22e RICAI (2e partie)

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22e RICAI* (2 e partie)
Résistances par efflux chez les bacilles à Gram négatif
(P. Plésiat, Besançon)
! Définition. Les systèmes d’efflux actifs sont des mécanismes de transport membranaire, dont le rôle physiologique
est de préserver l’équilibre physicochimique du milieu intracellulaire, en luttant contre l’accumulation de substances
toxiques.
Ces systèmes de pompe sont caractérisés par :
" leur spécificité de substrat ;
" leur structure à une (essentiellement chez les Gram positifs)
ou trois protéines (exclusivement chez les bactéries à Gram
négatif) ;
" le type d’énergie nécessaire à leur fonctionnement (hydrolyse de l’ATP ou force proton-motrice) ;
" leur mode d’expression : constitutif ou inductible.
Une même bactérie peut ainsi posséder plusieurs systèmes
d’efflux (présence de 37 pompes chez Escherichia coli, dont
seulement une vingtaine impliquées dans la résistance aux
substances toxiques), ce qui suggère leur implication dans
nombre de processus physiologiques.
! Structure des systèmes d’efflux. L’élément commun à tous
les systèmes d’efflux est une protéine (appelée “pompe”) située
dans l’épaisseur de la membrane cytoplasmique et dont le rôle
est d’assurer la reconnaissance puis la fixation et le transport
de substrats de structure plus ou moins proche. Cette pompe
(ou transporteur) est constituée de 4, 12 ou 14 segments peptidiques hydrophobes transmembranaires reliés entre eux par des
boucles hydrophiles extramembranaires. Il existe cinq familles
distinctes de transporteurs, en fonction des séquences d’acides
aminés qui le constituent : ABC (ATP-binding cassette), RND
(resistance nodulation cell division), MFS (major facilitator
superfamily), SMR (small multidrug resistance) et MATE. La
captation des substrats en provenance du milieu extracellulaire
s’effectue après solubilisation dans les couches lipidiques de
la membrane. L’énergie nécessaire au transport est fournie soit
par hydrolyse de l’ATP (protéines ABC), soit par le gradient
électrochimique membranaire, la sortie du substrat étant couplée à l’entrée dans la cellule d’un ion H+ (protéines RND,
MFS, SMR) ou d’un ion Na+ (protéine MATE).
Les systèmes d’efflux chez les Gram positifs sont composés
d’une pompe unique qui rejette les substrats dans l’espace
périplasmique, en favorisant ainsi l’accumulation entre les
* Réunion interdisciplinaire de chimiothérapie anti-infectieuse, Paris,
5-6 décembre 2002.
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RÉSISTANCE BACTÉRIENNE PAR EFFLUX
membranes externe et cytoplasmique et engendrant une saturation du système. Au contraire, les Gram négatifs possèdent
des systèmes d’efflux à trois composants : une protéine de membrane cytoplasmique (“pompe”), une protéine de membrane
externe (“pore”), une lipoprotéine de jonction (dite de “fusion
transmembranaire”). Cela permet de rejeter directement le substrat dans le milieu extérieur. Il semblerait, par ailleurs, que
l’assemblage pompe-pore-lipoprotéine ne soit que transitoire
et nécessite pour son fonctionnement une protéine auxiliaire
(Ton B). L’élément pompe des systèmes à trois composants
peut appartenir aux familles MFS, RND ou ABC.
! Aspects génétiques des systèmes d’efflux chez les Gram
négatifs. Les systèmes d’efflux chez les Gram négatifs sont
codés :
" Dans la majorité des cas, par des gènes chromosomiques isolés (pompe) ou regroupés en opérons de deux ou trois éléments
(pompe + lipoprotéine ± pore). Ces gènes peuvent être exprimés de façon constitutive, inductible, réprimée.
" Plus rarement, par des gènes mobiles (plasmides ou transposons), de spécificité étroite : Tet (résistance à la tétracycline),
Cml A (résistance au chloramphénicol), Mef (résistance aux
macrolides en C14 et C15). Ceci est à l’origine de résistances
acquises.
