S. typhimurium

Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II
Thèse de doctorat de l’université de la Méditerranée
Spécialité : Microbiologie moléculaire et Biotechnologie
présentée par
Magali Hebrard
pour obtenir le grade de docteur de l’université de la Méditerranée
Etude des systèmes antioxydants dans le métabolisme
et la virulence de Salmonella typhimurium
Jury composé du :
Dr. Françoise Norel
Dr. Claude Parsot
Pr. Josep Casadesús
Dr. Stéphane Méresse
Pr. Frédéric Barras
Dr. Laurent Aussel
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Co-directeur de thèse
Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II
Thèse de doctorat de l’université de la Méditerranée
Spécialité : Microbiologie moléculaire et Biotechnologie
présentée par
Magali Hebrard
pour obtenir le grade de docteur de l’université de la Méditerranée
Etude des systèmes antioxydants dans le métabolisme
et la virulence de Salmonella typhimurium
Jury composé du :
Dr. Françoise Norel
Dr. Claude Parsot
Pr. Josep Casadesús
Dr. Stéphane Méresse
Pr. Frédéric Barras
Dr. Laurent Aussel
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Co-directeur de thèse
Table des matières
Page
Liste des abréviations……………………………………………………………............ 1
AVANT-PROPOS………………………………………………………………………. 3
INTRODUCTION
Partie « Salmonella typhimurium » …………………………………………………...... 5
I- Introduction au genre Salmonella…………………………………………............ 5
1- Classification du genre Salmonella………………………………………. 5
2- Epidémiologie associée à S. typhimurium…………………………………5
3- La résistance aux antibiotiques chez S. typhimurium……………………...6
II- L’établissement de l’infection par S. typhimurium………………………………..6
1- La maladie déclenchée chez l’homme : la gastroentérite………………… 6
2- La maladie déclenchée chez la souris : la fièvre typhoïde……………….. 7
III- Les mécanismes de défense de l’organisme hôte…….…………………………... 7
1- Deux barrières naturelles : l’estomac et l’intestin…………………………8
2- Les mécanismes de défense du macrophage ……………………………...9
a. La fusion endolysosomale et la formation du phagolysosome…. 9
b. Les peptides antimicrobiens cationiques (CAMP)…………....... 10
c. La NADPH phagocyte oxydase………………………………… 10
d. L’oxyde nitrique synthase inductible……………………………12
e. Synergie d’action entre les deux enzymes…………………........ 13
f. Autres enzymes impliquées dans la production de FAO.............. 14
g. La protéine Slc11a1……………………………………………...15
IV- Les facteurs de virulence de S. typhimurium ………………………………….......15
1- Les systèmes de sécrétion de type III (SSTT) de S. typhimurium………...15
a. Le SSTT codé sur l’îlot de pathogénicité 1…………………….. 15
b. Le SSTT codé sur l’îlot de pathogénicité 2…………………….. 17
c. Ilots de pathogénicité et transfert latéral de gènes……………... 20
2- PhoP/PhoQ……………………………………………………………….. 20
a. Présentation de PhoP/PhoQ…………………………………….. 21
b. Activation par les ions Mg2+……………………………………. 21
c. Implication de PhoP/PhoQ dans la virulence de S. typhimurium. 21
3- Le plasmide pSLT………………………………………………………... 23
a. L’opéron spv……………………………………………………. 23
b. L’opéron pef……………………………………………………..23
4- Les superoxyde dismutases périplasmiques……………………………….24
a. Présentation de SodCI et SodCII………………………………. 24
b. Comparaisons entre SodCI et SodCII…………………………. 25
5- RpoS, le facteur sigma alternatif de la phase stationnaire………………... 25
a. Régulation de RpoS…………………………………………….. 25
b. Le régulon rpoS……………………………………………….... 26
c. Implication de RpoS dans la virulence de S. typhimurium……... 27
Partie « Stress oxydant »……………………………………………………………….. 28
I- Les Formes Actives de l’Oxygène (FAO)……………………………………....... 28
1- Les radicaux libres………………………………………………………... 28
a. L’oxygène moléculaire…………………………………………..28
b. L’anion superoxyde…………………………………………….. 28
c. Le radical hydroxyle……………………………………………. 29
d. L’anion radicalaire carbonate……………………………………29
2- Les FAO non radicalaires………………………………………………… 30
a. L’oxygène singulet……………………………………………... 30
b. Le peroxyde d’hydrogène…………………….………………… 30
3- Origine des FAO…………………………………………………………. 30
a. Les FAO d’origine endogène…………………………………... 30
b. Les FAO d’origine exogène……………………………………. 31
4- Les cibles des formes actives de l’oxygène……………………………..... 31
a. Les cibles de l’anion superoxyde……………………….……….32
b. Les cibles du peroxyde d’hydrogène…………………………. 32
c. Les cibles du radical hydroxyle…………………….…………... 33
d. Les lipides bactériens sont-ils une cible des FAO ?.................... 33
5- Les mécanismes de défense bactériens contre les FAO………………….. 34
a. Les superoxyde dismutases…………………………………….. 34
b. Les catalases et les peroxyrédoxines…………………………….34
c. Les systèmes de réparation protéique…………………………... 35
6- La régulation des systèmes d’adaptation au stress oxydant ……………... 35
a. Le système SoxR/SoxS…………………………………………. 36
b. Le régulateur OxyR…………………………………………….. 36
7- Les formes actives de l’azote………………………………………….…..37
a. Les réactions chimiques générées en présence de NO....……..
37
b. Présentation du NO. et des FAN………………………….……. 38
c. Production des FAN……………………………………………. 39
8- Les cibles des FAN...................................................................................... 40
9- Les mécanismes de défense contre les FAN …………………………….. 41
a. Les enzymes catalysant l’élimination du NO.…………..…….. 41
b. Les enzymes catalysant l’élimination du peroxynitrite………… 42
II- Les méthionine sulfoxyde réductases…………………………………………….. 43
1- La méthionine…………………………………………………………….. 43
a. Caractéristiques de la méthionine………………………………. 43
b. La méthionine, une "éponge" à stress oxydant………................ 43
2- Les méthionine sulfoxyde réductases…………………………………….. 44
a. Aspects biochimiques…………………………………………... 44
b. Réaction catalytique……………………………………………. 44
3- Organisation génétique et régulation …………………………………….. 44
a. Organisation génétique…………………………………………. 44
b. Régulation de msrA et msrB……………………………………. 45
4- Les substrats des Msr …………………………………………………….. 45
a. La protéine ribosomale L12…………………………………….. 45
b. La protéine chaperon groEL……………………………………. 45
c. Le complexe SRP………………………………………………. 46
5- Rôle de MsrA et MsrB dans la pathogénicité………………………….…. 46
a. Erwinia chrysanthemi…………………………………………... 46
b. Mycoplasma genitalium………………………………………… 46
c. Streptococcus pneumoniae……………………………………... 47
III- Les catalases………………………………………………….…………………... 47
1- Les caractéristiques des trois groupes……………………………………. 47
a. Les catalases monofonctionnelles……………………………….47
b. Les catalases-peroxydases……………………………………… 49
c. Les catalases à manganèse …………………………………….. 50
2- Rôle des catalases dans la physiologie des bactéries pathogènes………… 50
a. Helicobacter pylori …………………………………………….. 50
b. Agrobacterium tumefaciens…………………………………….. 51
c. Pseudomonas aeruginosa………………………………………. 51
d. Salmonella typhimurium…………………………………………51
IV- Les peroxyrédoxines……………………………………………………………… 52
1- Les peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines……………………………… 52
a. La réaction des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines……….. 52
b. Les caractéristiques générales d’AhpC……………….…………53
c. Régulation d’ahpC …………………………………………….. 53
d. Rôle d’AhpC dans la physiologie des bactéries pathogènes…… 53
2- Les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines…………………………….. 55
a. La réaction des peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines……… 55
b. Localisation cellulaire de Tpx……………………………..…… 56
c. Régulation de tpx………………………………………….……. 56
d. Rôle de Tpx dans la physiologie des bactéries pathogènes…….. 57
3- Les peroxyrédoxines à 1 cystéine………………………………………… 57
RESULTATS
Partie 1 : Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène dans le
métabolisme et la virulence de S. typhimurium : caractérisation du mutant Hpx°……..… 59
I- Construction du mutant 12023 ∆ahpCF ∆katG ∆katE katN::cat (Hpx°)………… 59
II- Caractérisation phénotypique du mutant Hpx°…………………………………... 59
III- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° au peroxyde d’hydrogène…………..….. 61
IV- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° à l’anion superoxyde et l’ion carbonate… 62
V- Etude du profil d’oxydation protéique du mutant Hpx° chez S. typhimurium…… 62
VI- Etude de la virulence du mutant Hpx°………………………………………….… 64
VII-Etude de la contribution individuelle des catalases KatG et KatE………….…… 66
Partie 2 : Caractérisation d’un biosenseur vivant du peroxyde d’hydrogène……………. 68
I- Construction du plasmide PahpC-GFP……………………………………………68
II- Caractérisation du biosenseur vivant en milieu de culture……………………….. 69
III- Caractérisation du biosenseur vivant dans des macrophages murins…………….. 70
IV- Implication de la NADPH phagocyte oxydase dans la production des FAO par
le macrophage………………………………………………………………………….72
Partie 3 : Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène dans le
métabolisme et la virulence de S. typhimurium : caractérisation du mutant HpxF- ……... 74
Article
Partie 4 : Implication des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de
S. typhimurium…………………………….……………………………………………… 76
I- Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx…………………… 76
II- Etude de la virulence du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx……………………............ 76
III- Etude du rôle des peroxyrédoxines de S. typhimurium dans les macrophages……78
IV- Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en présence
de FAO ou FAN……………………………………………………………………… 82
Partie 5 : Implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la
virulence de S. typhimurium…………………………………….………………………... 87
I- Construction de mutants des gènes msrA et msrB de S. typhimurium…………… 87
II- Caractérisation phénotypique des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx-……… 88
III- Etude de la sensibilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpxen présence d’H2O2…………………………………………………………………... 88
IV- Evaluation du niveau d’oxydation protéique des mutants msrAB-, Hpxet msrAB- Hpx- au cours de la croissance bactérienne……………………………….. 89
V- Etude de la mobilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx-………………... 90
VI- Etude de la virulence des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx-………………. 91
DISCUSSION ET PERSPECTIVES………………………………………………….. 94
MATERIELS ET METHODES……………………………………………………….. 101
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES …………………………………………….. 117
Avant-Propos
S. typhimurium est une bactérie enteropathogène dont la capacité à être virulente est, en partie,
assurée par deux systèmes de sécrétion qui lui permettent l’internalisation et la survie dans
des cellules hôtes. Ces systèmes de sécrétion sont des facteurs de virulence, classiquement
définis comme des composés dont l’absence va résulter en l’abolition du potentiel de
virulence de la bactérie sans en altérer le métabolisme. Au cours de mon travail de thèse, j’ai
pu montrer que des enzymes cytoplasmiques du métabolisme de S. typhimurium participaient
également aux capacités pathogéniques de la bactérie, ce qui nous a conduit à nous poser la
question de la définition de la virulence chez S. typhimurium.
Depuis dix ans, le laboratoire de F. Barras travaille sur la thématique du stress oxydant chez
Escherichia coli. Mon arrivée dans le laboratoire a coïncidé avec le démarrage d’un nouveau
sujet, le stress oxydant chez S. typhimurium. Le stress oxydant est défini comme un
déséquilibre entre les formes actives de l’oxygène (FAO), produits dérivés de l’oxygène
comme par exemple l’H2O2, et les systèmes impliqués dans leur élimination. La conséquence
est l’endommagement de l’ensemble des macromolécules biologiques (acides nucléiques,
protéines, lipides). Les catalases et les peroxyrédoxines participent à l’élimination de l’H2O2.
Au cours de ma thèse, j’ai montré que S. typhimurium possédait cinq enzymes impliquées
dans l’élimination de l’H2O2, 3 catalases, KatG, KatE et KatN ainsi que deux
peroxyrédoxines, AhpCF et TsaA. Ces cinq protéines participent également à l’établissement
de la virulence de la bactérie en condition d’infection dans des macrophages murins et dans la
souris. En effet, les macrophages sont pourvus d’un complexe enzymatique appelé NADPH
phagocyte oxydase qui produit de l’anion superoxyde. Cette FAO a une très forte propension
à se dismuter en H2O2. Nous avons montré que KatE, KatG, KatN, AhpCF et TsaA
éliminaient l’H2O2 produit par le macrophage, garantissant ainsi la viabilité de S. typhimurium
en condition d’infection. Ces résultats sont présentés page 74 de ce manuscrit (Hebrard et al.,
2009).
Nous nous sommes ensuite intéressés à la perception du stress oxydant en condition
d’infection par S. typhimurium. Pour cela, une sonde moléculaire détectant l’H2O2 a été
construite puis introduite dans une bactérie sauvage afin d’obtenir un « biosenseur vivant » du
peroxyde d’hydrogène. A l’aide de cette souche, nous avons montré que la bactérie ressentait
de l’H2O2 en condition d’infection dans des macrophages murins. Cela nous a permis de
3
mieux étudier le « burst oxydatif » tel que la bactérie le perçoit dans sa vacuole en condition
d’infection. Ces résultats ont souligné l’importance des enzymes éliminant l’H2O2 chez S.
typhimurium. Ce travail est présenté page 68 de ce manuscrit.
Au cours de ce travail, nous avons également montré que trois peroxyrédoxines de S.
typhimurium, AhpCF, TsaA et Tpx participaient à l’établissement de la virulence. Nous avons
montré que ces 3 enzymes ne semblaient pas essentielles pour éliminer les FAO ou les FAN
produites par la NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible, respectivement.
Un travail ultérieur permettra de comprendre le rôle des peroxyrédoxines de S. typhimurium
en condition d’infection dans les macrophages. Ce travail est présenté page 76 du manuscrit.
Enfin, nous avons étudié l’implication d’un système de réparation protéique, les méthionine
sulfoxyde réductases. Ces enzymes réparent les méthionines oxydées libres ou enchâssées au
sein des protéines. S. typhimurium possède deux méthionine sulfoxyde réductases, MsrA et
MsrB. Les résultats obtenus ont montré que les caractéristiques d’un mutant ∆msrA ∆msrB
étaient proches de celles de la souche sauvage. Les gènes msrA et msrB ont également été
inactivés dans une souche dépourvue de 2 catalases, KatG et KatE et d’une peroxyrédoxine,
AhpC. Dans cette souche accumulant de l’H2O2 endogène, la contribution de MsrA et MsrB
devient évidente pour lutter contre les effets liés au stress oxydant. Ce travail est présenté
page 87 du manuscrit.
Ainsi, au cours de ce travail de thèse, j’ai pu abordé les thématiques de la pathogénèse de
Salmonella typhimurium et du stress oxydant. Ces deux thématiques font l’objet de synthèses
bibliographiques qui sont présentées dans la première partie de ce manuscrit.
4
INTRODUCTION
Salmonella typhimurium
Introduction S. typhimurium
Salmonella
Sisal
Salmonella enterica
Salmonella bongori
Sous-espèce V
(SE V)
SE I
enterica
SE II
salamae
Salmonella typhoïdiques
adaptées aux primates et aux humains
Fièvre entérique
S. Typhi
S. Paratyphi A
S. Paratyphi B
S. Paratyphi C
S. Sendai
SE IIIa
arizonae
SE IIIb
diarizonae
S. Typhimurium
S. Enteritidis
+ 1500 autres
SE VI
indica
Salmonella non-typhoïdiques
non restreintes aux humains
Gastro-entérite
Non-invasive
SE IV
houtanea
Bactériémie
S. Typhimurium
S. Enteritidis
S. Dublin
S. Virchow
S. Heidelberg
Extra-intestinale
(invasive)
Infection localisée
S. Cholaraesuis
S. Typhisuis
S. Typhimurium
S. Enteritidis
S. Dublin
Bactériémie
S. Cholaraesuis
S. Typhisuis
S. Typhimurium
S. Enteritidis
S. Dublin
S. Virchow
S. Heidelberg
Figure 1 : Diagramme représentant le genre Salmonella (adapté de Langridge, Wain et
Nair, site web EcoSal « Module 8.6.2.2 »)
Les espèces et sous-espèces (SE) composant le genre Salmonella ont été définies par biotypage,
hybridation ADN/ADN, analyse de l’ARN 16S et électrophorèse d’isoenzymes ou MEE
(Multilocus Enzyme Electrophoresis). Salmonella est divisée en deux espèces : bongori et
enterica. L’espèce enterica comporte 6 sous-espèces dont la sous-espèce enterica. Celle-ci est
elle-même divisée en deux groupes : le groupe des Salmonella typhoïques et le groupe des
Salmonella non typhoïques à l’intérieur duquel est classée S. typhimurium.
Introduction S. typhimurium
I-
Introduction au genre Salmonella
1- Classification du genre Salmonella
Le genre Salmonella fait partie de la famille des Enterobacteriaceae et se divise en deux
espèces :
-
Salmonella enterica
-
Salmonella bongori
Salmonella enterica est l’espèce la plus représentée. Elle est elle-même divisée en 6 sousespèces (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtanae, indica) et en de nombreux
sérovars (plus de 2000) tels que Enteritidis, Typhi, Typhimurium…(Fig. 1).
La nomenclature des Salmonella est constituée du genre, de l’espèce, de la sous-espèce et du
serovar, par exemple, Salmonella enterica sous-espèce enterica serovar Typhimurium. Au
cours de cette thèse, une abréviation sera utilisée pour nommer les bactéries du genre
Salmonella. Je parlerai soit de S. typhimurium, soit de S. typhi, pour Salmonella enterica sousespèce enterica serovar Typhimurium et Salmonella enterica sous-espèce enterica serovar
Typhi, respectivement.
Les génomes de S. typhimurium et d’Escherichia coli possèdent plus de 84% d’identité de
séquence nucléique (comparaison réalisée à partir des souches référencées, LT2 pour
Salmonella et K12 pour E. coli ) (McClelland et al., 2001). Ces deux bactéries se sont
différenciées l’une de l’autre il y a 120 à 160 millions d’années.
Le génome de S. typhimurium LT2 comprend un chromosome de 4,8 millions de paires de
bases et un plasmide de virulence de 94 kb (Fig. 2). Les principales caractéristiques de ce
génome sont représentées dans le tableau 1 (McClelland et al., 2001).
2- Epidémiologie associée à S. typhimurium
Les salmonelles sont des microorganismes pathogènes responsables de gastro-entérites, de
toxi-infections alimentaires et de fièvres typhoïdes. Elles pénètrent dans l’organisme par voie
orale après ingestion d’aliments ou d’eau contaminés. La plupart des animaux constituent un
réservoir à salmonelles. Deux problèmes majeurs découlent de la prévalence de cette bactérie.
D’abord, Salmonella constitue un problème de santé publique mondial, principalement dans
les pays en voie d’industrialisation où les normes sanitaires ne sont pas correctement
appliquées. Ensuite, elle représente un problème économique. Aux Etats-Unis, le coût des
maladies associées à des pathogènes alimentaires peut atteindre 23 milliards de dollars par an.
5
Introduction S. typhimurium
(B)
(A)
Distribution des gènes
Spécifique de Typhimurium
Spécifique de Salmonella
Présent dans tous les génomes
Autre possibilité
Figure 2 : Représentation circulaire du génome de S. typhimurium (adapté de McClelland et al.,
2001)
(A) Le chromosome de S. typhimurium. Les deux cercles externes représentent l’orientation des séquences
codantes, avec le brin sens représenté à l’extérieur et le brin anti-sens à l’intérieur. Le rouge indique les
régions homologues présentes dans 8 autres génomes d’entérobactéries (S. typhi, S. paratyphi A, S.
paratyphi B, S. arizonae, S. bongori, E. coli K12, E. coli O157:H7, K. pneumoniae). Le vert indique les
gènes ayant un homologue chez au moins une autre Salmonella mais pas chez les E. coli ou chez K.
pneumoniae. Le bleu indique les gènes présents seulement chez S. typhimurium LT2. Le gris indique les
autres possibilités. Le cercle interne noir est le contenu en G+C; le cercle pourpre/jaune est le biais en GC.
Les positions de l’origine de réplication (ORI) et du terminus (TER) sont indiquées. (B) Le plasmide
pSLT de S. typhimurium. Le plasmide n’est pas à l’échelle. Le code couleur est le même que pour (A).
Paramètre
Chromosome
Plasmide pSLT
Taille (pb)
4857432
93939
GC%
53%
53%
Groupes d’ARN
ribosomaux
7
0
ARNs de transfert
85
0
Pseudogènes ARN de
transfert
1
0
ARNs structuraux
11
1
Séquences codantes
(dont les pseudogènes)
4489
108
Tableau 1 : Principales caractéristiques du génome de S. typhimurium (adapté de McClelland et al.,
2001)
Introduction S. typhimurium
Le centre national de référence (CNR) de Salmonella situé à l’Institut Pasteur a pour mission
de surveiller l’évolution d’épidémies de plusieurs bactéries entéropathogènes. Selon le rapport
annuel d’activité 2007 du CNR, 8124 isolements humains de Salmonella ont été réalisés en
France métropolitaine, dans les territoires d’outre-mer et à Monaco. Sur ces 8124 isolements,
plus de 37% des Salmonella isolées appartiennent au sérovar Typhimurium, ce qui en fait le
sérovar le plus représenté. Le second sérovar le plus représenté est le sérovar Enteritidis qui a
été identifié dans près de 27% des souches prélevées.
3- La résistance aux antibiotiques chez S. typhimurium
S. typhimurium est naturellement sensible à tous les antibiotiques actifs sur les
entérobactéries. En Europe, les premiers isolats de salmonelles résistantes aux antibiotiques
ont été réalisés au début des années 1960. L’analyse de la sensibilité du sérovar Typhimurium
aux antibiotiques montre des niveaux élevés de multi-résistances depuis 1993. Dans notre
pays, cette multi-résistance est surtout due à l’établissement du clone phage type DT104, au
début des années 1990 (Helms et al,. 2005). Le clone DT104 est résistant à l’ampicilline, au
chloramphénicol, à la streptomycine, aux sulfamides et aux tétracyclines (Type de résistance
ACSSTu). Les gènes impliqués dans la résistance ACCSSTu sont tous retrouvés sur le
chromosome de S. typhimurium DT104 au niveau d’une région de 12,5 kb, elle-même insérée
sur un îlot génomique appelé Salmonella Genomic Island I (SGI) (Threlfall et al., 1994). Ils
sont soit codés sur deux intégrons (Sandvang et al., 1998), soit situés entre ces deux intégrons.
La résistance à l’ampicilline est assurée par la production d’une β-lactamase, la résistance au
chloramphénicol et à la tétracycline par une pompe à efflux, la résistance à la streptomycine
par une mutation du site de fixation du ribosome et enfin la résistance aux sulfamides par une
dihydropteroate synthase qui permet la biosynthèse de folate, étape inhibée par les sulfamides.
II- L’établissement de l’infection par S. typhimurium
Après pénétration de S. typhimurium dans l’organisme par voie orale, la bactérie transite par
l’estomac et par la lumière intestinale. Suivant l’hôte infecté, les voies de dissémination au
travers de l’intestin ainsi que les symptômes associés à l’infection diffèrent.
1- La maladie déclenchée chez l’homme : la gastroentérite
6
Introduction S. typhimurium
Salmonella
Lumen
Pénétration
Diarrhée
Phase aiguë
Sécrétion d’eaux et d’électrolytes
Adhérence
Cellules épithéliales
intestinales
Lamina propria
Multiplication
Digestion lysosomale
Dissémination
Invasion des tissus
systémique
profonds
Phase
Phagocytose par des
systémique
neutrophiles et des macrophages
Figure 3 : Représentation schématique de la barrière épithéliale intestinale et de la voie d’entrée
de S. typhimurium au travers des entérocytes (adapté du livre Medical Microbiology, 4ème édition)
S. typhimurium a la capacité d’adhérer au niveau de l’épithélium intestinal. Cette adhésion peut
entraîner une destruction des cellules en surface ainsi que la sécrétion d’eau et d’électrolytes. La phase
aiguë de l’infection est alors déclarée, elle est caractérisée par de la fièvre et des diarrhées.
S. typhimurium a également la capacité de traverser les entérocytes. A l’intérieur de ceux-ci, la bactérie
va pouvoir se multiplier. Dans la lamina propria, la bactérie est phagocytée par des neutrophiles et des
macrophages et va pouvoir disséminer dans tout l’organisme. Il s’agit de la phase systémique de
l’infection.
Introduction S. typhimurium
Chez l’homme, S. typhimurium déclenche une infection localisée au niveau de l’intestin
appelée entérite. Après adhésion à la bordure en brosse qui constitue la membrane plasmique
des cellules épithéliales intestinales, S. typhimurium provoque la rupture des microvillosités et
envahit les entérocytes dans lesquels elle prolifère. Les entérocytes endommagés sont alors
remplacés par des cellules immatures (Fig. 3). Les fonctions d’absorption de l’intestin s’en
trouvent altérées. S. typhimurium sécrète, de plus, une entérotoxine cytotonique qui perturbe
la sécrétion d’eau et d’électrolytes. Les symptômes fréquemment déclenchés lors de
gastroentérite à Salmonella sont la fièvre, les nausées, les crampes abdominales, les
vomissements et les diarrhées.
2- La maladie déclenchée chez la souris : la fièvre typhoïde
Chez la souris, S. typhimurium est capable de franchir la barrière intestinale sans créer de
lésion. Elle envahit la muqueuse intestinale et se multiplie à l’intérieur de phagocytes présents
dans le tissu lymphoïde associé à l’intestin. Puis, elle est disséminée dans l’organisme à l’aide
de ces mêmes phagocytes et colonise les organes lymphoïdes secondaires tels que la rate et le
foie où elle prolifère à l’intérieur des différentes populations cellulaires retrouvées dans ces
organes, notamment les macrophages (Fig. 3). Dans les cas de chronicité, la bactérie est
retrouvée dans la vésicule biliaire ou dans la moelle osseuse.
En 1892, Loeffler observe la maladie déclenchée par S. typhimurium chez la souris. Il conclut
que les symptômes déclenchés se rapprochent de ceux de la fièvre typhoïde causée par S.
typhi chez l’homme dont l'évolution est habituellement grave voire mortelle (Loeffler, 1892).
Ainsi, l’interaction entre la souris et S. typhimurium devient un modèle d’étude pour
comprendre les déterminants moléculaires mis en place lors de la fièvre typhoïde aussi bien
du côté de l’hôte que du côté de la bactérie.
III- Les mécanismes de défenses de l’organisme hôte
Lors d’une contamination par S. typhimurium, les mécanismes de défense de l’organisme hôte
sont primordiaux pour contrôler la progression de l’infection. Dans ce chapitre, nous allons
aborder certains mécanismes de défense présents chez l’homme ou chez la souris. Nous nous
intéresserons d’abord aux barrières naturelles rencontrées dans l’estomac et dans l’intestin.
Puis, nous présenterons la réponse développée par une cellule immunitaire, le macrophage,
suite à la phagocytose d’un organisme étranger.
7
Introduction S. typhimurium
1- Deux barrières naturelles à l’invasion bactérienne : l’estomac et l’intestin
Après pénétration dans l’organisme, le premier obstacle rencontré par les bactéries
entéropathogènes est le pH acide de l’estomac. La présence d’acide chlorhydrique sécrété par
les cellules pariétales ou oxyntiques entraîne une acidification de l’environnement, le pH
résiduel se situe aux alentours de 1∼2. La majorité des microorganismes est incapable de
survivre dans ces conditions. L’estomac représente ainsi une barrière efficace pour lutter
contre de nombreuses infections.
L’intestin accomplit des fonctions essentielles telles que la digestion, le transport des
nutriments, le transport de l’eau… Il forme également une barrière efficace pour lutter contre
l’invasion et la dissémination des microorganismes commensaux ou pathogènes. Les
mécanismes de résistance mis en place par l’intestin sont nombreux et complexes. Nous
aborderons quelques exemples illustrant la diversité de ces mécanismes.
Les cellules du foie déversent en continue de la bile dans l’intestin. Elle est constituée
principalement de sels biliaires, de cholestérol et de bilirubine. La bile est un détergent
pouvant agir sur les lipides et notamment sur les membranes biologiques. De plus, les sels
biliaires entraînent une modification de la pression osmotique pouvant ainsi altérer le
repliement des protéines bactériennes de membranes externes ou périplasmiques.
L’intestin est également « tapissé » par un nombre important de microorganismes composant
la microflore. Cette microflore restreint de façon passive la croissance des bactéries
pathogènes, notamment en entrant en compétition pour la biodisponibilité des nutriments
(Stecher et al., 2008). De plus, elle libère des sous-produits de l’activité métabolique tels que
le propionate ou le butyrate qui peuvent être délétères pour la survie des autres bactéries
(Scheppach et al., 1992).
Un troisième exemple de mécanisme de défense mis en place dans l’intestin est illustré par la
production de peptides antimicrobiens cationiques (CAMP) par les cellules épithéliales de
l’intestin. Les CAMP sont des composés centraux de l’immunité innée produits par les
mammifères, oiseaux, insectes et plantes pour se protéger des infections bactériennes (Bals et
al., 2003). Ils sont retrouvés sur de nombreuses muqueuses telles que l’épithélium respiratoire
ou le tractus intestinal. Ils sont également retrouvés dans des cellules immunitaires où ils
représentent le mécanisme d’élimination bactérienne le plus efficace après la réponse
oxydative (Hancock et al., 2000; Canny et al., 2002). Ils agissent selon de nombreuses
8
Introduction S. typhimurium
Peptides antimicrobiens
Figure 4 : Modèle des mécanismes d’interactions des peptides antimicrobiens avec la membrane
interne bactérienne (adapté de Papo et al., 2003)
Les peptides antimicrobiens produits par les muqueuses et par certaines cellules immunitaires agissent
notamment en perturbant la membrane interne des bactéries. Il existe 4 mécanismes majeurs
d’interaction entre les peptides et les membranes.
(A) Les peptides antimicrobiens s’alignent parallèlement à la membrane interne des bactéries sans
perturber la structure membranaire
(B) Les peptides antimicrobiens s’alignent parallèlement à la membrane interne mais perturbent la
structure membranaire
(C) Les peptides antimicrobiens s’alignent parallèlement à la membrane interne mais perturbent la
structure membranaire et s’y insèrent en formant des pores
(D) Les peptides antimicrobiens s’insèrent profondément dans la membrane et forment des pores
transmembranaires.
Introduction S. typhimurium
stratégies soit en perméabilisant la membrane interne et externe des bactéries (notamment en
interagissant avec le lipide A du LPS) (Fig. 4), soit en inhibant la production du
peptidoglycane ou soit en modulant plusieurs fonctions intracellulaires bactériennes (Hancock
et al., 2000).
Un dernier exemple de mécanisme de défense présent dans l’intestin est le système
immunitaire associé aux muqueuses intestinales. Pour lutter contre l’invasion des bactéries
entéropathogènes, la muqueuse intestinale est drapée par un tissu lymphoïde qui se divise en
trois parties (Fig. 5) :
-
les plaques de Peyer et nodules lymphoïdes isolés : dans cette partie de l’intestin
sont localisées les cellules M (microfold), qui sont spécialisées dans le transport
d’antigène d’un côté à l’autre de l’intestin. L’antigène est transporté par un
mécanisme de pinocytose qui est un processus non spécifique d’endocytose
cellulaire de petites entités telles que les bactéries
-
les ganglions mésentériques lymphoïdes qui sont des carrefours de la circulation
lymphoïde
-
le tissu lymphoïde diffus de la lamina propria qui permet le drainage des cellules
immunitaires chargées de bactéries vers les ganglions mésentériques
2- Les mécanismes de défense développés par le macrophage
Les macrophages sont des cellules de l’immunité innée dont le rôle est de détruire des
éléments étrangers ayant pénétré dans l’organisme. Pour cela, plusieurs stratégies sont mises
en place : la formation d’une vésicule digestive, la production de peptides antimicrobiens
cationiques, la production de formes actives de l’oxygène et de l’azote ou encore
l’appauvrissement du cytosol eucaryote en nutriments.
a. La fusion endolysosomale et la formation du phagolysosome
La reconnaissance des éléments étrangers se fait grâce à la présence de récepteurs localisés à
la membrane du macrophage. Ces récepteurs interagissent avec certaines structures
spécifiques des composants procaryotes. Une des familles de récepteurs les plus étudiées est
la famille des Toll Like Receptor (TLR), comme par exemple le LPS receptor TLR-4/MD-2
qui est capable de reconnaitre le lipopolysaccharide (LPS). L’interaction des TLR avec des
composants procaryotes déclenche l’activation immunologique du macrophage et le mise en
9
Introduction S. typhimurium
Figure 5 : Schéma représentant les muqueuses intestinales et le système immunitaire afférant
Le tissu lymphoïde intestinal se divise en trois parties : les plaques de Peyer et follicules lymphoïdes
isolés, les nœuds mésentériques lymphatiques, le tissu lymphoïde diffus de la lamina propria.
Au niveau des plaques de Peyer, les cellules M sont chargées de la capture des antigènes. Par la
suite, ces antigènes sont acheminés vers les nœuds lymphatiques mésentériques. Les phagocytes
présents dans le tissu de la lamina propria s’acheminent également vers les nœuds mésentériques où
ils présentent leur antigène de surface aux cellules immunitaires spécialisées.
Introduction S. typhimurium
place de réponses inflammatoires (Blander et al., 2004; Miller et al., 2005). Ce phénomène se
caractérise par la production de cytokines, molécules « signal » qui permettent l’amélioration
des capacités bactéricides, dégradatives et sécrétoires du macrophage.
Ainsi, après reconnaissance de la bactérie par le macrophage, ce dernier déclenche la
phagocytose (Fig. 6) (Flannagan et al., 2009). Classiquement, ce processus permet la capture
et la dégradation de l’élément étranger. Il s’agit d’un mécanisme séquentiel au cours duquel la
bactérie internalisée est logée au sein d’une vacuole appelée phagosome. Le phagosome va
subir une série de transformations qui résulte de son interaction avec les vésicules de la voie
d’endocytose. Différentes étapes de maturation sont reconnues, phagosome précoce,
phagosome intermédiaire et phagosome tardif, qui correspond à la formation du
phagolysosome, stade d’évolution ultime. Durant sa maturation, le phagosome se charge en
enzymes lytiques (plus de 40 enzymes sont retrouvées dans le phagosome) et subit une
acidification progressive causée par la présence d’une ATPase vacuolaire qui pompe les
protons et les délivre dans la lumière du phagosome (Flannagan et al., 2009).
Après destruction de la bactérie, le macrophage présente à sa surface les antigènes bactériens
qui seront reconnus spécifiquement par des cellules de l’immunité acquise.
b. Les peptides antimicrobiens cationiques (CAMP)
En plus des enzymes lytiques, le macrophage synthétise des peptides antimicrobiens
cationiques tels que le lysozyme et les peptides antimicrobiens reliés aux cathélicidines
(CRAMP) (Rosenberger et al., 2004). Les lysozymes ont la particularité de reconnaître et de
cliver les liaisons osidiques β1-4 entre les dimères de N-Acétyl-glucosamine et de N-Acétylmurique composant le peptidoglycane (Sharon, 1967). La paroi bactérienne est alors dégradée
et les bactéries deviennent sensibles à de nombreux stress, comme par exemple le stress
osmotique.
Les CRAMP sont des peptides cationiques structurés en hélice alpha et qui ont une activité
antimicrobienne ciblée à la fois vers les bactéries à Gram + et vers les bactéries à Gram (Zaiou et al., 2002). Chez S. typhimurium, ces protéines empêchent la division cellulaire
bactérienne induisant ainsi la filamentation de la bactérie et sa mort.
c. La Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate (NADPH) phagocyte
oxydase
10
Introduction S. typhimurium
Figure 6 : Modèle des différentes étapes aboutissant à la phagocytose d’une bactérie
La phagocytose est initiée après contact avec un élément étranger, comme par exemple une bactérie. Des
pseudopodes se forment au niveau de la membrane eucaryote et permettent l’internalisation de la
bactérie. Cette dernière se retrouve dans une vésicule de phagocytose qui fusionne avec d’autres
vésicules contenant des enzymes lytiques (1) et (2). Le phagosome mature en phagolysosome dans
lequel la bactérie est décomposée par des hydrolases lysosomales.
Introduction S. typhimurium
Le « burst oxydatif » constitue une des stratégies bactéricides les plus efficaces. La notion de
« burst oxydatif » a été évoquée pour la première fois en 1933 par Baldridge et Gerard. Il fut
dénommé ainsi en raison de la grande quantité d’oxygène consommée après ingestion d’un
microorganisme par la cellule phagocytaire.
Le burst oxydatif se caractérise par la production d’importantes quantités d’anion superoxyde
(O2.-) suite à l’activation du macrophage. Ce phénomène de respiration non mitochondrial est
catalysé par la NADPH phagocyte oxydase (Babior, 1999; Segal, 2005; Cross et al., 2004).
La NADPH phagocyte oxydase est une enzyme multimérique composée de deux protéines
membranaires, gp91-Phox et p22-Phox, qui constituent le flavocytochrome b558
hétérodimérique, et de trois protéines cytosoliques, p47-Phox, p67-Phox et Rac (Babior et al.,
2002; Vignais, 2002). Un composant cytosolique non essentiel supplémentaire, p40-Phox,
semble avoir un rôle régulateur.
Après activation du macrophage suite à la phagocytose d’une particule étrangère, les sousunités membranaires s’associent à la membrane de la vésicule d’endocytose et sont bientôt
rejointes par les trois sous-unités cytosoliques afin de reconstituer la NADPH phagocyte
oxydase. Cette enzyme catalyse la réduction univalente d’oxygène moléculaire par des
électrons provenant du NADPH pour former de l’anion superoxyde directement dans la
lumière de la vésicule de phagocytose (Fig. 7). L’anion superoxyde est une espèce chargée et
ne peut donc pas traverser les membranes de façon passive. Deux possibilités s’offrent à lui
pour pénétrer dans la bactérie :
-
soit via des porines spécifiques des solutés anioniques. Il se retrouve alors dans
le périplasme bactérien où il pourra (i) oxyder certaines macromolécules périplasmiques
(Golubeva et al., 2006), ou (ii) être dismuté en peroxyde d’hydrogène par les superoxyde
dismutases périplasmiques de S. typhimurium
-
soit par une dismutation spontanée de l’anion superoxyde en peroxyde
d’hydrogène directement dans l’espace vacuolaire
La production d’anion superoxyde a lieu majoritairement durant les 4 premières heures de
l’infection.
Les cytokines proinflammatoires, telles que le TNFα (Tumor Necrosis Factor), l’IFNγ
(Interféron γ) et le facteur GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor)
stimulent l’activité de la NADPH phagocyte oxydase. Certains facteurs procaryotes comme le
11
Introduction S. typhimurium
NADPH
gp91-PHOX
NADP+
p40-PHOX
Activation
p67-PHOX
Rac1/2GTP
p47-PHOX
p22-PHOX
O2
O2.-
Figure 7 : Modèle d’activation de la NADPH phagocyte oxydase (El-Benna et al., 2008)
Lorsque le macrophage est inactif, seules les sous-unités gp91-Phox et p22-Phox sont localisées à la
membrane. Suite à l’activation du macrophage, les sous-unités cytosoliques p67-Phox, p47-Phox et
p40-Phox s’assemblent au niveau des deux sous-unités membranaires pour former la NADPH
phagocyte oxydase. En présence de NADPH et d’O2, cette enzyme synthétise de l’anion superoxyde et
du NADP+ directement dans la vésicule de phagocytose.
Introduction S. typhimurium
LPS peuvent également activer la transcription de gènes qui codent pour les composants de
l’oxydase (Cassatella et al., 1990).
La maladie granulomateuse chronique (CDG) illustre l’importance de la NAPDH phagocyte
oxydase dans le contrôle de la prolifération des bactéries pathogènes intracellulaires. Il s’agit
d’un syndrome d’immunodéficience causé par l’inactivation du système NADPH phagocyte
oxydase (Roos et al., 1992). La CGD est une maladie héréditaire qui résulte du
dysfonctionnement d’au moins 4 gènes : gp91-Phox, p22-Phox, p47-Phox ou p67-Phox. Une
CGD se caractérise par des infections récurrentes de champignons ou de bactéries associées à
une absence de burst oxydatif. S. typhimurium est la seconde cause d’infection bactérienne
dans les cas de CDG, soulignant ainsi le rôle essentiel de la NADPH phagocyte oxydase dans
la résistance de l’hôte contre S. typhimurium.
