intérêt du dosage résumé et explication

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PTH
Un essai immunoenzymatique pour la quantification de la PTHi (parathormone intacte) dans le sérum humain
INTÉRÊT DU DOSAGE
La trousse d’essai immunoenzymatique PTH MicroVue
mesure la quantité de parathormone intacte (PTHi) dans le
sérum humain.
RÉSUMÉ ET EXPLICATION
La PTH (hormone parathyroïdienne, parathormone,
parathyrine) est biosynthétisée dans la parathyroïde sous
forme d’hormone pré-proparathyroïdienne, un précurseur
moléculaire plus large composé de 115 acides aminés.
Après un clivage intracellulaire d’une séquence de 25
acides aminés, l’hormone pré-proparathyroïdienne est
convertie en un polypeptide intermédiaire de 90 acides
aminés, l’hormone proparathyroïdienne. Après une
nouvelle modification protéolytique, l’hormone
proparathyroïdienne est convertie en hormone
parathyroïdienne polypeptide de 84 acides aminés. Chez
les individus sains, la régulation de la sécrétion de
l’hormone parathyroïdienne se fait via un rétro-contrôle
négatif par le calcium sérique sur la parathyroïde. La PTH
intacte est biologiquement active et disparaît rapidement
de la circulation avec une demi-vie inférieure à 4 minutes.
1
La PTH subit une protéolyse dans la parathyroïde,
principalement dans les tissus périphériques et plus
particulièrement dans le foie, mais aussi dans les reins et
les os, pour former des fragments N-terminal et des
fragments
C-terminal ou région centrale à durée de vie plus longue.
Chez les sujets souffrant d’insuffisance rénale, les dosages
de PTH dans les fragments C-terminal et région centrale
donnent généralement des résultats d’hormone
parathyroïdienne élevés, qui se traduisent par une
altération de la clairance rénale.
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Les dosages de la PTHi sont importants pour différencier
l’hyperparathyroïdie primaire d’autres formes
d’hypercalcémie (non liées à la glande parathyroïde),
dues à une affection maligne, à une sarcoïdose ou à une
thyréotoxicose.2 La mesure de la quantité d’hormone
parathyroïdienne est la méthode la plus spécifique pour
diagnostiquer une hyperparathyroïdie primaire. En
présence d’hypercalcémie, un taux élevé d’hormone
parathyroïdienne établit pratiquement le diagnostic. Chez
les patients atteints d’hyperparathyroïdie primaire, le taux
d’hormone parathyroïdienne sera élevé dans plus de 90 %
des cas.3
L’hypercalcémie liée à une tumeur maligne est associée à
de bas niveaux d’hormone parathyroïdienne ou à des
niveaux de PTH normaux. La mesure du niveau de PTHi
pour le comparer à la quantité de calcium dans le sérum a
presque toujours permis de constater que la
concentration de PTHi chez les patients atteints
d’hypercalcémie due à une tumeur
maligne est anormalement basse par rapport au taux
élevé de calcium.3-5
Quand on a relevé le niveau de PTHi pour le comparer à la
quantité de calcium dans le sérum, on a presque toujours
constaté que la concentration de PTHi, chez les patients
atteints d’hypercalcémie due à une tumeur maligne, est
anormalement basse par rapport au taux élevé de
calcium.5
Dans le cas de l’hypocalcémie due à une hypoparathyroïdie
totale, les quantités de PTH sont généralement
imperceptibles mais elles se présentent à des niveaux
normaux si l’hypocalcémie résulte d’une perte partielle ou
d’une inhibition des fonctions de la glande parathyroïde.
PRINCIPE DU DOSAGE
L’essai immunoenzymatique de PTH intacte MicroVue
pour la quantification de la PTHi dans le sérum humain est
une procédure à deux étapes utilisant (1) une microplaque
recouverte de streptavidine et d’un anticorps polyclonal
de chèvre biotinylé qui se lie uniquement à la PTH région
centrale et C-terminal (39-84), (2) un anticorps polyclonal
de chèvre marqué à la peroxydase de raifort (HRP) anti-
PTH humaine N-terminal (1-34) et (3) un substrat
chromogène.