Résistance naturelle. Différents mécanismes, à l’échelle de
la bactérie, sont responsables de la résistance naturelle aux antibiotiques : modification ou hydrolyse enzymatique de l’antibiotique, faible affinité de la cible pour le produit, imperméabilité des membranes ou encore efflux actif. Il s’agit d’un
mécanisme de protection permanente, exprimée chez les bactéries sauvages.
!
! Résistance acquise. La résistance par efflux actif résulte de
l’acquisition de gènes étrangers ou de la surproduction par mutation d’un système propre à l’espèce (responsables d’une élévation des CMI au substrat de 2 à 32 fois, en général de 4 à 8 fois).
Parmi tous les systèmes d’efflux résidant chez les Gram négatifs, seuls certains appartenant à la famille RND sont responsables de résistances acquises. Leur surexpression engendre une
augmentation modérée de la résistance à des antibiotiques très
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divers sur le plan de leur structure chimique (tétracyclines,
macrolides, chloramphénicol, triméthoprime, rifampicine…),
principalement responsable sur le plan thérapeutique d’une
diminution d’efficacité des fluoroquinolones. Les niveaux de
résistance des mutants d’efflux sont en général modérés, en l’absence d’autres mécanismes, mais peuvent être responsables
d’échecs ou de mauvaises réponses thérapeutiques lorsque le
site infectieux est difficilement accessibles (os, prostate,
abcès…). Des essais cliniques seraient utiles pour évaluer l’impact de l’efflux actif sur l’efficacité de l’antibiothérapie. La multirésistance engendrée par la surproduction des systèmes d’efflux devient surtout significative chez les espèces nosocomiales
déjà peu sensibles aux antibiotiques (Pseudomonas aeruginosa,
Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii).
Résistance par efflux chez les bactéries à Gram positif
(R. Leclercq, Caen)
! Les pompes d’efflux. On distingue quatre familles de pompes
en fonction de la séquence des acides aminés constitutifs et de
leur localisation :
" La famille RND (resistance nodulation cell division) : elle
est formée de trois composants (une protéine de transport de la
membrane cytoplasmique, une protéine de transport située au
niveau de du périplasme, une protéine de membrane externe
de type “porine”, qui assure le transport du substrat vers
l’extérieur.
" La famille SMR (small multidrug resistance) est constituée
de pompes avec quatre domaines transmembranaires contenant
un domaine glutamate.
" La famille MFS (major facilitator superfamily), avec 12 ou
14 domaines transmembranaires.
" La super-famille des ABC transporteurs (ATP-binding cassette), avec 12 domaines transmembranaires et un site de fixation de l’ATP.
Toutes les cellules contiennent des pompes ; ainsi, la résistance
de Plasmodium falciparum à la chloroquine est liée à l’activité
d’ABC transporteurs qui expulsent le médicament hors de la
cellule cible. Seules les familles SMR, MFS et des ABC transporteurs, composées d’un seul transporteur localisé dans leur
membrane cytoplasmique, sont présentes chez les Gram positifs. La famille RND n’est pas décrite chez les bactéries à Gram
positif en raison de l’absence de membrane externe.
! Structure et physiologie des pompes d’efflux des Gram
positifs. Le mécanisme d’efflux requiert de l’énergie pour son
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fonctionnement. Cette énergie provient de l’hydrolyse de l’ATP
dans le cas de la famille des ABC transporteurs et de la force
protomotrice qui échange un ion H+ contre une molécule de
substrat dans les trois autres cas.
! Mécanismes d’efflux et résistance naturelle aux antibiotiques. Deux approches ont permis d’identifier les pompes
d’efflux chez les bactéries : la sélection in vitro de mutants
résistants à divers agents (rhodamine, bromure d’éthidium,
quinolones…) et le séquençage du génome bactérien. Plusieurs pompes physiologiques d’efflux aux antibiotiques ont
été rapportées chez de nombreux Gram positifs : par exemple,
pompe NorA et résistance aux fluoroquinolones chez Staphylococcus aureus, pompe Lsa et résistance aux lincosamides et aux streptogramines A chez Enterococcus faecalis.
L’efflux dû à la pompe physiologique se traduit le plus souvent par une augmentation modérée des CMI à l’antibiotique.