L’importance de la NADPH phagocyte oxydase a également été démontrée au cours d’une
étude réalisée sur des souris déficientes pour cette enzyme (Vazquez et al., 2000). Dans cette
étude, les auteurs ont montré que des souris dépourvues de NADPH phagocyte oxydase
devenaient plus sensibles à l’infection systémique de S. typhimurium et que cette sensibilité
était liée à un défaut dans l’activité bactéricide des macrophages (Fig. 8). La même équipe a
montré que l’activité bactéricide de macrophages dérivés du péritoine murin était une
propriété dépendante de la présence de la NADPH phagocyte oxydase (Vazquez et al., 2001).
d. L’oxyde nitrique synthase inductible
L’oxyde nitrique synthase inductible (NO. synthase inductible) est une enzyme eucaryote
également impliquée dans le contrôle de la réplication bactérienne dans le macrophage. Elle
catalyse l’oxydation de la L-arginine en oxyde nitrique (NO.). De façon similaire à la NADPH
phagocyte oxydase, cette hémoprotéine dimérique utilise l’oxygène moléculaire et les
électrons fournis par le NADPH pour produire du NO. (Nathan et al., 1994; Stuehr et al.,
1992).
Il existe trois isoformes de NO. synthases : la NO. synthase endothéliale, la NO. synthase
neuronale et la NO. synthase inductible. La NO. synthase inductible est localisée dans le
macrophage et associée, la plupart du temps, à des activités antibactériennes (Cherayil et al.,
2001).
12
Introduction S. typhimurium
Figure 8 : Expérience de survie de S. typhimurium dans des macrophages péritonéaux (VazquezTorres et al., 2000)
La survie de S. typhimurium a été étudiée dans des macrophages péritonéaux de fonds génétiques
différents issus de souris C5BL/6. Dans des macrophages sauvages, S. typhimurium est totalement
éliminée au bout de 15 heures d’infection (courbe bleue). Dans des macrophages dépourvus de NAPDH
phagocyte oxydase (phox KO), S. typhimurium n’est pas éliminée mais n’est pas capable de proliférer.
Dans des macrophages dépourvus de NO. synthase inductible (iNOS KO), S. typhimurium est éliminée
durant les premiers temps de l’infection puis commence à proliférer dans les temps tardifs de
l’infection. Enfin, dans des macrophages dépourvus des deux enzymes (iNOS KO/phox KO), S.
typhimurium n’est plus éliminée et commence à proliférer après 5 heures d’infection.
Ces résultats indiquent que la NADPH phagocyte oxydase est responsable de l’élimination de la
bactérie dans les temps précoces de l’infection, et que la NO. synthase inductible contrôle la
prolifération de la bactérie durant les temps tardifs de l’infection.
Introduction S. typhimurium
L’expression de la NO. synthase inductible est régulée au niveau transcriptionnel et peut être
stimulée après interaction avec des composés procaryotes ou en réponse à des cytokines (Il-1,
TNFα, IFNγ) (Muhl et al., 1999).
Plusieurs études ont renforcé l’hypothèse d’un rôle antimicrobien pour la NO. synthase
inductible dans les macrophages :
-
certaines souches de S. typhimurium atténuées dans leur pouvoir infectieux
redeviennent virulentes dans des souris dépourvues de NO. synthase inductible (De
Groote et al., 1995; De Groote et al., 1996; Fang, 1997; Lundberg et al., 1999)
-
des souris dépourvues de NO. synthase inductible sont beaucoup plus sensibles lors
d’une infection par S. typhimurium (Vazquez-Torres et al., 2000; Mastroeni et al.,
2000; Shiloh, 1999)
-
des formes actives de l’oxyde nitrique (FAN) telles que le S-nitrosogluthation, le
NO2, le NaNO2 ou encore le peroxynitrite ont une activité bactéricide sur S.
typhimurium in vitro (De Groote et al., 1997; De Groote et al., 1995; Saito et al.,
1991; Chen et al., 1998)
A la différence de la NAPDH phagocyte oxydase membranaire, la NO. synthase inductible est
une enzyme cytosolique. L’oxyde nitrique est donc produit directement dans le cytosol
eucaryote. Etant non chargé, il a la capacité de traverser toutes les membranes biologiques.
e. Synergie d’action entre la NADPH phagocyte oxydase et la NO.
synthase inductible
L’orchestration de la NADPH phagocyte oxydase et de la NO. synthase inductible peut être
résumée de la façon suivante : dans les premiers temps de l’infection, la NADPH phagocyte
oxydase est activée et produit de l’anion superoxyde, qui évolue rapidement vers d’autres
Formes Actives de l’Oxygène (FAO). Cette enzyme contribue ainsi au contrôle de la
prolifération bactérienne dans les temps précoces de l’infection. Ensuite, la NO. synthase
inductible est activée. Elle produit du NO. qui évolue également en d’autres espèces, limitant
ainsi la prolifération des bactéries qui auraient survécu à la première enzyme (Vazquez-Torres
et al., 2000) (Fig. 9).
L’anion superoxyde et l’oxyde nitrique peuvent agir selon deux voies. Ils peuvent soit agir
directement en endommageant les macromolécules biologiques de la bactérie présente dans le
phagosome, soit indirectement en évoluant vers d’autres formes plus nocives. Ainsi, l’anion
13
Introduction S. typhimurium
(A)
(B)
Figure 9 : Modèle pour l’action séquentielle de la NADPH phagocyte oxydase et de la NO. synthase
inductible (Vazquez-Torres et al., 2001)
Dans ce modèle, la NADPH phagocyte oxydase produit de l’anion superoxyde dans la lumière d’une
vésicule (A) qui se dismute spontanément en H2O2. L’H2O2 est une forme active de l’oxygène qui est
diffusible, elle atteint le cytoplasme bactérien où elle se combine avec le fer ferreux pour former le radical
hydroxyle ou le radical FeO.. Cette étape se déroule durant les temps précoces de l’infection.
(B) Après le burst oxydatif, la NO. synthase inductible produit du NO. à partir d’arginine et d’oxygène
moléculaire dans le cytosol du macrophage. Le NO. est un composé diffusible, il atteint le cytoplasme
bactérien. L’autooxydation du NO. aboutit à la production d’un oxydant puissant le NO2 ou d’un composé
nitrosylant, le N2O3. En présence de fer et de groupement thiols (RSH), des S-nitrosothiols et des
complexes dinitrosyl/fer (DNIC) peuvent être formés à partir du NO.. Le NO., le NO2 , le N2O3, les Snitrosothiols et les DNIC contribuent à l’inhibition de la réplication bactérienne.
Abbréviation : DNIC : Dinitrosyl Iron Complex
Introduction S. typhimurium
superoxyde peut être dismuté en péroxyde d’hydrogène qui est lui-même précurseur de
radical hydroxyle, composé oxydant puissant. L’oxyde nitrique peut évoluer vers le dioxyde
d’azote, ou vers les formes nitrate et nitrite. L’action de ces FAO et FAN seront abordées
dans le chapitre dédié au stress oxydant.
La NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible peuvent-elles avoir une action
coordonnée ? Des études ont montré que dans des macrophages dépourvus de NADPH
phagocyte oxydase, la production de NO. était augmentée (Vazquez-Torres et al., 2001). De
manière complémentaire, ils ont mis en évidence que des macrophages dépourvus de NO.
synthase inductible produisaient plus d’anion superoxyde et de peroxyde d’hydrogène. Ces
résultats indiquent que les FAO et FAN sont capables d’interagir, suggérant donc une
synergie entre la NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible. Pourtant, la
production de FAO et de FAN semble séparée dans le temps, avec la production de formes
actives de l’oxygène durant les temps précoces de l’infection et de formes actives de l’azote
durant les temps tardifs (Mastroeni et al., 2000; Vazquez-Torres et al., 1996) (Fig. 9).
Afin d’expliquer ces résultats, la production de peroxynitrite a été particulièrement étudiée.
Cette forme active de l’azote résulte de la combinaison entre l’anion superoxyde et l’oxyde
nitrique. Le peroxynitrite possède de fortes activités antibactériennes (De Groote et al., 1995;
Vazquez-Torres et al., 1996; Brunelli et al, 1995). La question de sa présence dans la vacuole
contenant Salmonella est un sujet de débat. Il semblerait que le peroxynitrite soit produit dans
le macrophage mais non retrouvé dans la bactérie (Vazquez-Torres et al., 2000)
f. Autres enzymes impliquées dans la production de FAO
La myéloperoxydase (MPO) est une protéine hémique tétramérique associée aux granules des
phagocytes. Cette enzyme représente 5% du poids sec des neutrophiles (Pham et al., 2003) et
une proportion plus faible chez les monocytes. La MPO n’est pas produite par les
macrophages issus de lignées cellulaires mais semble être présente dans certains macrophages
issus de lignées primaires (Daugherty et al., 1994). Elle est capable de générer divers
oxydants tels que le peroxyde d’hydrogène, le nitrite et l’acide hypochloreux. L’activité
antibactérienne de la MPO n’a jamais été clairement établie dans les macrophages murins. En
effet, contrairement à la CDG, une déficience en MPO n’est pas associée à phénotype de
sensibilité du système immunitaire. Enfin, la NADPH phagocyte oxydase ne nécessite pas la
présence de la MPO pour son action antimicrobienne (Daugherty et al., 1994).
14
Introduction S. typhimurium
La xanthine oxydase (XO) est une molybdo-enzyme qui peut générer des FAO grâce au
processus de dégradation de l’hypoxanthine ou de la xanthine en acide urique. La production
de XO en réponse aux cytokines proinflammatoires (Vorbach et al., 2003) ainsi qu’une
amélioration de la réplication microbienne dans des phagocytes ou des souris infectées après
administration d’inhibiteur de la XO laissent suggérer une rôle important joué par la XO dans
l’immunité innée (Takao et al., 1996; Umezawa et al., 1997).
g. La protéine Slc11a1
La protéine Slc11a1, aussi dénommée NRAMP1, est une protéine du macrophage impliquée
dans la résistance naturelle de la cellule à l’infection bactérienne. Slc11a1 influence
l’expression de la réponse immunitaire antimicrobienne de la cellule (Blackwell et al., 2003).
Elle est capable de limiter l’accès de la bactérie au fer cellulaire en réduisant les taux de fer
dans la vacuole dans laquelle est retrouvée la bactérie (Nairz et al., 2009). Ce métal joue un
rôle central dans l’interaction entre hôte et pathogène. Sa disponibilité est donc un critère
déterminant pour la survie de la bactérie dans le macrophage.
IV- Les facteurs de virulence de S. typhimurium
S. typhimurium est une bactérie enteropathogène intracellulaire facultative. Cela signifie
qu’elle a la capacité de franchir la barrière intestinale et qu’elle peut survivre à l’intérieur des
cellules hôte. Ces propriétés lui sont conférées par différents facteurs de virulence, dont les
principaux sont détaillés dans le chapitre à suivre.
1- Les systèmes de sécrétion de type III de S. typhimurium
Les facteurs de virulence majeurs de S. typhimurium sont deux systèmes de sécrétion de type
III (SSTT). La fonction principale des systèmes de sécrétion est de délivrer des protéines
procaryotes directement dans le cytosol eucaryote. Le premier système de sécrétion de type
III est localisé sur l’îlot de pathogénicité 1 (SPI-1) et le second système sur l’îlot de
pathogénicité 2 (SPI-2) du chromosome bactérien. Ils présentent de grandes similarités de
structure avec l’appareil flagellaire. Ces deux systèmes de sécrétion interviennent à des phases
distinctes du cycle infectieux de S. typhimurium.
a. Le système de sécrétion de type 3 codé sur l’îlot de pathogénicité 1
15
Introduction S. typhimurium
(A)
(B)
Figure 10 : Microscopie électronique et reconsitution de la structure de l’appareil de sécrétion de
type 3 (Galān et Zhou, 2000; Moraes et al., 2008 )
(A) Microscopie électronique de l’appareil de sécrétion de type 3 purifié.
(B) Architecture globale du système de sécrétion de type 3 réalisée à partir de cristaux. Le système de
sécrétion est composé du stator qui est inséré dans la membrane interne, de la sécrétine qui est
insérée dans le peptidoglycane et la membrane externe et enfin de l’aiguille qui traverse la
membrane de la cellule hôte.
Introduction S. typhimurium
Le SSTT SPI-1 a été découvert au cours d’une étude portant sur l’identification des gènes de
S. typhimurium impliqués dans la pénétration de bactéries à l’intérieur de cellules non
phagocytaires (Galān et Curtiss, 1989). L’îlot de pathogénicité 1 (SPI-1) est localisé au
centisome 63 du chromosome de S. typhimurium (Galān, 1999). Cet îlot code pour les
composants structuraux, pour les protéines effectrices sécrétées (effecteurs), pour les
chaperons des effecteurs et pour les protéines régulatrices d’un appareil de sécrétion de type 3
(SSTT) (Mills et al., 1995). Certains effecteurs sont également retrouvés à l’extérieur du SPI1, isolés sur des régions chromosomiques. Les protéines de structure s’assemblent pour
former un complexe ressemblant à une seringue, appelé injectisome et qui constitue l’élément
au travers duquel les effecteurs sont sécrétés (Fig. 10). Cette structure multiprotéique traverse
les membranes internes et externes bactériennes ainsi que la membrane de la cellule hôte
(Kubori et al., 1998).
Rôle du système de sécrétion SPI-1
Ce système de sécrétion est nécessaire pour initier la phase d’infection intestinale. Il permet à
S. typhimurium de traverser les cellules épithéliales. Les effecteurs bactériens sont adressés
vers le cytosol eucaryote et déclenchent une réorganisation du cytosquelette de la cellule
épithéliale. Les filaments d’actine se réarrangent et entraînent une invagination de la
membrane eucaryote. Celle-ci forme alors des « pseudopodes » qui permettent à la bactérie de
pénétrer dans la cellule, ce mécanisme d’entrée est appelé « Trigger » par opposition au
mécanisme « Zipper » qui est un phénomène de pinocytose déclenché par certaines bactéries
ne nécessitant pas de système de sécrétion de type III (Takeuchi, 1967). Il s’en suit la
formation d’une poche macropinocytique composée de la membrane de la cellule épithéliale,
S. typhimurium se retrouvant alors insérée à l’intérieur d’un compartiment cellulaire appelé
Salmonella Containing Vacuole (SCV) (Fig. 11 et 12).
Activation du système de sécrétion SPI-1
En plus des gènes impliqués dans la structure de l’injectisome ou de ceux codant pour les
effecteurs ou les chaperons, SPI-1 contient également des gènes codant pour des protéines
régulatrices de son expression (Fig. 13). Ces régulateurs sont impliqués dans l’activation du
système de sécrétion en contrôlant des gènes sur l’îlot de pathogénicité et à l’extérieur de
celui-ci. HilA (Hyper invasive locus A) est le régulateur central du système de sécrétion. Il est
16
Introduction S. typhimurium
Figure 11 : Microscopie électronique d’un évènement de macropinocytose de Shigella flexneri par
une cellule épithéliale (Roger Wepf, Philippe Sansonetti et Ariel Blocker,
http://www.bristol.ac.uk/cellmolmed/research/blocker-group.html)
Shigella flexneri est internalisée par une cellule épithéliale. Ce phénomène est commun à celui réalisé
par les entérocytes suite au contact de S. typhimurium (« Trigger mechanism »). La membrane
eucaryote s’invagine suite à une réorganisation du cytosquelette, les pseudopodes apparaissent. Ils
permettent ensuite l’internalisation de la bactérie dans le cytosol eucaryote.
Figure 12 : Microscopie électronique colorée de changements morphologiques subis par les cellules
épithéliales après contact avec S. typhimurium
(http://www.med.yale.edu/micropath/galan/Pages/galan_overview.html)
Des cellules épithéliales en culture internalisent S. typhimurium (en vert). Les cellules réarrangent leur
surface au niveau des points de contact avec les bactéries. Ces réarrangements sont causés par une
réorganisation du cytosquelette de la cellule hôte et initiés par les effecteurs de S. typhimurium pour
permettre l’entrée de la bactérie dans la cellule.
Introduction S. typhimurium
un membre de la famille ToxR/OmpR et active les opérons inv/spa et prg/org qui codent pour
les composants structuraux de l’appareil de sécrétion (Bajaj et al., 1995; Darwin et al., 1999;
Eichelberg et al., 1999; Lostroh et al., 2000) (Fig. 14). En plus de son rôle direct dans la
régulation des gènes de SPI-1, HilA est également l’activateur d’un second régulateur
transcriptionnel, InvF. Ce régulateur fait partie de la famille AraC et induit également
l’expression des effecteurs localisés sur l’opéron sic ainsi que des gènes isolés sur le génome,
sopE et sigD, qui codent également pour des effecteurs (Darwin et al., 1999; Kaniga et al.,
1994). L’expression de hilA est elle-même régulée par deux autres activateurs
transcriptionnels, HilC et HilD.
Les facteurs physicochimiques déclenchant l’activation du
SSTT SPI-1
Les facteurs physicochimiques participent également à la régulation du SSTT SPI-1. Il a été
montré que la tension en oxygène était un régulateur clé de l’expression des gènes d’invasion.
En effet, les gènes codés par SPI-1 sont exprimés en présence de faibles pressions en oxygène
à travers HilA (Jones et al., 1994; Bajaj et al., 1996). L’osmolarité est également un signal
probable déclenchant l’invasion. A partir de 300 Osm, l’expression de hilA est induite et
cause des changements dans la structure de l’ADN, affectant ainsi la transcription des gènes
d’invasion (Galan et al., 1990; Bajaj et al., 1996). Le pH neutre est un autre signal d’invasion
qui permet l’activation de l’expression de hilA (Bajaj et al., 1996). Enfin, des acides
organiques spécifiques affectent aussi la régulation des gènes d’invasion (Lawhon et al.,
2002).
Un parallèle pourrait être fait entre ces facteurs et les conditions environnementales de
l’intestin, lieu du déclenchement de la phase d’invasion. En effet, il a été montré que la
lumière intestinale était en microaérobiose, que la pression osmotique y était très forte, que le
pH était neutre, et enfin que des acides organiques étaient sécrétés par la microflore
intestinale.
b. Le système de sécrétion de type 3 codé sur l’îlot de pathogénicité 2
S. typhimurium possède un autre système de sécrétion de type 3, localisé au niveau du
centisome 30, appelé l’îlot de pathogénicité 2 (SPI-2) (Hensel et al., 1998). Ce système est
structuralement proche du 1er système de sécrétion. Il ressemble également à un
17
Introduction S. typhimurium
Composants de l’appareil de sécrétion de type III
Chaperonnes ou translocases
Effecteurs sécrétés
Régulateurs transcriptionnels
Figure 13 : Représentation schématique de l’organisation de l’îlot de pathogénicité 1 de S.
typhimurium (Lostroh et al., 2001)
En bleu et rayé noir sont retrouvés les gènes codant pour les composants de l’appareil de sécrétion, en
violet les chaperons ou translocases, en vert les effecteurs et en rouge les régulateurs transcriptionnels.
La longueur de chaque gène est approximativement à l’échelle. sipB et sipC sont bicolores car ils
peuvent servir simultanément de chaperons et d’effecteurs.
Figure 14 : Représentation schématique de la régulation de l’expression du système de sécrétion
de type III SPI-1 de S. typhimurium (Lostroh et al., 2001)
La régulation des différents facteurs codés sur le SPI-1 mène à la production du SSTT SPI-1. Quand
les conditions environnementales in vitro deviennent favorables pour l’expression des gènes
d’invasion, HilD déréprime le promoteur hilA. Les cercles suivis d’une ligne en pointillé indiquent les
ARNm, alors que les flèches indiquent la traduction des protéines. Le trait doublé par une flèche de
chaque côté montre que HilA active directement l’expression de gène de structure tel que prg ou de
gène de régulation tel que invF. La transcription d’invF est initiée au promoteur PinvF, elle résulte en la
production d’un long ARNm qui continue au moins jusqu’à sicA. InvF, en complexe avec SicA, active
directement l’expression d’effecteurs tels que SipB, SopE et SopB/SigD. HilD, comme indiqué par la
flèche orange, a également une légère contribution sur l’expression de invF en activant le promoteur
situé en amont du start de traduction de invF .
Introduction S. typhimurium
« injectisome », qui traverse les membranes internes et externes de la bactérie ainsi que la
membrane plasmique de la cellule hôte. Sur SPI-2 sont retrouvés des gènes codant pour la
structure et la régulation du système de sécrétion, pour les effecteurs ainsi que pour leurs
chaperons.
Rôle du système de sécrétion SPI-2
Ce second système de sécrétion est également très important puisqu’il garantit à la bactérie sa
survie et sa prolifération dans le macrophage. De façon générale, après phagocytose d’une
particule étrangère dans le macrophage, celle-ci se retrouve dans un phagolysosome où elle
est digérée 15 à 30 minutes après son entrée. S. typhimurium a évolué de façon à pouvoir
survivre et proliférer dans les macrophages. Ces capacités lui sont, en partie, conférées par ce
second système de sécrétion de type III.
A l’aide des effecteurs sécrétés SPI-2 dépendants, S. typhimurium détourne certaines
machineries du macrophage à son profit. A l’aide de la vésicule de phagocytose, elle aménage
une vacuole qui lui permet de proliférer à l’abri de l’environnement hostile du macrophage.
La formation de cette vacuole est un processus dynamique et complexe impliquant un
remodelage membranaire, des réarrangements des filaments d’actine, des mouvements de
microtubules ou encore l’extension de tubules. Au final, la bactérie se retrouve dans une
vacuole spécialisée appelée la Salmonella-Containing-Vacuole (SCV) qui la protège du
système immunitaire inné.
Au travers de l’analyse de différentes classes de mutants de gènes de SPI-2, ce système de
sécrétion a été montré important pour lutter notamment contre la fusion des endolysosomes
eucaryotes riches en enzymes lytiques avec la vésicule contenant S. typhimurium (Uchiya et
al., 1999; van der Velden et al., 2000), contre l’entrée en apoptose des macrophages qui
constitue une façon d’éliminer S. typhimurium (van der Velden et al., 2000), ou encore pour le
maintien de la vacuole bactérienne à l’aide d’un réseau de filament d’actine (Méresse et al.,
2001). Une étude publiée en 2000 par l’équipe de Ferric Fang a montré une implication du
système de sécrétion SPI-2 dans le contrôle de l’assemblage de la NADPH phagocyte oxydase
(Vazquez-Torres et al., 2000). Dans ce travail, les auteurs ont étudié les capacités de
prolifération de divers mutants de S. typhimurium dans des macrophages sauvages et
dépourvus de NADPH phagocyte oxydase (gp91-/-). Dans des macrophages sauvages, un
mutant du SSTT-2 est incapable de proliférer. Par contre, dans des macrophages gp91-/-, la
18
Introduction S. typhimurium
capacité de prolifération de ce mutant est restaurée. Les auteurs ont proposé qu’un effecteur
du SPI-2 altérerait l’assemblage de la NADPH phagocyte oxydase à la membrane de la SCV
(Vazquez-Torres et al., 2000).
De la même façon, une étude réalisée en 2002 a montré que le SSTT-2 interférait avec la NO.
synthase inductible (Chakravortty et al., 2002). Les auteurs ont effectué des expériences
d’infection de souris en utilisant comme précédemment un mutant du SSTT-2. Ils ont montré
que cette souche était altérée dans sa capacité à survivre dans des macrophages sauvages. Par
contre, en condition d’infection dans des macrophages dépourvus de NO. synthase inductible,
un mutant du SSTT-2 était toujours capable de survivre. Ainsi, ces résultats suggèrent que
l’une des stratégies mise en place par S. typhimurium consiste à agir directement sur les
enzymes responsables de la production des FAO et des FAN produites par le macrophage à
travers le SSTT-2. Cette bactérie possède pourtant un arsenal enzymatique antioxydant très
important. Une question peut alors être posée : les enzymes antioxydantes de S. typhimurium
ont-elles un rôle durant l’infection du macrophage ?
Régulation des gènes codant pour le système de sécrétion SPI-2
Parmi les régulateurs majeurs du système de sécrétion SPI-2 dépendant, on trouve SsrA/SsrB,
SlyA et PhoP/PhoQ.
SsrA/SsrB est un système de régulation à deux composants localisé sur SPI-2. SsrB est le
régulateur de réponse et SsrA, le senseur du signal (Walthers et al., 2007). Ce système à deux
composants est essentiel pour l’expression des gènes codant pour le système de sécrétion de
type III et ses effecteurs. En l’absence de ce système, S. typhimurium est incapable de
proliférer dans les macrophages et de survivre dans la souris. SsrB est capable de se fixer sur
la région promotrice de ssrA, mais cette région n’est pas librement accessible à son facteur de
transcription. En effet, des protéines contrôlant la topologie de l’ADN (H-NS, StpA, Hha,
YdgT) recouvrent la région promotrice. En l’absence de SsrB, l’expression du SSTT-2 est
réprimée par défaut d’accessibilité de l’ARN polymérase sur ses séquences cibles (Marshall et
al., 2000). En présence de SsrB, il y a une compétition avec ces répresseurs pour l’accession à
la région promotrice. SsrB entraîne donc une levée de répression de la transcription des gènes
codant pour le système de sécrétion.
SlyA est un facteur de transcription de S. typhimurium faisant partie de la famille de MarR,
famille de facteur de transcription participant à l’adaptation de la bactérie à son
19
Introduction S. typhimurium
environnement. La virulence des bactéries dépourvues du gène slyA est fortement atténuée
dans les souris, ainsi que la résistance au peroxyde d’hydrogène (Libby et al., 1994; Daniels
et al., 1996; Buchmeier et al., 1997). SlyA est une protéine de fixation à l’ADN qui montre
une forte affinité pour les régions palindromiques (Stapleton et al., 2002), notamment pour le
promoteur de ssrA (Okada et al., 2007). De la même façon que SsrB, SlyA régule l’expression
du SSTT-2 en délogeant H-NS de la région promotrice de ssrA, facilitant ainsi l’accès à
l’ARN polymérase (Ellison et al., 2006).
PhoP/PhoQ est également un système de régulation à deux composants impliqué dans la
régulation des gènes codant pour le SSTT SPI-2. PhoP, le régulateur transcriptionnel est
capable de se fixer sur le promoteur du gène ssrB (Feng et al., 2004). PhoP/PhoQ participe
également à la virulence de S. typhimurium indépendamment du SSTT-2. Cet aspect sera
abordé plus loin. Outre les facteurs protéiques, la limitation en carbone, des faibles
concentrations en ions Mg2+ ou Ca2+ et un pH acide induisent également l’expression des
gènes du SPI-2 in vitro (Deiwick et al., 1999; Beuzon et al., 1999).
c. Ilots de pathogénicité et transfert latéral de gènes
S. typhimurium possède de nombreux îlots de pathogénicité, qui ont tous été acquis grâce à un
transfert latéral de gène. Le pourcentage en GC de ces îlots est plus faible que celui des autres
régions chromosomiques de la bactérie, ce qui est une caractéristique des transferts latéraux
de gènes. Les sites d’insertion de beaucoup de ces îlots sont localisés prés de régions codantes
pour des ARN de transfert. Ces ARN de transfert sont fortement conservés dans le règne
bactérien et sont connus pour être des points d’ancrage pour l’intégration des phages tempérés
dans le génome (Hacker et Kaper, 2000). Tous les îlots de pathogénicité de S. typhimurium,
sauf exception avec le SPI-1, ont été trouvés associés avec des régions codant pour les ARN
de transfert. Par exemple, le locus du SPI-2 a été retrouvé associé avec le gène tRNAValV
(Hensel et al., 1997). L’acquisition par S. typhimurium des îlots de pathogénicité, par transfert
horizontaux de gènes, est une des résultantes de la divergence évolutive entre les bactéries E.
coli et S. typhimurium.
2- PhoP/PhoQ
Outre les systèmes de sécrétion de type 3, PhoP/PhoQ constitue également un facteur de
virulence majeur chez S. typhimurium. Il participe à l’adaptation aux environnements carencés
20
Introduction S. typhimurium
en magnésium et régule de nombreuses fonctions cellulaires chez les bactéries à Gram
négatif. Il peut agir dépendamment ou indépendamment du SSTT-2.
a. Présentation de PhoP/PhoQ
PhoP/PhoQ est constitué d’une protéine membranaire senseur PhoQ et d’une protéine
régulatrice cytoplasmique PhoP. Son activation est en partie contrôlée par la concentration en
ions Mg2+ et Ca2+ (Garcia-Vescovi et al., 1996). Ce système est activé en présence de
concentration micromolaire en Mg2+ et réprimé en présence de concentration millimolaire en
Mg2+ (Garcia-Vescovi et al., 1996; Kato et al.,1999). Hormis le Mg2+, de fortes
concentrations en Ca2+ ainsi qu’en Mn2+ peuvent réprimer le régulon phoP (Garcia-Vescovi et
al. 1996). Les peptides antimicrobiens sont également capables d’induire l’opéron
phoP/phoQ.
b. Activation par les ions Mg2+
Le senseur PhoQ possède deux segments transmembranaires, 1 boucle périplasmique et un
long domaine cytoplasmique responsable de l’autophosphorylation. Il ressent la présence
d’ions Mg2+ grâce à sa boucle périplasmique (Garcia-Vescovi et al., 1996). En présence d’une
faible concentration en ions Mg2+, PhoQ s’autophosphoryle et transfère son phosphate à
PhoP. PhoP phosphorylé fixe le promoteur des gènes constituant son régulon, il a, à la fois, un
rôle d’activateur et de répresseur transcriptionnel. Parmi les gènes activés par PhoP, phoP et
phoQ sont positivement autorégulés (Soncini et al., 1995).
c. Implication de PhoP/PhoQ dans la virulence de S. typhimurium
La régulation des gènes codant pour le système de sécrétion de
type III SPI-1
Nous avons précédemment vu que PhoP/PhoQ participait à l’activation de la transcription des
gènes codant pour le SSTT-2. En plus de ce système de sécrétion, PhoP/PhoQ régule
également le SSTT-1. Paradoxalement, la survie d’une souche exprimant constitutivement
phoP et présentant une augmentation de la transcription d’un facteur 10 des gènes activés par
PhoP est dramatiquement atténuée dans sa virulence, notamment pour les temps précoces de
l’invasion (Miller et Mekalanos, 1990). Ce phénotype peut être expliqué par le fait que PhoP
réprime l’expression de hilA, régulateur majeur de l’expression du SSTT-1 (Bajaj et al.,
21
Introduction S. typhimurium
1996). PhoP/PhoQ a également un rôle d’activateur de la transcription pour certains loci
appartenant au SSTT-1, loci importants pour l’étape d’invasion de S. typhimurium. La
transcription des gènes orgB et orgC est directement activée par PhoP en condition d’invasion
(Aguirre et al., 2006).
Résistance aux peptides antimicrobiens et modification du LPS
Les peptides antimicrobiens, retrouvés dans les cellules immunitaires, déstabilisent la
membrane interne et externe bactérienne. Le système PhoP/PhoQ est activé en présence de
faibles concentrations en peptides antimicrobiens (Bader et al., 2003). Il active un système
d’adaptation permettant à S. typhimurium de résister à l’action de ces peptides à travers le
système à deux composants, PmrA/PmrB. Il semblerait que PmrA/PmrB soit impliqué dans la
régulation d’environ 100 gènes, dont le rôle est, entre autres, de permettre la résistance aux
peptides antimicrobiens à travers la modification de composition du LPS (Gunn et al., 2008).
Certains composants sont alors greffés sur le lipide A du LPS entraînant un masquage des
groupements phosphates dont la charge positive facilite l’interaction électrostatique avec les
peptides antimicrobiens. PhoP active également la transcription de pagA, dont le rôle est aussi
de modifier chimiquement la composition du LPS dans le but d’empêcher l’interaction entre
le LPS et le peptide antimicrobien (Bishop et al., 2000).
Rôle de PhoP/PhoQ dans le contrôle de la réplication
bactérienne dans des fibroblastes
Au cours de l’infection, S. typhimurium contrôle son niveau de prolifération intracellulaire.
Cette constatation a été mise en évidence dans des fibroblastes et des cellules dendritiques,
cellules localisées à proximité de l’épithélium intestinal et proposées pour être des cellules de
transit de S. typhimurium au cours de l’infection systémique (Cano et al., 2001). PhoP/PhoQ
parait être impliqué dans le contrôle de la prolifération puisque une souche de S. typhimurium
dépourvue d’un système PhoP/PhoQ fonctionnel prolifère 20 fois plus qu’une souche sauvage
dans les mêmes conditions (Cano et al., 2001). Les auteurs de l’étude ont proposé que le
contrôle de la réplication intracellulaire permettait à S. typhimurium de rester masquée des
cellules immunitaires afin de persister dans l’organisme.
22
Introduction S. typhimurium
Régulateurs
Gènes de structure
Figure 15 : Représentation schématique de l’organisation génétique de l’opéron spv (Guiney et
al., 2005)
L’opéron spv est constitué des gènes de structure spvA, spvB, spvC, spvD et du régulateur spvR. spvR
possède ses propres signaux de transcription. Cet opéron contribue à la virulence de S. typhimurium
notamment en lui permettant de survivre dans les organes lymphoïdes secondaires.
La régulation de l’opéron spvABCD dépend de l’activateur transcriptionnel SpvR et du facteur σ
alternatif RpoS. L’expression de spvR est elle-même régulée par RpoS.
Introduction S. typhimurium
3- Le plasmide pSLT
Il existe de nombreux exemples de bactéries pathogènes pour qui les gènes localisés sur des
plasmides sont primordiaux pour l’établissement de la virulence, nous pouvons citer comme
exemples les espèces Shigella ou Yersinia. S. typhimurium ATCC 14028 possède également
un plasmide de virulence, pSLT, dont les produits des gènes participent à la pathogénèse.
a. L’opéron spv
S. typhimurium possède un plasmide de virulence de 94 kb sur lequel est retrouvée une région
conservée de 8 kb, l’opéron spv (Gulig et al., 1993). Cet opéron code pour cinq gènes,
spvABCD et spvR, qui contribuent à l’établissement de l’infection systémique de la bactérie
dans la souris (Fig. 15). Ces gènes sont requis pour l’étape précoce de l’infection dans les
cellules intestinales et pour l’étape tardive de l’infection dans les organes lymphoïdes
secondaires en modulant le taux de croissance bactérienne durant la phase systémique.
L’opéron spv possède deux régulateurs transcriptionnels, SpvR et le facteur sigma alternatif,
RpoS. SpvR active l’expression de l’opéron spv ainsi que sa propre expression (Coynault et
al., 1992). Le gène codant pour SpvR est régulé par le facteur sigma alternatif, RpoS qui peut
également activer directement l’expression de spv (Kowarz et al., 1994).
La virulence conférée par l’opéron spv est notamment due à l’action de SpvB. Cette protéine
possède une activité ADP-ribosyle transférase, essentielle pour la virulence dans le modèle
murin (Fig. 16) (Lesnick et al., 2001; Tezcan-Merdol et al., 2001). SpvB entraîne une ADPribosylation de l’actine monomérique G la rendant incapable de polymériser en filament
d’actine F. Elle agit ainsi comme une toxine intracellulaire en modifiant le niveau de
polymérisation des filaments d’actine, phénomène notamment important pour la formation
des phagolysosomes. Avec SPI-1 et SPI-2, l’opéron spv constitue le troisième exemple de
facteurs de virulence de S. typhimurium dont l’action aboutit à la modification du
cytosquelette de la cellule dans laquelle la bactérie réside (Fig. 17).
b. L’opéron pef
Le plasmide pSLT possède également un second opéron, pef, probablement impliqué dans
l’établissement de la virulence. Cet opéron code pour les composants d’un fimbriae, qui sont
des structures ancrées à la membrane plasmique bactérienne et orientées vers l’extérieur. Les
fimbriae sont notamment impliqués dans la liaison avec d’autres composants extracellulaires.
23
Introduction S. typhimurium
Actine G
Actine F
SpvB
Figure 16 : Représentation schématique du mode d’action de SpvB (Guiney et al., 2005)
spvB est codé sur l’opéron spv. SpvB agit comme une toxine au niveau du cytosquelette en
dépolymérisant l’actine. Dans le macrophage, il y a un équilibre entre les monomères d’actines G et les
filaments d’actines F polymérisés. SpvB possède un domaine ADP ribosyle transférase. Elle est capable de
se lier de façon covalente à l’ADP-ribose des monomères d’actines G empêchant leur incorporation dans
les polymères d’actine F. La conséquence est un appauvrissement de la cellule en filaments d’actines F. Le
cytosquelette est alors désorganisé.
Introduction S. typhimurium
L’implication de l’opéron pef dans la virulence de S. typhimurium n’a pas encore été établie
mais les propriétés d’adhérence des entéropathogènes sont cruciales, en effet, il a été montré
que la protéine FimH, adhésine composant les fimbriae de type I, était requise lors de
l’interaction de S. typhimurium avec les cellules dendritiques (Guo et al., 2007). Ces
dernières, localisées dans l’épithélium intestinal, sont capables de capturer S. typhimurium
dans la lumière intestinale à l’aide de leur dendrite. FimH permet une meilleure fixation et
internalisation de la bactérie à l’intérieur de la cellule dendritique.
4- Les superoxyde dismutases périplasmiques
S. typhimurium possède quatre superoxyde dismutases dont deux sont périplasmiques. Ces
dernières feront l’objet de ce paragraphe, la fonction des deux superoxyde dismutases
cytoplasmiques sera introduite dans le chapitre Stress Oxydant.
a. Présentation de SodCI et SodCII
Deux superoxyde dismutases périplasmiques sont retrouvées chez S. typhimurium, SodCI et
SodCII (Fang et al., 1999). Ces enzymes sont responsables de la dismutation de l’anion
superoxyde en peroxyde d’hydrogène (Fridovich, 1974). Elles possèdent dans leur site actif
des atomes de cuivre et de zinc permettant le passage des électrons lors de la réaction de
réduction. Pour cela, elles sont appelées des superoxyde dismutases Cu/Zn.
Le gène codant pour SodCII est localisé sur le chromosome de la bactérie. Cette enzyme est
l’orthologue de SodC d’Escherichia coli, qui est également une protéine à cuivre/zinc
périplasmique (Canvin et al., 1996). sodC2 est régulé par RpoS et l’anoxie et ne semble pas
important pour la virulence de S. typhimurium (Fang et al., 1999). SodCII participe à
l’élimination de l’anion superoxyde produit par le métabolisme bactérien dans le périplasme
(Voir section stress oxydant).
SodCI, absente chez E.coli, est codée par le bactériophage Gifsy-2 qui est impliqué dans
l’établissement de la virulence. Chez S. typhimurium, ce bactériophage a été acquis par un
transfert latéral de gène. De nombreux phages sont capables de s’intégrer dans les génomes
bactériens au niveau de régions particulières, formant ainsi des prophages. sodC1 est régulé
par PhoP/PhoQ et participe à la virulence de S. typhimurium, notamment lors de l’étape de
prolifération dans le macrophage (Golubeva et al., 2006). Les auteurs de l’étude ont suggéré
24
Introduction S. typhimurium
Lumière
intestinale
SPI1
Plaques
de Peyer
SPI2
spv
Foie et Rate
Macrophages
Figure 17 : Représentation schématique des sites d’action des systèmes de sécrétion de type trois
et du plasmide de virulence de S. typhimurium (Guiney et al., 2005)
S. typhimurium possède trois facteurs de virulence majeurs, le système de sécrétion de type trois SPI-1
(SPI1) pour l’invasion bactérienne, le système de sécrétion de type trois SPI-2 (SPI2) pour la
prolifération dans les macrophages et l’opéron spv pour l’établissement et la survie dans les organes
lointains. Dans chacun des trois cas, la bactérie remodèle le cytosquelette de la cellule à l’intérieur de
laquelle elle est localisée, la cellule épithéliale pour le SPI-1, le macrophage pour le SPI-2 et pour
l’opéron spv.
Introduction S. typhimurium
que l’importance de SodCI était liée au fait que cette enzyme protègeait une protéine
essentielle située dans le périplasme de S. typhimurium
(Golubeva et al., 2006). Cette
protéine cible serait dégradée ou inactivée par l’anion superoxyde produit par la NADPH
phagocyte oxydase.
b. Comparaisons entre SodCI et SodCII
Pourquoi seule SodCI est-elle impliquée dans la virulence de S. typhimurium ? Ces deux
protéines possèdent 60% d’identité de séquence protéique. Malgré ce fort niveau d’identité,
SodCI et SodCII n’ont pas la même implication chez S. typhimurium. Des expériences
réalisées sur l’activité enzymatique des deux protéines ne permettent pas d’expliquer cette
différence (Krishnakumar et al., 2007). Il semblerait plutôt que les propriétés structurales de
SodCI puissent expliquer ce phénomène car elles lui confèrent une grande résistance à la
dégradation par les protéases (Krishnakumar et al., 2007). En effet, SodCII est sensible à
l’action des protéases alors que SodCI y est résistante. Il a ainsi été proposé que
l’environnement vacuolaire étant riche en protéases, seule SodCI ne serait pas dégradée et
pourrait éliminer l’anion superoxyde produit par la NADPH phagocyte oxydase.
