de la région critique
de 2.7Mb.
Coding :
1
Unknown :
208
Non-coding : 207
Total variants
1982
Known :
1774
Coding :
21
Non-coding : 1753
Fig.38: Pédigrée de la famille B.
Le proband est indiqué par une flèche.
v
?
B1
c
Diabète gestationnel
Diabète précoce + Retard Mental + Microcéphalie
Diabète isolé
B2
B3
Fig.39: Région homozygote en 4q23.
Les noms des 25 gènes compris dans l’intervalle sont indiqués dans la colonne de gauche.
Fig.40: Classement des gènes candidats par le programme Endeavour.
Légende : Une couleur de fond aléatoire est attribuée au 16 premiers candidats, les candidats
avec un rang global > 16 ont une couleur de fond blanche. Les candidats écrits en rouge ont
réalisé un score de dissemblance maximum (les plus dissemblables des gènes modèles). Les
candidats barrés n'ont pas été trouvés dans la source de données utilisée (données manquantes).
Fig.41: Séquences Sanger de l’exon 4 de RG9MTD2.
Le proband (B1) est homozygote pour l’allèle muté, la mère (M) est hétérozygote pour l ’allèle
muté et le contrôle (Ctl) est un contrôle non apparenté homozygote pour l’allèle sauvage.
B1
M
Ctl
Fig.42: Conservation de l’Arg133 à travers différentes espèces.
CGA
TGA
Mammal cons.
Human
Pan Troglodytes
Nomascus leucogenys
Pongo abelii
Callithrix jacchus
Equus caballus
Ailuropoda melanoleuca
Sus scrofa
Canis lupus familiaris
Oryctolagus cuniculus
Mustela putorius furo
Mus musculus
Rattus norvegicus
Loxodonta africana
Bos taurus
DHLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DDLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DDLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
NIMALKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DSLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DSLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DSLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DSLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DDLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DSLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DDLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRASHPVQFYLT
DDLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRASHPVQFYLT
DDLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
DSLMVLKDIKKLHKQIQRCYAENRRALHPVQFYLT
Fig.43: Etude du transcrit BID1.
L’ARN extrait de lignées lymphoblastoïdes de nos patients et d’un contrôle non apparenté a
été rétrotranscrit et l’ADNc a été amplifié à l’aide d’amorces ciblant la mutation et
produisant un fragment de 631pb. Pt1, 2 : Patients atteints ; C : Contrôle non apparenté ;
RT- : Contrôle négatif de rétrotranscription.
800 bp
600 bp
Pt1 RT- Pt2 RT- C
RT-