La résistance naturelle à un antibiotique peut venir en partie
de son efflux physiologique. Cela explique la résistance naturelle des Enterococcus sp à plusieurs familles d’antibiotiques
(quinolones, chloramphénicol, tétracyclines, groupe MLS).
! Résistance acquise par efflux chez les Gram positifs. On
observe deux mécanismes distincts :
" Résistance par hyperexpression des pompes d’efflux. Ce
mécanisme a été rapporté essentiellement pour les quinolones
et implique les pompes décrites respectivement chez
Streptococcus pneumoniae et S. aureus, PmrA et NorA.
L’hyperexpression de NorA chez un mutant in vitro entraîne
une augmentation des CMI aux quinolones. Les molécules
hydrophiles, ciprofloxacine et norfloxacine, sont les plus touchées. Au contraire, les activités de l’ofloxacine, de la gatifloxacine et de la moxifloxacine sont peu affectées.
" Résistance par acquisition de gènes d’efflux. L’acquisition
de gènes plasmidiques ou transposables codant pour des
pompes d’efflux permet de rendre compte de la résistance
acquise aux tétracyclines et aux macrolides chez les entérocoques, staphylocoques et streptocoques (tableau I).
Conclusion. Certaines pompes physiologiques permettent
l’efflux de nombreuses molécules dont les quinolones hydrophiles, les macrolides, les lincosamides, les streptogramines,
le chloramphénicol. L’hyperexpression des pompes d’efflux est
l’un des mécanismes évoqués pour expliquer la résistance des
pneumocoques et des staphylocoques aux fluoroquinolones.
!
Tableau I. Résistance acquise aux antibiotiques par acquisition de gènes d’efflux.
Pompe
Famille de pompe
Gène
Bactérie
Antibiotique touché
TetK, TetL
MsrA
MFS
ABC transporteur
Plasmide
Plasmide
Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Enterococcus spp
S. aureus
VgA, VgAv, VgAB
MefA
ABC transporteur
MFS
Plasmide
Transposon
S. aureus
Streptocoques, Corynebacterium sp, Neisseria gonorrhoeae,
Acinetobacter junii
Tétracyclines
Érythromycine
Streptogramines B
Streptogramines A
Érythromycine
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Par ailleurs, l’acquisition de gènes plasmidiques ou transposables code pour des protéines d’efflux de l’érythromycine chez
les staphylocoques et les pneumocoques.
Relation efflux-virulence chez Pseudomonas aeruginosa
(O. Join-Lambert, Paris)
P. aeruginosa est une bactérie opportuniste responsable d’infections nosocomiales et d’infections des voies respiratoires
chez les sujets atteints de mucoviscidose. La multiplicité des
facteurs de virulence et l’existence de systèmes d’efflux à large
spectre expliquent la multirésistance aux antibiotiques.
Systèmes d’efflux chez P. aeruginosa. P. aeruginosa se
caractérise par sa résistance naturelle à de nombreux antibiotiques et par sa grande facilité à développer des résistances sous
traitement. Cela est dû à l’imperméabilité de sa membrane
externe et à l’existence de pompes d’efflux. On décrit cinq systèmes de pompes chez P. aeruginosa, appartenant toutes à la
famille RND : MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN,
MeXY-OprM, MexJK-OprM. Sur le plan génétique, ces
pompes sont organisées en opérons chromosomiques formés
de trois gènes, le premier codant pour une protéine de fusion
membranaire (MexA, MexC, MexE, MexJ, MexX), le second
pour un transporteur (MexB, MexD, MexF, MexK, MexY), le
troisième pour une protéine de membrane externe (OprM,
OprN, OprJ). Les trois protéines associées forment un canal
traversant la membrane interne, l’espace périplasmique et la
membrane externe. In vitro et in vivo, l’exposition aux antibiotiques et, en particulier, aux fluoroquinolones est responsable de l’émergence de mutants d’efflux. La surexpression
d’un système d’efflux engendre l’acquisition d’un phénotype
de multirésistance, diminuant la sensibilité de la bactérie à
d’autres antibiotiques que le seul substrat initial (tableau II).
!