5- RpoS, le facteur sigma alternatif de la phase stationnaire
RpoS, σS ou σ38, est un facteur de régulation global au stress, présent chez toutes les γprotéobactéries. Cette protéine constitue l’une des sous-unités de l’ARN polymérase, qui est
induite en début de phase stationnaire où elle rentre en compétition avec la sous-unité sigma
70 pour l’accès à l’ARN polymérase. Chez S. typhimurium, une souche dépourvue du gène
codant pour RpoS est altérée dans sa capacité à résister à différents types de stress, à s’adapter
à la carence nutritive, et à établir la virulence (Fang et al., 1992; Norel et al., 1992; RobbeSaule et al., 1995; Nickerson et al., 1997). Même si RpoS ne peut pas être définie comme un
facteur de virulence au sens premier du terme, sa contribution est essentielle pour S.
typhimurium en condition d’infection.
a. Régulation de rpoS
La régulation de rpoS se produit au niveau transcriptionnel, post-transcriptionnel,
traductionnel et post traductionnel. RpoS est induite lors de carences en carbone, en
phosphore, en azote et en acides aminés, par une osmolarité forte, un pH acide et un choc
25
Introduction S. typhimurium
thermique (Gentry et al., 1993; Lange et al., 1994; Lange et al., 1991; Muffler et al., 1996;
Lee et al., 1995; Bearson et al., 1996). Les protéines H-NS, Fis et la protéine CRP (cAMP
Receptor Protein) participent également à la régulation de rpoS. ArcA/ArcB est un système de
régulation à deux composants régulant également rpoS. ArcA/ArcB est un régulateur global
intervenant lors du passage de la bactérie d’un environnement aérobie à un environnement
anaérobie, il intervient aussi en fonction de l’état d’oxydoréduction des quinones (Malpica et
al., 2006). ArcA/ArcB régule rpoS à un niveau transcriptionnel et post-traductionnel, soit par
fixation de ArcA sur la région promotrice de rpoS réprimant ainsi son expression, soit en
induisant la dégradation de RpoS par activation de la protéase ATP-dépendante ClpX via
RssB (Mika et al., 2005). RssB est le régulateur de réponse principal impliqué dans la
proteolyse de RpoS. Il est capable de délivrer RpoS directement au niveau des résidus
catalytiques de la protéase ClpX (Becker et al., 1999; Stüdemann et al., 2003). BarA/UvrY est
un autre système à deux composants impliqué dans la régulation transcriptionnelle de rpoS
(Mukhopadhyay et al., 2000). Il participe à l’activation de la transcription de rpoS mais sa
contribution n’est pas essentielle. Le rôle de BarA/UvrY semble être global : il affecte le
métabolisme du carbone, la mobilité, la formation de biofilm et contribue à la virulence de
souches d’E. coli uropathogènes (Pernestig et al., 2001 et 2003; Teplitski et al., 2003). Enfin,
le système RscC/RscD/RscB participe à l’activation de la traduction de RpoS. Il s’agit d’un
système participant à la mobilité bactérienne ainsi qu’à l’établissement de biofilms.
b. Le régulon rpoS
Chez E. coli et en condition de stress, 10 % du génome (≈ 430 gènes) est contrôlé par RpoS
(Weber et al., 2005). Il en résulte une grande diversité dans la nature des gènes contrôlés par
ce régulateur. RpoS peut jouer le rôle d’activateur et de répresseur transcriptionnels. Le
premier gène appartenant au régulon rpoS à avoir été identifié est le gène codant pour la
catalase KatE (Loewen et Triggs, 1984; Mulvey et Loewen, 1989).
Les séquences promotrices reconnues par RpoS et σ70 sont très proches, ce chevauchement
pouvant être expliqué par une forte similarité de structure entre les deux protéines. Pourtant,
in vivo, ces deux sous-unités σ sont capables d’induire la transcription de gènes distincts
(Becker et al., 2001), grâce à des régulateurs additionnels pouvant les orienter ainsi que des
séquences spécifiques localisées dans les promoteurs (Ojangu et al., 2000; Arnqvist et al.,
1994; Barth et al., 1995).
26
Introduction S. typhimurium
c. Implication de RpoS dans la virulence de S. typhimurium
Une étude réalisée en 1992 a montré pour la première fois l’implication de RpoS dans la
virulence de S. typhimurium (Fang et al., 1992). Dans cette étude, les auteurs ont analysé la
dose létale (DL50) de S. typhimurium nécessaire pour tuer des souris BALB/c. La DL50 du
mutant rpoS est 1000 fois plus élevée que celle de la souche sauvage, ce qui indique que le
mutant rpoS est fortement affecté dans ses capacités de virulence dans la souris.
RpoS est un régulateur transcriptionnel global, les gènes appartenant à son régulon ont des
implications très diverses et le phénotype du mutant rpoS obtenu dans les souris peut être
expliqué de nombreuses façons. L’opéron spv, précédemment exposé, est activé par RpoS
(Kowarz et al., 1994). Cette opéron participe, entre autre, à l’établissement de la bactérie dans
les organes lymphoïdes secondaires. RpoS est également activé en présence de peptides
antimicrobiens et participe à la résistance à ces composés (Bader et al., 2003). Un traitement
de S. typhimurium avec des peptides antimicrobiens présensibilise la bactérie aux effets du
stress oxydant. Les bactéries deviennent alors plus résistantes aux effets liés au stress oxydant,
notamment au peroxyde d’hydrogène. Ce phénomène peut, en partie, être expliqué par le fait
que le régulon rpoS de S. typhimurium est constitué, entre autres, des gènes sodCII, katE, et
katN, enzymes possédant une activité antioxydante (Fang et al., 1999; Ibanez-Ruiz et al.,
2000; Robbe-Saule et al., 2001).
27
Le stress oxydant
Introduction Stress oxydant
Figure 1 : Schéma de production des différentes formes actives de l’oxygène (FAO) à partir de
l’oxygène moléculaire (Ziegelhoffer et al., 2009)
Ce schéma représente les changements se produisant au niveau de l’orbitale externe de l’O2 au cours
de la production des FAO. L’oxygène singulet, 1O2, est produit grâce à un transfert d’énergie sur
l’oxygène moléculaire. Les électrons de la couche externe de cette FAO ont un spin parallèle. Le
transfert d’un électron sur une molécule d’oxygène moléculaire (O2) aboutit à la production d’anion
superoxyde (O2.-), qui possède un électron non apparié sur son orbitale externe. Le transfert d’un
second électron produit de l’H2O2, structure stable possédant des électrons appariés sur l’orbitale
externe. Enfin, le transfert d’un 3ème électron aboutit au clivage réducteur de l’H2O2 en radical
hydroxyle (.OH) et en eau.
Abbréviation: 1O2 : oxygène singulet, H2O2 : peroxyde d’hydrogène, O2.- : anion superoxyde, .OH :
radical hydroxyle
Introduction Stress oxydant
L’oxygène moléculaire est apparu sur terre il y a 2 milliards d’années grâce à la
photosynthèse oxygénique réalisée par les cyanobactéries. Il assure la survie de nombreux
êtres vivants en permettant la production d’énergie via la respiration cellulaire. Par des
réactions de transfert d’électrons ou de transfert d’énergie, il peut être converti en formes
actives de l’oxygène (FAO), composés capables d’oxyder l’ensemble des macromolécules
biologiques. Quand l’équilibre entre production de FAO et systèmes d’élimination des FAO
(systèmes antioxydants) est rompu aux profits des FAO, la cellule est en état de stress oxydant
(Harman et al., 1956).
I-
Les formes actives de l’oxygène (FAO)
1- Les radicaux libres
La stabilité d’un composé chimique est liée à l’organisation de sa couche électronique
externe. Dans un composé stable, les électrons sont appariés 2 à 2. Un radical libre est un
atome ou une molécule ayant un ou plusieurs électrons non appariés sur son orbitale externe.
Les électrons libres confèrent une grande instabilité et réactivité à la molécule car ils
cherchent à s’apparier à un autre électron. Leur durée de vie est très courte. La plupart des
FAO sont des radicaux libres, leur instabilité et réactivité leur confèrent leur nocivité.
a. L’oxygène moléculaire
L’oxygène moléculaire (O2) est une espèce biradicalaire avec une structure orbitale originale,
il possède deux électrons non appariés à spin parallèle sur son orbitale externe (Fig. 1), alors
que dans la plupart des cas, les électrons non appariés ont un spin antiparallèle. Due à des
restrictions thermodynamiques, la réduction bivalente de l’oxygène en eau est la réaction
prépondérante. Pourtant, dans certains cas thermodynamiquement défavorables, des
réductions monovalentes de l’oxygène moléculaire peuvent se produire. La première forme
résultant d’une réduction monovalente est l’anion superoxyde (O2.-). Cette réaction
endothermique est catalysée par une oxydase.
b. L’anion superoxyde
L’anion superoxyde (O2.-) provient de la réduction univalente de l’oxygène moléculaire (Fig.
1). Il possède un atome non apparié sur sa couche orbitale externe. Son potentiel
d’oxydoréduction (E°= -0,33V) lui permet de servir à la fois de réductant univalent ou bien
d’oxydant univalent. Même si l’anion superoxyde n’est pas très réactif, il est cependant le
28
Introduction Stress oxydant
précurseur d’autres FAO plus nocives. Il peut se dismuter en peroxyde d’hydrogène (H2O2)
soit spontanément (Fridovich, 1983), soit enzymatiquement par une réaction catalysée par les
superoxyde dismutases (Sod) (McCord et Fridovich, 1969). Contrairement à la plupart des
réactions spontanées, l’autodismutation de l’anion superoxyde est rapide (constante de
dismutation : 8.10-4M-1sec-1), la dismutation de l’anion superoxyde par les superoxyde
dismutases est, toutefois, 106 fois plus rapide que le processus spontané. Sa charge électrique
le rend incapable de diffuser à travers les membranes biologiques.
c. Le radical hydroxyle
Le radical hydroxyle (.OH) est un puissant oxydant, il peut également résulter de plusieurs
réactions :
Clivage réducteur du peroxyde d’hydrogène : H2O2 + e- + H+ → H2O + .OH
Coupure homolytique du peroxyde d’hydrogène catalysée par les métaux :
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + .OH + -OH
Cette réaction a été décrite pour la première fois en 1876 par Fenton. Elle s’interrompt par
épuisement de l’ion Fe2+, sauf en présence d’O2.-, qui régénère l’ion Fe2+ en réduisant l’ion
Fe3+ produit selon la réaction :
Fe3+ + O2.- → Fe2+ + O2
Haber et Weiss ont identifié le radical hydroxyle comme étant l’agent oxydant de cette
réaction. La réaction dite de Haber-Weiss (1934) donne alors :
O2.- + H2O2 → .OH + -OH
Le fait que cette réaction ne puisse se produire en absence de catalyseur métallique est
aujourd’hui généralement accepté.
d. L’anion radicalaire carbonate
L’anion radicalaire carbonate (CO3.) est un oxydant possédant un électron non apparié sur son
orbitale externe. En tant qu’espèce chargée, il constitue un agent oxydant important en
environnement aqueux (Augusto et al., 2002). Il peut être produit :
-
soit à partir du CO2 : CO2 + H2O → H2CO3 → HCO3. + H+ → CO3. + 2H+
-
soit à partir du radical hydroxyle : HCO3. + .OH → CO3. + H2O
-
soit à partir du peroxynitrite : ONOO- + CO2 → ONOOCO2- → .NO2 + CO3.
29
Introduction Stress oxydant
2- Les FAO non radicalaires
a. L’oxygène singulet
L’oxygène singulet (1O2) est une forme excitée de l’oxygène moléculaire dans laquelle les
électrons appariés ont un spin antiparallèle (Fig. 1). Il est formé par transfert d’énergie à
l’oxygène moléculaire, par exemple au moment de la capture d’énergie solaire par les
photosystèmes des bactéries photosynthétiques. Les pigments présents dans les photosystèmes
transfèrent de l’énergie à l’oxygène moléculaire produisant ainsi de l’oxygène singulet
(Cogdell et al., 2000). Il faut 22 Kcal à l’oxygène pour être transformé en espèce singulet,
cette énergie est rarement produite au cours des réactions biochimiques.
b. Le peroxyde d’hydrogène
Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) peut résulter de trois réactions (Naqui et al., 1986) :
Dismutation de l’anion superoxyde : O2.- + O2.- + 2H+ → H2O2 + O2
Réduction univalente de l’anion superoxyde : O2.- + e- + 2H+ → H2O2
Réduction bivalente de l’oxygène : O2 + 2e- + 2H+. → H2O2
L’H2O2 n’est pas une espèce radicalaire car chacun de ses électrons est apparié. Il est tout de
même capable d’oxyder certaines macromolécules biologiques en interagissant avec des
métaux de transition (métal pouvant atteindre un grand degré d’oxydation) et est également
précurseur d’une FAO très réactive, le radical hydroxyle (.OH) (Fig. 1). L’H2O2 est
extrêmement diffusible, il peut traverser les membranes biologiques de la même façon que
l’eau par les aquaporines (Seaver et al., 2001). Il est le substrat des catalases et des
peroxydases qui le réduisent en eau (Loew, 1901; Seaver et al., 2001).
3- Origine des FAO
Les FAO proviennent de deux sources distinctes. La première source est endogène (c’est-àdire intracellulaire), dans ce cas, la production de FAO est une conséquence passive du
métabolisme aérobie. La seconde source est exogène, les FAO sont produites directement
dans le milieu environnant, puis perçues par la bactérie.
a. Les FAO d’origine endogène
La chaîne respiratoire aérobie est le principal lieu de production endogène des FAO. Par
exemple, au cours du transfert des électrons du NADH vers les ubiquinones via les différents
30
Introduction Stress oxydant
Périplasme
Membrane interne
Cytoplasme
.
Figure 2 : Schématisation de la production cytoplasmique de FAO chez E. coli (adapté de Imlay,
2003)
Au cours de la respiration aérobie, le cofacteur flavinique FADH2 de la NADH deshydrogènase II (Ndh
II) peut distribuer par inadvertance des électrons à l’oxygène moléculaire présent dans le cytoplasme. Il
en résulte la production d’anion superoxyde et de peroxyde d’hydrogène directement dans le cytoplasme
bactérien.
Introduction Stress oxydant
composants de la chaîne respiratoire aérobie, 0,5% des électrons va être capté par l’oxygène
moléculaire (Messner et al., 1999). La fuite électronique se situe au niveau du cofacteur
flavinique FADH2 de la NADH déshydrogénase II (Fig. 2). Il en résulte la production d’H2O2
et d’O2.-. Les mêmes comportements ont été rapportés pour d’autres enzymes dont la
succinate déshydrogénase, la fumarate réductase, la NADH déshydrogénase I, la glutamate
synthase, la lipoamide déshydrogénase, et la sulfite réductase (Geary et al., 1977; Grinblat et
al., 1991; Kussmaul et al., 2006; Messner et al., 1999; Messner et al., 2002). A l’aide de
mutants d’E. coli dépourvus de catalases et de peroxyrédoxine, l’H2O2 et l’O2.- produits par le
métabolisme bactérien ont pu être directement mesurés dans le milieu de culture (Seaver et
al., 2001). Ainsi, il a été estimé que 10 à 15 µM/s d’H2O2 et 5 µM/s d’O2.-étaient formés par
E. coli au cours de la phase exponentielle de croissance dans un milieu saturé en O2.
De l’anion superoxyde produit selon le même mécanisme peut également être retrouvé dans le
périplasme, il est estimé que 3 µM/s d’O2.- sont formés dans le périplasme d’E. coli en phase
exponentielle de croissance (Han et al., 2001).
b. Les FAO d’origine exogène
Les lactobacilles sont des microorganismes commensaux de l’homme, retrouvés notamment
dans la microflore de l’intestin. Ils participent à la résistance aux infections bactériennes,
notamment grâce à la production de peroxyde d’hydrogène à des concentrations millimolaires
à l’aide de flavoprotéines qui convertissent l’O2 en H2O2 (Eschenbach et al., 1989).
La NADPH phagocyte oxydase produit de l’anion superoxyde à partir d’oxygène moléculaire.
Cette enzyme est retrouvée dans de nombreuses cellules immunitaires et participe au contrôle
de la prolifération bactérienne (Babior, 1999). La vitesse de production de l’anion superoxyde
dans le macrophage est de 500 µM/s (Référence issue du site web EcoSal « Module 5.4.4 »).
L’H2O2 peut également être produit en milieu de culture LB au travers de réactions
photochimiques. Cette source de stress oxydant est d’ailleurs souvent largement ignorée bien
que capable d’influencer directement le résultat d’une expérience (Cuny et al., 2007).
4- Les cibles des formes actives de l’oxygène
Chez E. coli, une souche dépourvue de superoxyde dismutase ou de catalase et
peroxyrédoxine est incapable de pousser en milieu minimum (Carlioz et al., 1986; Jang et al.,
2007). Les mutants correspondants sont incapables d’éliminer l’anion superoxyde ou le
peroxyde d’hydrogène et accumulent ces composés dans leur cytoplasme. La conséquence est
31
Introduction Stress oxydant
(A)
(B)
[4Fe-4S]2+ + O2.- + 2H+ → [4Fe-4S]3+ + H2O2
[4Fe-4S]3+ → [3Fe-4S]1+ + Fe2+
Figure 3 : Schéma de l’inactivation d’un centre [4Fe-4S] par l’anion superoxyde (Imlay, 2003)
L’anion superoxyde attaque un atome de fer du centre [4Fe-4S] , entrainant son oxydation. Il en
résulte la perte de l’atome de fer au sein du centre [Fe-S], puis la déstabilisation et enfin la
dégradation du centre [Fe-S].
(A) Schématisation de l’inactivation du centre [4Fe-4S] par l’anion superoxyde
(B) Réaction d’oxydation du centre [4Fe-4S] par l’anion superoxyde
Introduction Stress oxydant
l’oxydation d’enzymes impliquées dans la biosynthèse de certains acides aminés et
l’auxotrophie des souches. Par exemple, chez E. coli, dans un mutant dépourvu de catalase et
de peroxyrédoxine, une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la leucine, l’IPMI,
est inactivée (Jang et al., 2007). Cette enzyme possède un centre Fer/Soufre ([Fe-S]) oxydable
par le peroxyde d’hydrogène. Ces phénotypes constituent la meilleure évidence que les
bactéries vivant en aérobiose produisent de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène à
des concentrations toxiques.
a. Les cibles de l’anion superoxyde
L’anion superoxyde est capable de détruire les centres [Fe-S] des protéines. E. coli possède
plusieurs enzymes qui sont des cibles de l’O2.-, la dihydroxyacide déshydratase, l’aconitase B,
la fumarase A et B (Flint et al., 1993; Gardner et al., 1991; Liochev et al., 1993). Dans ces
protéines, l’O2.- est électrostatiquement attiré par l’atome de fer catalytique. Lorsque le centre
est oxydé, il devient instable et se dégrade en libérant l’atome de fer (Fig. 3). L’oxydation des
centres [Fe-S] a deux conséquences : la première est l’inactivation de l’enzyme, la seconde est
la libération de l’ion Fe2+, substrat de la réaction de Fenton. Il a également été montré, que
l’anion superoxyde pouvait réagir et oxyder les groupements thiols des cystéines
(Winterbourn et al., 1999).
b. Les cibles de l’H2O2
Chez E. coli, la croissance d’une souche dépourvue de catalase et peroxyrédoxine en milieu
minimum est inhibée. Ce phénomène est dû à la production d’H2O2 par le métabolisme
endogène du mutant ([H2O2] = 1 µM) (Seaver et al., 2001). Ce résultat illustre parfaitement la
nocivité de l’H2O2 dont les cibles directes sont exclusivement protéiques.
L’H2O2 est capable d’oxyder le groupement sulfhydrile des cystéines. La conséquence est la
production de dérivés acides sulféniques qui peuvent soit former des ponts disulfures avec
d’autres cystéines, soit atteindre un degré d’oxydation supérieur et former des acides
sulfiniques ou sulfoniques (Fig. 4). L’H2O2 peut également oxyder l’atome de soufre de la
méthionine produisant ainsi de la méthionine sulfoxyde puis de la méthionine sulfone.
En présence d’H2O2 et de métaux de transition, l’arginine, la lysine, la thréonine, la proline et
l’histidine peuvent être carbonylées. La carbonylation est une modification irréversible
résultant de la greffe d’un groupement carbonyle sur les chaines latérales des acides aminés. Il
32
Introduction Stress oxydant
Cystéine réduite
R-S(H)
H2O2
H2O
Acide sulfénique
H2O2
Acide sulfinique R-SO2(H)
R-SO(H)
R-SO(H)
R-S-S-R
Pont disulfure
Acide sulfonique R-SO3(H)
Figure 4 : Les différents états d’oxydation de la cystéine
En présence d’une molécule d’H2O2, le groupement thiol de la cystéine est oxydé, la cystéine est alors
transformée en acide sulfénique. Celui-ci peut soit former un pont disulfure avec un autre acide
sulfénique, soit être tranformé en acide sulfinique en présence d’une seconde molécule d’H2O2. L’état
final d’oxydation de la cystéine est l’acide sulfonique.
Introduction Stress oxydant
semblerait que le radical hydroxyle, dérivé de l’H2O2, soit directement responsable de
l’oxydation.
Chez E. coli, de faibles doses d’H2O2 sont capables de bloquer le cycle de Krebs ainsi que la
biosynthèse de la leucine (Référence issue du site web EcoSal « Module 5.4.4 »). En effet,
l’H2O2, au même titre que l’anion superoxyde, est capable d’attaquer les centres [4Fe-4S] de
certaines déshydratases. Il semblerait que ces réactions d’oxydations se produisent
essentiellement via la réaction de Fenton.
c. Les cibles du radical hydroxyle
Le radical hydroxyle (.OH) est la FAO la plus réactive et dont les conséquences sont les plus
nocives pour la cellule. Il est capable d’endommager toutes les macromolécules biologiques,
notamment l’ADN qui est une cible privilégiée du radical hydroxyle. Ce dernier est produit à
partir d’H2O2 et d’ion ferrique. Etant donné que les acides nucléiques lient efficacement les
atomes de fer, le radical hydroxyle est, ainsi, produit à proximité de la molécule d’ADN. Il est
capable de chélater un atome d’hydrogène à une unité désoxyribose et entraîne alors une
rupture de la molécule d’ADN entre le phosphate et le désoxyribose (Fig. 5). Ces ruptures
monobrins sont aisément réparées par des systèmes enzymatiques spécialisés.
Plus de 20 modifications oxydatives ont pu être identifiées suite à l’action du radical
hydroxyle sur les bases de l’ADN (Halliwell et al., 1991). Les bases puriques et pyrimidiques
sont toutes deux cibles de cette FAO, entraînant des modifications dont les conséquences
peuvent être des mutations au niveau de l’ADN, la formation de sites abasiques ou la rupture
de la molécule d’ADN (Fig. 6).
d. Les lipides bactériens sont-ils ciblés par les FAO ?
Chez les mammifères, les lipides sont très sensibles à la peroxydation lors d’un stress
oxydant. Cependant, l’existence d’une telle réaction n’a pas été mise en évidence chez les
bactéries. Les cibles lipidiques des FAO sont les acides gras polyinsaturés, or la plupart des
bactéries ne possèdent que des acides gras monoinsaturés qui sont non réactifs (Bielski et al.,
1983).
33
Introduction Stress oxydant
Figure 5 : Schéma de la réaction du radical hydroxyle au niveau du désoxyribose de l’ADN
Le radical hydroxyle est capable d’arracher un atome d’hydrogène à l’unité désoxyribose au niveau du
carbone 4. Il en résulte la formation d’un clivage entre le phosphate et le désoxyribose et la rupture
simple brin au niveau de la molécule d’ADN.
Figure 6 : Schéma de la réaction du radical hydroxyle au niveau des bases de l’ADN
Le radical hydroxyle est capable d’interagir avec les bases puriques et pyrimidiques de l’ADN.
L’oxydation de la guanine par le radical hydroxyle aboutit à la formation du résidu 8-hydroxyguanine.
Introduction Stress oxydant
5- Les mécanismes de défense bactériens contre les FAO
Il existe deux stratégies antioxydantes principales. La première stratégie implique des
systèmes d’élimination des FAO et la seconde, des systèmes de réparation des effets liés au
stress oxydant.
a. Les
superoxyde
dismutases,
système
d’élimination
de
l’anion
superoxyde
Les superoxyde dismutases (Sod) sont des enzymes qui catalysent la dismutation de l’anion
superoxyde en peroxyde d’hydrogène :
O2.- + O2.- + 2 H+ → H2O2 + O2
Chez les eubactéries, il existe différentes Sod dont la séquence, la structure, l’activité et la
localisation varient. Par exemple, S. typhimurium possède 4 Sod dont 2 Sod cytoplasmiques
(SodA et SodB) et 2 Sod périplasmiques (SodCI et SodCII).
SodA et SodB possèdent 42% d’identité de séquence. sodA code pour une superoxyde
dismutase à manganèse, il est régulé par SoxR/SoxS, un système d’adaptation bactérienne à
l’anion superoxyde (Pomposiello et al., 2000). sodB code pour une superoxyde dismutase à
fer, il est régulé par le régulateur du trafic de fer, Fur (Dubrac et al., 2002). Ces deux enzymes
participent à l’élimination de l’anion superoxyde d’origine endogène.
Deux Sod sont également localisées dans le périplasme de S. typhimurium, SodCI et SodCII.
Ces deux enzymes sont des superoxyde dismutases à cuivre/zinc. sodCI est régulé par le
système à deux composants PhoP/PhoQ et sodCII par RpoS (Golubeva et al., 2006; Fang et
al., 1999). En dépit du fait que SodCI et SodCII possédent une forte identité de séquence
protéique (60%), leur implication cellulaire est différente. SodCI participe à l’établissement
de la virulence alors que SodCII, dont un orthologue est présent chez la plupart des
entérobactéries, a été proposée pour lutter contre l’anion superoxyde produit par la chaîne
respiratoire (Uzzau et al., 2002). SodCI et SodCII sont également évoquées dans le chapitre
consacré aux facteurs de virulence de S. typhimurium.
b. Les catalases et les peroxyrédoxines, système d’élimination de l’H2O2
Les catalases et les peroxyrédoxines sont impliquées dans l’élimination du peroxyde
d’hydrogène. Elles ont fait l’objet d’une partie de ce travail de thèse, elles seront développées
dans un chapitre indépendant.
34
Introduction Stress oxydant
(A)
(B)
Figure 7 : Modèle d’activation de SoxR et induction de la transcription du régulon soxRS
(Pomposiello et al., 2001; Demple, 1996)
(A) Modèle d’activation de SoxR. En présence d’anion superoxyde, les deux centres [2Fe-2S]2+
de SoxR sont oxydés en [2Fe-2S]3+ . Il en résulte un changement conformationnel de SoxR qui
améliore la fixation du régulateur sur sa région cible, le promoteur soxS, permettant sa
transcription.
(B) L’induction de la transcription du régulon soxRS nécessite deux étapes. Au cours de la
première étape, SoxR est soit oxydé par l’anion superoxyde, soit nitrosylé par l’oxyde nitrique. Il
en résulte une modification conformationnelle de SoxR qui peut alors activer la transcription de
soxS. Au cours de la seconde étape, SoxS est produite et se fixe sur le promoteur des gènes cibles
composant son régulon induisant leur transcription.
Introduction Stress oxydant
c. Les systèmes de réparation protéique : les méthionine sulfoxyde
réductases, les thiorédoxines et les glutarédoxines
L’oxydation de la plupart des acides aminés est un phénomène irréversible dont l’issue est la
dégradation protéolytique. Il existe cependant deux acides aminés pouvant être oxydés puis
réduits : la méthionine et la cystéine. Ces acides aminés soufrés sont largement exposés à
l’oxydation et peuvent être réparés soit par les méthionine sulfoxyde réductases, soit par les
systèmes de résolution des ponts disulfures, thiorédoxine/thiorédoxine réductase ou
glutarédoxine/glutarédoxine réductase, respectivement.
Les méthionine sulfoxyde réductases ont fait l’objet d’une partie de ce travail de thèse. Elles
seront présentées dans une partie indépendante.
Le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase est un système ubiquitaire. Il sert de système
réducteur à certaines protéines cytoplasmiques telles que les méthionine sulfoxyde réductases
ou la ribonucléotide réductase en réduisant les ponts disulfures (Gon et al., 2006; Russel et
al., 1986). La thiorédoxine catalyse la réduction des ponts disulfures grâce à une activité thioltransférase, elle possède dans son site actif un motif conservé : Trp-Cys-Gly-Pro-Cys. La
thiorédoxine réductase est une flavoprotéine qui catalyse la réduction de la thiorédoxine
oxydée à l’aide des électrons du NADPH. Elle contient un domaine de fixation au NADPH
dans lequel sont retrouvées deux cystéines, Cys135 et Cys138, impliquées dans l’activité
catalytique de l’enzyme (Veine et al., 1998). Le motif C-X-X-C est ubiquitairement retrouvé
dans le site actif des enzymes impliquées dans la résolution des ponts disulfures.
Les glutarédoxines ont des structures similaires aux thiorédoxines. Elles possèdent également
un site actif avec le motif C-X-X-C leur permettant de réduire les ponts disulfures, mais elles
sont moins efficaces que les thiorédoxines. Une fois oxydées, les glutarédoxines constituent
un substrat du glutathion (γ-glutamyl-cystéinyl-glycine), tripeptide abondant fournissant la
cellule en groupements thiols dans le but d’« éponger » le stress oxydant endogène. La
glutathion réductase est une flavoprotéine qui catalyse la réduction du glutathion oxydé (Ritz
et Beckwith, 2001).
6- La régulation des systèmes d’adaptation au stress oxydant
Il existe deux systèmes de régulation majeurs impliqués dans la résistance aux FAO chez S.
typhimurium. Le premier est activé par l’anion superoxyde et le second par l’H2O2.
35
Introduction Stress oxydant
Figure 8 : Modèle d’activation et de désactivation d’OxyR (Pomposiello et al., 2001)
OxyR est un tétramère, il possède deux cystéines par monomère dont l’état d’oxydation détermine
l’activité de la protéine. A l’état réduit, OxyR ne peut pas se fixer sur ses gènes cibles. En présence
d’H2O2, les groupements sulfhydriles d’OxyR sont oxydés, il en résulte la formation de quatre ponts
disulfures. Sous cette conformation, OxyR est actif et peut fixer le promoteur des gènes constituant
son régulon.
En absence d’H2O2 , la glutarédoxine est capable de réduire les ponts disulfures d’OxyR, elle exerce
ainsi un rétrocontrôle négatif sur le régulon oxyR puisqu’elle-même en fait partie.
Introduction Stress oxydant
a.
Le système SoxR/SoxS
E. coli est capable de percevoir la présence d’anion superoxyde grâce à son système de
régulation, SoxR/SoxS. SoxR est le senseur/régulateur de réponse et SoxS, un deuxième
régulateur de réponse. SoxR est un homodimère qui possède un centre [2Fe-2S] 2+ par sousunité. En présence d’anion superoxyde, les centres [2Fe-2S]2+ de SoxR sont oxydés (Hidalgo
et al., 1997) (Fig. 7A). Il en résulte un changement de conformation qui va permettre à SoxR
d’activer la transcription de soxS (Chander et al., 2004) (Fig. 7B). La production de SoxS
mène à l’activation d’un régulon composé d’une vingtaine de gènes dont ceux codant pour
SodA qui participe directement à la dismutation de l’anion superoxyde, pour l’endonucléase
IV qui participe à la réparation des dommages oxydatifs au niveau de l’ADN ou encore pour
Fpr, dont le rôle est de réduire les centres [Fe-S] (Hidalgo et al, 1995).
L’oxyde nitrique est également capable de nitrosyler les centres [Fe-S] de SoxR. La forme
nitrosylée de SoxR est très stable et peut activer la transcription de soxS (Demple et al, 1999).
b. Le régulateur OxyR
Le prétraitement d’E. coli ou de S. typhimurium à 60 µM d’H2O2 entraine une augmentation
de la résistance bactérienne à des concentrations molaires de peroxyde d’hydrogène (Demple
et Halbrook, 1983; Winquist et al., 1984). Cette réponse adaptative nécessite la transcription
d’une trentaine de gènes, dont la plupart sont régulés par le facteur de transcription OxyR.
OxyR appartient à la famille de régulateur LysR. En présence d’H2O2, OxyR subit une
régulation post-traductionnelle qui résulte en la formation d’un pont disulfure entre les
cystéines 199 et 208 (Zheng et al., 1998; Tao et al., 1999) (Fig. 8). Dans cette conformation,
OxyR se fixe sous forme de tétramère sur les promoteurs d’au moins 20 gènes et active leur
transcription. OxyR est très sensible à l’oxydation, la formation du pont disulfure se produit à
partir de 100 nM d’H2O2 (Aslund et al., 1999). En absence d’inducteur, la glutarédoxine 1
(Grx1) réduit le pont disulfure afin de régénérer OxyR (Zheng et al., 2001). grx1 fait partie du
régulon oxyR, il participe ainsi à la répression du régulon via un rétrocontrôle négatif. Il a
également été montré que la thiorédoxine 1 pouvait réduire la forme oxydée d’OxyR.
En 2001, l’équipe de Gisela Storz a réalisé un transcriptome dans le but d’identifier, chez E.
coli, les gènes dont la transcription était induite en présence d’H2O2 (Zheng et al., 2001). La
majorité de ces protéines appartient au régulon oxyR. Ce régulon est constitué, entre autre, du
gène codant pour la peroxyrédoxine AhpC, du gène codant pour la catalase KatG, ou encore
du gène codant pour la protéine de séquestration du fer et de liaison à l’ADN Dps. Les auteurs
36
Introduction Stress oxydant
ont montré qu’après traitement d’E. coli à 1 mM d’H2O2 pendant 10 minutes, les gènes dps,
katG et ahpC étaient induits respectivement 180, 44 et 20 fois en comparaison avec une
souche non exposée à l’H2O2 (Zheng et al., 2001).
En plus de l’oxydation de la Cys199 et de la Cys208, l’hydroxylation, la nitrosylation ou la
glutathionylation de la Cys199 augmentent les capacités de fixation d’OxyR sur les promoteurs
de ses gènes cibles (Kim et al., 2002).
7- Les formes actives de l’azote
A l’instar de l’oxygène, l’oxyde nitrique est une molécule centrale chez de nombreux êtres
vivants dont l’importance provient notamment de son rôle de molécule signal. Une
dérégulation de sa production peut entraîner des conséquences néfastes pour les cellules,
notamment suite à la production d’espèces dérivées de l’oxyde nitrique, les formes actives de
l’azote (FAN).
a. Les réactions chimiques générées en présence de NO. ou de ses dérivés
Réaction d’oxydation
.
Le NO et ses dérivés sont capables de réagir avec l’oxygène moléculaire, les métaux de
transition ainsi que l’anion superoxyde. Les conséquences sont multiples : oxydation des
protéines, oxydation des métaux, production de nouvelles FAN…
Réaction de nitration
La réaction de nitration est une réaction covalente résultant de l’ajout d’un groupement NO2.
De nombreux composés, dont la tyrosine, sont sensibles à la nitration au cours de laquelle le
groupement NO2 vient se greffer sur un carbone du noyau aromatique. De nombreuses
enzymes catalysent la production de NO2.
Réaction de nitrosylation
Le NO. est capable de nitrosyler certaines protéines au niveau de leurs groupements amine,
des noyaux aromatiques, des groupements alcool et thiols. La nitrosylation consiste en l’ajout
d’un groupement NO.. L’oxydation des thiols produit des S-nitrosothiols, et l’oxydation des
amines produit des nitrosamines.
37
Introduction Stress oxydant
b. Présentation du NO. et des FAN
Le NO.
Le NO. est une petite molécule soluble dans l’eau et diffusible à travers les membranes
biologiques. Il s’agit d’une espèce radicalaire possédant un électron non apparié sur son
orbitale externe lui conférant une grande réactivité. A faible concentration (< 10-7 M), il agit
en tant que molécule médiatrice de l’information, notamment pour les mammifères supérieurs
chez qui il contrôle la pression sanguine et où il agit comme un messager du système nerveux
central et périphérique. A forte concentration, le NO. peut avoir une activité bactéricide. Il
peut directement inhiber la croissance de certains parasites eucaryotes tels que Leishmania ou
Trypanosoma (Wanasen et al., 2008 ; Silva et al., 2003), ainsi que plusieurs espèces
bactériennes en inactivant des enzymes de la chaîne respiratoire et du cycle de Krebs. En plus
de son action directe, le NO. peut réagir avec les FAO. Les espèces résultantes, espèces
actives de l’azote (FAN), sont en général beaucoup plus réactives et présentent ainsi un
potentiel oxydant plus important.
Le dioxyde d’azote
Le dioxyde d’azote (NO2) peut résulter de plusieurs réactions :
-
l’autooxydation du NO. : 2 NO. + O2 → 2NO2
-
la décomposition de l’acide péroxynitreux (ONOOH) :
NO. + O2 - → ONOOONOO- + H+ → ONOOH
ONOOH → NO2 + .OH
-
la réaction du NO. avec des hydroperoxydes organiques
ROO + NO. → ROONO → RO + NO2
Il s’agit d’un oxydant fort capable de nitration sur certaines molécules. Il peut également être
nitrosylé en N2O3.
Le trioxyde d’azote
Le N2O3 est un oxydant relativement faible :
NO2 + NO. → N2O3
A pH neutre, il s’agit de l’espèce prédominante formée à partir du NO.. Il peut agir
directement et indirectement sur ses cibles soit en oxydant, soit en nitrosylant ses molécules
cibles. En terme chimique, le N2O3 est quasi identique à l’acide nitreux.
38
Introduction Stress oxydant
Le peroxynitrite
Le peroxynitrite résulte de la combinaison entre le NO. et l’anion superoxyde :
NO. + O2.- → ONOOIl s’agit d’une réaction très rapide car le NO. et l’anion superoxyde sont des radicaux libres.
Le taux de formation du peroxynitrite est 3,5 fois plus important que la réaction de l’anion
superoxyde avec la superoxyde dismutase (Squadrito et al., 1995). Cette observation suggère
que si le NO. et l’O2.- sont produits simultanément, la réaction de production du peroxynitrite
sera majoritaire par rapport à la dismutation enzymatique de l’O2.-.
Le pKa du peroxynitrite est de 6,8. En solution acide, il forme de l’acide péroxynitreux, qui à
son tour forme du nitrate (NO3-). Le peroxynitrite est extrêmement oxydant, et peut agir via
des réactions d’oxydation à un électron ou à 2 électrons ou via des réactions de nitration sur
de nombreuses cibles.
Les travaux de Lymar et collaborateurs ont montré que les actions du peroxynitrite sont
influencées par la présence de CO2 (Lymar et al., 1996). Le CO2 module principalement les
réactions de nitration provoquées par ONOO-. Il réagit avec le dioxyde de carbone pour
former l’ion nitrosoperoxycarbonate :
CO2 + ONOO- → ONOOCO2En l'absence d'un substrat adéquat (une molécule aromatique comme la tyrosine, par
exemple), l'adduit se décompose en nitrate et CO2. Sinon, il se forme du NO2• et un radical
anionique CO3• (l'anion carbonyle). Le système (NO2• + CO3•) réalise des nitrations monoélectroniques des composés aromatiques (Bonini et al., 1999).
c. Production des FAN
Les NO. synthases
Le NO. peut être produit par les NO. synthases via des réactions séquentielles d’oxydation de
l’arginine :
L-Arginine + O2 + NADPH → Nw-hydroxyle-L-arginine + H2O + NADP+
Nw-hydroxyle-L-arginine + ½NADPH + O2 → L-citrulline + NO. + H2O + ½NADP+
L’équation peut être résumée de la sorte :
O2 + L-arginine → NO. +L-citrulline
Les NO. synthases sont des enzymes exclusivement présentes chez les eucaryotes. Il existe
trois isoformes : 2 sont constitutives et fonctionnent avec la calmoduline (NO. synthase
39
Introduction Stress oxydant
N2O3, NO.