Lors de l’étape 1, les étalons, les contrôles et les
échantillons sont ajoutés dans les puits préalablement
recouverts de streptavidine. Un anticorps polyclonal
primaire couplé à la biotine anti-PTH humaine région
centrale et C-terminal (39-84) et un anticorps polyclonal
secondaire marqué à la peroxydase de raifort (HRP) anti-
PTH humaine N-terminal (1-34) sont ajoutés à chaque
puits de test. La PTHi présente dans les étalons, les
contrôles ou les échantillons est capturée dans les
micropuits à microplaques en permettant à l’anticorps
primaire biotinylé de se lier à la streptavidine immobilisée
sur la plaque ; elle est simultanément détectée par
l’anticorps secondaire marqué à l’HPR. À la fin de
l’incubation, les composants libres sont retirés du puits
par lavage.
Lors de l’étape 2, un substrat enzymatique chromogène
est ajouté dans chacun des puits. Le conjugué HRP lié
réagit avec le substrat pour former une couleur bleue.
Après incubation, la réaction enzymatique est
chimiquement interrompue, la couleur vire au jaune et
l’intensité de la couleur est mesurée à l’aide d’un
spectrophotomètre à 450 nm. L’intensité de la couleur est
proportionnelle à la concentration de PTHi présente dans
les échantillons, les étalons et les contrôles.
RÉACTIFS ET MATÉRIEL FOURNIS
96 dosages de la PTH (parathormone intacte) intacte
La trousse d’essai immunoenzymatique de la PTH
intacte MicroVue contient les éléments suivants :
A
|
F
Étalons PTH Réf. CAL A – CAL F 0,5 ml chacun
Lyophilisé. Chaque étalon contient un peptide PTH synthétique
purifié avec une concentration de protéine assignée (pg/ml)
dans une solution BSA avec sérum de chèvre. L’étalon zéro est
une solution BSA avec sérum de chèvre
L
Contrôle PTH 1 Réf. CTRL 1 0,5 ml
Lyophilisé. Contient un peptide PTH synthétique humain purifié
avec une concentration assignée (pg/ml) dans une solution BSA
avec sérum de chèvre
HContrôle PTH 2 Réf. CTRL 2 0,5 ml
Lyophilisé. Contient un peptide PTH synthétique humain purifié
avec une concentration assignée (pg/ml) dans une solution BSA
avec sérum de chèvre
Microplaque Réf. PLA 12 x 8 puits
Huit barrettes de puits revêtues de streptavidine dans une
poche en aluminium rescellable
Solution d’arrêt Réf. SOLN 20 ml
Contient 1N (3 %) d’acide sulfurique (H2SO4)
Concentré de lavage 20X Réf. RGT A 30 ml
Contient une solution saline avec agent de surface
Diluant pour échantillons Réf. RGT 3 2 ml
Contient du sérum de cheval
Substrat TMB Réf. RGT B 20 ml
Prêt à l’emploi. Contient du 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine
(TMB) et du peroxyde d’hydrogène (H2O2)
Anticorps PTH biotinylé Réf. RGT 1 7 ml
Contient un anticorps polyclonal à la biotine anti-PTH humaine
région centrale et C-terminal (39-84)
Anticorps PTH marqué à l’enzyme Réf. RGT 2 7 ml
Contient un anticorps polyclonal marqué à la peroxydase de
raifort anti-PTH humaine N-terminal (1-34)
Solution de reconstitution Réf. RGT 4 5 ml
Contient une solution saline avec agent de surface

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MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
 Minuteur (60 minutes)
 Plaques à usage unique, plaque de dilution à 96 puits
et/ou tubes à essais et portoirs
 Récipient pour la dilution de tampon de lavage
 Bouteille de lavage ou tout autre équipement de
lavage homologué
 Micropipettes et embouts
 Multipette ajustable (8 ou 12 canaux) ou pipetteur
automatique
 Pipettes de 1 ml, 5 ml et 10 ml
 Réservoirs de réactif pour ajouter des solutions de
conjugué, de substrat et d’arrêt à la plaque (utiliser des
réservoirs vides et propres pour chaque réactif)
