Master Ecosciences, Microbiologie PROPOSITION SUJET de

Master Ecosciences, Microbiologie Parcours Recherche « Ecologie Microbienne » Bâtiment Dubois – 2ème étage Université Claude Bernard Lyon 1 69622 – VILLEURBANNE CEDEX Tel : 04 72 43 13 77 E‐mail : master2.ecomi@univ‐lyon1.fr http://spiral.univ‐lyon1.fr/Files_m/M5298/WEB/EcologieMicrobienne.htm PROPOSITION SUJET de MASTER 2014‐2015 TITRE : Caractérisation fonctionnelle de la pompe à efflux RND EbyCAB de Stenotrophomonas maltophilia Nom, Prénom du Maitre de Stage : FAVRE‐BONTE Sabine Qualité : Maître de Conférences Téléphone : 04 72 43 14 95 E‐mail : sabine.favre‐bonte@univ‐lyon1.fr Laboratoire d’accueil, Responsable et équipe : UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne – Y. MOENNE‐LOCCOZ Equipe Multi‐résistance environnementale et Efflux bactérien – S. NAZARET Adresse : Bat. G. Mendel, 43 bd du 11 novembre 1918 69622 Villeurbanne Cedex Nom du candidat éventuellement proposé : S'il n'est pas retenu, acceptez‐vous un autre candidat ? Oui ‐ Non Description du sujet au verso  Sujet (objectif, démarche et technique, collaboration(s),...) :
Les systèmes d’efflux bactériens sont connus pour médier l’efflux actif de nombreux
antibiotiques et agents chimiothérapeutiques, et sont à l’origine des phénotypes de multi-résistance
fréquemment observés chez les espèces pathogènes de l’homme. Ils sont largement distribués chez
les procaryotes, ont des déterminants génétiques généralement localisés sur le chromosome et
auraient sur la base d’études phylogénétiques une origine ancienne très antérieure à l’ère
antibiotique (D’Costa et al., 2011). Il est supposé que dans leur habitat d’origine, les systèmes
d’efflux permettent à la bactérie de lutter contre l’ensemble des composés naturels potentiellement
toxiques. Par ailleurs, il a été montré que ces systèmes jouent un rôle prépondérant dans le contrôle
de l’homéostasie des métaux (Nies, 2003).
Stenotrophomonas maltophilia est une espèce largement distribuée dans l’environnement que
ce soit dans les sols mais également dans les milieux aquatiques et sédimentaires, ainsi que dans des
résidus organiques. Elle est par ailleurs pathogène opportuniste de l’Homme, en émergence dans le
milieu hospitalier. Sa grande versatilité métabolique, sa résistance intrinsèque à de nombreux
antibiotiques et la présence sur son génome d’une vaste palette de pompes à efflux contribueraient à
son aptitude à coloniser une grande diversité de milieux. Nous avons récemment démontré que des
souches environnementales de S. maltophilia présentaient une association phénotypique de
résistance aux métaux et antibiotiques en fonction de l’environnement à partir duquel elles étaient
isolées (Deredjian, soumis). Nous avons d’autre part mis en évidence une nouvelle une pompe à
efflux, EbyCAB chez une souche isolée du sol présentant un phénotype de multi-résistance aux
antibiotiques et aux métaux semblable aux souches cliniques.
Nous formulons l’hypothèse que la pompe EbyCAB interviendrait dans la gestion
d’antibiotiques thérapeutiques mais également de métaux et métabolites secondaires de plantes
potentiellement présents dans l’environnement d’isolement de la souche.
L’objectif de ce projet est de caractériser plus finement le fonctionnement de la pompe
EbyCAB quant à la gestion d’antibiotiques, de métaux et de métabolites secondaires de plantes. Les
données obtenues récemment en utilisant un mutant isogénique délété de la pompe EbyCAB ont
montré que des antibiotiques et des métabolites secondaires de plantes étaient des substrats
potentiels de cette pompe. D’autre part, une souche d’E. coli exprimant EbyCAB montre que le
nickel et le cobalt sont pris en charge par cette pompe. L’opéron EbyCAB étant précédé par un
gène régulateur de type tetR chez S. maltophilia, nous souhaitons connaitre le rôle de ce régulateur
potentiel sur l’expression de la pompe ainsi qu’évaluer les conditions d’induction de cette pompe.
Démarche expérimentale :
Caractérisation phénotypique des mutants dans l’opéron eby :
Les mutants dans les gènes codant l’opéron eby seront caractérisés phénotypiquement de manière
plus exhaustive pour la résistance aux antibiotiques, aux métaux et aux métabolites secondaires de
plantes afin d’évaluer le rôle de cette pompe à efflux dans la gestion de ces molécules (sur la base de
données Omnilog déjà disponibles).
Rôle régulateur de tetR dans l’expression de l’opéron ebyCAB :
Des constructions de fusion transcriptionelle (gène xylE) seront réalisées afin de cibler la réponse de
l’opéron ebyCAB à la présence de métaux, d’antibiotiques et de métabolites secondaires de plantes,
dans un contexte sauvage et dans le mutant du régulateur.
Implication directe de la pompe dans l’efflux de métaux :
La concentration intracellulaire des métaux efflués sera mesurée chez E. coli, complémentée ou non,
ainsi que chez S. maltophila et son dérivé eby, par dosage ICP-MS (Inductively coupled plasma
mass spectrometry). Le nickel étant pris en charge par EbyCAB, des dosages cinétiques
d’accumulation de 63Ni, en présence ou non d’autres ions compétiteurs complèteront ces données et
permettront la caractérisation fine de l’efflux médié par la pompe à efflux EbyCAB.
Collaborations : Agnès Rodrigue (UMR CNRS 5240 Microbiologie Adaptation Pathogénie) pour la
caractérisation fine de la prise en charge des métaux par la pompe EbyCAB.