Péroxynitrite
Guanine fragmentée
Guanine oxydée
Liaison croisée
entre les molécules d’ADN
ADN
8-Nitro-dG
Désoxyribose oxydé
Bases désaminées
Sites abasiques
Sites abasiques
Cassure simple brin
Figure 9 : Voies d’endommagement de l’ADN en présence de NO. et de FAN (adapté de
Burney et al., 1999)
Le N2O3 et le NO. sont capables de désaminer l’ADN entraînant ainsi la production de sites
abasiques pouvant aboutir à la formation de cassures simple brin de l’ADN.
Le peroxynitrite oxyde l’ADN au niveau des bases et du désoxyribose. Il en résulte également la
production de sites abasiques et des cassures simple brin de la molécule d’ADN.
Introduction Stress oxydant
endothéliale et neuronale), alors que la troisième est inductible et indépendante de la
calmoduline (NO. synthase inductible) (Mori et al., 2004). La disponibilité en arginine
intracellulaire est le facteur limitant de la réaction de production de NO.. Les NO. synthases
sont également abordées dans le chapitre consacré à S. typhimurium.
La nitrate réductase
L’assimilation du nitrate est une voie majeure pour l’approvisionnement en azote des plantes
et de certains microorganismes. Parce que la réduction du nitrate est une étape limitante, la
nitrate réductase est considérée comme une enzyme clé dans la voie d’assimilation du nitrate.
Chez certains organismes, notamment les plantes, la nitrate réductase a également la capacité
de produire du NO. à partir de nitrite (Yamasaki et al., 2000). Le rôle proposé du NO. produit
à partir du nitrite serait d’une part de diminuer la concentration en nitrite qui est un composé
phytocytotoxique, mais également de participer à des cascades de transduction de signaux
(Grace et al., 1998 ; Delledonne et al., 1998).
8- Les cibles des FAN
A l’instar des FAO, les FAN sont capables de réagir avec un grand nombre de
macromolécules biologiques.
L’ADN est une cible du NO., du N2O3 et de l’ONOO- (Fig. 9). In vitro, le NO. et le N2O3 ont
la capacité de désaminer les nucléosides ainsi que les nucléotides (Wink et al., 1991). Dans la
majorité des cas, la désamination a lieu au niveau d’une cytosine et produit de l’uracile qui est
éliminée par une uracile glycosylase. Il en résulte la formation d’un site abasique, lésion
fréquemment « réparée » par la mauvaise insertion d’une adénine à la place de la cytosine.
Ainsi, on assiste à une transition de G:C→A:T, pouvant être conservée au cours de la
réplication. L’exposition au NO. peut également entraîner la formation de clivage simple brin
de l’ADN (Tamir et al., 1996). La désamination de la guanine aboutit à la production de
xanthine qui selon un mécanisme commun à celui décrit précédemment va être éliminée et
non remplacée et ainsi engendrer la création d’un site abasique. Les sites abasiques peuvent,
dans certains cas, être clivés par des endonucléases et créer ainsi de l’ADN simple brin.
Le peroxynitrite n’entraîne pas de désamination mais une oxydation de la molécule d’ADN. A
très faible concentration, il peut causer des cassures au niveau de l’ADN de façon beaucoup
plus efficace que le NO.. En effet, des lésions ont été observées sur des plasmides mis en
40
Introduction Stress oxydant
présence de 2 à 5 µM d’ONOO- (Kennedy et al., 1997). Il semblerait que l’ONOO- attaque
directement le désoxyribose de la molécule d’ADN.
Le peroxynitrite a également la capacité de réagir avec les métalloprotéines. Des études ont
montré que cette FAN pouvait oxyder des protéines à hème telles que les catalases (Floris et
al., 1993). Il a également été montré que l’ONOO- pouvait réagir avec les NO. synthases et les
inhiber irréversiblement (Pasquet et al., 1996). Enfin, l’ONOO- est capable d’endommager les
centres [Fe-S] des protéines, comme notamment l’aconitase B, avec pour conséquence
l’inactivation de l’enzyme (Bouton et al., 1997).
La tyrosine est un acide aminé sensible à la nitration. En présence de peroxynitrite, la tyrosine
est modifiée en 3-nitrotyrosine (Reiter et al., 2000). De façon générale, la nitration des
tyrosines est une réaction longue qui se produit en présence de fortes concentrations en
peroxynitrite (Pfeiffer et al., 2000). Cependant, en présence de métaux de transition tels que
l’ion ferrique (Fe3+) ou le CO2, l’action du peroxynitrite sur les tyrosines semble plus efficace
(Beckman et al., 1992, Lymar et al., 1996).
En présence de FAN, les lipides peuvent être soit oxydés, soit nitrés. Le peroxynitrite est
l’espèce majoritairement responsable de ces réactions. La réaction d’oxydation du
peroxynitrite est fortement dépendante du pH et peut se faire à l’aide d’un ou deux électrons.
L’ONOO- réagit soit directement avec les acides gras insaturés, soit en se décomposant en
NO2. et .OH (Botti et al., 2004). La conséquence est l’initiation de l’oxydation des lipides.
L’ONOO- peut également induire une réaction de nitration. Il en résulte la production d’un
intermédiaire alkyl peroxynitrite (LOONO) qui est hautement instable et qui se décompose
spontanément pour former une espèce capable de réinitier le processus de nitration (Rubbo et
al., 1994).
9- Les mécanismes de défense contre les FAN
a. Les enzymes catalysant l’élimination du NO.
Il existe de nombreux mécanismes de détoxication du NO. et des FAN. Seuls quelques
exemples seront illustrés dans la partie suivante.
Les flavohémoglobines
La flavohémoglobine d’E.coli (Hmp) est un monomère hémique de 44 KDa. Hmp catalyse la
réduction du NO. selon la réaction suivante :
2 NO. + 2O2 + NADPH → 2NO3- + NADP+ + H+
41
Introduction Stress oxydant
La partie C-terminale d’Hmp ressemble fortement aux réductases à ferrédoxine NADP+ car
elle possède des sites de fixation conservés pour le FAD et le NADPH. Son domaine
réductase est essentiel, il lui confère la capacité de transférer ses électrons du NADPH vers
l’hème (Hernandez-Urzua et al., 2003). La transcription d’hmp est directement régulée par le
NO. et certaines de ses formes dérivées (Poole et al., 1996).
Chez S. typhimurium, Hmp protège également des effets du NO., des S-nitrosothiols et du
nitrate acidifié (Crawford et al., 1998 ; Bang et al., 2006).
Les flavorubrédoxines
Les flavorubrédoxines sont des protéines possédant deux atomes de fer dans leur site actif
ainsi qu’un site de fixation au NO. (Wasserfallen et al., 1998). Chez E. coli, le gène codant
pour la flavorubrédoxine NorV est retrouvé au sein de l’opéron norRVW (Gardner et al.,
2003). Ces enzymes sont impliquées dans la détoxication du NO. en anaérobiose. Au cours de
la réduction du NO., 2 molécules de NO. se lient au centre actif (Fe2+-O- Fe2+) et sont réduites
en anions nitroxyles (NO-). Les deux molécules de NO- vont ensuite se combiner pour former
du N2O et de l’eau.
La nitrite oxyde réductase
Chez les procaryotes, le NO. peut également jouer un rôle d’intermédiaire du cycle de l’azote,
notamment lors du processus de dénitrification. Chez les bactéries dénitrifiantes, le NO. est
réduit en NO2 par les nitrite oxyde réductases (NOR) (Zumft, 1997). Les NOR sont des
enzymes membranaires contenant un hème dans leur sous-unité catalytique, évolutivement
très proches des réductases à oxygène hème/cuivre (Saraste et al., 1994).
b. Les enzymes catalysant l’élimination du peroxynitrite
Les peroxyrédoxines AhpC et TsaA
AhpC et TsaA sont des peroxyrédoxines qui ont été préalablement décrites pour leur capacité
à éliminer les hydroperoxydes, parmi lesquels l’H2O2. En 2001, une étude a montré que ces
enzymes avaient une activité peroxynitrite réductase in vitro (Bryk et al., 2000). Les auteurs
ont purifié la protéine AhpC de S. typhimurium et TsaA d’H. pylori. En présence de fortes
concentrations en AhpC, l’ADN est protégé des lésions simples brins causées par le
peroxynitrite. AhpCF et TsaA catalysent la réduction du peroxynitrite en nitrite, composé peu
nocif pour les macromolécules biologiques. La réaction de réduction est réalisée par la
42
Introduction Stress oxydant
NH3+-CH-COOMéthionine
NH3+-CH-COO-
NH3+-CH-COO-
Méthionine sulfoxyde
Méthionine sulfone
Figure 10 : Formule chimique de l’acide aminé méthionine et de ses formes oxydées
MsrA
L-Méthionine-(S)-sulfoxyde
FAO
L-Méthionine
L-Méthionine-(R)-sulfoxyde
MsrB
Figure 11 : Cycle d’oxydoréduction de la méthionine chez E. coli
En présence d’H2O2, la L-méthionine est oxydée en L-méthionine-(S)-sulfoxyde ou en Lméthionine-(R)-sulfoxyde . La méthionine-(S)-sulfoxyde est réduite en méthionine par MsrA et
la méthionine-(R)-sulfoxyde par MsrB.
Introduction Stress oxydant
cystéine péroxidatique d’AhpC soit à travers une oxydation, soit à travers une nitrosylation du
groupement thiol. AhpF est nécessaire pour la réduction du système. Il semblerait que cette
activité soit spécifique du peroxynitrite et non de l’oxyde nitrique ou de formes dérivées.
Les autres composés éliminant le peroxynitrite
Il existe plusieurs classes de composés impliquées dans l’élimination du peroxynitrite. Parmi
ces composés, on peut relever la présence de protéines thiolées, catalyseurs efficaces de la
réduction du peroxynitrite. On retrouve également des centres métalthiolates au sein de
protéines, des métalloporphyrines, des méthionines, des protéines à sélénium, du glutathion…
Les métalloporphyrines à fer ou à manganèse réduisent le peroxynitrite de façon catalytique,
elles protègent ainsi la cellule des dommages oxydatifs liés au NO..
II- Les méthionine sulfoxyde réductases
1- La méthionine
a. Caractéristiques de la méthionine
La méthionine est un acide aminé à caractère hydrophobe contenant une fonction thioéther
(Fig. 10). Il s’agit d’un des acides aminés les plus sensibles à l’oxydation qui produit de la
méthionine sulfoxyde. La présence de métaux de transition peut entraîner une oxydation
supplémentaire en méthionine sulfone (Toennis et Kolb, 1941) (Fig. 10). L’oxydation de la
méthionine au sein d’une protéine peut entraîner un changement conformationel dont la
conséquence peut être une déstructuration ainsi que la perte de fonction de la protéine. Il
existe de nombreux exemples relatant de l’importance des méthionines dans le maintien de
l’activité enzymatique des protéines.
b. La méthionine, une "éponge" à stress oxydant
Une étude réalisée en 1999 et portant sur l’oxydation de la glutamine synthase a montré que
sur les 16 résidus méthionines présents dans la protéine, 8 pouvaient être oxydés sans
entraîner de conséquences majeures pour l’activité de l’enzyme (Stadtman et al., 1992). Les
résidus oxydés étaient exposés en surface de l’enzyme alors que les résidus réduits étaient
enfouis dans l’enzyme. Les auteurs ont proposé l’existence d’une différence de sensibilité des
résidus méthionines à l’oxydation selon leur localisation dans la protéine, ainsi les résidus
méthionines agiraient en tant qu’"éponge" antioxydante avec un rôle protecteur pour la
protéine.
43
Introduction Stress oxydant
Figure 12 : Schéma de la réaction enzymatique des méthionine sulfoxyde réductases (BoschiMuller et al., 2000)
La cystéine 51, Cys51, de la méthionine sulfoxyde réductase attaque l’atome de soufre de la méthionine
sulfoxyde (IA). Il en résulte un réarrangement moléculaire aboutissant à la libération de la méthionine
réduite et à la formation d’un acide sulfénique (IB). Celui-ci va être attaqué par la Cys198 pour former
un pont disulfure entre la Cys51 et la Cys198 (IIB). Ce pont disulfure sera alors échangé entre la Cys198
et la Cys206 puis sera réduit par le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase (III).
Introduction Stress oxydant
2- Les méthionine sulfoxyde réductases
Les méthionine sulfoxyde réductases (Msr) sont des enzymes spécifiquement impliquées dans
la réparation des méthionines sulfoxydes, qu’elles soient libres ou enchâssées dans un
squelette peptidique. La découverte de MsrA remonte à l’année 1979 (Ejiri et al., 1979). La
première caractérisation de MsrB a été réalisée dans l’équipe en 2001 (Grimaud et al., 2001).
a. Aspects biochimiques
Il existe deux diastéréoisomères de méthionines sulfoxydes, la méthionine-S-sulfoxyde et la
méthionine-R-sulfoxyde, classification effectuée en fonction de la stéréochimie de l’atome de
soufre sur la chaîne latérale. La réduction des méthionines sulfoxydes en méthionines est
catalysée par MsrA et MsrB qui sont spécifiques des diastéréoisomères S et R, respectivement
(Sharov et al., 1999 ; Grimaud et al., 2001) (Fig. 11).
b. Réaction catalytique
Toutes les Msr caractérisées à ce jour présentent le même mécanisme de réduction, composé
de trois étapes catalytiques (Boschi Muller et al., 2000 ; Olry et al., 2002). La première étape
mène à la formation d’un acide sulfénique sur la cystéine catalytique, Cys51. Il en résulte la
libération concomitante de méthionine (Fig. 12). Puis, un pont disulfure intramoléculaire est
formé suite à l’attaque d’une seconde cystéine, Cys198 (appelée cystéine de recyclage) sur
l’intermédiaire acide sulfénique et à la libération d’une molécule d’eau. Le pont disulfure est
ensuite transféré entre la Cys198 et la Cys206. Enfin, il est réduit par le système de réduction
thiorédoxine/thiorédoxine réductase. L’étape limitante de la réduction des méthionines
sulfoxydes par les Msr est associée au recyclage de la thiorédoxine.
MsrA et MsrB réalisent la même réaction catalytique en dépit du fait que ces deux protéines
soient structuralement très éloignées ( elles ne présentent aucune homologie de séquence ou
de structure (Kauffmann et al., 2002)).
3- Organisation génétique et régulation de msrA et msrB
a. Organisation génétique
msrA et msrB comptent parmi les gènes les plus conservés dans le règne du vivant, suggérant
une origine ancestrale commune et une grande importance dans la physiologie cellulaire.
Ainsi, des orthologues de msrA et msrB sont présents dans la plupart des génomes. Pourtant,
44
Introduction Stress oxydant
leur organisation génétique ainsi que le nombre de copies varie d’une espèce à l’autre (Ezraty
et al., 2005). Chez de nombreux procaryotes, dont E. coli et S. typhimurium, msrA et msrB
constituent deux unités de transcription indépendantes avec une localisation chromosomique
opposée. Chez Bacillus subtilis, msrA et msrB forment un opéron. Enfin, chez Neisseria,
msrA et msrB sont fusionnés au sein d’un même gène et codent deux domaines d’une protéine
qui contient également un domaine thiorédoxine (Olry et al., 2002). E. coli possède une copie
de chaque gène alors que Staphylococcus possède trois copies de msrA et une copie de msrB
(Singh et al., 2003).
b. Régulation de msrA et msrB
Chez E. coli et S. typhimurium, les régulateurs de l’adaptation au stress oxydant sont OxyR et
SoxR. Pourtant, ni msrA ni msrB n’appartiennent à leurs régulons. Des travaux portant sur la
régulation de msrA d’E. coli ont révélé que l’activité méthionine sulfoxyde réductase de MsrA
augmentait d’un facteur 3 entre le milieu de phase exponentielle et la phase stationnaire de
croissance indiquant que la transcription de msrA semblait dépendante de la phase de
croissance (Moskovitz et al., 1995). L’étude de la régulation de msrB a, en partie, était
réalisée au laboratoire. Des travaux non publiés réalisés par Julia Bos ont montré que la
régulation de la transcription de msrB était dépendante de l’ARN non codant, RhyB. Cette
régulation est directement liée à la biodisponibilité du fer chez E. coli puisque RhyB est luimême régulé par le régulateur de trafic ferrique, Fur.
4- Les substrats des Msr
a. La protéine ribosomale L12
La protéine ribosomale L12 est impliquée dans la synthèse protéique. Elle possède trois
résidus méthionines sensibles à l’oxydation (Caldwell et al., 1978). L’oxydation des
méthionines en méthionines sulfoxydes entraîne des perturbations fonctionnelles qui
empêchent la protéine L12 de se lier à ses ribosomes et d’assurer sa fonction. Il a été montré
in vitro que l’activité de la protéine L12 pouvait être restaurée après réduction des
méthionines sulfoxydes par MsrA d’E. coli. La protéine L12 a été le premier substrat de MsrA
caractérisé in vitro (Brot et al., 1981).
b. La protéine chaperon GroEL
45
Introduction Stress oxydant
La protéine chaperon GroEL d’E. coli assure le repliement des protéines nouvellement
synthétisées. GroEL est insensible à certaines espèces actives telles que l’oxyde nitrique ou le
peroxyde d’hydrogène mais peut être oxydée par le peroxynitrite ou l’HOCl. L’activité de
GroEL est alors abolie. MsrA et MsrB peuvent réduire les méthionines sulfoxydes de GroEL
et ainsi réactiver l’enzyme in vitro (Khor et al., 2004).
c. Le complexe SRP
Chez E. coli, le complexe SRP (Signal Recognition Particule) reconnait la séquence signal des
protéines en cours de synthèse et les adresse vers la membrane plasmique. Chez les
procaryotes, SRP est une ribonucléoprotéine constituée de l’ARN 4,5S fixant une protéine Ffh
au niveau de son domaine M (car riche en méthionines). Dans l’équipe, il a été montré que
l’oxydation du domaine M de Ffh entraînait la perte de fixation à l’ARN 4,5S et que la
conséquence était un défaut d’exportation des protéines extracytoplasmiques (Ezraty et al.,
2004). L’étude a également montré que Ffh oxydée était un substrat de MsrA et MsrB, et que
ces deux enzymes pouvaient restaurer l’activité de Ffh oxydée. Il s’agit de la première étude
pour laquelle l’implication de MsrA et MsrB a été montrée in vivo.
5- Rôle de MsrA et MsrB dans la pathogénicité
a. Erwinia chrysanthemi
E. chrysanthemi est un pathogène de plantes dont les facteurs de virulence sont
essentiellement des enzymes digestives de la paroi cellulaire des végétaux. MsrA est un autre
exemple de facteur de virulence chez ce phytopathogène exposé à la réponse oxydante des
plantes (Hassouni et al., 1999). Un mutant msrA d’E. chrysanthemi est incapable d’envahir les
feuilles des végétaux ou d’établir une infection systémique.
b. Mycoplasma genitalium
M. genitalium est l’organisme possédant le plus petit génome doué de réplication autonome. Il
est impliqué dans des pathologies humaines telles que des infections respiratoires et
urogénitales. La capacité d’adhérence de M. genitalium sur sa cellule hôte est indispensable
pour le succès de l’infection. MsrA participe à l’établissement de la virulence de M.
genitalium en affectant la capacité d’adhérence de ce dernier, en effet, un mutant msrA est
incapable d’adhérer à des érythrocytes de mouton (Dhandayuthapani et al., 2001).
46
Introduction Stress oxydant
c. Streptococcus pneumoniae
S. pneumoniae est un autre exemple de pathogène pour qui MsrA est importante pour les
capacités d’adhérence du pathogène à sa cellule hôte. Chez S. pneumoniae, un mutant msrA
perd près de 75 % de sa capacité d’adhérence (Wizemann et al., 1996). MsrA participe
également à l’adhérence sur des cellules hôtes chez E. coli et chez Neisseria gonhorrae
(Wizemann et al., 1996).
III- Les catalases
Les catalases sont des enzymes clés du système antioxydant et sont présentes chez la plupart
des organismes vivants. La réaction catalysée par les catalases est la dégradation de deux
molécules de peroxyde d’hydrogène en eau et oxygène :
2H2O2 → H2O + O2
Les catalases constituent une grande famille enzymatique dont une première classification a
été réalisée en 1989 par Goldberg et Hochman, les critères de classification étaient basés sur
les propriétés physicochimiques (Vitesse maximale (Vm), constante catalytique (Kcat)…) de
catalases isolées. L’existence de 3 groupes de catalases avait alors été proposée : les catalases
typiques, les catalases atypiques et les catalases-peroxydases (Goldberg et Hochman, 1989).
Cette classification souleva de nombreux problèmes, notamment dus au fait que les propriétés
des catalases avaient été établies à partir d’enzymes non purifiées à homogénéité, ce qui
engendra de nombreux artefacts. De plus, avec l’apport constant de nouvelles séquences de
catalases, la classification sur les critères physicochimiques fut abandonnée pour une
classification basée sur des critères phylogénétiques (Von Ossowski et al., 1993 ; Mayfield et
Duval, 1996). A ce jour, plus de 300 séquences de catalases sont disponibles dans les banques
de données classifiées soit parmi les catalases monofonctionnelles, soit parmi les catalasesperoxydases, soit parmi les catalases à manganèse.
Dans son génome, S. typhimurium possède une catalase monofonctionnelle, KatE, une
catalase-peroxydase KatG et une catalase à manganèse, KatN (Robbe-Saule et al., 2001).
1- Les caractéristiques des trois groupes de catalases
a. Les catalases monofonctionnelles
La plupart des catalases présentes chez les eucaryotes et chez les procaryotes font parties de
ce groupe. Il s’agit d’enzyme à hème possédant une grande sous-unité (> 75 KDa) et une
47
Introduction Stress oxydant
Figure 13 : Représentation du noyau hémique présent dans le site actif des catalases
monofonctionnelles
Le noyau hémique présent dans le site actif des catalases est constitué d’un atome d’ion ferreux (Fe2+)
qui est coordonné avec un noyau tetrapyrolle de protoporphyrine IX. Les porphyrines sont des
molécules cycliques formées de 4 noyaux pyrolles unies par des liens methenyl.
Introduction Stress oxydant
petite sous-unité (< 60 KDa), structurée en homotétramère. Dans la majorité des cas, la
protoprophyrine IX constitue l’hème (Fig. 13). Ces catalases dégradent l’H2O2 par une
réaction biphasique. Dans la première étape, une molécule d’H2O2 oxyde l’hème de la
protoporphyrine IX en une espèce oxo-férryle (FeIV=O). La seconde molécule d’H2O2 est
utilisée en tant que réductant de l’espèce oxo-férryle pour régénérer l’enzyme en produisant
de l’eau et de l’oxygène :
.+
Por FeIII + H2O2 → Por FeIV=O + H2O
.+
Por FeIV=O+ H2O2 → Por FeIII + H2O + O2
2 H2O2 → 2H2O + O2
Les catalases monofonctionnelles sont divisées en trois clades : le clade 1 est composé
presqu’exclusivement de catalases de plantes et d’un sous-groupe de catalases bactériennes, le
clade 2 est constitué de la grande sous-unité des catalases bactériennes et fongiques et le clade
3, de la petite sous-unité des catalases bactériennes, fongiques, eucaryotes et
d’archaebactéries (Klotz et al., 1997).
La large sous-unité des catalases du clade 2 comprenant des enzymes telles que KatE de S.
typhimurium, est extrêmement résistante à la dénaturation thermique, au pH et à la protéolyse
(Switala et al., 1999). L’activité de KatE augmente jusqu’à 60°C et commence à diminuer à
80°C (Température de melting : 83°C). De plus, KatE possède toujours une activité très forte
en présence de protéinase K à un ratio 1:1 pendant 16 heures à 37°C (Chelikani et al., 2003).
Cette stabilité thermique et la résistance à la dénaturation peuvent être expliquées par la
structure stable et rigide des catalases. La résistance à la protéolyse est un avantage pour KatE
qui est produite en phase stationnaire de croissance, une période où le recyclage des protéines
est rapide et le niveau de protéases élevé.
Les catalases monofonctionnelles n’obéissent pas à la cinétique de Michaelis-Menten (la
vitesse de la réaction n’est pas proportionnelle à la concentration en substrat). La petite-sous
unité est inactivée en présence de 300 à 500 mM d’H2O2 et la grande sous unité à 3 M
(Chelikani et al., 2003).
La caractéristique structurale des catalases monofonctionnelles est un site actif comprenant un
hème profondément enfoui dans une structure en tonneau β. Trois canaux connectent l’hème
avec la surface de l’enzyme. Un des trois canaux semble être considéré comme la principale
route d’acheminement de l’H2O2 vers l’hème. Quatre résidus sont conservés chez les catalases
48
Introduction Stress oxydant
Figure 14 : Structure du site actif impliqué dans l’activité catalase chez les catalases-peroxydases
(Chelikani et al., 2004)
Les catalases-peroxydases possèdent une structure commune localisée dans le site actif et constituée de
la triade Trp111-Tyr238-Met264. Il s’agit d’une structure constituée de liaisons covalentes entre le noyau
indol du tryptophane 111 du site actif, le soufre de la méthionine 264 et le noyau de la tyrosine 238.
Cette triade d’acides aminés est indispensable à l’activité catalase des catalases-peroxydases.
Introduction Stress oxydant
monofonctionnelles, His128, Asn201, Ser167, Tyr415. Ces résidus clés ainsi que l’atome de fer
sont combinés pour réagir avec l’H2O2 (Fita et Rossmann, 1985).
b. Les catalases-peroxydases
Le second groupe de la classification des catalases est le groupe des catalases-peroxydases ou
catalases bifonctionnelles. On trouve des représentants de ces catalases dans les trois règnes
du vivant bien que chez les eucaryotes, elles aient été seulement détectées chez les
champignons. Ces catalases semblent être apparues aprés les catalases fonctionnelles. Leur
poids moléculaire varie de 120 à 340 KDa et en général, ce sont des homodimères bien que
des cas d’homotétramères aient été reportés. Les catalases-peroxydases possèdent une plus
forte identité de séquence avec les peroxydases à hème qu’avec les catalases
monofonctionnelles. En dépit d’une séquence tertiaire et quaternaire très différente, la
réaction catalytique des catalases-peroxydases est la même que celle des catalases
monofonctionnelles :
.+
Por-FeIII + AH2 → Por-FeIV=O + •AH
.+
Por-FeIV=O + AH2 → Por-FeIII + H2O + •AH
2 AH2 + → H2O + 2 •AH
Les catalases-peroxydases sont également capables de catalyser des réactions péroxidatiques.
Malheureusement, le substrat péroxidatique de ces enzymes n’a jamais pu être identifié in
vivo.
Le site actif contenant l’hème est profondément enfoui dans l’enzyme. Le canal acheminant
les substrats approche l’hème latéralement plutôt que perpendiculairement, comme c’est le
cas pour les catalases monofonctionnelles. Une caractéristique de ces enzymes est la présence
d’une structure covalente constituée d’une triade d’acides aminés : le tryptophane présent dan
le site actif (Trp111), la méthionine 264 et la tyrosine 238 (Fig. 14). Le rôle de cette structure
est encore à l’étude même si de nombreuses études semblent indiquer qu’elle est importante
pour l’activité catalase et non pour l’activité peroxydase de l’enzyme. Ainsi, les peroxydases
auraient évolué des catalases-peroxydases suite à l’interruption de la liaison entre les trois
acides aminés, la conséquence aurait été la perte de l’activité catalase (Klotz et al., 2003).
49
Introduction Stress oxydant
c. Les catalases à manganèse
Les catalases à manganèse ont d’abord été classées en tant que pseudo-catalases car elles ne
possédaient pas d’hème dans leur site actif (Kono et al., 1983). A ce jour, les catalases à
manganèse n’ont été identifiées que chez les bactéries. D’après l’arbre phylogénétique des
catalases, elles semblent être apparues après les catalases monofonctionnelles et avant les
catalases-peroxydases (Klotz et al., 2003). Des expériences de cristallographie effectuées à
partir de cristaux des catalases à manganèse de Thermus thermophilus et de Lactobacillus
plantarum ont révélé que le centre catalytique de l’enzyme est un groupement constitué de
deux atomes de manganèse (Allgood et al., 1986 ; Barynin et al., 2001).
Ces enzymes contiennent quatre ou six sous-unités identiques de 30 KDa avec un domaine
extrêmement conservé constitué de 4 hélices (Allgood et al, 1986). Chacune des sous-unités
contient un centre à manganèse binucléaire. Les ligands des atomes de manganèse sont
également conservés. Un canal central permet l’accès au centre binucléaire. Il traverse
chacune des sous-unités et possède des branches dans chacune des sous-unités.
La réaction catalysée par les catalases à manganèse est un processus en deux étapes qui
consiste à l’oxydation des deux atomes de manganèse par l’H2O2, puis à la régénération des
atomes de manganèse par une seconde molécule d’H2O2. Cette réaction produit également de
l’oxygène et de l’eau.
H2O2 + Mn2+- Mn2+ (2H+) → Mn3+- Mn3+ + 2 H2O
H2O2 + Mn3+- Mn3+ → Mn2+- Mn2+ (2H+) + O2
2H2O2 → 2 H2O + O2
Le taux d’élimination de l’H2O2 par ces catalases est inférieur à celui des deux premiers
groupes de catalases car l’efficacité catalytique des catalases à manganèse est beaucoup plus
faible, notamment pour les concentrations en H2O2 très basses.
2- Rôle des catalases dans la physiologie de bactéries pathogènes
a. Helicobacter pylori
H. pylori est une bactérie pathogène qui colonise la muqueuse de l’intestin. Cette bactérie a
l’extraordinaire capacité de survivre à des pH extrêmement acides (1∼2). Suite à l’infection
déclenchée par la bactérie, des cellules immunitaires sont recrutées dans l’estomac. Ces
cellules détruisent les éléments étrangers selon différentes stratégies dont une est la
production de grandes quantités de FAO. H. pylori possède une catalase KatA qui appartient
50
Introduction Stress oxydant
au groupe des catalases monofonctionnelles. KatA est absolument requise pour la survie de la
bactérie en présence de FAO extracellulaires produites par les macrophages ou pour la survie
d’H. pylori dans le phagosome (Wang et al., 2006).
b. Agrobacterium tumefaciens
A. tumefaciens est une bactérie phytopathogène qui déclenche des tumeurs en transférant de
l’ADN (ADN-T) d’un plasmide directement dans le cytosol de la plante à l’aide d’un système
de sécrétion de type IV. Lors d’une interaction entre la plante et A. tumefaciens, une des
premières réponses mises en place par l’hôte est la production et l’accumulation de FAO. A.
tumefaciens possède une catalase KatA dont l’absence résulte en une diminution du pouvoir
pathogène de la bactérie. En effet, un mutant katA est très altéré dans sa capacité à provoquer
des tumeurs sur les feuilles des végétaux (Xu et al., 2000).
c. Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui peut être retrouvée dans les
poumons des personnes contaminées. Etant donnée sa localisation, elle est exposée à de fortes
concentrations en oxygène. Elle possède trois catalases, KatA, KatB et KatE qui appartiennent
au groupe des catalases monofonctionnelles (Lee et al., 2005). Ces trois catalases ont des
implications différentes dans la cellule, parmi elles, KatA contribue à la résistance à l’H2O2, à
l’osmoprotection et a un rôle essentiel chez P. aeruginosa lors d’une infection systémique
dans la souris. KatB et KatE ne participent à la virulence mais à la résistance et à l’adaptation
à l’H2O2.
d. Salmonella typhimurium
Une étude réalisée sur les catalases de S. typhimurium a révélé que le mutant ∆katG ∆katE
n’était affecté ni dans la capacité à proliférer dans les macrophages, ni dans la capacité à
survivre dans la souris (Buchmeier et al., 1995) suggérant que ces enzymes n’avaient pas de
rôle dans la pathogénicité de la bactérie. S. typhimurium possède une troisième catalase, KatN
et jusqu’alors aucune étude n’a été réalisée sur l’implication dans la virulence des trois
catalases de S. typhimurium, KatG, KatE et KatN (Robbe-Saule et al., 2001). L’étude de
KatG, KatE et KatN a fait l’objet d’une partie de cette thèse.
51
Introduction Stress oxydant
(A)
(B)
Figure 15 : Réactions enzymatiques catalysées par les 3 familles de peroxyrédoxines présentes
chez les entérobactéries (Wood et al., 2003)
(A) La décomposition du peroxyde (ROOH) nécessite une base B: pour déprotoner la cystéine
péroxidatique (CysSp), la réactivité de cette cystéine catalytique étant supérieure sous la forme
thiolate qui est plus nucléophile que la forme protonée. Un acide B:H est également nécessaire
pour reprotoner le groupement RO et former ainsi un alcool ou une molécule d’eau. Toutes les
peroxyrédoxines possèdent une arginine conservée dans leur site actif qui permet la diminution
du pKa de la cystéine peroxydatique favorisant ainsi la forme thiolate.
(B) Description complète des réactions de réduction réalisée par les trois familles de
peroxyrédoxines. Chacune des trois réactions est décrite en détail dans le texte.
Introduction Stress oxydant
IV- Les peroxyrédoxines
En plus des catalases, il existe une seconde classe d’enzyme capable d’éliminer l’H2O2, les
peroxyrédoxines. Cette famille d’enzymes porte des noms aussi divers, que peroxydase,
thiorédoxine peroxydase, alkyl hydroperoxyde réductase…. Le terme peroxyrédoxine sera
utilisé pour nommer cette famille. Comme les catalases, ces enzymes sont retrouvées dans les
trois règnes du vivant et dans la quasi-totalité des organismes. Seule, l’espèce Borrelia semble
dépourvue de peroxyrédoxines. Chez les eucaryotes, les peroxyrédoxines peuvent également
avoir un rôle dans la régulation du signalement d’un stress peroxyde.
Les peroxyrédoxines catalysent la réaction suivante :
ROOH + 2e- + 2H+→ ROH + H2O
Dans cette réaction, ROOH peut être du peroxyde d’hydrogène, du peroxynitrite ainsi que
tous les hydroperoxydes organiques existants. Il existe 6 classes de peroxyrédoxines, dont
uniquement 3 sont présentes chez les procaryotes.
La classification des peroxyrédoxines a été effectuée selon le nombre de résidus cystéine
impliqués dans l’action catalytique et selon leur localisation cellulaire. Chez S. typhimurium,
on peut identifier des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines, AhpCF et TsaA, une
peroxyrédoxine atypique à 2 cystéines, Tpx qui est également retrouvée dans la classe des
peroxyrédoxines à 1 cystéine (Fig. 15A et B).
1- Les peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines
a. La réaction catalytique des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines,
l’exemple d’AhpC
La réaction est composée de deux étapes centrées autour d’une cystéine catalytique, nommée
cystéine péroxidatique (Wood et al., 2003). Dans la première étape, la cystéine péroxidatique
(Cys-SpH) attaque le peroxyde et est oxydée en acide sulfénique (Cys-SOH). Cette cystéine
est conservée parmi les peroxyrédoxines de cette famille et est située aux alentours du résidu
50. La seconde étape consiste en la résolution de l’acide sulfénique par une seconde cystéine,
nommée cystéine de résolution. Cette cystéine est également conservée et se situe aux
alentours du résidu 170. Les peroxyrédoxines typiques sont des homodimères contenant donc
deux sites actifs. Dans la seconde étape de la réaction, l’acide sulfénique de la cystéine
péroxidatique de la première sous-unité est attaqué par la cystéine de résolution (Cys-SrH)
localisée dans la partie C-terminale de l’autre sous unité. Cette réaction résulte en la formation
52
Introduction Stress oxydant
AhpF
AhpC
Figure 16 : Voie d’acheminement des électrons à travers AhpF et AhpC (adapté de Jönsson et al.,
2007)
Les électrons transitent du NADH vers l’hydroperoxyde en passant par :
1- Le FAD d’AhpF
2- Les cystéines 345 et 348 d’AhpF
3- Les cystéines 129 et 132 d’AhpF
4- Les cystéines 46 et 165 d’AhpC
Introduction Stress oxydant
d’un pont disulfure stable inter-unité. Ce pont est ultérieurement réduit par des
oxydoréductases spécifiques ou non de la peroxyrédoxine. Ainsi, AhpC est réduit par sa
réductase
dédiée
AhpF,
alors
que
TsaA
est
réduit
par
le
système
général
thiorédoxine/thiorédoxine réductase.
b. Les caractéristiques générales d’AhpC
AhpF, l’oxydoréductase dédiée d’AhpC
ahpC se situe en opéron avec un autre gène, ahpF. Dans les systèmes bactériens où un
homologue d’AhpC existe et possède plus de 55% d’identité de séquence protéique, il y a
invariablement un homologue d’AhpF codé juste après ahpC.
AhpC fonctionne avec un partenaire d’oxydoréduction, AhpF qui est une réductase disulphide
(Fig. 16). AhpF réduit le pont disulfure inter-unité formé par les cystéines péroxidatiques
(Cys46) et de résolution d’AhpC (Cys165). La partie C-terminale d’AhpF (320 résidus) est
homologue avec la thiorédoxine réductase (35 % d’identité de séquence) et contient le motif
C-X-X-C nécessaire à la réduction des ponts disulfures. De plus, AhpF possède un domaine
N-terminal d’environ 200 acides aminés, absent de la thiorédoxine réductase, dans lequel est
retrouvé une seconde fois le motif C-X-X-C. Il semblerait donc qu’AhpF possède un second
site catalytique impliqué dans la réduction des ponts disulfures. Le coenzyme NADH
constitue un autre partenaire du système. Il fournit ses électrons à AhpF pour que celui-ci
retrouve sa forme réduite.
Sensibilité d’AhpC envers l’H2O2
Les peroxyrédoxines ne présentent pas toutes le même comportement de sensibilité en
présence d’H2O2. Il semblerait que les peroxyrédoxines bactériennes soient beaucoup plus
résistantes que les peroxyrédoxines eucaryotes (Yang et al., 2002). AhpC de S. typhimurium
est très robuste face à de l’H2O2. L’inactivation de l’enzyme ne survient qu’en présence de
concentrations de l’ordre de plusieurs molaires d’H2O2. Cette différence serait en partie
expliquée par l’existence de plusieurs motifs sensibles à l’oxydation présents dans la séquence
protéique des enzymes eucaryotes.
Oligomérisation d’AhpC
53
Introduction Stress oxydant
Figure 17 : Structure d’un décamère d’AhpC (Wood et al., 2002)
Lorsqu’AhpC est oxydée, elle forme un pont disulfure inter-unité avec une autre molécule d’AhpC,
elle est alors sous forme dimérique (α2). Les dimères sont A-B, C-D, A’-B’, C’-D’ et E-E’. Chaque
dimère peut également s’associer à 4 autres dimères d’AhpC pour former une structure (α2)5
décamérique. La structure ainsi formée porte le nom de « doughnut ». Le décamère a un diamètre
externe de 115 Å et un diamètre interne de 60 Å.
Chaque molécule d’AhpC est colorée différemment.
Introduction Stress oxydant
Des structures cristallographiques d’AhpC réalisées en 1998 ont montré que cette enzyme
était un homodimère antiparallèle qui pouvait s’oligomériser en décamère (Fig. 17). La
décamérisation est une propriété de l’état réduit de la protéine, alors que l’état oxydé peut être
retrouvé sous toutes les formes oligomériques (Wood et al., 2002). L’oligomérisation aurait
un rôle sur l’activité de l’enzyme, en effet, il semblerait que les décamères soient plus actifs
que les dimères parce que plus stables. Chez les eucaryotes, Tsa1 et Tsa2 sont deux
peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines dont l’oligomérisation leur confère une activité de
chaperon moléculaire. Elles protègent les protéines non repliées de l’agrégation, suite à un
choc thermique (Jang et al., 2004).
c. Régulation d’ahpC
La régulation d’ahpC a été étudiée à l’aide d’un mutant d’oxyR constitutif, OxyR1 (Storz et
al., 1989). OxyR1 a une résistance supérieure à l’H2O2 et surproduit plusieurs protéines.
Parmi ces protéines, AhpC et AhpF ont été identifiées en tant qu’alkyl hydroperoxyde
réductase. Par la suite, des expériences de fusions transcriptionnelles et de footprint ont validé
l’existence de la régulation et des sites de fixation d’OxyR sur la région promotrice d’ahpC
(Tartaglia et al., 1989).
d. Rôle d’AhpC dans la physiologie de bactéries pathogènes
Vibrio vulnificus
V. vulnificus est un pathogène marin pouvant être contracté après ingestion d’aliments
contaminés, responsable de gastroentérites et de septicémies. Chez V. vulnificus, le système
AhpC/AhpF est indispensable pour l’établissement de la virulence (Baek et al., 2009). Un
mutant ∆ahpC est moins cytotoxique envers les cellules hôtes de V. vulnificus et est altéré
dans sa capacité à établir la maladie systémique. Il semblerait qu’AhpC participe à la
virulence de cette bactérie en contrôlant son taux de croissance pendant l’infection.