 Lecteur de microplaque capable de lire l’absorbance
à A450 and A405 entre 0,0 et 4,0
 Eau désionisée ou distillée
 Agitateur orbital/rotateur d’une capacité de
170 ± 10 tr/min
AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS
1. Réservé au diagnostic in vitro.
2. La PTH intacte 1-84 est une molécule très labile.
Effectuer le dosage immédiatement après la
reconstitution ou la décongélation de tous les étalons,
contrôles et échantillons de patients.
3. Traiter tous les échantillons comme des produits
potentiellement dangereux. Observer les précautions
standard lors de la manipulation de cette trousse et
des échantillons de patients.7
4. Porter des vêtements, des gants, un masque et des
lunettes de protection lors de la manipulation de cette
trousse.
5. Utiliser ensemble tous les réactifs avant la date
d’expiration indiquée sur l’étiquette de la boîte.
6. Les réactifs provenant des divers numéros de lots ne
sont pas interchangeables.
7. Suivre les recommandations pour la conservation
des réactifs.
8. Ne pas utiliser les barrettes de puits si leur emballage
est abîmé.
9. La solution d’Arrêt est une solution corrosive
susceptible de provoquer des irritations. Ne pas
ingérer. Éviter tout contact avec les yeux, la peau et les
vêtements. En cas de contact, rincer immédiatement à
l’eau. En cas d’ingestion, appeler un médecin.
10. L’utilisation de multipettes ou de pipetteurs
automatiques est recommandée pour limiter le temps
de distribution des réactifs.
11. Pour obtenir une mesure précise des échantillons,
pipeter avec précautions les échantillons et les étalons
en utilisant du matériel calibré.
12. Pour obtenir des résultats précis, il est indispensable
de recueillir et de conserver correctement les
échantillons (voir MANIPULATION ET PRÉPARATION DES
ÉCHANTILLONS).
13. Éviter toute contamination microbienne ou croisée des
échantillons et des réactifs.
14. Doser chaque échantillon en double.
15. Ne pas utiliser un même puits pour plusieurs tests.
16. Toute modification du temps ou de la température
d’incubation indiqués dans le protocole de dosage
peut entraîner des résultats erronés.
17. Le substrat TMB doit être protégé de la lumière et de
tout contact avec du métal ou du caoutchouc pendant
le stockage et l’incubation. Éviter tout contact avec les
yeux, la peau et les vêtements. En cas de contact, rincer
immédiatement à l’eau.
18. Ne pas laisser les puits sécher pendant le dosage.
19. Lors du retrait de liquide des puits, ne pas gratter ni
toucher le fond des puits.
20. Pour éviter la formation d’aérosol pendant le lavage,
aspirer le liquide de lavage dans une bouteille
contenant de l’eau de javel.
21. Utiliser une bouteille de lavage ou un système de
remplissage automatique pour laver les microplaques
(PROTOCOLE DE DOSAGE, étape 5). Pour des résultats
optimaux, ne pas utiliser de multipette pour le lavage
de la microplaque.
22. Éliminer les réactifs non utilisés et leurs flacons selon la
réglementation en vigueur.
23. Pour plus d’informations, consulter la fiche technique
sur le site quidel.com.
CONSERVATION
Conserver tous les composants de la trousse à 2-8 °C,
excepté le concentré de lavage et la solution d’arrêt. Tous
les réactifs, excepté les étalons, les contrôles de la trousse
et le concentré de lavage sont prêts à l’emploi. Stocker
tous les réactifs à 2-8 °C, excepté le concentré de lavage et
la solution d’arrêt, qui doivent être conservés à
température ambiante jusqu’à la dilution pour éviter la
précipitation.