Tableau II. Antibiotiques exportés par les systèmes d’efflux de
P. aeruginosa.
Systèmes d’efflux
Antibiotiques exportés
MexAB-OprM
Quinolones, tétracyclines, chloramphénicol,
triméthoprime, β-lactamines, inhibiteurs
des β-lactamines
MexXY-OprM
Tétracyclines, érythromycine, aminoglycisides
MexJK-OprM
Tétracyclines, érythromycine
MexCD-OprJ
Quinolones, érythromycine, C3G
MexEF-OprN
Quinolones, chloramphénicol, triméthoprime
! Fonctions naturelles des pompes d’efflux. Le nombre de
gènes codant pour des systèmes d’efflux de la famille RND est
très élevé chez P. aeruginosa (dix systèmes contre quatre chez
E. coli). La pompe MexAB-OprM est exprimée de façon constitutive chez les souches sauvages, contrairement aux systèmes
MexCD-OprJ et Mex EF-OprN. Cela suggère que la mise en
route de ces pompes pourrait représenter un coût pour la bactérie et que leur activation serait réservée à des situations de
lutte et de survie de la bactérie.
68
! Relation efflux-virulence chez P. aeruginosa. L’étude de
l’expression de la virulence chez des mutants isogéniques de
PAO1 (souche sauvage) de référence a montré que les systèmes
d’efflux interféraient avec la régulation de la virulence par
quorum sensing (cf. infra) et avec la capacité d’exprimer un
phénotype invasif.
! Facteurs de virulence de P. aeruginosa. Il existe deux types
de facteurs de virulence :
" Les facteurs associés à la bactérie, composant la structure
bactérienne (flagelles, pili, adhésines, lipopolysaccharides, alginate).
" Les facteurs de virulence extracellulaires sécrétés (protéases,
hémolysines…). La production de certains agents de virulence
extracellulaires est régulée par le quorum sensing.
Régulation par quorum sensing de l’expression de virulence de P. aeruginosa. Il s’agit d’un système permettant aux
bactéries de communiquer entre elles pour réguler la synthèse
de leurs facteurs de virulence, grâce à l’action d’auto-inducteurs appelés homosérines lactones (LHS).
On distingue deux types de quorum sensing chez P. aeruginosa : le système las (lasI, lasR : régulateur transcriptionnel de
la synthèse d’élastase) et le système rhl (rhlI, rhlR : régulateur
transcriptionnel de la synthèse de rhamnolipides). Les gènes
las I et rhl II codent pour une enzyme responsable de la synthèse d’un auto-inducteur. Lors de l’augmentation de la population bactérienne, ces auto-inducteurs se fixent aux activateurs
transcriptionnels Lasr et RhlR. Chaque complexe auto-inducteur-activateur transcriptionnel induit alors l’expression de
gènes de virulence dépendant de son système respectif.
In vivo, le quorum sensing pourrait être impliqué dans le
passage de la phase de colonisation bactérienne à la phase d’infection aiguë par P. aeruginosa.
!
Inhibiteurs des systèmes d’efflux chez les bactéries
(J.M. Pagès, Marseille)
Les systèmes de pompes, regroupés en six familles, jouent un
rôle clé dans la détoxification de la cellule.
Dans le domaine de l’antibiothérapie, ces systèmes ont différentes fonctions :
" expulser les antibiotiques hors de la cellule cible ;
" accroître le potentiel d’autres mécanismes de résistance (par
inactivation enzymatique de l’antibiotique ou modification de
la perméabilité membranaire), ce qui est à l’origine de la
multirésistance ;
" faciliter l’adaptation des bactéries in vivo ;
" favoriser l’émergence de mutants de cibles.
Mécanismes d’efflux et cibles potentielles. La mise en
action des mécanismes d’efflux entraîne une modification
notable de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques et
l’apparition de phénotypes de résistance. Face aux risques
d’impasse thérapeutique, différentes études sont menées
à la recherche de molécules capables de bloquer ces
mécanismes de transport et de restaurer l’activité des antibiotiques expulsés.
!
La Lettre de l’Infectiologue - Tome XVIII - n° 2 - mars-avril 2003
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Cibles potentielles. On distingue plusieurs cibles potentielles : l’énergie permettant le transport ; la pompe elle-même ;
les caractéristiques fonctionnelles du canal ; l’assemblage du
système.
!
Les inhibiteurs d’efflux. Nous décrirons ici l’action de
quatre molécules inhibitrices.