Staphylococcus aureus
S. aureus est une bactérie pathogène opportuniste souvent associée aux maladies
nosocomiales. Dans son génome, elle possède la catalase KatA et la peroxyrédoxine AhpC. Il
a été montré qu’AhpC participait à la colonisation nasale, étape précédant l’infection
systémique, ainsi qu’à la persistance de S. aureus dans l’organisme (Cosgrove et al., 2007).
En présence de FAO, l’activité enzymatique des deux enzymes peut se compenser
54
Introduction Stress oxydant
mutuellement dans le cas de la perte de l’une d’entre elles, par exemple en l’absence d’AhpC,
KatA est capable d’assurer la protection de S. aureus. Cette compensation fonctionnelle n’est
pas vérifiée dans le modèle d’infection nasale où la présence des deux protéines est requise.
S. typhimurium
Une étude réalisée en 1998 par Taylor et collaborateurs a montré qu’AhpC n’était pas
impliquée dans la virulence de S. typhimurium (Taylor et al., 1998). Dans leurs travaux, les
auteurs ont infecté des souris avec un mutant ∆ahpC par voie intrapéritonéale et ont observé
que la dose létale 50 (DL50) de ce mutant était identique à celle de la souche sauvage. Le
mutant ∆oxyR a également été analysé, de la même façon que pour le mutant ∆ahpC, la DL 50
de ce mutant est identique à celle de la souche sauvage. Dans son génome, S. typhimurium
possède une seconde peroxyrédoxine qui présente des identités de séquence avec TsaA. TsaA
est une peroxyrédoxine typique à deux cystéines qui a été identifiée dans le génome d’H.
pylori (Slonczewski et al., 2000). TsaA constitue une unité de transcription indépendante.
Une étude réalisée en 2001 sur la protéine purifiée a montré qu’elle pouvait fonctionner in
vitro avec le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase (Baker et al., 2001). Aucun
partenaire physiologique n’a encore été identifié. Chez H. pylori, TsaA subit un changement
conformationnel en présence d’H2O2 aboutissant à l’oligomérisation de la protéine (Chuang et
al., 2005). A l’état d’oligomère, la protéine n’a plus fonction de peroxyrédoxine mais de
chaperon.
A l’instar d’AhpC chez S. typhimurium, TsaA possède également une activité peroxynitrite
réductase (Bryk et al., 2000).
Il existe donc deux peroxyrédoxines dans le génome de S. typhimurium. L’étude de
l’implication d’AhpCF et TsaA dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium a fait
l’objet d’une partie de ce travail de thèse.
2- Les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines
a. La réaction catalysée par les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines,
l’exemple de Tpx
La première étape de la réaction catalysée par les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines est
strictement identique à celle décrite pour les peroxyrédoxines typiques. La seconde étape est
par contre différente car ces enzymes sont monomériques (Fig. 15B). Ainsi, la cystéine
péroxidatique et la cystéine de résolution font partie de la même protéine. Il en résulte la
55
Introduction Stress oxydant
formation d’un pont disulfure intra-unité. La position de la cystéine catalytique des
peroxyrédoxines typiques et atypiques n’est pas conservée en terme d’identité de séquence.
La réduction du pont disulfure est réalisée par le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase.
Tpx est une thiol peroxydase de 20 KDa, dimérique, qui a été caractérisée chez E. coli en
1995 au cours d’une étude dont le but était l’identification d’enzymes antioxydantes thioldépendantes (Cha et al., 1995). Tpx possède trois cystéines, Cys95, Cys82, Cys61. La Cys61 est
la cystéine péroxidatique capable de former un pont disulfure avec la Cys95 de la même sousunité au cours de la réduction de peroxydes (Baker et al., 2003). Tpx oxydée est réduite par le
système thiorédoxine/thiorédoxine réductase. La cinétique de réduction de Tpx montre que
Tpx hydrolyse plus rapidement ses substrats qu’AhpC (environ deux fois plus vite) (Baker et
al., 2003). Par contre, Tpx semble montrer une préférence de substrats pour les
alkylhydroperoxydes.
b. Localisation cellulaire de Tpx
La localisation de Tpx a fait débat pendant plusieurs années. Tpx ne possède ni séquence
signal Sec-dépendante ni motif twin-arginine (RR) dans son segment N-terminal, mais a
pourtant été décrite comme étant localisée dans le périplasme (Cha et al, 1995). Au cours de
cette étude, les auteurs ont réalisé des expériences de fractionnement cellulaire suivies d’un
marquage protéique à l’aide d’anticorps dirigés contre Tpx et ont montré que cette dernière
était localisée dans le périplasme de S. typhimurium. En 2008, une autre étude (Tao, 2008) a
été publiée sur la localisation cytoplasmique de Tpx. In vitro, la thiorédoxine 1 et la
thiorédoxine réductase (TrxC), protéines cytoplasmiques, servent de systèmes réducteurs pour
recycler Tpx (Baker et al, 2003). L’auteur de l’étude a utilisé cette propriété pour montrer que
Tpx était également cytoplasmique. Au cours de cette étude, un variant de la thiorédoxine 1 a
été utilisé dans lequel la cystéine péroxidatique a été mutée en sérine. Ainsi, le pont disulfure
formé entre la cystéine de Tpx et la cystéine péroxidatique de Trx1 ne pouvait pas être résolu.
Il en a résulté la formation de complexes Trx1-S-S-Tpx visualisables sur gel SDS-PAGE en
conditions non réductrices suivi d’un marquage protéique avec des anticorps dirigés contre
Tpx. L’auteur a ainsi conclu que, chez S. typhimurium, Tpx était localisée dans le cytoplasme.
c. Régulation de tpx
La régulation de tpx a lieu à un niveau transcriptionnel ainsi que post-transcriptionnel et
semble reliée à l’oxygène. A l’aide d’une fusion transcriptionnelle tpx-lacZ, il a été montré
56
Introduction Stress oxydant
que la transcription de tpx était réprimée en anaérobiose par les régulateurs transcriptionnels
ArcA et Fnr (Kim et al., 1999). Enfin, dans une étude récente, il a été montré que tpx subissait
une régulation post-transcriptionnelle via un ARN non codant, ArcZ (Papenfort et al., 2000).
ArcZ reconnait et s’apparie à une région inclue dans la partie codante de tpx, entraînant ainsi
la répression de l’ARNm tpx.
d. Rôle de Tpx dans la physiologie des bactéries pathogènes
Mycobacterium tuberculosis
M. tuberculosis est un pathogène intracellulaire qui s’établit au sein des macrophages durant
son cycle infectieux. Il est alors exposé aux FAO et FAN produites par la NADPH phagocyte
oxydase et la NO. synthase inductible. Pour lutter contre les effets du stress oxydant, M.
tuberculosis possède 22 protéines possédant des activités antioxydantes. Parmi ces protéines,
il a été montré que Tpx était importante pour la survie de M. tuberculosis dans la souris, au
cours de l’infection systémique, ainsi que pour la prolifération dans les macrophages (Hu et
al., 2009).
Enterococcus faecalis
E. faecalis fait partie du microbiote intestinal retrouvé chez les humains et chez beaucoup
d’autres animaux. Dans certaines conditions, E. faecalis peut devenir un pathogène
opportuniste. Au cours de son trajet infectieux, ce microorganisme se retrouve dans les
macrophages. Pour lutter contre les FAO produites dans le macrophage, E. faecalis posséde
Tpx qui est primordiale pour l’établissement de l’infection (La Carbona et al., 2007). Chez
cette bactérie, tpx appartient au régulon hypR qui est un homologue d’OxyR.
3- Les peroxyrédoxines à 1 cystéine
Dans cette classe de peroxyrédoxines, seule la cystéine péroxidatique est conservée (Fig.
15B). L’acide sulfénique généré par la réaction avec les peroxydes est réduit par un donneur
d’électrons possédant un groupement thiol, mais l’identité de ce partenaire d’oxydoréduction
n’a pas encore été découverte. Il a été proposé que le glutathion puisse jouer ce rôle (Wood et
al., 2003). Ainsi, par analogie, ce donneur thiolé doit former un pont disulfure avec l’enzyme,
qui doit être réduit par un second donneur d’électron thiolé, recyclant ainsi l’enzyme.
Chez Mycobacterium, il a été montré que la cystéine de résolution, qui forme le pont disulfure
avec la cystéine péroxidatique, n’est pas indispensable pour l’activité de Tpx (Trujillo et al.,
57
Introduction Stress oxydant
2006). Dans cette étude, la cystéine de résolution a été mutée en sérine, et les auteurs ont
montré que cette substitution n’affectait ni l’état d’oxydation de Tpx, ni sa réduction par des
partenaires tels que le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase.
58
RESULTATS
Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène
dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium :
caractérisation du mutant Hpx°
Résultats Partie 1
(A)
(B)
10
1
1
0,1
0,1
DO 600 nm
10
wt
wt
Hpx°
Hpx°
0,01
0,01
0
100
200
300
400
0
500
100
200
300
400
500
Temps (min)
Temps (min)
(C)
DO 600 nm
1
0,1
wt
Hpx°
wt + H
H202
2O2
Hpx° + H
H2O2
2O2
0,01
0
200
400
600
Temps (min)
Figure 1 : Croissance en milieu riche et en milieu minimum de la souche sauvage et du
mutant Hpx°
(A) Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été réalisées en milieu LB, à
37°C et en aérobie. Le lendemain, ces précultures ont été diluées à DO600 = 0,01 en LB et la
croissance a été suivie.
(B) Même protocole que (A). Les souches ont poussé en milieu minimum glucose 0,2% et
casamino acides 0,1%.
(C) Même protocole que (A). Les souches ont été diluées à DO600 = 0,05 en milieu minimum
glucose 0,2%. De l’ H2O2 a été ajouté dans certaines cultures bactériennes à une concentration
finale de 25 µM.
Résultats Partie 1
Les catalases et les peroxyrédoxines sont des enzymes impliquées dans l’élimination de
l’H2O2 produit par le métabolisme aérobie (Seaver et al., 2001), ou rencontré dans
l’environnement. Une étude réalisée chez E. coli a montré qu’un mutant dépourvu des
catalases KatG et KatE et de la peroxyrédoxine AhpCF, appelé Hpx, n’est plus capable
d’éliminer l’H2O2 (Seaver et al., 2001). C’est pourquoi, nous avons construit un mutant Hpx
équivalent à celui d’E. coli dont nous avons testé la virulence ainsi que d’autres propriétés
phénotypiques. Les résultats obtenus ont montré que les propriétés phénotypiques du mutant
Hpx de S. typhimurium étaient proches de celles de la souche sauvage. Les résultats de ces
expériences sont présentés dans le chapitre des méthionine sulfoxyde réductases (voir chapitre
« Methionine sulfoxyde réductases » p. 74). Ils démontrent que l’inactivation des gènes katG,
katE et ahpCF n’a pas les mêmes conséquences chez E. coli et chez S. typhimurium. Chez
cette dernière, une troisième catalase, KatN, a été identifiée (Robbe-Saule et al., 2001). Nous
avons alors construit le mutant Hpx° dépourvu des trois gènes codant pour les catalases KatG,
KatE et KatN ainsi que du gène codant pour la peroxyrédoxine, AhpCF. La caractérisation du
mutant Hpx° fait l’objet de ce chapitre.
I-
Construction du mutant 12023 ∆ahpCF ∆katG ∆katE katN::cat (Hpx°)
Le gène katE a été inactivé dans la souche 12023 (ATCC 14028) de S. typhimurium selon la
technique de Wanner et Datsenko (Datsenko et Wanner, 2000). Il s’agit d’une double
recombinaison homologue entre le plasmide pKD4, codant pour un gène impliqué dans la
résistance à la kanamycine et katE. Un lysat a ensuite été obtenu à partir de la souche 12023
katE::kan à l’aide du phage P22, spécifique de S. typhimurium. Ce lysat a permis de transduire
l’allèle muté katE::kan dans une souche sauvage. Les gènes katG, katN et ahpCF ont été
inactivés et les mutations correspondantes transduites selon les mêmes méthodes. Deux
mutants ont été construits, 12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan (Hpx) et 12023 ∆ahpCF ∆katG
∆katE katN::cat (Hpx°).
II- Caractérisation phénotypique du mutant Hpx°
Dans le but d’étudier la contribution d’AhpCF, de KatG, de KatE et de KatN dans la
physiologie de S. typhimurium, la croissance du mutant Hpx° a été comparée à celle de la
souche sauvage en milieu LB et milieu minimum (Fig. 1A et 1B). En milieu LB, à 37°C et en
aérobie (Fig. 1A), les deux souches ont un temps de génération de 25 minutes. En milieu
59
Résultats Partie 1
1,00E+10
1,00E+09
1,00E+08
cfu/ml
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
wt
1,00E+03
Hpx°
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0
24
48
72
Temps (heures)
Figure 2 : Dénombrement de la souche sauvage et du mutant Hpx° après 72 heures de croissance en
milieu LB
Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été réalisées en LB et en aérobiose. Ces
précultures ont été diluées à DO600 = 0,05. A t0h, t24h, t48h et t72h après ensemencement, des aliquots de
culture ont été prélevés et les cfu dénombrées 24 h après incubation à 37°C.
Résultats Partie 1
minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1%, les deux souches ont un temps de
génération de 35 minutes (Fig. 1B). Ainsi, les croissances de la souche sauvage et du mutant
Hpx° sont identiques en milieu riche et en milieu minimum. L’absence d’AhpCF, KatG, KatE
et KatN n’affecte donc pas la croissance de S. typhimurium.
Chez E. coli, il a été montré que le mutant ∆ahpCF ∆katG ∆katE (Hpx) est auxotrophe pour la
leucine (Jang et al, 2006). Dans ce mutant, une enzyme à centre Fer/Soufre impliquée dans la
voie de biosynthèse de la leucine, l’isopropylmalate isomérase (IPMI), est non fonctionnelle.
Afin d’analyser si les catalases et les peroxyrédoxines de S. typhimurium protègent également
l’IPMI de l’oxydation et de l’inactivation, la croissance de la souche sauvage de S.
typhimurium a été comparée à celle du mutant Hpx° en milieu minimum glucose 0,2 % (Fig.
1C). Dans le but d’accentuer les effets du stress oxydant sur la physiologie de S. typhimurium,
la croissance a également été analysée en présence d’H2O2 à une concentration finale de
25µM (Fig. 1C). En milieu minimum glucose 0,2% avec ou sans ajout d’H2O2, la croissance
du mutant Hpx° est faiblement altérée par rapport à celle de la souche sauvage. Ces résultats
démontrent que le mutant Hpx° ne présente pas d’auxotrophie. Il semblerait ainsi que l’IPMI
soit fonctionnelle dans le mutant Hpx° suggérant que le système enzymatique impliqué dans
la dégradation de l’H2O2 est différent chez E. coli et chez S. typhimurium.
Afin d’étudier l’implication de katG, katE, katN et ahpCF dans l’adaptation de S.
typhimurium à la phase stationnaire de croissance, nous avons comparé la croissance de la
souche sauvage et du mutant Hpx° sur des périodes d’incubation allant de 24 à 72 heures.
Dans cette expérience, la souche sauvage et le mutant Hpx° ont été ensemencées à DO600 =
0,05 en LB. Des aliquots de culture ont été prélevés à t0h, t24h, t48h et t72h après
ensemencement, dilués de façon appropriée, étalés sur boîte LB et enfin dénombrés (Fig. 2).
Le nombre de cfu (colony forming unit) de la souche sauvage et du mutant Hpx° augmente
d’environ deux logarithmes 24 heures après ensemencement (2.107 cfu/ml à t0h et environ
4.109 cfu/ml à t24h), il est de 4,4.109 cfu/ml pour la souche sauvage et de 2.109 cfu/ml pour le
mutant Hpx° à t48h et de 1,4.109cfu/ml à t72h pour les deux souches. La souche sauvage et le
mutant Hpx° présentent un comportement similaire, suggérant qu’AhpCF, KatG, KatE et
KatN ne jouent pas de rôle majeur dans l’adaptation de S. typhimurium à la phase stationnaire
de croissance.
60
Résultats Partie 1
10
wt
DO 600 nm
Hpx°
1
0,1
0
100
200
300
400
500
600
Temps (min)
wt
1,00E+10
Hpx°
1,00E+09
1,00E+08
cfu/ml
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0
45
90
Temps aprés ajout de l’H2O2 (min)
Figure 3 : Croissance et dénombrement de la souche sauvage et du mutant Hpx° après exposition à
2,5 mM d’H2O2
Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été
diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été rajouté dans le milieu de
croissance. 0, 45 et 90 minutes après stress, des aliquots de culture ont été prélevés, puis étalés après
dilution sur boîte LB. 24 heures après incubation à 37°C, les colonies ont été dénombrées. La croissance
est représentée en haut et le dénombrement sur boîte LB en bas.
Résultats Partie 1
III- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° au peroxyde d’hydrogène
Dans le but de caractériser l’implication de KatG, KatE, KatN et TsaA dans la protection de S.
typhimurium face au stress oxydant, nous avons, d’une part, analysé le comportement du
mutant Hpx° en présence d’H2O2 et nous avons, d’autre part, analysé son aptitude à dégrader
l’H2O2.
Pour évaluer l’impact de KatG, KatE, KatN et TsaA sur la croissance de Salmonella, nous
avons entrepris la caractérisation d’Hpx° en testant sa capacité à pousser en milieu LB et en
présence d’H2O2. Pour cela, des bactéries en phase exponentielle de croissance (DO600 = 0,3)
en milieu LB ont été exposées à de l’H2O2 à une concentration finale de 2,5 mM (Fig. 3). Des
aliquots de culture ont été prélevés 0, 45 et 90 minutes après ajout de l’H2O2 et dénombrés 24
heures après étalement sur boîte LB. L’ajout d’H2O2 ne semble pas affecter la croissance de la
souche sauvage. Ce résultat est confirmé par le fait que le nombre de cfu augmente d’un
demi-logarithme 90 minutes après ajout de l’H2O2 (5.108 cfu/ml à t0’ et 2.109 cfu/ml à t90’). Par
contre, la croissance du mutant Hpx° est immédiatement arrêtée après ajout de l’H2O2. Le
nombre de cfu de ce mutant chute d’environ un logarithme 90 minutes après ajout de l’H2O2
(9.108 cfu/ml à t0’ et 2.108 cfu/ml à t90’). Ainsi, la croissance du mutant Hpx° est affectée par
l’H2O2 dans les conditions testées. Les catalases KatG, KatE, KatN et la peroxyrédoxine
AhpCF permettent donc à S. typhimurium de pousser en présence d’H2O2 exogène.
Pour préciser la contribution des catalases et de la peroxyrédoxine dans la dégradation du
peroxyde d’hydrogène, nous avons testé les capacités du mutant Hpx° à éliminer l’H2O2 en
milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1% (Fig. 4). Pour réaliser ce test, nous
avons utilisé une propriété de l’H2O2 qui est sa capacité à diffuser librement à travers les
membranes. Ainsi, la concentration en H2O2 intracellulaire est équivalente à la concentration
en H2O2 extracellulaire. La concentration en H2O2 dans le milieu de culture a été mesurée par
un test utilisant l’Amplex Red et l’« Horseradish » peroxydase (HRP) (Fig. 4A). En présence
d’H2O2 et d’HRP, l’Amplex Red est oxydé en un composé fluorescent, la résorufine, dosable
à 587 nm. Nous avons observé que la souche sauvage éliminait rapidement (15 minutes) la
totalité de l’H2O2 présent dans le milieu de culture (Fig. 4B). Sa vitesse de dégradation est de
1,07 µM d’H2O2/minute (Fig. 4C). La courbe d’élimination d’H2O2 du mutant Hpx° présente
deux phases. Une première phase très rapide (15 minutes) pendant laquelle la quasi-totalité de
61
Résultats Partie 1
(A)
(B)
25
wt
Amplex Red
20
Résorufine
Hpx°
[H2O2] µM
Horse Radish
Peroxydase
15
10
5
0
0
1ère phase
50
2ème phase
100
Temps (min)
(C)
Vitesse de disparition de l'H2O2
(µM/min)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
wt
Hpx° 1ère phase
Hpx° 2nde phase
Figure 4 : Capacité d’élimination de l’H2O2 de la souche sauvage et du mutant Hpx°
La souche sauvage et le mutant Hpx° ont été cultivés en milieu minimum glucose 0,2% et
casamino acides 0,1% jusqu’à DO600 = 0, 3 puis dilués à DO600 = 0,1. De l’ H2O2 a été rajouté à
une concentration finale de 20 µM. Des aliquots ont été prélevés toutes les 15 minutes pour
mesurer la concentration en H2O2 restante dans le milieu.
(A) Réaction d’oxydation de l’Amplex Red en résorufine, composé dosable à 587 nm.
(B) Courbe de vitesse de disparition de l’H2O2.
(C) Vitesse de disparition de l’H2O2 de la souche sauvage et du mutant Hpx°. La 1ère phase et la 2nde
phase sont représentées sur le graphique (B), la 1ère phase correspond au premier quart d’heure de
l’expérience, la 2nde phase correspond aux deux heures suivantes.
Résultats Partie 1
l’H2O2 a été dégradée, puis une seconde phase (2 heures) pendant laquelle l’élimination de
l’H2O2 restant est beaucoup plus lente. La vitesse d’élimination de l’H2O2 du mutant Hpx°
pendant la première phase est de 0,8 µM d’H2O2/min et de 0,016 µM d’H2O2/min durant la
seconde phase (Fig. 4C). KatG, KatE, KatN et AhpCF participent, ainsi, à l’élimination de
l’H2O2. De plus, ces travaux suggèrent que S. typhimurium possède encore une enzyme
impliquée dans l’élimination de l’H2O2.
IV- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° à l’anion superoxyde et l’ion carbonate
Dans le but de contrôler la spécificité des catalases et d‘AhpCF envers l’H2O2, la sensibilité
du mutant Hpx° a été testée en présence de paraquat, un générateur d’anion superoxyde, et de
bicarbonate, générateur d’ion carbonate, au cours de deux expériences différentes.
Afin de tester la sensibilité du mutant Hpx° au paraquat, une expérience de concentration
minimale inhibitrice (CMI) a été effectuée (Fig. 5A). Trois concentrations en paraquat ont été
utilisées : 20 mM, 50 mM et 100 mM. Le diamètre d’inhibition de croissance de la souche
sauvage et du mutant Hpx° est le même quelle que soit la concentration en paraquat (Fig. 5A).
L’ion carbonate constitue un oxydant puissant, capable de diffuser librement sous la forme
HCO3-. Nous avons donc testé la sensibilité du mutant Hpx° au bicarbonate, un générateur
d’ion carbonate. Des expériences de numération de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont
été effectuées en présence de 10 mM de carbonate (Fig. 5B). Aucune différence de sensibilité
n’a été observée puisque le nombre de cfu de la souche sauvage et du mutant Hpx° est de
3.108 cfu/ml sur boîte LB et sur boîte LB/HCO3-. Les catalases KatG, KatE, KatN et la
peroxyrédoxine AhpCF ne semblent donc impliquées ni dans l’élimination de l’anion
superoxyde, ni dans l’élimination du carbonate. Ces résultats suggèrent une spécificité de ces
enzymes pour l’H2O2.
V- Etude du profil d’oxydation protéique du mutant Hpx° chez S. typhimurium
A l’exception des résidus cystéines et méthionines, l’oxydation des acides aminés est un
processus irréversible qui peut aboutir à la dégradation de la protéine. Nous avons voulu
savoir si le défaut d’élimination d’H2O2 du mutant Hpx° pouvait entraîner l’oxydation et la
dégradation des protéines de S. typhimurium. Pour cela, nous avons comparé les contenus
protéiques de la souche sauvage et du mutant Hpx° par des électrophorèses en deux
dimensions. Après comparaison des profils protéiques obtenus à partir de gels SDS-PAGE
62
Résultats Partie 1
(A)
18
Diamètre d'inhibition (mm)
16
14
wt
Hpx°
12
10
8
6
4
2
0
20 mM
50 mM
100 mM
(B)
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+07
cfu/ml
1,00E+06
wt
1,00E+05
Hpx°
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
LB
LB + HCO3-
Figure 5 : Numération de la souche sauvage et du mutant d’Hpx° en présence d’O2.- et d’HCO3Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été réalisées en milieu LB et en aérobiose.
(A) Une surcouche bactérienne a été réalisée sur une boîte LB en mélangeant 150 µl de préculture
bactérienne et 3 ml d’agar mou, pour chacune des deux souches. A la surface de la surcouche, un disque
d’ouate imbibé de paraquat à différentes concentrations a été déposé. Le diamètre d’inhibition de
croissance a été mesuré après 24 heures de croissance.
(B) A DO600 = 0,5, des aliquots ont été prélevés et étalés soit sur boîte LB, soit sur boîte LB contenant 10
mM d’HCO3- . Les colonies ont été dénombrées 24 h après incubation à 37°C.
Résultats Partie 1
(Fig. 6), nous avons observé la disparition de 5 spots sur le gel du mutant Hpx° (spots 1, 2, 3,
4 et 5 sur les gels) et d’un spot sur le gel de la souche sauvage (spot 6). Des bandes de gel
correspondants aux spots disparus ont été découpées et traitées sur microplaque dans le but
d’identifier les protéines correspondantes par spectrométrie de masse après digestion par la
trypsine. Les résultats sont présentés sur la figure 6. Les 5 spots absents dans le mutant Hpx°
sont respectivement (1) la protéine flagellaire FliC, le facteur d’élongation Ts, un mélange
entre le facteur d’élongation Ts et une déshydrogénase, une protéine de dégradation des
acides gras FadH et une protéine de fixation aux nucléotides. Le spot absent dans la souche
sauvage correspond à une protéine de fixation aux nucléotides. Ainsi, l’absence des 3
catalases et d’AhpCF entraîne des modifications du contenu protéique Hpx°.
Dans le but d’étudier si les protéines précédemment identifiées par spectrométrie de masse
sont oxydées et dégradées dans le mutant Hpx°, nous avons entrepris l’étude de la
fonctionnalité de FadH dans ce mutant. FadH (spot 4), ou la 2,4-dineoyl-CoA-réductase, est
une enzyme impliquée dans la dégradation des acides gras. Elle catalyse la réaction NADHdépendante du 2,4-dineoyl-CoA en 2-trans-enoyl-CoA (Fig. 7A). Il a été proposé que FadH
soit indispensable pour la croissance d’E. coli en présence d’acides gras insaturés à nombre
pair de carbone (You et al., 1989). Des croissances en milieu minimum ont donc été réalisées
avec comme source de carbone soit des acides gras insaturés à nombre impair de carbone
(acide oléique, acide 9-cis-octadénoïque), soit à nombre pair de carbone (acide pétrosélinique,
acide 6-cis-octadénoïque) (Fig. 7B). Les résultats obtenus montrent que le mutant Hpx° est
capable de pousser en présence d’acides gras insaturés à nombre de carbone. Deux hypothèses
peuvent expliquer ce résultat : soit une partie du pool de FadH produit par le mutant Hpx°
n’est pas oxydée et est donc encore fonctionnelle, soit la contribution de FadH à la croissance
de S. typhimurium en présence d’acides gras insaturés à nombre pair de carbone n’est pas
indispensable. Dans le but de tester cette seconde hypothèse, nous avons entrepris une
nouvelle approche qui a consisté à utiliser une souche d’E. coli dépourvue du gène fadH.
La croissance du mutant ∆fadH a été suivie en milieu minimum contenant soit des acides gras
insaturés à nombre pair de carbone, soit à nombre impair de carbone (Fig. 7C). Nous avons
observé que le mutant ∆fadH est capable de pousser en présence d’acides gras insaturés à
nombre pair de carbone suggérant que FadH n’est pas indispensable à la croissance d’E. coli.
Ainsi, nos expériences n’ont pas reproduit les résultats précédemment publiés par You et
63
Résultats Partie 1
(B)
(A)
KDa
1
1
175
83
2
62
47,5
2
3
3
32,5
25
6
6
5
5
4
4
16,5
6,5
Figure 6 : Analyse par electrophorèse en deux dimensions d’extraits protéiques de la souche sauvage
et du mutant Hpx°.
Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été
diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 1, des aliquots de cultures bactériennes ont été prélevés
puis lysés par la presse de French afin d’obtenir des extraits protéiques. Ces extraits protéiques ont été
centrifugés 30 minutes à 13000 rpm. Un gel SDS-PAGE en deux dimensions a été réalisé à l’aide des
surnageants des deux souches. Le gel a été révélé au bleu colloïdal. Les protéines cibles ont été identifiées
par spectrométrie de masse.
(A) Profil de séparation des protéines cytoplasmiques de la souche sauvage
(B) Profil de séparation des protéines cytoplasmiques du mutant Hpx°
Les flèches rouges indiquent les protéines présentes, les flèches bleues indiquent les protéines absentes.
1: FliC; 2: Facteur d’élongation Ts; 3: Mélange de deux protéines (Facteur d’élongation Ts et une
déshydrogénase); 4: FadH; 5: protéine putative de fixation à l’ADN; 6: protéine de fixation aux
Nucléotides.
L’échelle de poids moléculaire est représentée à gauche, elle est exprimée en kilodalton.
Résultats Partie 1
collaborateur (1989), et la caractérisation de la fonctionnalité de FadH dans le mutant Hpx°
n’a pas été poursuivie.
VI- Etude de la virulence du mutant Hpx°
1- Indice de prolifération du mutant Hpx° dans des macrophages murins
Afin de savoir si KatG, KatE, KatN et AhpCF étaient importantes pour la survie et la
prolifération de S. typhimurium en condition d’infection, des expériences d’infection de
macrophages murins ont été réalisées avec la souche sauvage et le mutant Hpx°.
Les capacités de prolifération de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été testées dans des
macrophages issus d’une lignée cellulaire, les RAW 264.7. Les lysats cellulaires obtenus
après passage des bactéries dans les macrophages, afin de dénombrer les bactéries ayant
survécu à l’infection, ont été étalés soit sur boîte LB, soit sur boîte LB contenant de la
catalase. En effet, plusieurs études ont montré que la gélose LB constituait un environnement
oxydant pour les bactéries (James Imlay, EcoSal Module « 5.4.4 » ; Cuny et al., 2007). Le
mutant Hpx° est dépourvu de 4 gènes impliqués dans la détoxication de l’H2O2 et présente
une forte sensibilité à l’H2O2 (Voir Section III de ce chapitre). Afin de diminuer les effets du
stress oxydant pouvant être subis par le mutant Hpx° lors de l’étalement, une partie des boîtes
LB utilisées a été additionnée de 2000 unités de catalase purifiée.
Des expériences de prolifération dans des RAW 264.7 ont été effectuées. Dans chacune des
expériences réalisées, les indices de prolifération obtenus à partir des dénombrements
effectués sur les boîtes LB variaient d’une expérience à l’autre (Fig. 8A). Par contre, sur
boîtes LB additionnées de catalases, les indices de prolifération du mutant Hpx° étaient
toujours supérieurs à celui de la souche sauvage (Fig. 8B). Ainsi, l’ajout de catalase sur la
boîte LB stabilise la capacité du mutant Hpx° à former des colonies après passage dans les
macrophages. Le fait que la variation de l’indice de prolifération du mutant Hpx° soit abolit
lorsqu’on ajoute de la catalase sur la boîte LB laisse supposer que ce mutant a accumulé des
dommages oxydatifs au cours de l’infection. Ainsi, S. typhimurium percevrait du stress
oxydant en condition d’infection dans le macrophage.
Cependant, au cours de l’expérience préparant les bactéries à l’infection, ces dernières
subissent différents traitements « stressants ». Ainsi, fin de nous assurer que l’accumulation
de dommages oxydatifs du mutant Hpx° était dûe à l’environnement du macrophage et non
aux stress liés au protocole utilisé, des contrôles de viabilité ont été effectués. Nous avons
64
Résultats Partie 1
(A)
(B)
1
1
3
4
DO 600 nm
2
∗
∗
0,1
wt A.O.
Hpx° A.O
wt A.P.
5
Hpx° A.P.
0,01
0
100
200
300
400
Temps (min)
(C)
DO 600 nm
1
wt A.O.
0,1
fadH- A.O.
wt A.P.
fadH- A.P.
0,01
0
100
200
300
400
Temps (min)
Figure 7 : Etude de l’état d’oxydation de FadH dans la souche Hpx°
(A) Produits de dégradation de l’acide linoléique (1), 4-cis-decenoyl CoA (2), 2-trans-4-cis-decadienoyl
CoA (3), 2-trans-decenoyl CoA (4); decenoyl CoA (5). FadH catalyse la réaction marquée d’une
astérisque.
(B) Des précultures des deux souches en milieu minimum glucose 0,2 % ont été utilisées pour ensemencer
soit un milieu minimum avec 0,05 % d’acide oléique (A.O.), soit avec 0,05 % d’acide pétrosélinique
(A.P.). La croissance de la souche sauvage et du mutant Hpx° a été suivie à DO 600 nm.
(C) Même expérience que (B) , la souche sauvage d’E. coli MG1655 et le mutant ∆fadH ont été testés.
Résultats Partie 1
réalisé une expérience d’infection en soumettant la souche aux différents traitements subis au
cours de l’infection : carence nutritionnelle, stress thermique et détergent (Fig. 8C). Les
résultats obtenus montrent qu’il n’y a pas de différence de viabilité entre les deux souches
quelles que soient les conditions testées (Fig. 8D).
Au cours de ces expériences, nous avons, donc, observé que l’indice de prolifération du
mutant Hpx° fluctuait lorsqu’il était calculé à partir des dénombrements effectués sur boîte
LB. Ce phénomène est abolit lorsque de la catalase est ajouté sur les boîtes LB. Ainsi, S.
typhimurium semble accumuler du stress oxydant en condition d’infection, qui l’altère dans sa
capacité à former des colonies lorsqu’elle est étalée sur une boîte LB. Par contre, lorsque la
bactérie est étalée sur boite dont le niveau de stress oxydant est moindre, S. typhimurium
restaure sa capacité à former des colonies. En conclusion, S. typhimurium perçoit du stress au
cours de l’infection, mais ce stress n’est pas suffisant pour tuer la bactérie.
2- Survie du mutant Hpx° en condition d’infection dans les souris
Dans le but d’analyser le rôle des catalases et des peroxyrédoxines dans l’établissement de la
virulence chez la souris, une expérience de compétition entre la souche sauvage et le mutant
Hpx° a été entreprise. Au préalable, les capacités du mutant Hpx° à entrer en compétition
avec la souche sauvage ont été contrôlées en milieu LB additionné de catalase. Pour cela, les
deux souches ont été ensemencées simultanément en milieu LB. Trois aliquots de culture ont
été prélevés 0, 24h et 48h après ensemencement du milieu, puis étalés sur boîte appropriée
(voir Chapitre « Matériel et Méthodes »). A t0h, « l’input » a été calculé : il s’agit du rapport
entre le nombre de cfu du mutant Hpx° et le nombre de cfu de la souche sauvage à t0h. A t24h
ou t48 h, « l’output » a été calculé : il s’agit du rapport entre le nombre de cfu du mutant Hpx°
et le nombre de cfu de la souche sauvage à t24h ou t48h. Enfin, l’index de compétition 24 heures
et 48 heures a été déterminé : il est défini comme étant le rapport entre output et input.
L’index de compétition du mélange Hpx° et souche sauvage est de 0,6, 24 heures après
ensemencement et de 1,3, 48 heures après ensemencement (Fig. 9A). Ce résultat signifie que
le mutant est faiblement altéré dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche
sauvage 24 heures après ensemencement. Cette différence n’est plus visible 48 heures après
ensemencement. Ce résultat suggère que les mutations n’entraînent pas de défaut dans la
compétitivité de S. typhimurium en milieu LB pendant 48 heures.
65
Résultats Partie 1
(B)
Indice de prolifération (cfu 16h/ cfu 2h)
Indice de prolifération (cfu 16h/ cfu 2h)
(A) 18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
wt
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Hpx°
(C)
wt
Hpx°
(D)
Préculture en LB
Préculture à 4°C
Carence et stress oxydant
1,00E+09
wt
1,00E+08
Hpx°
1,00E+07
Stress thermique
Opsonisation à 4°C
Azide de sodium
Infection
cfu/ml
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
Lyse des macrophages
Triton 0,1%
1,00E+01
1,00E+00
Ensemencement
des bactéries intracellulaires
Stress oxydant
sur gélose LB
Culture de
nuit
4°C
Azide de
sodium
Triton
0,1%
Figure 8 : Indice de prolifération de la souche sauvage et du mutant Hpx° dans différentes lignées
de macrophages
(A) Des macrophages RAW 264.7 ont été infectés par des cultures bactériennes à une dose infectieuse de
50 bactéries par cellule. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées au triton 0,1%
et les bactéries intracellulaires ont été étalées sur boîte LB. 24 heures après, les colonies ont été
dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé (cfu 16h/ cfu 2h).
(B) Même expérience que (A). Les bactéries intracellulaires ont été étalées sur boîtes LB additionnées de
2000 unités de catalase.
(C) Diagramme des différentes étapes du protocole utilisé pour l’infection de macrophages. A chacune
de ces étapes, S. typhimurium est soumise à des stress de différente nature.
(D) Expérience de viabilité du mutant Hpx° face aux stress rencontrés durant le protocole d’infection
Résultats Partie 1
Le même inoculum bactérien composé de la souche sauvage et du mutant Hpx° a été injecté à
des souris BALB/c par voie intra-péritonéale. Les deux souches ont été inoculées à 105
bactéries/ml dans un ratio 1:1. L’index de compétition obtenu après 48 heures d’infection est
de 0,6 indiquant que ce mutant est faiblement altéré dans sa capacité à entrer en compétition
avec la souche sauvage dans la souris (Fig. 9B). En LB, l’index de compétition obtenu était
également de 0,6 (Fig. 9A). Ainsi, le défaut de compétitivité du mutant Hpx° en milieu LB se
traduit également par un défaut de compétitivité en condition d’infection. Ce résultat montre
qu’une altération métabolique de S. typhimurium peut influencer sa capacité à être virulente.
Les mutations des gènes codant pour KatG, KatE, KatN et AhpCF affectent donc pas la
capacités de virulence de S. typhimurium en condition d’infection dans la souris.
VII-
Etude de la contribution individuelle des catalases KatG et KatE
Dans le but d’évaluer la contribution individuelle des catalases dans la résistance à l’H2O2,
katG et katE ont été clonés sur le plasmide pACYC 184. Les plasmides pACYC 184, pACYC
184 katG+ (pkatG) et pACYC 184 katE+ (pkatE) ont ensuite été transformés dans le mutant
Hpx°. Les souches sauvage, Hpx°, Hpx° pACYC 184, Hpx°pkatG et Hpx°pkatE ont été
cultivées en milieu LB, à 37°C et en aérobiose. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été ajouté
directement dans le milieu de culture à une concentration finale de 2,5 mM (Fig. 10). Dans le
but de différencier la contribution physiologique de KatG et de KatE, la croissance des
souches a également été testée en présence d’H2O2 à une concentration finale de 10 mM,
concentration critique pour la survie de S. typhimurium (Fig. 11). Des aliquots de culture
bactérienne ont été prélevés 0, 45 et 90 minutes après ajout de l’H2O2, étalés sur boîte LB et
dénombrés 24 heures après incubation à 37°C. En présence de 2,5 mM d’H2O2, la croissance
de la souche sauvage, du mutant Hpx° pkatG et du mutant Hpx° pkatE n’est pas affectée. Par
contre, il entraine l’arrêt de la croissance du mutant Hpx° (Fig. 10A). La croissance du mutant
Hpx°pACYC 184 est également arrêtée après ajout de l’H2O2, suggérant que le plasmide
n’induit pas d’effet sur la viabilité de la souche. Le nombre de cfu des mutants Hpx°pkatG et
Hpx°pkatE augmente d’un demi-logarithme, 90 minutes après ajout d’H2O2 (Fig. 10B).
L’apport de KatG ou de KatE dans la souche Hpx° permet donc de restaurer la croissance de
ce mutant. Ainsi, l’apport de KatG ou KatE permet de supprimer un phénotype lié à
l’inactivation de quatre gènes. Ce résultat souligne l’importance de KatG et de KatE dans
l’élimination du peroxyde d’hydrogène.