PRÉPARATION DES RÉACTIFS
Amener tous les réactifs et le matériel à température
ambiante avant utilisation.
Après utilisation, conserver les réactifs et le matériel
inutilisés à la température requise (voir CONSERVATION).
Barrettes de puits
Déterminer le nombre de barrettes nécessaires pour le
dosage. Quidel recommande de doser en double les
blancs, les étalons et les contrôles. Refermer avec soin la
pochette contenant le reste des barrettes et la conserver à
2–8 °C. Placer les barrettes destinées au dosage sur le
support.

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Solution de lavage (RGT A)
Mélanger la solution de lavage concentrée 20X en
inversant à plusieurs reprises le flacon. Si la solution de
lavage concentrée a été conservée à 2–8 °C, une formation
de cristaux peut être observée. Pour dissoudre ces
cristaux, réchauffer le flacon dans un bain-marie à 37 °C
jusqu’à dissolution et mélanger soigneusement. Préparer
la solution de lavage en diluant le contenu entier de la
bouteille de concentré de lavage 20X (30 ml) dans 570 ml
d’eau distillée ou désionisée. Bien mélanger. La solution
de lavage diluée reste stable pour 90 jours lorsqu’elle est
conservée dans un conteneur propre à température
ambiante.
Étalons et contrôles
Pour chaque étalon (CAL A à F) et pour les contrôles 1 et 2
de la trousse, reconstituer chaque flacon à l’aide de 500 l
de solution de reconstitution (RGT 4) et mélanger. Laisser
le flacon reposer 10 minutes et bien mélanger en
retournant doucement le flacon pour assurer une
reconstitution complète. La PTH intacte est une molécule
très labile. Utiliser les étalons et les contrôles
immédiatement après la reconstitution. Congeler (-20 °C)
les étalons et les contrôles restants dès que possible après
utilisation. Les étalons et les contrôles restent stables à -
20 °C pendant 6 semaines après la reconstitution avec un
maximum de 3 cycles de congélation/décongélation, à
condition que les recommandations soient respectées.
Solutions d’anticorps (facultatives)
Si cela est souhaité, mélanger des volumes égaux
d’anticorps biotinylé (RGT 1) et d’anticorps marqué à
l’enzyme (RGT 2) dans une bouteille propre de couleur
ambrée, en veillant à préparer suffisamment de solution
pour le dosage. Ajouter ensuite 100 l d’anticorps
mélangé dans chaque puits. Cette méthode consiste à
remplacer les étapes 3 et 4 du Protocole de dosage, suivi
de l’incubation dans l’agitateur orbital.
RECUEIL ET PRÉPARATION DES
ÉCHANTILLONS
Manipuler et éliminer les échantillons selon les
précautions standard.
Recueil des échantillons
AVERTISSEMENT : Traiter tous les échantillons comme
étant potentiellement infectieux. Suivre les
précautions standard. Ne pas utiliser d’échantillons
contaminés ou mal conservés.
Sérum/plasma
La détermination de la PTHi doit être effectuée avec du
plasma EDTA ou du sérum. Une meilleure stabilité de la
PTH a pu être observée avec du plasma EDTA qu’avec du
sérum6. Les taux de PTHi obtenus sur plasma EDTA
peuvent donc représenter plus précisément les taux
observés in vivo.
Les échantillons sur sérum et plasma EDTA doivent être
recueillis selon une technique aseptique standard.8 Après
avoir laissé le sang se coaguler, séparer rapidement le
sérum ou le plasma EDTA avec une centrifugeuse
réfrigérée de préférence, et conserver à une température
inférieure ou égale à -20 °C. Les échantillons sur sérum
peuvent être conservés pour un maximum de 8 heures à
2-8 °C. Les échantillons sur sérum congelés à -20 °C sont
stables pour une durée maximum de 4 mois.