" Le carbonyl cyanure m-chlorophényl hydrazone (CCCP).
Son rôle est de détruire la composante énergétique de la pompe
et de bloquer l’expulsion des antibiotiques. Le CCCP permet
ainsi de restaurer la concentration intracellulaire de l’antibiotique expulsé ; cependant, la composition chimique de la
molécule (qui constitue un poison énergétique) restreint son
utilisation au laboratoire à l’identification des mécanismes
d’efflux.
" Phénylalanine arginine ß-naphthylamide (PAßN). Il s’agit
d’un puissant inhibiteur des pompes d’efflux chez P. aeruginosa, capable de restaurer la sensibilité à la lévofloxacine de
souches surexprimant les pompes MexAB-OprM, MexCDOprJ, MexEF-OprN. De plus, ce produit, actif sur la famille
!
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B
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des fluoroquinolones, a démontré un effet significatif sur le
seuil de sensibilité à d’autres familles antibiotiques (chloramphénicol, tétracyclines, carbénicilline). L’addition de cette
molécule induit une forte diminution des CMI considérées. Sur
des souches d’Enterobacter aerogenes possédant des pompes
au chloramphénicol et à la norfloxacine, la molécule augmente
l’accumulation du premier et améliore la sensibilité pour les
deux antibiotiques. Le niveau de concentration intracellulaire
reste cependant inférieur à celui obtenu avec les poisons énergétiques.
" Dérivés quinoléines. La famille des dérivés quinoléines (pyridoquinoléines, alkoxyquinoléines, aminoquinoléines) paraît
être une source de molécules potentiellement actives contre
l’efflux.
" Réserpine. La réserpine est un puissant inhibiteur de certains
transporteurs membranaires eucaryotes. Chez S. aureus, elle
induit une forte inhibition des systèmes d’efflux et augmente
de manière significative la sensibilité à la norfloxacine.
S. Ansart, Paris
NOTRE SÉLECTION D’ARTICLES (n° mars-avril 2003)…
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E. Caumes
Typhoid fever.
Parry CM, Hien TT, Dougan G et al. N Engl J Med 2002 ; 347 : 1770-82.
Une revue exhaustive et très bien faite sur la fièvre typhoïde.
Human metapneumovirus in the community.
Osterhaus A, Fouchier R. Lancet 2003 ; 361 : 890-1.
Une excellente (et très courte) mise au point sur ce nouveau virus responsable d’infections respiratoires potentiellement sévères.
Oral pristinamycin versus standard penicillin regimen to treat erysipelas in adults : randomised, non inferiority open trial.
Bernard Ph, Chosidow O, Vaillant L on behalf of the French Erysipelas Study Group. Br Med J 2002 ; 325 : 1-5.
Il s’agit d’une étude comparative randomisée témoignant de la supériorité de la pristinamycine sur la pénicilline (péni-G intraveineuse relayée par la pénicilline V per os) dans le traitement de l’érysipèle.
Effect of short-term treatment with azithromycin on recurrent ischaemic events in patients with acute coronary syndrome in
the Azithromycin in Acute Coronary Syndrome (Azacs) trial : a randomised controlled trial.
Cercek B, Shah PK, Noc M et al. for the Azacs investigators. Lancet 2003 ; 361 : 809-13.
Cette étude comparative randomisée (versus placebo) montre l’absence d’efficacité de l’azithromycine dans la prévention des récidives d’insuffisance coronarienne chez des patients présentant un syndrome d’insuffisance coronaire.
Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus : a meta analysis of prevalence and risk factors.
Salgado CD, Farr BM, Calfee DP. Clin Infect Dis 2003 ; 36 : 131-9.
Une revue complète de la littérature sur l’épidémiologie de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline en ville.
Contacts with varicella or with children and protection against herpes zoster in adults : a case control study.
Thomas SL, Wheeler JG, Hall AJ. Lancet 2002 ; 360 : 678-82.
Une étude cas-témoin montrant que l’exposition à la varicelle (et, dans une moindre mesure, à des enfants malades) protège du zona
les personnes déjà infectées par le virus varicelle-zona.
La Lettre de l’Infectiologue - Tome XVIII - n° 2 - mars-avril 2003
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