66
Résultats Partie 1
(A)
2,5
Index de compétition
2
1,5
1
0,5
0
24h
48h
(B)
Souche A
Souche B
Index de
compétition
wt
∆ahpCF ∆katG ∆katE
0,58
wt
∆ahpCF ∆katG ∆katE ∆katN
0,6
Figure 9 : Index de compétition en milieu LB entre la souche sauvage et le mutant Hpx°
(A) Une préculture de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisée en LB et en aérobiose, a été diluée à
DO600 = 0,025 puis mélangée à un ratio 1:1. A t0h, t24h et t48 h, des aliquots de culture ont été prélevés
et étalés soit sur boîte LB pour dénombrer la population totale, soit sur boîte LB avec antibiotique
pour dénombrer les cfu du mutant. L’input a été calculé (cfu Hpx° à t0h/cfu souche sauvage à t0h ),
ainsi que l’output (cfu Hpx° à t24h ou t48 h / cfu souche sauvage à t24h ou t48 h). Enfin, l’indice de
compétition a été déterminé (Output (24h ou 48h)/ Input).
(B) Des souris BALB/c agées de 6 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec un mélange
bactérien composé de la souche sauvage et d’un des mutants à un ratio 1:1 et à 105 cfu/ml. En
parallèle de l’infection, les concentrations bactériennes de chacune des deux souches inoculées ont
été contrôlées sur boîte LB (Input). 2 jours après, les souris ont été sacrifiées, les rates collectées et
les bactéries intracellulaires étalées sur boîte LB et dénombrées (Output). Au final, l’index de
compétition a été déterminé (Output/Input).
Résultats Partie 1
En présence de 10 mM d’H2O2, la concentration bactérienne de la souche sauvage et du
mutant Hpx° pkatE chute très légèrement 90 minutes après stress (Fig. 11). Le nombre de cfu
du mutant Hpx° chute d’environ 5 logarithmes (1.109 cfu/ml à t0’ et 2,6.104 cfu/ml à t90’) et
celui du mutant Hpx° pACYC chute d’un logarithme et demi (5,5.108 cfu/ml à t0’ et 1,7.107
cfu/ml à t90’). Ce résultat suggère que le plasmide pACYC184 a un effet sur la croissance du
mutant Hpx°. L’effet de l’ajout d’H2O2 est moins drastique sur la croissance du mutant Hpx°
pkatG. En effet, le nombre de cfu de ce mutant augmente 90 minutes après l’ajout d’H2O2
(8.108 cfu/ml à 3.109 cfu/ml). L’apport de katE sur un plasmide multicopie confère au mutant
Hpx° le même phénotype que celui de la souche sauvage. L’apport de katG sur un plasmide
multicopie permet au mutant Hpx° de continuer à pousser après ajout de l’H2O2. Ces résultats
indiquent que KatE et KatG suppriment le phénotype observé dans le mutant Hpx°.
VIII- Conclusion et discussion
Le but de cette étude était d’évaluer l’implication des catalases et des peroxyrédoxines dans le
métabolisme et la virulence de S. typhimurium. Pour cela, une souche dépourvue de katG,
katE, katN et ahpCF (Hpx°) a été construite et analysée pour sa sensibilité à l’H2O2, sa
capacité à éliminer l’H2O2, et enfin sa capacité à établir la virulence. Cette étude a montré que
les catalases et les peroxyrédoxines de S. typhimurium participaient à l’élimination de l’H2O2
protégeant ainsi la bactérie de ses effets toxiques. Nous avons également observé que le
mutant Hpx° était en partie capable d’éliminer l’H2O2 indiquant que S. typhimurium était
dotée d’une autre réductase d’H2O2.
Nous avons, de plus, identifié des conditions pour lesquelles la virulence d’Hpx° était altérée.
En effet, nous avons observé une altération de la capacité à former des colonies pour le
mutant Hpx° après passage dans les macrophages et étalement sur boîte LB. Une possibilité
est que la bactérie soit exposée au stress oxydant dans les conditions d’infection et qu’elle
accumule des dommages oxydatifs.
Cependant, le défaut observé n’est pas corrélé avec une forte diminution de la survie de S.
typhimurium suggérant que la bactérie est en partie capable de lutter contre le stress oxydant
produit dans le macrophage. Cette propriété semble lui être conférée par la présence d’une
autre enzyme impliquée dans la dégradation de l’H2O2.
67
Résultats Partie 1
(A)
wt
DO 600 nm
10
Hpx°
1
Hpx°
pACYC184
0,1
Hpx° pkatG
Hpx° pkatE
0,01
0
100
200
300
400
500
Temps (min)
cfu/ml
(B)
1,00E+10
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
wt
Hpx°
Hpx°
pACYC184
Hpx° pkatG
Hpx° pkatE
0
45
90
Temps après ajout de l'H2O2 (min)
Figure 10 : Croissance et survie des souches en présence de 2,5 mM d’H2O2
Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été
diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été rajouté dans le milieu de croissance à
une concentration finale de 2,5 mM. La croissance a été suivie (A) et 0, 45 et 90 minutes après stress,
des aliquots de culture ont été prélevés puis dénombrées après 24 h d’incubation à 37°C (5B).
Résultats Partie 1
1,00E+10
1,00E+09
1,00E+08
cfu/ml
1,00E+07
1,00E+06
wt
1,00E+05
Hpx°
1,00E+04
Hpx° pACYC184
1,00E+03
Hpx° pkatG
1,00E+02
Hpx° pkatE
1,00E+01
1,00E+00
0
45
90
Temps aprés ajout de l’H2O2 (min)
Figure 11 : Survie des souches en présence de 10 mM d’H2O2
Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été
diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été ajouté dans le milieu de croissance à
une concentration finale de 10 mM. 0, 45 et 90 minutes après stress, des aliquots de culture ont été
prélevés. 24 heures après incubation à 37°C, les colonies ont été dénombrées.
Caractérisation d’un biosenseur vivant
du peroxyde d’hydrogène
Résultats Partie 2
Au cours de notre précédente étude, le mutant Hpx°, dépourvu des catalases KatG, KatE,
KatN et de la peroxyrédoxine AhpCF a été construit. Nous avons analysé ce mutant pour sa
capacité à proliférer dans les macrophages murins et à survivre dans les souris. Malgré le fait
que la viabilité de ce mutant ne soit pas fortement affectée, nous avons identifié des
conditions pour lesquelles le mutant Hpx° accumulait des dommages oxydatifs après passage
dans les macrophages. Ce résultat suggère que S. typhimurium perçoit du stress oxydant au
cours de l’infection.
Plusieurs études ont montré que la NAPDH phagocyte oxydase synthétise de l’anion
superoxyde, 30 minutes après activation du macrophage et durant 6 heures (Vazquez-Torres
et al., 2000 ; Vanderven et al., 2009). Ces études ont été réalisées avec des sondes chimiques
qui, lorsqu’elles sont oxydées par les FAO, émettent des signaux facilement dosables. Ces
sondes ont comme principaux défauts d’être invasives et assez peu spécifiques des FAO. Au
LCB, une plateforme a été créée dont le but est de développer des biosenseurs vivants afin de
détecter d’éventuelles pollutions de l’environnement humain par des substances chimiques
et/ou biologiques (comme des bactéries dont certaines peuvent être pathogènes). Ces
biocapteurs vivants spécifiques sont construits à partir de « gène-signature » d’un polluant
donné fusionné à un gène rapporteur (Fantino et al., 2009). Nous avons exploité la même
stratégie dans le but de sonder et d’identifier spécifiquement la composition de
l’environnement cytoplasmique de S. typhimurium. Pour cela, un biosenseur vivant capable de
détecter l’H2O2 a été construit. Cet outil est constitué du promoteur du gène ahpC, dont la
transcription est activée par OxyR en présence d’H2O2, fusionné à la séquence codante d’une
protéine rapportrice, la GFP, émettrice d’un signal facilement mesurable. Le biosenseur
vivant a, d’abord, été caractérisé en milieu de culture. Pour cela, plusieurs questions ont été
posées : Le biosenseur vivant répond-il à la présence d’H2O2 ? Cette réponse est-elle sous le
contrôle d’OxyR ? Quelle est la gamme de linéarité de réponse du biosenseur vivant ? Nous
avons, par la suite, réalisé des infections de macrophages à l’aide de biosenseurs vivants pour
sonder l’environnement de S. typhimurium tel qu’elle le perçoit.
I-
Construction du plasmide PahpC-GFP
Chez E. coli et chez S. typhimurium, il existe un régulon spécifiquement induit par le
peroxyde d’hydrogène, le régulon oxyR (Zheng et al., 2001). D’après des études
transcriptomiques réalisées chez E. coli en 2001 par l’équipe de Gisela Storz, le régulon oxyR
se compose de plusieurs dizaines de gènes dont dps, katG et ahpC, dont les expressions sont
68
Résultats Partie 2
(B)
GFP/DO (UA)
(A)
Temps (min)
GFP/DO (UA)
(C)
Temps (min)
Figure 1 : Caractérisation du biosenseur vivant en milieu minimum glycérol 0,2% et en présence
d’H2O2
La souche sauvage (A) le mutant Hpx° (B) et le mutant ∆oxyR (C) ont été cultivés en milieu minimum
glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. A DO600 = 0,4, des concentrations croissantes d’H2O2 ont été
rajoutées directement dans le milieu de culture. La fluorescence a été suivie à 530 nm par un fluorimètre.
Le bruit de fond correspondant à la fluorescence des bactéries sauvages a été retranché. Le rapport entre la
fluorescence et la DO600 est représenté sur les graphiques.
Résultats Partie 2
induites 184, 44 et 20 fois, respectivement en présence d’1 mM d’H2O2. Parmi ces trois gènes,
seul ahpC est uniquement régulé par OxyR. Ce gène semblait donc être un bon candidat afin
de savoir si dans le macrophage S. typhimurium était exposée à de l’H2O2. Nous avons choisi
la protéine GFP (Green Fluorescence Protein) comme rapporteur pour sa facilité d’usage et sa
rapidité de détection. La GFP est une protéine fluorescente facilement dosable par
fluorimétrie. Nous avons utilisé un variant de la GFP, la GFP mut3a (Cormack et al., 1996)
qui offre un signal plus stable et plus intense (de 20 à 35 fois) que la protéine sauvage. Le
promoteur du gène ahpC a donc été cloné puis fusionné au gène codant pour la GFP mut3a
sur le plasmide pFPV25. Il existe entre 10 et 15 copies du plasmide pFPV25 par bactérie. Le
plasmide recombinant obtenu a été transformé dans la bactérie sauvage et dans des bactéries
de fonds génétiques variés. La bactérie transformée par le plasmide PahpC-GFP sera appelée
biosenseur vivant dans le reste du chapitre.
II- Caractérisation du biosenseur vivant en milieu de culture
Dans le but de savoir si le biosenseur vivant percevait de l’H2O2, la croissance de la souche a
été réalisée en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. A DO600 = 0,4, de
l’H2O2 a été ajouté directement dans le milieu de culture à une concentration finale de 10 µM
et la fluorescence a été suivie au cours du temps à 530 nm (Fig. 1A). L’intensité de GFP
mesurée au cours du temps a été rapportée à la concentration bactérienne. Les résultats ont
montré qu’immédiatement après ajout de l’H2O2, le niveau de fluorescence augmente pour
atteindre un pic 25 minutes après le début de l’expérience. En absence d’H2O2, le niveau de
fluorescence mesuré (Fig. 1A) reste nul au cours du temps. Ce résultat montre que le
biosenseur est capable de percevoir la présence d’H2O2.
Afin de vérifier que la réponse du biosenseur est dépendant d’OxyR, l’expérience a été
renouvelée en utilisant un mutant ∆oxyR transformé avec le plasmide PahpC-GFP. Ce
biosenseur vivant a été exposé à 0, 10 et 20 µM finaux d’H2O2, le niveau de fluorescence
mesuré reste nul dans chacun des cas. Ce résultat confirme que la perception d’H2O2 par le
biosenseur est dépendante de la présence d’OxyR.
Afin d’étudier la gamme de sensibilité du biosenseur vivant en fonction de la concentration en
H2O2 perçu, l’intensité de fluorescence du biosenseur vivant a été mesurée en présence de
différentes concentrations en H2O2 (2, 4, 6 et 8 µM) (Fig. 2). Dans chacune des quatre
conditions, le niveau de fluorescence augmente immédiatement après l’ajout d’H2O2. Le
niveau de fluorescence maximum atteint dépend de la concentration en H2O2 utilisée. Plus la
69
Résultats Partie 2
µM
Figure 2 : Caractérisation du biosenseur vivant en milieu minimum glycérol 0,2% et soumis à des
doses répétées d’H2O2.
La souche sauvage a été cultivée en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. Toutes les
20 minutes, de l’H2O2 a été rajouté directement dans le milieu de culture. Quatre concentrations d'H2O2
ont été testées : 2, 4, 6 et 8 µM. La fluorescence a été suivie à 530 nm. Le bruit de fond correspondant à la
fluorescence des bactéries sauvages a été retranché. Le rapport entre la fluorescence et la DO600 est
représentée sur le graphique.
Résultats Partie 2
concentration en H2O2 est élevée, plus le niveau maximum de fluorescence atteint est élevé.
Ce résultat montre que la réponse du biosenseur vivant est proportionnelle à la concentration
en H2O2 détectée par celui-ci dans la gamme des concentrations testée. Cette caractéristique
pourra être utilisée pour déterminer la concentration en H2O2 perçue dans les macrophages.
Nous nous sommes ensuite demandés si le biosenseur pouvait être saturé lorsqu’il était
soumis à un flux constant d’H2O2. Pour cela, de l’H2O2 a été ajouté toutes les 20 minutes dans
le milieu de culture. Nous avons observé que le niveau de fluorescence du biosenseur vivant
augmentait après chaque ajout d’H2O2 indépendamment de la concentration en H2O2 testée (2,
4, 6 ou 8 µM). Ainsi, dans les conditions testées, nous ne sommes pas parvenus à saturer le
biosenseur vivant. Ce résultat montre que le biosenseur vivant est apte à détecter des
concentrations constantes d’H2O2.
Dans le but d’augmenter l’intensité de fluorescence, le plasmide PahpC-GFP a été transformé
dans le mutant Hpx°, dépourvu de KatG, KatE, KatN et AhpCF. Ce mutant est altéré dans sa
capacité à éliminer l’H2O2 et la prédiction est alors que ce mutant produirait plus de GFP que
la souche sauvage. Dans le but d’éprouver cette prédiction, la croissance de la souche a été
réalisée en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. A DO600 = 0,4, de l’H2O2
a été ajouté directement dans le milieu de culture à une concentration finale de 0, 2, 4, 6, 8 ou
10 µM. La fluorescence a été suivie au cours du temps par fluorimétrie (Fig. 1B). Le niveau
de fluorescence augmente immédiatement après ajout d’H2O2. Le pic de fluorescence est
atteint 25 minutes après le début de l’expérience et l’intensité de fluorescence dépend de la
concentration en H2O2 utilisée. Ainsi, le profil des courbes de fluorescence du biosenseur
Hpx° est superposable à celui du biosenseur sauvage. Le niveau de fluorescence atteint par le
biosenseur Hpx° est, par contre différent, de celui du biosenseur sauvage. Par exemple, après
ajout de 10 µM d’H2O2, le niveau de fluorescence du biosenseur Hpx° est environ 2 fois plus
élevé que celui de la souche sauvage. Ce résultat indique que le niveau de GFP produit par le
biosenseur vivant Hpx° est plus important que celui produit par la souche sauvage. Ainsi, cet
outil nous permet d’augmenter le niveau du signal produit par le biosenseur vivant sauvage.
Cet aspect pourrait être important dans la cas où le niveau d’H2O2 perçut par la souche
sauvage soit trop faible pour être détectée.
70
Résultats Partie 2
Expression GFP (UA)
Expression GFP (UA)
A
Expression GFP (UA)
Expression GFP (UA)
B
Figure 3 : Caractérisation du biosenseur vivant dans la souche sauvage ou dans le mutant Hpx° en
condition d’infection dans des macrophages murins.
Des macrophages issus de lignée cellulaire, les RAW 264.7 (A) non activés (panneau de gauche) ou
activés à l’IFNγ 10 U/ml et au PMA 0,2 µM (panneau de droite), et des macrophages primaires (B),
issus de moelle osseuse, non activés (panneau de gauche) ou activés dans les mêmes conditions
(panneau de droite) ont été infectés par la souche sauvage et le mutant Hpx° portant le plasmide PahpCGFP pendant 10h. A différents temps d’infection, des aliquots de culture ont été prélevés et lysés afin
d’isoler les bactéries intracellulaires. Les bactéries ont ensuite été fixées au paraformaldéhyde et
analysées pour leur niveau de fluorescence par cytométrie de flux
Résultats Partie 2
III- Caractérisation du biosenseur vivant dans des macrophages murins
Nous avons, ensuite, analysé le comportement du biosenseur vivant directement en condition
d’infection dans des macrophages dans le but de savoir si S. typhimurium percevait de l’H2O2
en condition d’infection. Deux types cellulaires ont été testés, soit des macrophages murins
issus de lignée cellulaire, soit des macrophages murins primaires issus de moelle osseuse et
fraîchement différenciés. Pour augmenter leur activité oxydante, une partie des macrophages
des deux types cellulaires a été traitée avec de l’IFNγ et du PMA. L’infection a été réalisée sur
10 heures et 6 prélèvements à différents temps après infection ont été effectués. Les bactéries
intracellulaires ont été isolées, analysées au cytomètre de flux pour leur niveau de
fluorescence.
Lorsque le biosenseur vivant a été utilisé pour infecter des macrophages RAW 264.7 non
activés, nous avons observé une augmentation du niveau de fluorescence dès le début de
l’infection. La fluorescence a atteint son niveau maximal après 120 minutes d’infection (Fig.
3A), puis a diminué immédiatement après et pendant les 8 heures d’infection restantes. Ce
résultat montre que le biosenseur vivant perçoit de l’H2O2 pendant les 120 premières minutes
de l’infection, puis que l’inducteur semble disparaître progressivement pendant le reste de
l’infection.
Lorsque le biosenseur sauvage a été utilisé pour infecter des macrophages RAW 264.7 activés
à l’IFNγ et au PMA, nous avons observé que le profil de la courbe de fluorescence était
strictement superposable à celui obtenu dans des macrophages non activés. Par contre, le
niveau maximum de fluorescence produit par le biosenseur vivant dans des macrophages
activés (60 UA) est supérieur à celui produit dans des macrophages non activés (30 UA). Ces
résultats montrent que S. typhimurium perçoit de l’H2O2 en condition d’infection et que cette
perception diffère en fonction de l’état d’activation des cellules infectées.
Lorsque le biosenseur vivant a été utilisé pour infecter des macrophages primaires issus de
moelle osseuse, les résultats obtenus ont présenté un profil légèrement différent de celui
obtenu dans des RAW 264.7 (Fig. 3B). Nous avons observé une augmentation du niveau de
fluorescence pendant les 240 premières minutes de l’infection, et contrairement au biosenseur
vivant dans des RAW 264.7, le niveau de fluorescence a très légèrement diminué pendant
toute la durée restante de l’infection. Ces résultats montrent que le niveau d’H2O2 perçu par
Salmonella dans des macrophages primaire est plus élevé et se produit sur une durée plus
longue que l’inducteur semble être présent pendant toute la durée de l’infection dans ces
macrophages.
71
Résultats Partie 2
°
Figure 4 : Caractérisation du biosenseur vivant dans différente souches en condition d’infection
dans des macrophages murins
Des macrophages primaires, issus de moelle osseuse, activés à l’IFNγ 10 U/ml et au PMA 0,2 µM ont été
infectés par soit la souche sauvage de S. typhimurium, soit le mutant Hpx°, soit le mutant ∆oxyR portant
le plasmide PahpC-GFP pendant 8h.
A différents temps d’infection, des aliquots de culture ont été prélevés et lysés dans le but d’isoler les
bactéries intracellulaires. Par la suite, les bactéries ont été fixées au paraformaldéhyde et leur niveau de
fluorescence quantifié par cytométrie de flux.
Résultats Partie 2
Enfin, le biosenseur vivant a été utilisé pour infecter des macrophages primaires issus de
moelle osseuse activés à l’IFNγ et au PMA. Nous avons observé que le profil de la courbe de
fluorescence était strictement superposable à celui obtenu dans des macrophages primaires
non activés. Par contre, le niveau maximum de fluorescence produit par le biosenseur vivant
dans des macrophages activés (100 UA) est supérieur à celui produit dans des macrophages
non activés (70 UA).
Ainsi, les infections de macrophages réalisées avec le biosenseur vivant ont permis de
montrer que S. typhimurium était exposée à de l’H2O2 en condition d’infection et que la
cinétique de production de l’H2O2 perçue par la bactérie dépendait du type de macrophages et
de l’état d’activation de ces derniers.
Nous nous sommes assurés que la réponse du biosenseur observée dans les macrophages était
dépendante du régulateur transcriptionnel OxyR. Pour cela, le biosenseur vivant ∆oxyR a été
utilisé pour infecter des macrophages primaires issus de moelle osseuse activés à l’IFNγ et au
PMA. Nous avons observé que le niveau de fluorescence du biosenseur vivant ∆oxyR restait
nul pendant toute la durée de l’infection.
Enfin, nous avons testé le biosenseur vivant dans le mutant Hpx° (Fig. 3). Les résultats
obtenus sont directement corrélables avec ceux obtenus avec le biosenseur vivant sauvage
dans les quatre conditions testées (RAW 264.7 ou macrophages primaires, non activés ou
activés). Par contre, le niveau de fluorescence maximum atteint est dans chaque cas supérieur
à celui obtenu avec le biosenseur vivant sauvage.
IV- Implication de la NADPH phagocyte oxydase dans la production des FAO par le
macrophage
La NADPH phagocyte oxydase est supposée être responsable de la production des FAO dans
le macrophage. Ainsi, une prédiction est qu’en l’absence de cette enzyme eucaryote, il n’y ait
plus de production de FAO dans le macrophage et ainsi que le biosenseur vivant ne perçoive
plus d’H2O2. Dans le but de tester cette prédiction, des macrophages primaires ont été infectés
par le biosenseur vivant. Ces macrophages ont été extraits de moelle osseuse de souris
sauvages et de souris dont le gène codant pour une des sous–unités de la NADPH phagocyte
oxydase, la sous-unité gp91-Phox, a été inactivé. Ces souris ne sont donc plus capables de
produire de l’anion superoxyde via la NADPH phagocyte oxydase. Une proportion des
macrophages a été activée par un traitement IFNγ et PMA (Fig. 5A). Nous avons observé
72
Résultats Partie 2
(A)
(B)
WT
gp91-/-
Figure 5 : Caractérisation du biosenseur vivant dans des macrophages primaires sauvages
ou dépourvus de la sous-unité gp91-Phox.
Des macrophages primaires (sauvages ou dépourvus de la sous-unité gp91-Phox) issus de moelle
osseuse soit ont été infectés par la souche sauvage de S. typhimurium portant le plasmide PahpCGFP pendant 7h. (A) A différents temps d’infection, des aliquots de culture ont été prélevés et
lysés afin d’isoler les bactéries intracellulaires. Les bactéries ont ensuite été fixées au
paraformaldéhyde et leur niveau de fluorescence quantifié par cytométrie de flux. (B) Trois
heures après infection, les bactéries intracellulaires isolées de macrophages sauvages (panneaux
du haut) ou gp91-/- (panneaux du bas) ont été isolées et observées par microscopie. Le LPS
bactérien a été marqué par un anticorps spécifique (1ère colonne), la fluorescence de la sonde
PahpC-GFP analysée (2èmecolonne), et une superposition des deux signaux effectuée (3ème
colonne). Cette expérience a été réalisée par Stéphane Méresse au Centre d’Immunologie de
Marseille-Luminy.
Résultats Partie 2
qu’en l’absence de la NADPH phagocyte oxydase, le niveau de fluorescence de la sonde
PahpC-GFP reste nul, indépendamment de l’état d’activation des macrophages.
Des clichés de microscopie ont été réalisés 3h après infection de macrophages sauvages et de
macrophages dépourvus de la NADPH oxydase (gp91-/-) infectés par la souche sauvage
portant la sonde PahpC-GFP (Fig. 5B). Les signaux de marquage des LPS étaient équivalents
dans les cellules sauvages et les cellules gp91-/- signifiant que la concentration bactérienne
était la même dans les deux types de cellules. Le niveau de GFP est, par contre, beaucoup plus
intense dans des biosenseurs vivants infectant des cellules sauvages. Ce résultat confirme que
les macrophages gp91-/- sont moins oxydants. Ainsi, on peut conclure que dans les
macrophages sauvages, l’H2O2, responsable de l’activation transcriptionnelle du promoteur
ahpC-gfp, est produit par la NADPH phagocyte oxydase.
V- Conclusion et discussion
Dans le but de caractériser la réponse oxydante perçue par S. typhimurium au cours de
l’infection, nous avons créé un outil génétique capable de détecter l’H2O2 dans le cytoplasme
de S. typhimurium. Le promoteur du gène ahpC a donc été choisi pour sa capacité de réponse
transcriptionelle en présence d’H2O2, et ce, de façon exclusivement OxyR dépendante. Nous
avons fusionné le promoteur ahpC et le gène codant pour la protéine rapportrice GFP, l’outil
construit est capable de signaler la présence d’H2O2 dans le cytoplasme de la bactérie et de
répondre de façon dose.
Dans des macrophages RAW 264.7, nous avons observé que S. typhimurium était très
rapidement exposée à de l’H2O2 (dans les premières minutes de l’infection). Cette phase dure
approximativement 120 minutes, puis le niveau de GFP chute assez vite indiquant que le
niveau d’H2O2 perçu par la bactérie diminue. Ce résultat est en accord avec différentes études
réalisées sur la cinétique du burst oxydatif dans des macrophages murins (Vazquez-Torres et
al., 2000 ; Vanderven et al., 2009). Dans des macrophages issus de moelle osseuse, la bactérie
perçoit un niveau de stress plus long et plus intense.
73
Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène dans le
métabolisme et la virulence de S. typhimurium :
caractérisation du mutant HpxF-
Article
Redundant hydrogen peroxide scavengers contribute to
Salmonella virulence and oxidative stress resistance
Journal of Bacteriology (2009) 191: 4605-14
Résultats Partie 3
Contexte de l’étude
Les deux précédentes études ont montré qu’en condition d’infection dans des macrophages
murins, S. typhimurium percevait de l’H2O2 et que le mutant Hpx° dépourvu des 3 catalases
KatG, KatE et KatN et de la peroxyrédoxine AhpCF était toujours capable de proliférer. Ces
résultats suggèrent que le mutant Hpx° possède encore une enzyme qui détoxifie
l’environnement oxydant du macrophage permettant à la bactérie de se répliquer.
Une analyse bioinformatique du génome de S. typhimurium nous a permis d’identifier une
seconde peroxyrédoxine TsaA. Cette enzyme possède plus de 34% d’identité de séquence
protéique avec AhpC de S. typhimurium et plus de 58,5% avec AhpC d’Helicobacter pylori
(Voir résultats complémentaires).
Afin d’évaluer la contribution de TsaA dans le phénotype du mutant Hpx° en condition
d’infection, nous avons inactivé tsaA dans la souche Hpx° pour créer le mutant HpxF-. La
caractérisation phénotypique ainsi que les tests de virulence du mutant HpxF- ont fait l’objet
de la publication qui suit.
74
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 2009, p. 4605–4614
0021-9193/09/$08.00⫹0 doi:10.1128/JB.00144-09
Copyright © 2009, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Vol. 191, No. 14
Redundant Hydrogen Peroxide Scavengers Contribute to Salmonella
Virulence and Oxidative Stress Resistance䌤†
Magali Hébrard,1,3 Julie P. M. Viala,1,3 Stéphane Méresse,2,3 Frédéric Barras,1,3 and Laurent Aussel1,3*
CNRS, Laboratoire de Chimie Bactérienne (UPR 9043), Institut de Microbiologie de la Méditerranée, IFR 88, 31 Chemin Joseph Aiguier,
13402 Marseille Cedex 20, France1; Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, CNRS-INSERM-Univ. Méditerranée,
Parc Scientifique de Luminy, Case 906, 13288 Marseille Cedex 9, France2; and
Aix-Marseille University, Marseille, France3
Received 3 February 2009/Accepted 9 May 2009
mechanisms. The KatE and KatG catalases are involved in
H2O2 degradation, with katE being described as a member of
the RpoS regulon (17, 22) and katG being OxyR dependent
(26, 39). Both enzymes share the ability to reduce hydrogen
peroxide to water and molecular oxygen, and their role was
shown to be predominant at millimolar concentrations of
H2O2 since they do not require any reductant (32). This observation is of particular importance, since these enzymes are
not limited by the availability of a reductant, such as NADH,
which cannot be generated fast enough to face a burst of H2O2.
However, the katG and katE simple mutants, as well as the
katE katG double mutant, did not show any increased susceptibility in macrophage or virulence attenuation in mice (5, 27).
A possible reason could be the presence of a third nonheme
and manganese-dependent catalase called KatN (30). This enzyme may contribute to hydrogen peroxide resistance under
certain environmental conditions, but its involvement in virulence remains unknown. Moreover, katE, katG, and katN single mutants did not show any susceptibility to exogenous millimolar H2O2, essentially due to the compensatory function of
the remaining catalases (5, 30).
Another family of enzymes was shown to play an alternative
role in H2O2 scavenging: the alkyl hydroperoxide reductases.
These proteins directly convert organic hydroperoxides to alcohols, e.g., hydrogen peroxide to water. The alkyl hydroperoxide reductase AhpC belongs to the two-cysteine peroxiredoxin family, and the gene encoding this enzyme was identified
as a member of the OxyR regulon (26, 39). The redox system
consists of two proteins, AhpC and AhpF, with the latter being
a thioredoxin reductase-like protein that contains two disulfide
centers and transfers electrons from NADH to AhpC (13).
Salmonella is a facultative intracellular pathogen that is associated with gastroenteritis, septicemia, and typhoid fever.
This gram-negative bacterium survives and replicates in macrophages during the course of infection and can be exposed to
a number of stressful environments during its life cycle (16).
One of the host defense mechanisms that Salmonella encounters upon infection is the production of superoxide anion O 䡠⫺
2
by the phagocyte NADPH oxidase (1, 25). This radical can pass
the outer membrane of the bacteria and represents one of the
major weapons used by the macrophage to kill engulfed pathogens (18). Evidence that phagocyte-produced superoxide is a
key mechanism for avoiding Salmonella infection is clear: mice
and humans who are genetically defective in superoxide production are significantly more susceptible to infection (36, 38).
Superoxide dismutases, located in the bacterial periplasm and
in the cytoplasm, dismutate superoxide O2䡠⫺ to hydrogen peroxide H2O2 and molecular oxygen. Unlike superoxide, hydrogen peroxide can diffuse readily across bacterial membranes
and form HO䡠 hydroxyl radicals in the presence of Fe(II) (18).
These reactive oxygen species (ROS) can oxidize and damage
proteins, nucleic acids, and cell membranes.
To scavenge and degrade H2O2 molecules generated either
as a by-product of aerobic metabolism or by the phagocyte
NADPH oxidase, Salmonella has evolved numerous defense
* Corresponding author. Mailing address: Laboratoire de Chimie
Bactérienne, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20,
France. Phone: 33 4 91 16 46 59. Fax: 33 4 91 71 89 14. E-mail:
[email protected].
† Supplemental material for this article may be found at http://jb
.asm.org/.
䌤
Published ahead of print on 15 May 2009.
4605
Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
Salmonella enterica serovar Typhimurium is an intracellular pathogen that can survive and replicate within
macrophages. One of the host defense mechanisms that Salmonella encounters during infection is the production of reactive oxygen species by the phagocyte NADPH oxidase. Among them, hydrogen peroxide (H2O2) can
diffuse across bacterial membranes and damage biomolecules. Genome analysis allowed us to identify five
genes encoding H2O2 degrading enzymes: three catalases (KatE, KatG, and KatN) and two alkyl hydroperoxide
reductases (AhpC and TsaA). Inactivation of the five cognate structural genes yielded the HpxFⴚ mutant,
which exhibited a high sensitivity to exogenous H2O2 and a severe survival defect within macrophages. When
the phagocyte NADPH oxidase was inhibited, its proliferation index increased 3.7-fold. Moreover, the overexpression of katG or tsaA in the HpxFⴚ background was sufficient to confer a proliferation index similar to that
of the wild type in macrophages and a resistance to millimolar H2O2 in rich medium. The HpxFⴚ mutant also
showed an attenuated virulence in a mouse model. These data indicate that Salmonella catalases and alkyl
hydroperoxide reductases are required to degrade H2O2 and contribute to the virulence. This enzymatic
redundancy highlights the evolutionary strategies developed by bacterial pathogens to survive within hostile
environments.
4606
J. BACTERIOL.
HÉBRARD ET AL.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains and growth conditions. The bacterial strains used in this
study are listed in Table 1. Strains were routinely grown in Luria-Bertani (LB)
medium at 37°C. Minimal medium (M9) contained MgSO4 (1 mM), CaCl2 (200
␮M), and thiamine (1 ␮g/ml). As a carbon source, glucose was added at a final
concentration of 0.2%. Ampicillin (50 ␮g/ml), kanamycin (25 ␮g/ml), and chloramphenicol (25 ␮g/ml) were added when necessary. Deletions of various genes
and concomitant insertion of an antibiotic resistance cassette were carried out
using lambda-Red-mediated recombination (11). Mutations were moved to the
wild-type strain 12023 by P22 transductions. To avoid the outgrowth of suppressed strains, katE, katG, katN, ahpCF and tsaA mutations were selected
anaerobically on LB agar supplemented with bovine liver catalase (2,000 U/plate;
Sigma-Aldrich). In some cases, antibiotic resistance cassettes were removed by
using the temperature-sensitive plasmid pCP20 carrying the FLP recombinase
(11).
In silico genome analysis. The genome analyzed was that of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 (23) (www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind?S
.typhimurium). STM4106, STM1318, and STM0608 correspond to the catalases
KatG and KatE and the alkyl hydroperoxide reductase AhpC, respectively.
STM1731 was characterized as a third catalase, KatN (30). STM0402 was annotated as a putative thiol-alkyl hydroperoxide reductase, and we renamed it TsaA
(thiol-specific antioxidant) for homology with Helicobacter hepaticus TsaA
(58.5% identity) (24).
TABLE 1. Bacteria and plasmids used in this study
Bacterium/plasmid
S. Typhimurium
strains
12023
Ahp⫺ mutant
Kat⫺ mutant
HpxT⫺ mutant
HpxF⫺ mutant
E. coli strains
MG1655
Hpx⫺ mutant
Plasmids
pACYC184
pkatG
ptsaA
pKD3
pKD4
pCP20
pKD46
Source or
reference
Relevant characteristic(s)
Wild type
⌬ahpCF::kan ⌬tsaA::cat
⌬katE ⌬katG ⌬katN::kan
⌬katE ⌬katG ⌬ahpCF::kan
⌬katE ⌬katG ⌬katN ⌬ahpCF
⌬tsaA
Laboratory stock
This study
This study
This study
This study
F⫺; wild type
⌬katE::tet ⌬katG::cat
⌬ahpCF::kan
Laboratory stock
This study
cat (Cmr) tet (Tcr), p15A, ori
pACYC184 derivative carrying
katG and its promoter (Cmr)
pACYC184 derivative carrying
tsaA and its promoter (Cmr)
Template plasmid; contains an
FLP recombination targetflanked chloramphenicol
resistance gene (Cmr)
Template plasmid; contains an
FRT-flanked kanamycin
resistance gene (Kmr)
Thermal induction of FLP
synthesis
Red recombinase expression
plasmid
7
This study
This study
11
11
11
11
Measurement of hydrogen peroxide accumulation in cell culture. Cells were
grown overnight in M9 minimal medium containing 0.2% glucose and supplemented with Casamino Acids (1 mg/ml), diluted to an optical density at 600 nm
(OD600) of 0.05, and grown for four generations. These cells were then washed
in fresh minimal medium containing 0.05% glucose and incubated with shaking
at 37°C for 25 min. Aliquots were removed every 5 min, and hydrogen peroxide
levels were determined using the Amplex red/horseradish peroxidase method
(Invitrogen). The low glucose concentration was used in order to minimize H2O2
production by catalyzed glucose autooxidation.
Hydrogen peroxide scavenging by whole cells. Bacterial cultures were grown
overnight aerobically in M9 minimal medium supplemented with Casamino
Acids, diluted to an OD600 of 0.01, and grown to an OD600 of 0.3. Cells were
diluted in fresh prepared minimal medium at an OD600 of 0.1. H2O2 was added
at a final concentration of 10 ␮M. Each 90 s, aliquots were removed and assayed
immediately for H2O2 content by the Amplex red/horseradish peroxidase
method (Invitrogen).
Hydrogen peroxide sensitivity assay. Bacterial cultures were grown overnight
in LB, diluted to an OD600 of 0.05, grown to an OD600 of 0.3 in LB, and treated
with 1 mM hydrogen peroxide. To determine viability, aliquots were taken
immediately before treatment and 1 h and 2 h after treatment, serially diluted,
and plated onto LB supplemented with catalase.
Bacterial infection of macrophages and survival assays. RAW 264.7 macrophages were seeded at a density of 4 ⫻ 105 cells per well in six-well tissue culture
plates containing Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) with 10% fetal
calf serum (FCS) (HyClone) and supplemented with gamma interferon (IFN-␥)
(10 U/ml; ImmunoTools) 24 h before use. Bone marrow cells were isolated from
femurs of 8- to 10-week-old C57BL/6 female mice and differentiated into macrophages as described previously (12). Bacteria were cultured overnight at 37°C
with shaking and opsonized in DMEM containing FCS and normal mouse serum
(10%; Perbio) for 30 min. The macrophages were activated with 0.2 ␮M phorbol
12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma Aldrich) before infection. Where indicated, diphenyleneiodonium (DPI) (Sigma Aldrich) was added at various concentrations to inhibit NADPH oxidase. Bacteria were added to the monolayers
at a MOI of ⬇70:1, centrifuged at 400 ⫻ g for 5 min at 4°C, and incubated for
30 min at 37°C in 5% CO2. The macrophages were washed three times and
Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
AhpC was shown to be a predominant scavenger at low concentrations of H2O2, mainly because its catalytic efficiency was
better than those of catalases (32). Recently the alkyl hydroperoxide reductase from Helicobacter hepaticus, TsaA
(Thiol-Specific Antioxidant), was characterized (24). The tsaA
mutant was found to be more sensitive to oxidizing agents like
superoxide anion or t-butyl hydroperoxide. Surprisingly, this
mutant was more resistant than the wild-type to H2O2, essentially because the level of catalase was increased in this background (24). In gastric pathogens, TsaA plays a critical role in
the defense against oxygen toxicity that is essential for survival
and growth (2). Interestingly, Salmonella contains two genes
encoding alkyl hydroperoxide reductases, ahpC and tsaA,
whereas a single copy was found in Escherichia coli (ahpC) or
in Helicobacter pylori (tsaA).
The redundancy of these antioxidant proteins could explain
the extremely high resistance of Salmonella to hydrogen peroxide. It has been shown by Imlay and coworkers that in E. coli,
three genes were involved in H2O2 scavenging: two catalase
genes (katE and katG) and an alkyl hydroperoxide reductase
gene (ahpC) (32). Simultaneous inactivation of the katE, katG,
and ahpCF genes negated H2O2 degradation. As a consequence, this triple mutant, called the Hpx⫺ mutant, accumulates intracellular H2O2 (32). Moreover, H2O2 generated by
aerobic metabolism was found to be sufficient to create toxic
levels of DNA damage in such a background (28). In the
present study, we deleted the Salmonella katE, katG, and
ahpCF genes and two more genes absent in E. coli, katN and tsaA,
to obtain the HpxF⫺ mutant, which lacks three catalases and
two alkyl hydroperoxide reductases. HpxF⫺ cells exhibited the
incapacity to degrade micromolar concentrations of H2O2,
whereas this phenotype was not observed for the Kat⫺ (katE
katG katN) and Ahp⫺ (ahpCF tsaA) mutants. Therefore, the
HpxF⫺ mutant exhibited a high sensitivity to this compound.
Moreover, this mutant did not show any proliferation within
macrophages and presented reduced virulence in mice, suggesting that Salmonella catalases and alkyl hydroperoxide reductases form a redundant antioxidant arsenal essential for
survival and replication within host cells.
VOL. 191, 2009
OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA
RESULTS
Three catalases and two alkyl hydroperoxide reductases allow Salmonella to tolerate an anaerobic/aerobic shift. To assay
the importance of Salmonella catalases and alkyl hydroperoxide reductases during aerobic metabolism, two mutants were
built: a katE katG ahpCF mutant (HpxT⫺, for Hpxthree⫺) and
a katE katG katN ahpCF tsaA mutant (HpxF⫺, for Hpxfive⫺).
These strains were precultured in LB anaerobically and then
diluted in aerobic medium, and their phenotypes were compared to that of the E. coli katE katG ahpCF mutant (Hpx⫺).