Dilution des échantillons
Les échantillons doivent être dilués de sorte que les
valeurs observées ne dépassent pas l’étalon présentant la
concentration la plus haute (CAL F) qui est d’environ
700 - 1 000 pg/ml (voir la concentration exacte sur
l’étiquette du flacon). Les échantillons présentant des
valeurs hors de cette plage doivent être dilués à l’aide du
diluant pour échantillons (RGT 3) et redosés à la nouvelle
concentration. Multiplier le résultat par le facteur de
dilution. Ne pas conserver ou réutiliser les échantillons
dilués.
PROTOCOLE DE DOSAGE
Lire le protocole en entier avant de commencer le
dosage.
Voir MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS et PRÉPARATION
DES RÉACTIFS.
1. Placer suffisamment de barrettes revêtues de
streptavidine dans un conteneur pour traiter les six (6)
échantillons de PTHi [A – F, concentration exacte
indiquée sur l’étiquette du flacon], étalons de la
trousse et échantillons des patients.
2. Pipeter 25 l d’étalon, de contrôle ou d’échantillon
dans le puits désigné ou déterminé. Congeler (-20 °C)
les étalons et les contrôles restants dès que possible
après l’utilisation.
3. Ajouter ou délivrer 50 µl d’anticorps biotinylé (RGT 1)
dans chaque puits contenant l’étalon, le contrôle ou
l’échantillon.
4. Ajouter ou délivrer 50 l d’anticorps marqué à
l’enzyme (RGT 2) dans chacun de ces puits. Couvrir
la/les microplaque(s) d’une feuille d’aluminium ou
d’un plateau pour éviter toute exposition à la
lumière. Placer un agitateur orbital ou un rotateur à
170 ± 10 tr/min à température ambiante (22-28 °C)
pour 3 heures ± 30 minutes.
5. Laver les micropuits en suivant la procédure
suivante :
a. Aspirer le contenu de chaque puits.
b. Ajouter environ 350 µl de solution de lavage dans
chaque puits à l’aide d’une bouteille de lavage ou
d’un système automatique.
c. Aspirer le contenu de chaque puits.
d. Répéter les étapes a-c quatre (4) fois de plus pour
cinq (5) lavages au total.

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6. Ajouter ou délivrer 150 µl de substrat TMB (RGT B)
dans chaque puits de test lavé.
7. Après avoir installé un couvercle approprié pour
empêcher l’exposition à la lumière, placer la/les
microplaque(s) dans un agitateur orbital ou un
rotateur à 170 ± 10 tr/min à température ambiante
(22-28 °C) pendant 30 minutes ± 5 minutes.
8. Ajouter ou délivrer 100 µl de solution d’arrêt dans
tous les puits pour arrêter la réaction enzymatique.
9. Tapoter doucement la plaque pour permettre un
développement uniforme de la coloration.
10. Lire l’absorption à 450 nm pour chaque puits dans
les 10 minutes qui suivent l’addition de la solution
d’arrêt (étape 8), en faisant une correction de blanc
selon le système spectrophotométrique utilisé. Lire
de nouveau la plaque à 405 nm, en faisant une
correction de blanc conformément au système
spectrophotométrique utilisé (correction de blanc :
250 µl d’eau distillée ou désionisée).
REMARQUE : La deuxième lecture est destinée à
étendre la validité analytique de la courbe
d’étalonnage à la valeur représentée par l’étalon le
plus haut, qui est d’environ 700 – 1 000 pg/ml. En
conséquence, les échantillons de patients avec une
PTH > 200 pg/ml peuvent être quantifiés contre une
courbe d’étalonnage consistant en des valeurs allant
jusqu’à la concentration équivalente à l’étalon le plus
haut utilisant la valeur 405 nm, loin de la longueur
d’onde de l’absorbance maximale. En général, il est
conseillé de lire les échantillons de patients et de
contrôles avec un lecteur réglé sur 450 nm pour les
concentrations de PTH jusqu’à 200 pg/ml. Les
concentrations de PTH supérieures à 200 pg/ml
doivent être interpolées avec une lecture à 405 nm.
11. Lire la concentration des échantillons et des
contrôles à partir de la courbe standard.
12. Éliminer le reste des échantillons, substrats et
barrettes utilisés (voir MISES EN GARDE ET
PRÉCAUTIONS).
CONTRÔLE DE LA QUALITÉ
Le certificat d’analyse inclus dans ce kit est spécifique au
lot et doit être utilisé pour vérifier si les résultats obtenus
dans votre laboratoire sont semblables à ceux qui ont été
obtenus par Quidel Corporation. Les densités optiques
sont mentionnées uniquement à titre indicatif. Les
résultats obtenus dans votre laboratoire peuvent être
différents.
Des plages de contrôle de la qualité sont fournies. Les
valeurs de contrôle sont destinées à vérifier la validité de
la courbe standard et des résultats obtenus pour les
échantillons. Chaque laboratoire doit établir ses propres
critères de validation. Si les valeurs obtenues NE sont PAS
dans les limites acceptables du laboratoire, les résultats
seront considérés comme douteux, et un redosage des
échantillons devra être effectué.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Utilisation de la courbe standard
En utilisant les valeurs d’absorbance finales obtenues à
l’étape 10 du Protocole de dosage, construire une courbe
d’étalonnage à l’aide d’une interpolation par splines
cubiques, à ajustement de courbe à 4 paramètres ou point
à point pour quantifier la concentration de PTHi. La
plupart des logiciels de lecture de plaques et des
ordinateurs peuvent effectuer ces calculs.
Les données peuvent être mises en graphe manuellement.
Pour les valeurs de 450 nm, construire une courbe
d’étalonnage à l’aide des cinq premiers étalons fournis,
c’est-à-dire les étalons A - E. Pour les valeurs de 405 nm,
construire une deuxième courbe d’étalonnage à l’aide des
trois étalons présentant les concentrations les plus hautes,
c’est-à-dire
D - F. Les valeurs (pg/ml) des échantillons de test peuvent
être directement relevées sur la droite d’ajustement de la
courbe d’étalonnage.
Tableau 1 : Données d’échantillon à 450 nm
Échantillon A450 pg/ml
Étalon A 0,018 0
Étalon B 0,054 7
Étalon C 0,122 18
Étalon D 0,391 55
Étalon E 1,338 210
Contrôle 1 0,200 27,6
Contrôle 2 0,799 119
Échantillon patient 1 0,142 19,1
Échantillon patient 2 0,408 58,5
Échantillon patient 3 2,415 *
Échantillon patient 4 3,725 *
* La concentration étant supérieure à 200 pg/ml, il est recommandé d’utiliser les
données obtenues à 405 nm (voir le Tableau 2 ci-dessous).
Tableau 2 : Données d’échantillon à 405 nm
Échantillon A405 pg/ml
Étalon A 0,011 0
Étalon D 0,126 55
Étalon E 0,427 210
Étalon F 1,313 700
Contrôle 1 0,070 *
Contrôle 2 0,256 **
Échantillon patient 1 0,046 *
Échantillon patient 2 0,133 *
Échantillon patient 3 0,770 401
Échantillon patient 4 1,318 ***
* Pour les échantillons d’une valeur inférieure à 200 pg/ml, il est recommandé
d’utiliser les données obtenues à 450 nm (voir le Tableau 1 ci-dessus). Cette
méthode devrait donner des résultats avec une sensibilité du dosage optimale.
** Même si la lecture du contrôle 2 indique une valeur < 200 pg/ml, il est
recommandé de lire et d’enregistrer le résultat réel pour l’évaluation du contrôle
qualité. En outre, l’absorbance du contrôle 2 est suffisamment élevée pour être
valable pour l’analyse.
*** La lecture de l’absorbance est en dehors des limites ou supérieure à
l’absorbance moyenne de l’étalon le plus élevé. Il est conseillé de retester
l’échantillon avec dilution.