Salmonella HpxT⫺ cells did not present any growth defect,
whereas the HpxF⫺ mutant initially grew and then stalled for
2 to 3 h, finally catching up at the end of the stationary phase
(Fig. 1A). At OD600s of 0.1, 0.5, and 1, aliquots of each culture
were removed and observed under a microscope. Whereas
Salmonella wild-type and HpxT⫺ cells appeared rod shaped,
HpxF⫺ cells formed long filaments (Fig. 1C). This trend was
emphasized at an OD600 of 0.5 and correlated with the lag
observed during growth but decreased at an OD600 of 1 when
the cells escaped from the lag and resumed growing. Similar
observations were made with the E. coli Hpx⫺ mutant, which
presented a growth defect and filamentation when the cells
were submitted to an anaerobic/aerobic shift (Fig. 1B and C).
Presumably, upon the switch to aerobiosis, cells experience a
sudden burst in ROS that catalases and alkyl hydroperoxide
reductases are able to scavenge. These results are consistent
with the characterization of the E. coli Hpx⫺ strain already
reported (28). Taken together, these data indicated that inactivation of three catalases and two alkyl hydroperoxide reductases led to a growth lag and filamentation of Salmonella under
an aerobic shift.
Viability of the HpxFⴚ mutant is not affected by endogenous
hydrogen peroxide. To establish the impact of endogenous
H2O2 on Salmonella fitness, we built two supplementary mutants, which we referred to as the Kat⫺ mutant, which lacks
three catalases (katE, katG, and katN), and the Ahp⫺ mutant,
which lacks two alkyl hydroperoxide reductases (ahpCF and
tsaA). Then, we evaluated their ability to eliminate endogenously produced H2O2. In order to monitor H2O2 accumulation generated during aerobic growth, the strains were grown
in minimal medium supplemented with Casamino Acids for at
least four generations and immediately resuspended in fresh
medium. H2O2 was then quantified every 5 min over a period
of 25 min. In wild-type and Kat⫺ strains, the H2O2 levels
remained constant, accumulating at a rate of 1.2 nM/min (Fig.
2A). The Ahp⫺ mutant also showed only a minor accumulation
of H2O2 (2 nM/min), reaching a final concentration of 0.14
␮M. Within HpxF⫺ cells, the H2O2 concentration increased
2.6-fold in 25 min to reach 0.36 ␮M, with a rate of 8.8 nM/min
(Fig. 2A). Thus, a HpxF⫺ mutant accumulated much more
endogenous H2O2 than Kat⫺ or Ahp⫺ mutants, underlying the
synergistic action of both type of enzymes on H2O2 degradation. Then, to estimate the impact of endogenous H2O2 accumulation on their fitness, the four bacterial strains were grown
aerobically in LB and viability was assayed at various times.
Growth was monitored at 600 nm, and the growth curves of the
four strains were found to be identical (data not shown). Then,
aliquots from each culture were removed at OD600s of 0.5 and
2 and plated on LB agar medium supplemented with catalase.
The results showed that the wild type and the three mutants
shared identical plating recovery, indicating that none of the
mutants presented any viability defect in comparison to its
wild-type parent (Fig. 2B). Thus, the HpxF⫺ mutant clearly
accumulated H2O2 during growth, but the concentrations
reached in LB medium were not high enough to compromise
viability. Finally, the wild-type strain and the three mutants
(the Ahp⫺, Kat⫺, and HpxF⫺ mutants) were grown in minimal
medium under aerated conditions. The growth of all the mutants was slowed down, with HpxF⫺ being slightly more affected (Fig. 2C). Thereby, the nutrient limitation led to a
growth rate reduction for the Ahp⫺, Kat⫺, and HpxF⫺ mutants. Surprisingly, addition of Casamino Acids did not signif-
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incubated with DMEM containing FCS and 100 ␮g/ml gentamicin for 90 min,
after which the gentamicin concentration was decreased to 10 ␮g/ml for the
remainder of the experiment. For enumeration of intracellular bacteria, macrophages were washed two times with phosphate-buffered saline and lysed with
0.1% Triton X-100, and a dilution series was plated on LB agar supplemented
with catalase.
Competition assays. Eight- to 10-week-old C57/B6 mice were inoculated intraperitoneally with equal amounts of two bacterial strains for a total of 105
bacteria per mouse. The spleens were harvested 48 h after inoculation and
homogenized. Bacteria were recovered and enumerated after plating a dilution
series onto LB agar and LB agar with the appropriate antibiotics, both supplemented with catalase. Competitive indexes (CIs) were determined for each
mouse (3). The CI is defined as the ratio between the mutant and wild-type
strains within the output (bacteria recovered from the mouse after infection)
divided by their ratios within the input (initial inoculum). A one-sample t test was
used to determine whether the CI was significantly different from 1. All statistical
analyses were performed by using the Prism software program (GraphPad, San
Diego, CA). The two-tailed P value was calculated.
Competition assays in LB medium were performed as described previously
(10). Briefly, bacterial mixtures were incubated with equal amounts at 37°C for
24 h under shaking. Cells were diluted and plated on LB agar supplemented with
catalase, and the resulting colonies were plated on the selective medium to
determine the relative percentage of each strain recovered. The CI was calculated as described above.
RNA extraction and quantitative PCR. RNA extraction from intracellular
bacteria was adapted from a previously described method (14). In brief, activated
RAW 264.7 macrophages were seeded in 10 tissue-culture-treated plates (128 by
86 mm). The infection was carried out as described above with few modifications:
bacteria were added to the monolayers at a MOI of 50:1, and supplemented
DMEM containing 66 ␮g/ml gentamicin was added for 45 min following the
three washes. Six hours postinfection, cells were washed twice with phosphatebuffered saline and lysed, and RNA was stabilized with a solution of 0.3% sodium
dodecyl sulfate, 1% acidic phenol, and 19% ethanol for 30 min on ice. RNA
extraction was performed with the SV Total RNA isolation system (Promega).
cDNAs were synthesized from 1 ␮g RNA with the Superscript II reverse transcriptase and random primers (Invitrogen). Real-time PCR was performed on a
Mastercycler ep realplex instrument (Eppendorf) by using the SYBR Premix Ex
Taq (Perfect Real Time) PCR kit (Takara Bio Group, Japan). Specific primers
are described in Table S1 in the supplemental material. Melting curves were
analyzed to control for the specificities of the PCRs. Copy numbers were calculated from a standard curve plotting four different dilutions of genomic DNA
against the PCR cycle number at which the measured fluorescence intensity
reached the threshold, specified so that it was significantly above the noise band
of the baseline (10 times the standard deviation).
Plasmid construction. The cloning vector used was pACYC184. The insert
carrying the 200-bp-upstream katG start codon and the katG gene was PCR
amplified from S. Typhimurium 12023 by using the forward primer 5⬘-CCCAA
GCTTCCGGGAGCTTTATTACAACTC-3⬘ and the reverse primer 5⬘-GGGG
GATCCCTGGTTGTGCATAACATAGGC-3⬘. PCR products were digested
using BamHI and HindIII and cloned into the pACYC184 vector to generate
pkatG, and the insert was verified by sequencing. The insert carrying the 200bp-upstream tsaA start codon, and the tsaA gene was PCR amplified by using the
forward primer 5⬘-CCCTCTAGAAGCGAGGGCGTGCGTCAGATC-3⬘ and
the reverse primer 5⬘-GGGGGATCCGAAGTGGCGCTGGAAGCGTTG-3⬘.
PCR products were digested using BamHI and XbaI and cloned into the
pACYC184 vector to generate ptsaA, and the insert was verified by sequencing.
4607
4608
HÉBRARD ET AL.
J. BACTERIOL.
icantly change the growth rate of the HpxF⫺ mutant (data not
shown). This last observation ruled out the possibility that this
mutation led to amino acid auxotrophy as described for the E.
coli sodA sodB mutant (6).
The HpxFⴚ mutant is highly sensitive to exogenous hydrogen peroxide. To evaluate the role of catalases and alkyl hydroperoxide reductases when Salmonella is submitted to exogenous stress, the wild-type strain and the three mutants were
exposed to various exogenous H2O2 levels. The bacterial
strains were first assayed for their ability to scavenge micromolar concentrations of H2O2. Bacterial cultures were grown
to an OD600 of 0.3 and diluted in minimal medium, and H2O2
was added at the final concentration of 10 ␮M. The wild-type,
Ahp⫺, and Kat⫺ strains scavenged H2O2 in less than 7 min,
whereas the HpxF⫺ mutant failed to do so (Fig. 3A). A wildtype strain heat killed at 80°C displayed a degradation profile
similar to that of the HpxF⫺ mutant (Fig. 3A). These data
demonstrated that the combination of mutations in catalaseand alkyl hydroperoxide reductase-encoding genes prevented
scavenging of exogenous H2O2 at micromolar concentrations.
They also highlighted the catalytic efficiency of catalases and
alkyl hydroperoxide reductases, since the Ahp⫺ and Kat⫺ mutants could completely degrade 10 ␮M H2O2 in a few minutes.
Next, to evaluate the impact of millimolar concentrations of
H2O2 on Salmonella fitness, strains were grown to an OD600 of
0.3 in LB medium and treated with 1 mM H2O2, and growth
was monitored at 600 nm over time. The Kat⫺ and HpxF⫺
mutant growth was abolished following the addition of exogenous H2O2 (Fig. 3B). In contrast, growth of the wild type and
the Ahp⫺ strain was not affected, reflecting the poor efficiency
of AhpC and TsaA in scavenging millimolar concentrations of
H2O2. Finally, we examined cell viability after exposure to 1
mM H2O2. Bacterial cells were collected just before and 1 and
2 h after H2O2 treatment. We observed that 2 h after stress,
plating recovery of the HpxF⫺ mutant exhibited a 25-fold drop,
from ⬇108 to 4 ⫻ 106 CFU/ml, whereas plating recovery of the
wild-type strain showed a 10-fold increase (Fig. 3C). Viability
of the Kat⫺ strain was also affected, since its plating recovery
showed a threefold decrease 2 h after stress, whereas the Ahp⫺
mutant survived as well as its wild-type parent. Differences in
plating recovery between the Kat⫺ and HpxF⫺ mutants also
assigned a scavenging effect to the Ahp enzymes, observed only
Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
FIG. 1. E. coli Hpx⫺ and Salmonella HpxF⫺ strains share the same growth defect linked to filamentation. S. Typhimurium 12023 (wild type;
filled squares), E. coli MG1655 (wild type; filled circles), S. Typhimurium HpxF⫺ (katE katG katN aphCF tsaA; open triangles), S. Typhimurium
HpxT⫺ (katE katG aphCF; open squares), and E. coli Hpx⫺ (katE katG aphCF; open circles) cells were grown in LB medium anaerobically until
early log phase. The cells were then diluted in aerobic LB medium to an OD600 of 0.05, and aerobic growth was monitored at 600 nm (A and B).
At OD600s of 0.1, 0.5, and 1, cells from the five strains were removed for microscopic observations (C) (magnification, ⫻100).
VOL. 191, 2009
when the catalases were inactivated (Fig. 3C). All together,
these experiments highlighted the sensitivity of the HpxF⫺
mutant when subjected to exogenous stress and the importance
of the catalases in degrading millimolar concentrations of exogenous hydrogen peroxide.
The HpxFⴚ mutant is defective for proliferation within macrophages. To investigate the involvement of catalases and alkyl
hydroperoxide reductases in intracellular proliferation, we in-
4609
FIG. 3. The HpxF⫺ mutant is highly sensitive to exogenous hydrogen peroxide. (A) Wild-type (filled squares), Ahp⫺ (filled circles),
Kat⫺ (open squares), HpxF⫺ (open circles), and heat-killed wild-type
(filled triangles) cells were grown in minimal medium to an OD600 of
0.3 and then diluted at an OD600 of 0.1. H2O2 was added at a final
concentration of 10 ␮M. Aliquots were removed every 90 s to assay
H2O2 levels as described in Materials and Methods. (B) Bacterial
cultures (wild type, Ahp⫺, Kat⫺, and HpxF⫺) grown to an OD600 of 0.3
in LB medium were treated with 1 mM hydrogen peroxide (arrow).
The growth was then monitored at 600 nm. (C) Viability was assayed,
respectively, before (white bars) and 1 h (gray bars) and 2 h (black
bars) after H2O2 treatment by plating the bacterial cells on LB agar
supplemented with catalase. Results are the means ⫾ standard deviations for three independent experiments, each in triplicate.
fected two kind of cells: macrophages freshly prepared from
murine bone marrow and considered highly oxidant and RAW
264.7 mouse macrophages. Both kind of cells were activated
with IFN-␥ and PMA and infected with the wild-type, Ahp⫺,
Kat⫺, and HpxF⫺ Salmonella strains. Bacterial proliferation
was assayed by calculating the proliferation index as a ratio of
Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
FIG. 2. Endogenous H2O2 does not affect HpxF⫺ mutant viability.
(A) Cultures of Salmonella Typhimurium 12023 (wild type; filled
squares), the Ahp⫺ mutant (aphCF tsaA; filled circles), Kat⫺ (katE
katG katN, open squares), and the HpxF⫺ mutant (katE katG katN
aphCF tsaA; open circles) were grown overnight aerobically in minimal
medium supplemented with Casamino Acids, diluted to an OD of 0.05,
and grown for four generations. The cells were then washed in fresh
medium and incubated, and aliquots were removed every 5 min to
measure H2O2 concentrations as described in Materials and Methods.
(B) Wild-type, Kat⫺, Ahp⫺, and HpxF⫺ strains were grown in LB
medium. At OD600s of 0.5 (white bars) and 2 (gray bars), aliquots were
removed from each culture and plated on LB agar supplemented with
catalase to determine cell viability. Results are the means ⫾ standard
deviations for three independent experiments, each in triplicate.
(C) Wild-type, Kat⫺, Ahp⫺, and HpxF⫺ cells were grown in minimal
medium overnight. The cells were then diluted to an OD600 of 0.1, and
aerobic growth was monitored at 600 nm.
OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA
4610
J. BACTERIOL.
HÉBRARD ET AL.
the intracellular bacteria between 16 and 2 h postinfection.
Within murine bone marrow, the proliferation indexes of the
wild-type and Kat⫺ cells were found to be nearly similar
(2.38 ⫾ 0.21 and 2.76 ⫾ 0.10, respectively), whereas the Ahp⫺
and HpxF⫺ mutants were defective for proliferation (0.92 ⫾
0.07 and 0.64 ⫾ 0.01, respectively) (Fig. 4A). Within RAW
cells, the proliferation index was also very near for the wild-
TABLE 2. Competition assays with micea
Strain
description
Median
CI
No. of
mice
P valueb
Fold
attenuation
Kat⫺
Ahp⫺
HpxF⫺
1.11
1.20
0.07
4
4
5
NSc
NS
⬍0.0001
NS
NS
14
a
Mice were inoculated intraperitoneally with a mixture of two strains. At day
2 after injection, spleens were harvested for bacterial counts. CIs of wild-type
versus Kat⫺, wild-type versus Ahp⫺, and wild-type versus HpxF⫺ strains were
determined.
b
A one-sample t test was used to determine whether the CI was significantly
different from 1.
c
NS, not significant.
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FIG. 4. HpxF⫺ mutations led to a drastic attenuation of intracellular proliferation within bone marrow-derived and RAW 264.7 macrophages. Opsonized bacteria (Wild type or Kat⫺, Ahp⫺, or HpxF⫺
mutant) were phagocytosed by freshly prepared bone marrow-derived
macrophages (A) or RAW 264.7 cells (B), both activated with IFN-␥
and PMA. Two and sixteen hours postinfection, mouse macrophages
were lysed for enumeration of intracellular bacteria (gentamicin protected), determined by CFU counts. The values shown represent the
proliferation index, calculated as a ratio of the intracellular bacteria
between 16 and 2 h postinfection. (C) The HpxF⫺ mutant and the
wild-type strain were tested for infection of activated RAW 267.4 cells
without or with 1 ␮M DPI, which inhibits the phagocyte NADPH
oxidase. The proliferation index was calculated as described above.
The inset represents the proliferation index ratio (wild type/HpxF⫺)
without or with 1 ␮M DPI. Results presented in the three panels are
the means ⫾ standard deviations for at least three independent experiments, each in triplicate.
type and Kat⫺ cells (11.9 ⫾ 0.6 and 11.5 ⫾ 1.9, respectively)
whereas the Ahp⫺ and HpxF⫺ mutants exhibited proliferation
indexes of 5.5 ⫾ 2.1 and 0.5 ⫾ 0.1, respectively (Fig. 4B). These
results indicated that the HpxF⫺ mutant was unable to proliferate within bone marrow or RAW 264.7 macrophages. Moreover, they highlighted the contribution of Ahp enzymes to
intracellular replication within macrophages. Next, to test if
the lack of proliferation of the HpxF⫺ mutant was due to
exogenous oxidative stress generated by the phagocyte
NADPH oxidase, we infected macrophages in the presence of
various concentrations of DPI, an inhibitor of this enzymatic
complex. The proliferation index of the HpxF⫺ strain increased 3.7-fold in the presence of 1 ␮M DPI (Fig. 4C). Conversely, the proliferation index of the wild-type strain decreased from 10.4 ⫾ 2.4 to 3.9 ⫾ 2.1 when DPI was added,
indicating that this molecule had an undesirable effect on the
bacterial proliferation (Fig. 4C). Thus, we calculated the comparative wild type/HpxF⫺ proliferation index ratio, which
dropped from 28.8 to 2.9 in the presence of the NADPH
oxidase inhibitor (Fig. 4C). These results showed that despite
the nonspecific effect of DPI, the oxidative stress generated by
the NADPH oxidase was partially responsible for the proliferation defect of the HpxF⫺ mutant.
The HpxFⴚ mutant exhibited attenuated virulence in mice.
Finally, we tested whether mutation of catalase- and alkyl
hydroperoxide reductase-encoding genes contributed to virulence in the animal. To address this issue, we used mixed
infections of wild-type and mutant strains in mice to determine
the CI, a very sensitive technique to compare the virulence
levels of different strains (3). The lack of three catalases and
two alkyl hydroperoxide reductases significantly decreased Salmonella virulence, since the CI of the HpxF⫺ mutant was
found to be 0.07 (Table 2). In contrast, the CIs of the Kat⫺ and
Ahp⫺ mutants did not show any significant alteration in virulence (Table 2). These results indicate that deletion of all
catalase- and Ahp-encoding genes strongly affects Salmonella
virulence in the mouse model. As a control, a competition
assay was performed in LB, in which the mutant and wild-type
strains were mixed one to one and grown under aerated conditions. The CIs of the Kat⫺, Ahp⫺, and HpxF⫺ mutants were
found to be 1.10, 0.86, and 0.69, respectively (Table 3). Thus,
the three mutants tested could compete with the wild-type
strain in rich culture medium. All in all, these data provided
evidence for a contribution of catalases and alkyl hydroperoxide reductases in allowing resistance against oxidative stress
generated during the infection process.
VOL. 191, 2009
OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA
4611
TABLE 3. Competition assays with LB aerated culturesa
Strain
description
Median
CI
No. of
samples
P valueb
Fold
attenuation
Kat⫺
Ahp⫺
HpxF⫺
1.10
0.86
0.69
3
3
3
NSc
NS
NS
NS
NS
NS
a
Bacterial mixtures were incubated with equal amounts for 24 h with shaking.
Cells were then diluted and plated to determine the relative percentage of each
strain recovered. CI of wild-type versus Kat⫺, wild-type versus Ahp⫺, and wildtype versus HpxF⫺ strains were determined.
b
A one-sample t test was used to determine whether the CI was significantly
different from 1.
c
NS, not significant.
FIG. 5. Expression pattern of catalase- and alkyl hydroperoxide
reductase-encoding genes in LB and RAW 264.7 macrophages. RNA
was extracted from the Salmonella wild-type strain grown either in LB
medium to an OD600 of 2 or within activated RAW 264.7 cells during
6 h. cDNA were synthesized from 1 ␮g RNA, and real-time PCR was
performed to amplify the katE, katG, katN, ahpC, tsaA genes. A noncoding (n.c.) DNA domain located between STM0413 and STM0414
was used as a control to monitor the basal level of expression due to
residual genomic DNA. The results are the means ⫾ standard deviations for three independent experiments.
Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
Gene expression pattern in LB and macrophages. To monitor the expression of Salmonella catalase- and Ahp-encoding
genes, we performed quantitative reverse transcription-PCR
using a wild-type strain grown either within RAW 264.7 macrophages for 6 h or in LB to an OD600 of 2. Within macrophages, ahpC and tsaA were strongly transcribed (3 ⫻ 1010 and
4.7 ⫻ 1010 copies/␮g RNA, respectively) (Fig. 5). In comparison, the three catalase-encoding genes presented much lower
expression levels (4.3 ⫻ 109, 4.7 ⫻ 108, and 4.5 ⫻ 108 copies/␮g
RNA for katG, katE, and katN, respectively) (Fig. 5). These
data highlight the efficient transcription of ahpC and tsaA, both
being strongly expressed in LB and within macrophages.
The katG and tsaA genes can complement the HpxFⴚ mutant. To evaluate the contributions of individual genes in H2O2
scavenging, we cloned katG and tsaA into the low-copy-number plasmid pACYC184. Wild-type and HpxF⫺ strains were
transformed with the pkatG and ptsaA plasmids, and these
strains were grown in LB. When submitted to 1 mM H2O2, the
HpxF⫺ strain carrying pkatG grew as well as its wild-type
parent (Fig. 6A). In contrast, the HpxF⫺ strain carrying ptsaA
showed a growth defect similar to that of the HpxF⫺ strain
carrying pACYC184 (Fig. 6A). Thus, the presence of katG
carried on a low-copy-number plasmid (10 to 15 copies/cell)
FIG. 6. pkatG and ptsaA complement the HpxF⫺ mutant with different efficiencies. Bacterial cultures (wild type, filled symbols; HpxF⫺, open
symbols) were transformed with empty vector (squares), the pkatG plasmid (circles), or the ptsaA plasmid (triangles). The cells grown to an
OD600 of 0.3 and were treated with 1 mM H2O2 (arrow). Growth was
monitored at an OD of 600 nm (A), and the viability was assayed before
(white bars) and 1 h (gray bars) and 2 h (black bars) after H2O2 treatment
(B). Wild-type and HpxF⫺ strains were transformed with empty vector,
pkatG, and ptsaA and were tested for infection within activated RAW
264.7 cells. Bacterial cells were plated and counted on LB agar supplemented with chloramphenicol and catalase. The values shown represent
the proliferation index, calculated as a ratio of the intracellular bacteria
between 16 and 2 h postinfection (C). Results presented in panels B and
C are the means ⫾ standard deviations for at least three independent
experiments, each in triplicate.
4612
HÉBRARD ET AL.
DISCUSSION
Resistance to oxidative stress is one of the key processes that
allow pathogens to survive within macrophages. Hence, pathogenic bacteria have developed a series of antioxidative defenses which either eliminate ROS or repair their damages (18,
31). In recent years, several attempts have been made to assess
the contribution of these defenses to the overall virulence of
bacteria. Surprisingly, the outcome was not as straightforward
as one would have anticipated. Thus, in several cases, inactivation of genes encoding ROS-eliminating enzymes failed to
cause a significant defect in bacterial virulence. For instance,
inactivation of catalase-encoding genes had little if any effect
on pathogenicity-associated traits of Salmonella Typhimurium
(5), Yersinia pestis (15), Francisella tularensis (21), Staphylococcus aureus (9), and Neisseria gonorrhoeae (34). In the present
study, we addressed the question of the involvement of cytoplasmic H2O2-degrading enzymes in Salmonella virulence. Our
study revealed that efficient proliferation of this bacterium in
macrophages relies on the activities of three catalases and two
alkyl hydroperoxide reductases. It illustrates how Salmonella
has evolved numerous and redundant defense mechanisms to
survive within such hostile and oxidative environments.
Analysis of the S. Typhimurium genome allowed us to identify five genes encoding H2O2 degrading enzymes: two alkyl
hydroperoxide reductases, AhpC and TsaA, and three catalases, KatE, KatG, and KatN. Alkyl hydroperoxide reductase
activity was found to contribute to macrophage infection, since
the proliferation index of a strain lacking both ahpC and tsaA
was decreased by twofold. This observation could be linked to
the oxidative microenvironment present within a Salmonellacontaining vacuole (SCV), where ROS and reactive nitrogen
species are massively synthesized after macrophage phagocytosis (18, 36). Stimulation of NADPH oxidase and NO synthase, both located on the SCV membrane of the macrophages, leads to the production of O2䡠⫺ and NO䡠, respectively.
Both molecules (i) are used directly as a reactive species
against Salmonella, (ii) are enzymatically transformed into another reactive species (H2O2 or NO2䡠), or (iii) react with each
other to generate a peroxynitrite anion, ONOO⫺. In contrast,
a Kat⫺ mutant strain, lacking all three catalases, exhibited a
wild-type-like proliferation index within macrophages and
mice. This is consistent with previous results in which a Salmonella katE katG mutant retained full murine virulence (5).
Alternatively, the wild-type phenotype of the Kat⫺ mutant
could be related to the low expression levels of katE, katG, and
katN under infection conditions. However, this possibility can
be discarded on the basis that a Kat⫺ mutant failed to resist to
millimolar exogenous H2O2. This implies that the level of expression recorded was sufficient for participation in H2O2 scavenging. Moreover, one can anticipate that the presence of
catalases was the very thing accounting for the resistance of the
Ahp⫺ mutant to millimolar concentrations of H2O2. These
observations fit with the E. coli model, wherein AhpC was
proposed to be of primary importance in scavenging micromolar concentrations of H2O2 whereas the role of catalases was
dominant at millimolar concentrations of H2O2 (32).
An HpxF⫺ mutant lacking the three catalases and the two
alkyl hydroperoxide reductases was unable to proliferate or
even survive within macrophages. These mutations also contributed to the attenuation of Salmonella virulence, since the
HpxF⫺ cells exhibited a reduced proliferation in mice. Exogenous ROS were found to be partially responsible for the
proliferation defect of the HpxF⫺ mutant, since its intracellular replication increased when NADPH oxidase was inhibited.
But the DPI did not allow this mutant to reach a wild-type
replication efficiency, and its effects appeared quite difficult to
sort out since it altered proliferation of the wild-type strain as
well. Still, the fact that DPI increased the replication of the
HpxF⫺ mutant is fully consistent with the “exogenous ROS”
hypothesis. Other causes could account for the reduced proliferation of the HpxF⫺ cells. For instance, this mutant was
found to accumulate H2O2 during aerobic growth much faster
than its wild-type parent. Thus, endogenous ROS generated
during aerobic metabolism in the bacterial cytoplasm might
contribute to cumulative oxidative damages. Moreover, the
HpxF⫺ mutant was found to grow poorly in minimal medium,
and nutrient limitation within the SCV could amplify this
trend. Finally, the two detrimental effects could act synergistically and explain the drastic attenuation of proliferation of the
HpxF⫺ mutant within macrophages and mice.
Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
was sufficient to allow wild-type resistance to exogenously
added H2O2. On the other hand, the tsaA-encoded enzyme did
not support a catalytic efficiency strong enough to allow the
HpxF⫺ mutant to be resistant to 1 mM H2O2.
We also investigated cell viability after exposure to 1 mM
H2O2. HpxF⫺ cells carrying pkatG exhibited a wild-type plating recovery (⬇108 to ⬇2 ⫻ 109 CFU/ml 2 h after stress),
compared to a 10-fold decrease in viability of the HpxF⫺,
pACYC184-carrying control (Fig. 6B). Moreover, in a wildtype background, the presence of pkatG yielded an increased
plating recovery of ⬇2 ⫻ 109 CFU/ml 2 h after stress, compared to ⬇7 ⫻ 108 CFU/ml obtained with pACYC184. The
contribution of tsaA was less pronounced but increased 4.5fold the bacterial cell survival level: 54% of the HpxF⫺ cells
carrying ptsaA survived for 2 h after the stress, compared to
12% for the HpxF⫺ cells carrying pACYC184 (Fig. 6B). Thus,
katG was found to restore the viability of the HpxF⫺ cells,
whereas a slight contribution was attributed to tsaA.
The contribution of katG and tsaA was also assayed under
infection conditions. All proliferation indexes were found to
decrease in the presence of the pACYC184 plasmid and its
derivatives, as described previously (19). Transformation of the
wild-type strain with pkatG or ptsaA did not significantly
change the intracellular proliferation compared to results with
the empty vector (1.6-fold and 0.73-fold, respectively) (Fig.
6C). In contrast, the presence of katG or tsaA noticeably increased the proliferation index of the HpxF⫺ mutant (9.6-fold
or 6.7-fold, respectively). Moreover, the proliferation indexes
of the HpxF⫺ strain carrying pkatG and wild-type strain carrying pACYC184 were found to be quite similar (2.21 ⫾ 0.95
versus 2.47 ⫾ 0.31) (Fig. 6C). This observation suggested that
an overexpressed single gene suppressed a phenotype generated by the mutation of five different genes. Thus, these experiments assigned a direct role for both the tsaA and katG
genes in intracellular bacterial growth, showing a link between
resistance to oxidative stress and proliferation within macrophages.
J. BACTERIOL.
VOL. 191, 2009
4613
(37). Their data suggested that the NADPH phagocyte oxidase
could be excluded from SCV in a Salmonella pathogenicity island
2-dependent manner. Thus, an emerging comprehensive picture
would be that Salmonella relies on two alternative ways of coping
with oxidative stress: excluding the NADPH phagocyte oxidase
and metabolizing ROS produced by the host. Investigation of the
interplay between the two strategies represents a major challenge
for the future.
ACKNOWLEDGMENTS
Thanks are due to the members of the F.B. group, A. Latifi and P.
Moreau (LCB, Marseille, France), for fruitful discussions and to R.
Stevens (GAFL, Avignon, France) for critical reading of the manuscript.
This work was funded by the ANR (Programme Blanc “Stress Oxydant” and Programme M.I.E. “Salmo-sensor”), the CNRS, and the
Université de la Méditerranée. M.H. was supported by the Ministère
de la Recherche and J.P.M.V. by the Fondation pour la Recherche
Médicale (FRM).
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Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
The HpxF⫺ mutant exhibited much stronger deficiencies
than the Ahp⫺ or Kat⫺ mutant. The additive effect of the ahpC
tsaA and katE katG katN mutations opened the possibility that
both types of scavenging systems contribute in a specific way to
the replication process. For instance, H2O2 concentrations
were found to vary during infection, increasing massively just
after phagocytosis and decreasing during the next 6 h (36).
Then, both type of activity would be exploited at different time
points during the whole process. An alternative possibility is
that the substrate repertoire of alkyl hydroperoxide reductases
is much more expanded than that of catalases: ethyl, t-butyl,
cumene, and linoleic acid hydroperoxides, among others, were
efficiently reduced by Salmonella AhpC (29). Also, this enzyme
was shown to protect Salmonella against reactive nitrogen intermediates and to detoxify peroxynitrite (ONOO⫺) to nitrite
fast enough to forestall DNA oxidation (4, 8). Hence, catalases
could act as an H2O2 scavenger while alkyl hydroperoxide
reductases could intervene in eliminating micromolar concentrations of H2O2 and other hydroperoxides.
The redundancy of Salmonella enzymes is striking even in a
comparison with the closely related E. coli, which requires only
three genes, ahpC, katE, and katG, to scavenge H2O2. It is a
classic hypothesis that occurrence of redundancy can be rationalized by genetic regulation. In the present work, the expression levels of Salmonella tsaA and ahpC, quantified 6 h after
macrophage infection, were found to be high. Conversely, the
three catalase-encoding genes were poorly transcribed. The
importance of fine-tuning gene expression was also illustrated
by the fact that a moderate increase in gene dosage (15 copies
per cell) allowed either katG or tsaA to confer a proliferation
index similar to that of the wild type. This demonstrated that
increased synthesis of only one type of H2O2-degrading activity
is sufficient to restore a wild-type replication level within macrophages. However, a certain degree of redundancy also arises
at the regulatory level, with OxyR being the transcriptional
activator of katG and ahpC whereas katE and katN transcription is RpoS dependent. Our ongoing work aims at assessing a
link between redundancy and genetic regulation by carrying
out a thorough gene regulation study with Salmonella-infected
macrophages.
Previous studies had revealed that an important aspect of
Salmonella survival within macrophages was the production of
two periplasmic Cu/Zn superoxide dismutases, SodCI and
SodCII. These enzymes combat phagocytic superoxide O2䡠⫺ by
dismutation to H2O2 and O2. SodCI but not SodCII was found to
play a role during infection of mice by Salmonella (10, 20, 35). In
this context, SodCI and SodCII were considered the front line for
combating NADPH-oxidase-generated superoxide. A remaining
question was the management of H2O2 produced by dismutation
of superoxide. The H2O2 flux into the bacterial cytoplasm was
shown to be rapid, with a high permeability coefficient of the
membrane (33). Here we showed that cytoplasmic catalases and
alkyl hydroperoxide reductases constitute a second line for combating H2O2 produced by SodCI and SodCII in the periplasm.
Hence, together with these previous studies, the present work
contributes to a better understanding of the strategies used by
Salmonella to resist host-produced ROS. It will now be extremely
important to bring into the picture the proposal by Fang and
coworkers that Salmonella pathogenicity island 2 allows bacteria
to avoid NADPH oxidase-dependent killing by macrophages
OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA
4614
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
28.
29.
proteins can significantly inhibit Salmonella enterica virulence in both epithelial cells and macrophages: implications for bacterial pathogenesis studies. Infect. Immun. 73:7027–7031.
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Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010
27.
HÉBRARD ET AL.
Supplemental Material
Proliferation index (16 h/2 h)
5
4
3
2
1
0
WT
Kat-
Ahp-
HpxF-
Figure 7: Non-opsonized bacteria (Wild-type, Kat-, Ahp-, and HpxF- mutants) were
phagocytosed by activated RAW 264.7 cells. 2 and 16 hours post-infection, mouse
macrophages were lysed for enumeration of intracellular bacteria (gentamicinprotected) determined by colony-forming unit counts. The values shown represent
the proliferation index calculated as a ratio of the intracellular bacteria between 16
and 2 hours post-infection. These results are the means of one experiment
performed in triplicate.
Table S1
List of the primers used for quantitative RT-PCR.
Target gene
n.c. DNA
R : CCGTCATTTATGACATGGATTG
F : AATCGATTGCGTTCACGTTT
katE
R : CTTAAAAGCGCCCGAGACC
F : ATTGGTGGTCAGCGCATAAT
katG
R : TGGAAAATGTCCTTTCCATCA
F : AAGATCCACGCGAAGCTG
katN
R : TTTCGACACGTAAAACAACTTCA
F : ACTGTTCCAGCAGCAGGTTC
ahpC
R : CTTTCAAAAACCAGGCGTTC
F : GGTAGAAGAAGAAGACGCTCCA
tsaA
R : TGGTACTGGTTACTCGTCAGG
F : CCATTGGTGTGCTGTTTGAA
Proliferation index (16 h/2 h)
5
4
3
2
1
0
WT
katE- katG- katE- katGkatN- ahpCF- katN- tsaA-
HpxF-
Figure 8: Opsonized bacteria (Wild-type, katE katG katN ahpCF, katE katG katN
tsaA, and HpxF- mutants) were phagocytosed by activated RAW 264.7 cells. 2 and
16 hours post-infection, mouse macrophages were lysed for enumeration of
intracellular bacteria (gentamicin-protected) determined by colony-forming unit
counts. The values shown represent the proliferation index calculated as a ratio of
the intracellular bacteria between 16 and 2 hours post-infection. These results are
the means of one experiment performed in triplicate. Note that activation of
macrophages was performed using IFN-γ at 25 U/ml, whereas 10 U/ml were used in
the experiments presented in the figures 4A, 4B, 4C, and 6C.
Résultats complémentaires non publiés
Résultats complémentaires Partie 3
AhpC
AhpC
TsaA
TsaA
AhpC
AhpC
TsaA
TsaA
AhpC
AhpC
TsaA
TsaA
AhpC
AhpC
TsaA
TsaA
S.
E.
S.
H.
S.
E.
S.
H.
S.
E.
S.
H.
S.
E.
S.
H.
typhimurium
coli
typhimurium
pylori
typhimurium
coli
typhimurium
pylori
typhimurium
coli
typhimurium
pylori
typhimurium
coli
typhimurium
pylori
10
20
30
40
50
60
|
|
|
|
|
|
MSLINTKIKPFKNQAFK-NGEFIEVT--EKDTEGRWSVFFFYPADFTFVCPTELGDVADH
MSLINTKIKPFKNQAFK-NGEFIEIT--EKDTEGRWSVFFFYPADFTFVCPTELGDVADH
MVLVTRQAPDFTAAAVLGSGEIVDKFNFKQHTNGKTTVLFFWPMDFTFVCPSELIAFDKR
-MLVTKLAPDFKAPAVLGNNEVDEHFELSKNLGKNGAILFFWPKDFTFVCPTEIIAFDKR
*:.
*. *. ..*. :
.:.
. :::**:* *******:*: . .:
70
80
90
100
110
120
|
|
|
|
|
|
YEELQKLGVDVYSVSTDTHFTHKAWHSSSE---TIAKIKYAMIGDPTGALTRNFDNMRED
YEELQKLGVDVYAVSTDTHFTHKAWHSSSE---TIAKIKYAMIGDPTGALTRNFDNMRED
YEEFQKRGVEVVGVSFDSEFVHNAWRNTPVDKGGIGPVKYAMVADVKREIQKAYGIEHPD
VKDFQEKGFNVIGVSIDSEQVHFAWKNTPVEKGGIGQVTFPMVADITKSISRDYDVLF-E
:::*: *.:* .** *:. .* **:.:.
*. :.:.*:.* . : : :.
:
130
140
150
160
170
180
|
|
|
|
|
|
EGLADRATFVVDPQGIIQAIEVTAEGIGRDASDLLRKIKAAQYVAAHPGEVCPAKWKEGE
EGLADRATFVVDPQGIIQAIEVTAEGIGRDASDLLRKIKAAQYVASHPGEVCPAKWKEGE
EGVALRGSFLIDANGIVRHQVVNDLPLGRNIDEMLRMVDALQFHEEH-GDVCPAQWEKGK
EAIALRGAFLIDKNMKVRHAVINDLPLGRNADEMLRMVDALLHFEEH-GEVCPAGWRKGD
*.:* *.:*::* : ::
:.
:**: .::** :.* .
* *:**** *.:*.
190
200
|
|
ATLAPSLDLVGKI-------ATLAPSLDLVGKI-------EGMNASPDGVAKYLAENISSL
KGMKATHQGVAEYLKENSIKL
: .: : *.:
Figure 1 : Alignement des séquences protéiques d’AhpC et de TsaA
Les séquences protéiques d ’AhpC de S. typhimurium et d’E. coli ont été alignées, ainsi que celles
de TsaA de S. typhimurium et d’E. coli. AhpC et TsaA portent des motifs catalytiques conservés (boites
grises). La cystéine péroxidatique est localisée dans le premier motif catalytique, Cys50; la cystéine de
résolution est localisée dans le second motif catalytique, Cys172. Ces deux cystéines sont représentées
en rouge.
Résultats complémentaires Partie 3
Comparaison de séquences protéiques entre les peroxyrédoxines AhpC et TsaA
AhpC appartient à la famille des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines, TsaA fait également
partie de cette famille. Cette protéine a été caractérisée chez Helicobacter pylori et a été
appelée AhpC (Baker at al., 2001). AhpC et TsaA sont toutes deux présentes chez S.
typhimurium. Ces deux peroxyrédoxines possèdent les deux cystéines catalytiques : Cys46 et
Cys165. Cys46 est la cystéine péroxidatique, elle forme un acide sulfénique Cys-S-OH après
avoir réduit un hydroperoxyde, Cys165 est la cystéine de résolution, elle forme un pont
disulfure avec Cys46. Le pont disulfure formé est réduit par une réductase disulfure, AhpF est
le réductant spécifique d’AhpC. Le système réducteur de TsaA n’a pas été identifié in vivo.
Une étude réalisée en 2001 chez H. pylori a montré que TsaA pouvait être réduite in vitro par
le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase d’E. coli. Contrairement à AhpF, ce système
réducteur a une large spécificité de substrats (Baker et al., 2001). AhpF et le système
thiorédoxine/ thiorédoxine réductase sont eux-mêmes réduits par le cofacteur NADH.
L’alignement de séquence entre AhpC d’E. coli et de S. typhimurium et TsaA de S.
typhimurium et d’H. pylori a révélé deux domaines parfaitement alignés (Fig. 1). Le premier
domaine présentant une identité de séquence est constitué de sept acides aminés et inclus
Cys46, le second domaine est constitué de quatre acides aminés et inclus Cys165. Le
pourcentage d’identité de séquence protéique entre AhpC et TsaA de S. typhimurium est de
34,8% alors que celui effectué entre TsaA de S. typhimurium et d’H. pylori et de 58,5% (Fig.
1). Ces résultats soulignent les sites catalytiques conservés de AhpC et de TsaA de S.
typhimurium et suggèrent ainsi des activité enzymatiques identiques ainsi qu’un répertoire de
substrat commun.
75
Implication des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la
virulence de S. typhimurium
Résultats Partie 4
(B)
10
10
1
1
DO 600 nm
DO 600 nm
(A)
wt
0,1
wt
0,1
ahpCF- tsaA- tpx-
ahpCF- tsaA- tpx-
0,01
0,01
0
100
200
300
400
500
0
100
Temps (min)
200
300
400
500
Temps (min)
(C)
DO 600
1
0,1
wt
ahpCF- tsaA- tpx-
0,01
0
100
200
300
400
500
600
Temps (min)
Figure 1 : Croissance de la souche sauvage et du triple mutant en milieu LB, en milieu minimum
et en milieu LPM
(A) Une préculture de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en LB, à 37°C ont été
réalisées puis diluées dans les mêmes conditions. La croissance a été suivie à 600 nm.
(B) Une préculture de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en milieu minimum glucose
0,2% et amino acides 0,1%, à 37°C ont été réalisées, puis diluée dans les mêmes conditions. La
croissance a été suivie à 600 nm.
(C) Une préculture de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en LPM, à 37°C ont été
réalisées puis diluées dans les mêmes conditions. La croissance a été suivie à 600nm
Résultats Partie 4
S. typhimurium possède 9 gènes codant pour des peroxyrédoxines. Trois d’entre elles, AhpC,
TsaA et Tpx, ont déjà été impliquées dans l’établissement de la virulence bactérienne, (Baek
et al., 2009 ; Hu et al., 2009, Hebrard et al., 2009). Au cours de notre précédente étude, nous
avons montré qu’un mutant ∆ahpCF ∆tsaA était altéré dans sa capacité à proliférer dans le
macrophage. Ce résultat a soulevé la question du rôle des peroxyrédoxines dans le contexte de
l’infection chez S. typhimurium. Afin d’étudier l’importance des peroxyrédoxines dans la
virulence de S. typhimurium, nous avons entrepris une nouvelle approche génétique qui a
consisté à construire les doubles mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx, ∆tsaA ∆tpx ainsi que
le triple mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. La caractérisation phénotypique des doubles mutants
∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx, ∆tsaA ∆tpx ainsi que du triple mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx fait
l’objet de cette étude.
I-
Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx
Dans le but d’évaluer la contribution des peroxyrédoxines dans la physiologie bactérienne, la
croissance de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ont été analysées en milieu
LB, en milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1% et en milieu LPM (fig.1A, 1B
et 1C). Le milieu LPM (low phosphate low magnésium) est un milieu « pauvre » dans lequel
les concentrations en phosphate (337µM) et en magnésium (8µM) sont faibles et le pH est à
5,8 (Coombes et al., 2004). Ce milieu mime les conditions environnementales rencontrées
dans le macrophage. En milieu LB (Fig. 1A), la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA
∆tpx ont un temps de génération de 24 minutes. En milieu minimum (Fig. 1B), la souche
sauvage a un temps de génération de 50 minutes et le triple mutant de 55 minutes. En milieu
LPM (Fig. 1C), la souche sauvage a un temps de génération de 72 minutes et le triple mutant
de 90 minutes. L’inactivation d’ahpCF, de tsaA et de tpx n’entraine donc pas d’altération
majeure dans la croissance de S. typhimurium en milieu riche et en milieu minimum M9. Par
contre, en milieu carencé en magnésium et phosphate et à pH acide, ce mutant pousse
légèrement moins vite laissant supposer que la mutation d’ahpCF, de tsaA et de tpx entraîne
une altération du métabolisme de S. typhimurium.
II- Etude de la virulence du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx
1- Etude de la virulence dans des macrophages murins
76
Résultats Partie 4
(B)
2h pi
1,00E+07
16h pi
1,00E+06
cfu/ml
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
wt
Indice de proliferation 16h/2h
(A)
12
10
8
6
4
2
0
ahpCF- tsaA- tpx-
wt
ahpCF- tsaA- tpx-
Figure 2 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγγ par la souche sauvage et le
triple mutant.
Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 activés par l’IFNγ ont été infectées soit par la
souche sauvage, soit par le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par
cellule. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées par avec triton à 0,1%, les
bactéries intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. Les colonies ont été dénombrées et
l’indice de prolifération a été déterminé.
(A) Dénombrement des bactéries 2h et 16h après infection (pi).
(B) Indices de prolifération (cfu 16h/cfu2h).
(A)
(B)
1,00E+08
2h pi
25
16h pi
Indice de proliferation
1,00E+07
cfu/ml
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
20
15
10
5
0
wt
ahpCFtsaA-
ahpCFtpx-
tsaA- tpx-
wt
ahpCFtsaA-
ahpCF- tsaA- tpxtpx-
Figure 3 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγγ par les trois doubles mutants.
Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ ont été infectées soit par la souche
sauvage, soit par les mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50
bactéries par cellule. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées avec du triton à
0,1%, les bactéries intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. Les colonies ont été
dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé.
(A) Dénombrement des bactéries 2h et 16h après infection (pi)
(B) Indices de prolifération (cfu 16h/cfu2h)
Résultats Partie 4
Dans le but d’étudier l’implication des peroxyrédoxines de S. typhimurium dans la virulence,
un test de prolifération bactérienne dans des macrophages a été réalisé. Des macrophages
RAW 264.7 activés à l’IFNγ 10 U/ml ont été infectés par la souche sauvage ou le mutant
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. L’indice de
prolifération a été calculé. Un résultat expérimental typique est représenté (Fig. 2). Dans cette
expérience, le nombre de cfu de la souche sauvage augmente d’un logarithme entre 2 heures
et 16 heures alors que celui du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx reste quasiment identique (Fig.
2A). L’indice de prolifération de la souche sauvage est de 10 et celui du mutant ∆ahpCF
∆tsaA ∆tpx de 1,4 (Fig. 2B). Le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est très altéré dans sa capacité à
proliférer dans les macrophages, et son indice de prolifération chute d’un facteur 7 par rapport
à celui de la souche sauvage. Ce résultat indique que la capacité réplicative du mutant est
affectée par rapport à celle de la souche sauvage et que les peroxyrédoxines de S.
typhimurium sont requises pour l’étape de prolifération dans les macrophages.
Nous avons ensuite voulu comparer l’implication des trois peroxyrédoxines dans la capacité
proliférative de S. typhimurium dans les macrophages. Pour cela, nous avons infecté des
macrophages avec les mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx. Ces trois mutants
ont été analysés dans des macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ 10 U/ml (Fig. 3).
La valeur moyenne de l’indice de prolifération des mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et
∆tsaA ∆tpx est présentée sur la figure 3B. L’indice de prolifération de la souche sauvage est
de 15 et celui du mutant ∆tsaA ∆tpx est de 18. Le mutant ∆ahpCF ∆tsaA a un indice de
prolifération atteignant 10. Enfin, le double mutant ∆ahpCF ∆tpx a un indice de prolifération
de 7. Ces résultats confirment l’importance des peroxyrédoxines pour la survie de S.
typhimurium dans le macrophage puisque pour les mutants ∆ahpCF ∆tsaA et ∆ahpCF ∆tpx,
l’indice de prolifération obtenu est significativement inférieur à celui de la souche sauvage.
Néanmoins, la contribution physiologique des peroxyrédoxines n’est pas équivalente en
condition d’infection. En effet, seule l’absence d’AhpCF chez S. typhimurium en combinaison
avec la mutation de TsaA ou de Tpx altère la capacité à proliférer de S. typhimurium. Ce
résultat suggère que l’apport d’AhpCF en condition d’infection est supérieur à celui de TsaA
ou Tpx.
77
Résultats Partie 4
Souche A
wt
Souche B
Index de compétition en LB
Index de compétition dans
les souris
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx
0,7
0,5
Tableau 1 : Index de compétition en LB et dans les souris entre la souche sauvage et
le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx.
Une préparation constitué de la souche sauvage et le triple mutant à un ratio 1:1 a été utilisé pour être
ensemencé en milieu LB (DO600 = 0,025), ou inoculé par voie intrapéritonéale dans des souris (5.105
cfu/ml). Des aliquots de cultures bactériennes ont été prélevés dans le but de contrôler la concentration
de chacune des deux populations présentes (Input). 24 heures après ensemencement en milieu LB, un
aliquot de culture a été prélevé dans le but de déterminer les concentrations bactériennes finales
(Output LB). Deux jours après l’inoculation, les souris ont été sacrifiées, les rates prélevées et les
bactéries intracellulaires étalées sur boîte et dénombrées (Output souris). Au final, l’index de
compétition a été déterminé.
0,4
Index de competition
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Macrophages sauvages
Macrophages gp91-/-
Figure 4 : Infection de macrophages primaires gp91-/- issus de moelle osseuse activés à l’IFNγ.
Des macrophages sauvages et des macrophages dépourvus de la sous-unité gp91-Phox de la NADPH
phagocyte oxydase ont été infectés avec un inoculum composé de la souche sauvage et du mutant
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à un ratio 1:1 et à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. 2 heures après
infection, l’input a été calculé (cfu mutant/cfu sauvage). 16 heures après infection, l’output a été
calculé (cfu mutant/cfu sauvage). Au final, l’indice de prolifération a été déterminé (Output/Input)
Résultats Partie 4
2- Etude de la virulence en condition d’infection dans des souris
Dans le but de confirmer l’importance d’AhpCF, de TsaA et de Tpx dans la virulence de S.
typhimurium, des expériences de compétition dans les souris ont été entreprises.
Avant de réaliser l’infection, une expérience contrôlant les capacités du mutant ∆ahpCF
∆tsaA ∆tpx à entrer en compétition avec la souche sauvage a été réalisée en milieu LB. La
souche sauvage et le triple mutant ont été simultanément ensemencés dans un milieu LB à
concentration égale (DO600 = 0,025) et à un ratio 1:1. L’index de compétition, calculé 24
heures après infection est de 0,7 (Tableau 1), signifiant que le mutant est faiblement altéré
dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage pendant 24h, en milieu LB et
à 37°C.
Un nouvel inoculum bactérien composé de la souche sauvage et du triple mutant a été injecté
aux souris par voie intra-péritonéale. L’index de compétition obtenu 48 heures après infection
dans la souris est de 0,5 (Tableau 2), indiquant que le triple mutant est légèrement altéré dans
sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage lors d’une infection systémique.
III- Etude du rôle des peroxyrédoxines de S. typhimurium dans les macrophages
Afin de comprendre pourquoi le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était affecté dans sa capacité à
proliférer dans le macrophage, nous avons formulé l’hypothèse selon laquelle le mutant
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était sensible aux FAO et aux FAN produites par le macrophage. Afin de
tester notre hypothèse, deux types d’expérience ont été effectuées : nous avons infecté des
macrophages soit dépourvus de NADPH phagocyte oxydase (gp91-/-), soit altérés dans leur
capacité à produire des FAN, puis nous avons observé si le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx
accumulait dans son cytoplasme les FAO ou FAN produites par des macrophages sauvages.
1- Infection de macrophages gp91-/- ou de macrophages NO. déficients
Une expérience de compétition entre la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a été
réalisée soit dans des macrophages sauvages activés à l’IFNγ, soit dans des macrophages
dépourvus de la sous-unité gp91-Phox de la NADPH phagocyte oxydase (gp91-/-) également
activés à l’IFNγ. Des macrophages ont été infectés par un mélange des deux souches
bactériennes dans un ratio 1:1 et à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule pendant
16h. L’input et l’output ont été calculés 2h et 16h après infection, respectivement. L’index de
compétition a, finalement, été déterminé. Les macrophages dépourvus de NADPH phagocyte
78
Résultats Partie 4
(A)
300000
GFP/DO (UA)
250000
200000
150000
wt
100000
ahpCF- tsaA- tpx-
50000
ahpCF- tsaA- tpx- oxyR-
0
0
100
200
300
400
500
600
700
Temps (min)
(B)
300000
GFP/DO (UA)
250000
200000
150000
wt
ahpCF- tsaA-
100000
ahpCF- tpxtsaA- tpx-
50000
ahpCF- tsaA- tpx0
0
100
200
300
400
500
600
700
Temps (min)
Figure 5 : Expression du biosenseur vivant en milieu de culture.
Les souches transformées avec la sonde PahpC-GFP ont été cultivées en milieu minimum glycérol
0,2% et acides aminés 0,1%. La fluorescence a été suivie au cours du temps à 530 nm.
(A) La souche sauvage aunsi que les mutants ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx et ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ∆oxyR ont
été testés.
(B) La souche sauvage et les doubles mutants des peroxyrédoxines ont été testés.
Résultats Partie 4
oxydase sont des cellules contraignantes à obtenir et à cultiver, ainsi que très facilement
contaminables. Cette expérience n’a pu être réalisée qu’une fois. Dans les macrophages
primaires sauvages (Fig. 4), l’index de compétition obtenu est de 0,22. Dans les macrophages
gp91-/-, l’index de compétition obtenu est de 0,35. Ce résultat indique que le mutant ∆ahpCF
∆tsaA ∆tpx a toujours un défaut de prolifération dans des macrophages dépourvus de NADPH
phagocyte oxydase en comparaison avec la souche sauvage. Ainsi, les FAO produites par la
NADPH phagocyte oxydase ne sont pas responsables du défaut de prolifération du mutant
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx.
Nous avons poursuivi en infectant des RAW 264.7 traités avec un inhibiteur de la NO.
synthase inductible, le 1400W. Le 1400W est un inhibiteur sélectif et réversible de la NO.
synthase inductible. Il agit comme un compétiteur de la L-arginine pour le site actif de
l’enzyme. Les macrophages RAW 264.7 ont été traités avec 2µM de 1400W pendant toute la
durée de l’infection. Les macrophages ont également été traités avec de l’IFNγ 10 U/ml. Par la
suite, la prolifération bactérienne de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a été
analysée dans les macrophages pendant 16h. Les résultats sont présentés sur la figure 6.
L’indice de prolifération de la souche sauvage passe de 4 dans des macrophages non traités à
12 dans des macrophages traités au 1400W (Fig. 5). Pour le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx,
l’indice de prolifération passe de 0,8 à 1,6. L’indice de prolifération de la souche sauvage est
multiplié par 3 et celui du mutant par 2. En conclusion, bien qu’améliorant ses capacités
prolifératives, le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est toujours altéré dans sa capacité à proliférer
dans les macrophages en comparaison avec la souche sauvage. Ce résultat montre que les
FAN produites par la NO. synthase inductible ne sont pas responsables du défaut de
prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx.
Afin de diminuer les effets non spécifiques liés à l’utilisation de molécules artificielles, nous
avons reproduit l’expérience sur des macrophages simplement traités à l’IFNγ, cytokine
naturellement produite par le macrophage et importante pour la réponse immunitaire innée de
l’organisme et notamment pour activer la NO. synthase inductible. L’effet de l’IFNγ sur
l’activité de la NO. synthase inductible a été contrôlé par la mesure de nitrite dans des lysats
cellulaires de macrophages infectés, le nitrite étant un produit de dégradation du NO.. La
prolifération bactérienne de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a donc été
analysée dans les macrophages traités ou non à l’IFNγ. Les résultats sont présentés sur la
79
Résultats Partie 4
(A)
1,00E+07
2h pi
1,00E+06
16h pi
cfu/ml
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
wt
wt + 1400W
ahpCF- tsaA- tpx- ahpCF- tsaA- tpx-+
1400W
(B)
16
Indice de prolifération
14
12
10
8
6
4
2
0
wt
wt + 1400W
ahpCF- tsaA- tpx-
ahpCF- tsaA- tpx-+
1400W
Figure 6 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’INFγ et traités avec un inhibiteur de la
NO. synthase inductible
Deux heures avant infection, les macrophages RAW 264.7, préalablement activés à l’IFNγ, ont été
traités avec 2 µM de 1400W. Les macrophages ont ensuite été infectés par des précultures de la souche
sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule pendant 16
heures. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées par du triton à 0,1%, les bactéries
intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. Les colonies ont été dénombrées (A) et l’indice
de prolifération déterminé (B).
Résultats Partie 4
figure 6. L’indice de prolifération de la souche sauvage chute de 30 dans des cellules non
traitées à 2,8 dans des cellules traitées (Fig. 6B). Celui du mutant chute de 7 à 0,6. Les indices
de prolifération des deux souches ont chuté environ d’un facteur 11 après traitement des
macrophages par l’IFNγ illustrant l’importance des cytokines pour l’activation du macrophage
et de ses fonctions bactéricides. Ainsi, le rapport des indices de prolifération pour la souche
sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est identique. Ce résultat indique que l’absence de
traitement des macrophages à l’IFNγ n’améliore pas significativement la prolifération du
mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Comme dans les deux expériences précédentes, les
peroxyrédoxines ne semblent pas essentielles pour l’élimination des FAN produites par la NO.
synthase inductible.
La concentration en NO. produit pendant l’expérience a, ensuite, été mesurée.Le nitrite étant
facilement dosable grâce au réactif de Griess, nous avons dosé sa concentration dans des
lysats cellulaires (Fig. 6C). Dans des macrophages non traités, la concentration en nitrite
passe de 2 µM à 8 µM en présence de la souche sauvage et de 2 µM à 6 µM en présence du
mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx entre 2 heures et 16 heures d’infection. La concentration en nitrite
augmente donc d’un facteur 3. Dans des macrophages traités à l’IFNγ, la production de nitrite
passe de 2 µM à 15 µM pour la souche sauvage et de 2 µM à 18 µM pour le mutant ∆ahpCF
∆tsaA ∆tpx. La concentration en nitrite augmente d’un facteur 8 dans des cellules traitées à
l’IFNγ. Ce résultat confirme la présence de nitrite dans nos expériences d’infection de
macrophages activés à l’IFNγ et donc l’activité de la NO. synthase inductible. Ces expériences
montrent que les FAN ne sont pas responsable du phénotype du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx
dans les macrophages.
En conclusion, ces expériences suggèrent que le mutant n’est pas sensible soit aux FAO
seulement, soit aux FAN seulement. Ces résultats suggèrent plutôt une implication des
peroxyrédoxines dans l’élimination simultanée des FAO et des FAN.
2- Accumulation des FAO et FAN produites par des macrophages sauvages par
le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx
Afin de tester l’accumulation de FAO ou FAN dans le cytoplasme du mutant ∆ahpCF ∆tsaA
∆tpx, nous avons utilisé deux biosenseurs vivants : un biosenseur de l’H2O2 et un biosenseur
du NO.. Pour cela, le plasmide PahpC-GFP précédemment construite a été transformé dans le
mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Nous avons, dans un premier temps, testé l’activité
80
Résultats Partie 4
(A)
(B)
2h pi
16h pi
35
1,00E+06
30
Indice de prolifération
1,00E+07
cfu/ml
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
25
20
15
10
5
0
1,00E+00
wt
wt + IFNg
ahpCFahpCFtsaA- tpx- tsaA- tpx- +
IFNg
wt
wt + IFNg
ahpCFahpCFtsaA- tpx- tsaA- tpx-+
IFNg
[NaNO2] µM
(C)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
2h pi
16h pi
wt
wt + IFNg
ahpCF- tsaAtpx-
ahpCF- tsaAtpx-+ IFNg
Figure 7 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ et dosage de la production de
nitrite par les macrophages RAW 264.7
Des macrophages RAW 264.7, traités avec de l’IFNγ à 15 U/ml pendant 24 h, ont été infectés par la
souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. 2h et
16h après infection, les cellules infectées ont été lysées par 0,1% de triton, les bactéries intracellulaires
ont été isolées et étalées sur boîte LB. 24h après incubation à 37°C, les colonies ont été dénombrées (A)
et l’indice de prolifération a été déterminé (B). (C) 2h et 16h après infection, 1ml de surnageant de
culture de macrophage a été prélevé, afin de déterminer la concentration en nitrites produits par le
macrophage au cours de l’infection. La concentration en nitrite a été déterminée à l’aide du réactif de
Griess qui permet une détection colorimétrique du NO2.
Résultats Partie 4
transcriptionnelle du promoteur ahpC-gfp en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino
acides 0,1% sans ajout d’H2O2 exogène. Le résultat est présenté sur la figure 7A. Nous avons
observé une augmentation du niveau de fluorescence durant tout le temps de la croissance.
Ces résultats indiquent une forte activité transcriptionnelle du promoteur ahpC en l’absence
d’H2O2 exogène. Afin de nous assurer que l’augmentation de fluorescence observée était
dépendante d’OxyR, la mutation oxyR a été introduite dans la souche ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, la
souche ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ∆oxyR a été construite et l’expérience a été reproduite. Dans cette
souche, le niveau de fluorescence reste nul durant tout le temps de la croissance (Fig. 7A).
L’augmentation du niveau de fluorescence suggère que l’H2O2 perçu par la souche ∆ahpCF
∆tsaA ∆tpx est produit par son propre métabolisme, et que ce phénomène est dépendant de la
présence d’OxyR.
Ce résultat nous a conduit à reproduire l’expérience avec les mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF
∆tpx et ∆tsaA ∆tpx afin d’identifier l’enzyme responsable de ce phénotype (Fig. 7B). Dans les
mutants ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx, l’activité transcriptionnelle du promoteur ahpC n’est pas
induite. Par contre, le niveau de fluorescence du biosenseur ∆ahpCF ∆tsaA augmente
fortement au cours de la croissance et à un niveau équivalent à celui obtenu pour la souche
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Ce résultat indique que l’absence des gènes ahpCF et tsaA est la cause
de l’accumulation d’H2O2 et de l’activation transcriptionelle du promoteur ahpC. De la même
façon que dans le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, l’activation transcriptionnelle d’ahpC dans le
mutant ∆ahpCF ∆tsaA est dépendante d’OxyR (résultat non présenté). Le niveau de
fluorescence du biosenseur vivant dans le contexte génétique ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx étant élevé,
nous n’avons pas pu utiliser notre outil en condition d’infection dans les macrophages pour
savoir si le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx accumulait de l’H2O2 produit par la NADPH
phagocyte oxydase.
Dans le but de savoir si le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx accumulait du NO. produit par le
macrophage, un nouveau biosenseur a été construit à l’aide du promoteur du gène ytfE . Le
gène ytfE a été choisi car son activité transcriptionnelle est induite en présence de nitrite
acidifié, qui est un composé mimant les formes actives de l’azote produites dans le
macrophage (Kim et al., 2003). Le promoteur du gène ytfE a été fusionné à une séquence
codant pour la GFP-mut3a sur le plasmide pFPV25. Le plasmide construit a été transformé
dans la souche sauvage. Afin de valider l’outil construit, des croissances en milieu minimum
glycérol 0,2% et casamino acides 0,1% ont été réalisées avec le biosenseur vivant. En début
81
Résultats Partie 4
10000
wt pytfE-GFP
9000
wt pytfE-GFP + NO.
GFP/DO (UA)
8000
wt pytfE-GFP + H202
7000
wt pytfE-GFP + ONOO-
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
100
200
300
Temps (min)
400
500
600
Figure 8 : Expression de la fluoresence du biosenseur NO.-dépendant en réponse à différents
stress.
La souche sauvage portant plasmide PytfE-GFP a été cultivée en milieu minimum glycérol 0,2% et
acides aminés 0,1%. En début de croissance, 10 µM de Noc5-Noc7, générateurs d’oxyde nitrique, 20
µM d’H2O2, ou 20 µM de SIN-1, générateur de peroxynitrite, ont été rajoutés directement dans le
milieu de culture. La fluorescence de la GFP a été suivie au cours du temps à 530 nm.
600
wt
GFP/DO (UA)
500
ahpCF- tsaA- tpx400
300
200
100
0
0
2
4
Temps (h)
6
8
10
Figure 9 : Expression de la fluorescence du biosenseur NO.-dépendant en condition d'infection.
Des macrophages issus de lignée cellulaire, les RAW 264,7, activés à l’IFNγ ont été infectés par la
souche sauvage et le triple mutant tranformé par le plasmide PytfE-GFP. 1h, 2h, 4h, 7h et 10h après
infection, des aliquots de culture ont été prélevés, les cellules lysées, les bactéries intracellulaires
isolées, et leur niveau de fluorescence déterminé par cytométrie de flux.
Résultats Partie 4
de croissance, 10 µM d’oxyde nitrique, 20 µM de péroxyde d’hydrogène ou 20 µM de
peroxynitrite ont été ajoutés directement dans le milieu de culture et la fluorescence a été
suivie pendant 10 heures. Les résultats sont représentés sur la figure 8. En présence de
peroxyde d’hydrogène, de peroxynitrite ou en absence de tout composé, le niveau de
fluorescence reste à un niveau faible et constant. Par contre en présence de NO., une forte
augmentation du niveau de fluorescence est observable, reflétant l’activité transcriptionnelle
du promoteur ytfE. Cette expérience montre que l’activation de la transcription d’ytfE est
spécifique de l’oxyde nitrique. L’outil construit permet donc la détection de NO. présent dans
l’environnement et dans le cytoplasme de S. typhimurium.
Le biosenseur vivant de NO. a ensuite été analysé dans des macrophages RAW 264.7 activés à
l’IFNγ pendant 10 heures d’infection. Des aliquots de culture ont été prélevés 0, 1 heure, 2
heures, 4 heures, 7 heures et 10 heures après infection. Les cellules infectées ont été lysées
avec du triton, les bactéries intracellulaires isolées puis analysées en cytométrie de flux pour
leur niveau de fluorescence. Les résultats sont présentés sur la figure 9. Le niveau de GFP
mesuré est quasi-nul durant les quatre premières heures d’infection, puis il augmente
brutalement jusqu’à 7 heures d’infection. Enfin, entre 7 heures et 10 heures d’infection, le
niveau de fluorescence est stable et reste élevé. Ce résultat montre que le biosenseur vivant
perçoit du NO. 4 heures après le début de l’infection, et que le niveau augmente durant tout le
reste de l’infection.
Le biosenseur vivant a ensuite était analysé dans le contexte génétique ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx
dans les mêmes conditions d’infection. Le profil de la courbe de fluorescence obtenu pour le
biosenseur vivant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est strictement superposable à celui obtenu pour le
biosenseur vivant sauvage suggérant que ces deux biosenseurs vivants accumulent le NO. de
la même façon durant l’infection. Les peroxyrédoxines ne semblent donc pas éliminer le NO.
en condition d’infection.
IV- Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en présence de FAO
ou FAN
Le macrophage est un environnement complexe et mal défini, ce qui rend ardue la
compréhension des expériences d’infection. Dans le but de travailler dans un environnement
plus « simple », nous avons poursuivi en milieu de culture. Jusqu’alors, nous testions l’effet
de l’absence d’une enzyme génératrice soit de FAN, soit de FAO sur la prolifération du
82
Résultats Partie 4
(A)
(B)
DO 600 nm
10
1
wt
0,1
ahpCF- tsaA- tpx-
0,01
0
100
200
300
Temps (min)
(D)
(C)
10
1
DO 600 nm
DO 600 nm
10
wt
0,1
1
wt
0,1
ahpCF- tsaA- tpx-
0,01
ahpCF- tsaA- tpx0,01
0
100
200
300
400
Temps (min)
500
600
0
100
200
300
400
500
600
Temps (min)
Figure 10 : Croissance de la souche sauvage et du triple mutant en présence de formes actives de
l’oxygène.
(A) Equation d’oxydation du paraquat avec production d’anion superoxyde. Des précultures de la souche
sauvage et du triple mutant ont été réalisées en milieu LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées
en LB jusqu’à DO600 = 0,3. Puis, 1 mM de paraquat (B), 1 mM d’H2O2 (C) ou 50 µM d’hydroperoxyde de
cumène (D) ont été ajoutés directement dans le milieu de culture. La croissance a été suivie à DO 600 nm.
Résultats Partie 4
mutant. Nous avons, ensuite, adopté une stratégie qui a consisté à tester la présence d’un
composé défini sur la croissance ou sur la viabilité du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Pour cela,
deux types d’expériences ont été réalisées : nous avons, d’abord, testé le croissance du mutant
en présence de FAO ou de FAN, puis nous avons testé la sensibilité du mutant en présence de
FAO, de FAN ou des deux espèces.
1- Croissance du mutant en présence de FAO ou de FAN
Trois composés générateurs de FAO ont été testés sur le mutant, l’H2O2, le paraquat qui est un
générateur de superoxyde (Fig. 10A) et l’hydroperoxyde de cumène. L’expérience a consisté
à faire pousser les souches en milieu LB, à 37°C et en aérobiose. A DO600 = 0,3, les différents
composés ont été rajoutés dans le milieu de culture. En présence de 1 mM final de paraquat, la
croissance de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est ralentie par rapport à
une croissance en LB sans ajout de paraquat (Fig. 10B). La courbe de croissance du mutant
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est superposable à celle de la souche sauvage indiquant que les
peroxyrédoxines ne sont pas impliquées dans l’élimination du superoxyde. Une concentration
finale de 10 mM de paraquat a également été analysée. Nous n’avons également pas vu de
différence entre la croissance de la souche sauvage et du mutant des peroxyrédoxines.
L’expérience a été renouvelée en présence de 1 mM final d’H2O2 (Fig. 10C) et de 50 µM
finaux d’hydroperoxyde de cumène (Fig. 10D). Dans chacun des cas, les courbes de
croissance des de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx sont identiques. Les
peroxyrédoxines de S. typhimurium ne semblent donc pas être impliquées dans l’élimination
de l’anion superoxyde, de l’H2O2 et des alkyl hydroperoxydes.
Nous avons suivi des croissances avec la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en
milieu LB, en présence de deux formes actives de l’azote, l’oxyde nitrique et le peroxynitrite.
A DO600 = 0,3, les différents composés générateurs de FAN ont été rajoutés dans le milieu de
culture, la croissance a été suivie. L’expérience a été réalisée avec du NOC5/NOC7 à une
concentration finale de 50 µM. Le résultat est présenté sur la figure 11A. Le temps de
génération des deux souches est de 40 minutes. L’expérience a été renouvelée avec 250 µM
de NOC5/NOC7. Aucune différence significative n’est visible. L’expérience a finalement été
reproduite avec du SIN-1 à une concentration finale de 50 µM. Le résultat est présenté sur la
figure 11B. Le temps de génération de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est
83
Résultats Partie 4
(A)
DO 600 nm
10
1
wt
ahpCF- tsaA- tpx0,1
0,01
0
100
200
300
400
500
Temps (min)
(B)
DO 600 nm
10
1
wt
ahpCF- tsaA- tpx-
0,1
0
100
200
300
400
500
600
Temps (min)
Figure 11 : Croissance des souches en présence de formes actives de l’azote.
Des précultures de la souche sauvage et du triple mutant des peroxyrédoxines ont été réalisées en
milieu LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées en LB jusqu’à DO600 = 0,3. Puis, 50 µM
de NOC5/NOC7 (A) ou 50 µM de SIN-1 (B) ont été ajoutés directement dans le milieu de culture. La
croissance a été suivie à DO 600 nm.
Résultats Partie 4
de 40 minutes. Les peroxyrédoxines ne semblent donc pas contribuer à l’élimination du NO.
et du peroxynitrite.
2- Sensibilité de mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en présence de FAO ou de FAN
La viabilité du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a ensuite été testée en présence d’H2O2, de SIN-1,
un générateur de peroxynitrite et des deux composés en même temps.
Pour cela, les souches ont été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3. Les bactéries ont
été prélevées, lavées et reprises dans du tampon phosphate puis exposées à de l’H2O2 à une
concentration finale de 10 mM pendant trente minutes. Puis à 0, 120 et 240 minutes après les
trente minutes d’incubation avec l’H2O2, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et
étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement bactérien. Les résultats sont présentés sur
la figure 12A. Le nombre de cfu chute de 1,5.108 cfu/ml à 3.107 cfu/ml pour la souche
sauvage et de 1.108 cfu/ml à 1.107 cfu/ml pour le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, 200 minutes
après ajout de l’H2O2. La survie des deux souches est, donc, affectée de la même façon.
En parallèle, les deux souches ont été exposées à 1 mM final de SIN-1. Les résultats sont
présentés sur la figure 12B. Directement après ajout du composé, 120 et 240 minutes après
traitement, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB. Le nombre de
cfu est le même (3. 108 cfu/ml) pour la souche sauvage et pour le mutant 240 minutes après
ajout du SIN-1. Ainsi, l’ajout de 1mM de SIN-1 n’affecte pas la viabilité des souches.
Enfin, les souches ont été exposées à un prétraitement d’H2O2 à une concentration finale de
10 mM pendant 30 minutes, puis 1 mM final de SIN-1 a été ajouté dans les mêmes cultures.
Les résultats sont présentés sur la figure 12C. A 0, 60, 120, 180 et 240 minutes, des aliquots
de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB. Le nombre de cfu de la souche
sauvage reste proche de 1.108 cfu/ml, 240 minutes après ajout des deux composés. Le nombre
de cfu du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx chute de 1.108 cfu/ml à 2.106 cfu/ml, 240 minutes après
ajout des deux composés. Ce résultat indique que ce mutant est affecté par le traitement
simultané d’H2O2 et de peroxynitrite.
La même expérience a été reproduite avec de l’oxyde nitrique à la place du peroxynitrite. Les
deux souches ne sont pas affectée par les conditions testées. Ce résultat suggère que le triple
mutant est spécifiquement altéré par le peroxynitrite et non pour toutes formes dérivés de
l’oxyde nitrique ou de l’oxyde nitrique lui même.
84
Résultats Partie 4
(A)
(B)
wt
1,00E+09
wt
ahpCF- tsaA- tpx1,00E+09
1,00E+08
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+07
cfu/ml
1,00E+06
cfu/ml
ahpCF- tsaA- tpx-
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+01
1,00E+00
1,00E+00
0
120
240
0
120
Temps (min)
240
Temps (min)
(C)
wt
1,00E+09
ahpCF- tsaA- tpx-
1,00E+08
1,00E+07
cfu/ml
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0
60
120
180
240
Temps (min)
Figure 12 : Survie de la souche sauvage et du triple mutant en présence de formes actives de
l’oxygène et de l’azote
Des précultures de la souche sauvage et du triple mutant des peroxyrédoxines ont été réalisées en milieu
LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3. La croissance a
été arrêtée, les bactéries ont été lavées et reprises dans du tampon phosphate.
(A) 10 mM d’H2O2 ont été ajoutés directement dans le tampon phosphate. Le traitement a duré 30
minutes. 0, 120 et 240 minutes après ajout de l’H2O2, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et
étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement des bactéries.
(B) 1 mM de SIN-1 a été ajouté directement dans le tampon phosphate. 0, 120 et 240 minutes après ajout
du SIN-1, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB pour effectuer un
dénombrement des bactéries.
(C) 10 mM d’H2O2 ont été ajoutés directement dans le tampon phosphate. Le traitement a duré 30
minutes, puis 1 mM de SIN-1 a également été ajouté dans le tampon phosphate. 0, 60, 120, 180 et 240
minutes après ajout de l’H2O2, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués, et étalés sur boîte LB pour
effectuer un dénombrement des bactéries.
Résultats Partie 4
Dans le but de savoir si chacune des peroxyrédoxines de S. typhimurium pouvait contribuer
individuellement à la protection face au double traitement peroxyde d’hydrogène et
peroxynitrite, la survie des mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx a été testée
dans les mêmes conditions. Les résultats sont présentés sur la figure 13. Le nombre de cfu de
chacun des trois doubles mutants reste proche de 1.108 cfu/ml, 240 minutes après l’ajout des
deux composés. Les trois mutants ne sont pas affectés par le traitement simultané H2O2/ SIN1. Seule une souche dépourvue de AhpCF, TsaA et Tpx est sensible à un tel traitement. Ainsi,
la présence d’une seule peroxyrédoxine est suffisante pour assurer la protection de S.
typhimurium.
V- Conclusion et discussion
Le but de cette étude était d’évaluer l’implication des peroxyrédoxines dans la virulence de S.
typhimurium. Pour cela, nous avons construit un mutant dans lequel les gènes ahpCF, tsaA et
tpx ont été inactivés et nous l’avons analysé par des tests de virulence. Nous avons observé
que le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était très affecté dans sa capacité à proliférer dans le
macrophage, son indice de prolifération dans des macrophages murins étant proche de celui
d’un mutant du système de sécrétion de type 3, contrôle négatif souvent utilisé dans ce genre
d’expérience. Ce résultat a suggéré que les peroxyrédoxines étaient importantes pour S.
typhimurium en condition d’infection dans le macrophage.
Dans le but de comprendre ce phénotype, une question a été posée : le phénotype du mutant
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx peut-il être expliqué par sa sensibilité aux FAO et aux FAN produites par
le macrophage? Afin de répondre à cette question, nous avons effectué des expériences
d’infection dans des macrophages soit incapables de produire des FAO, soit altérés dans leur
capacité à produire des FAN. Les résultats de cette étude ont montré que les peroxyrédoxines
AhpCF, TsaA et Tpx n’étaient pas requises pour éliminer soit les FAO, soit les FAN produits
par le macrophage.
Nous avons poursuivi la caractérisation du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en l’exposant
directement à des FAO ou FAN en milieu de culture. Nous avons pu ainsi identifier des
conditions dans lesquelles la survie du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était très affectée en
comparaison avec la souche sauvage. En effet, le traitement simultané H2O2/SIN-1 a un effet
drastique sur la viabilité de la souche. Une explication pourrait provenir du fait que, le mutant
∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx accumule de l’H2O2, comme l’ont montré les expériences du biosenseur
85
Résultats Partie 4
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+07
cfu/ml
1,00E+06
1,00E+05
0
1,00E+04
60
120
1,00E+03
240
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
wt
wt
ahpCF- tpx-
tsaA- tpx-
ahpCF- tsaA-
ahpCF- tsaAtpx-
Figure 13 : Survie de la souche sauvage et des doubles mutants des péroxyrédoxines en présence
de formes actives de l’oxygène et de l’azote
Des précultures de la souche sauvage et du triple mutant des péroxyrédoxines ont été réalisées en milieu
LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3. La croissance a
été arrêtée, les bactéries ont été lavées et solubilisées dans du tampon phosphate. 10 mM d’H2O2 ont été
ajoutés directement dans le tampon phosphate. Le traitement a duré 30 minutes puis 1 mM de SIN-1 a
également été ajouté dans le tampon phosphate. 0, 60, 120, 180 et 240 minutes après ajout de l’ H2O2,
des aliquots de culture ont été prélevés, dilués, et étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement
des bactéries.
Résultats Partie 4
vivant. L’H2O2 appauvrit la bactérie en molécules antioxydantes non enzymatiques telles que
le glutathion. Or, ces « éponges » à stress contribuent à l’élimination du peroxynitrite, ainsi en
leur absence, les effets du peroxynitrite seraient exacerbés. Ce modèle correspond
parfaitement à la double activité d’élimination des peroxyrédoxines face aux FAO et aux
FAN. Dans la littérature, il existe de nombreux exemples de microorganismes bactériens pour
qui les peroxyrédoxines sont impliquées dans l’élimination des FAO et des FAN (Baek et al.,
2009 ; Cosgrove et al., 2007 ; Hu et al., 2009 ; La Carbona et al., 2007). Nos résultats
confirment la contribution de ces enzymes du métabolisme au capacité de virulence des
pathogènes.
Enfin, les peroxyrédoxines illustrent une nouvelle fois l’importance de la stratégie de
redondance fonctionnelle mis en place par S. typhimurium pour éliminer les FAO et FAN,
puisque la présence d’une seule des trois enzymes est suffisante pour protéger S. typhimurium.
86
Implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le
métabolisme et la virulence de S. typhimurium
Résultats Partie 5
Nom du mutant
Génotype
msrAB-
12023 msrA::kan msrB::cat
Hpx-
12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan
msrAB- Hpx-
12023 ∆msrA ∆msrB ∆ahpCF
katG::cat katE::kan
Tableau 1 : Tableau des souches utilisées dans cette étude
Les mutants ont été réalisés par double recombinaison homologue entre des
cassettes de résistances au chloramphénicol (cat) et à la kanamycine (kan) et les
gènes à inactiver msrA, msrB, katG, katE et ahpCF (Datsenko et al., 2000).
Résultats Partie 5
Les méthionine sulfoxyde réductases (Msr) sont des enzymes impliquées dans la réparation
des dommages dûs au stress oxydant. Elles permettent de réduire les méthionines oxydées,
libres dans la cellule ou enchâssées dans des protéines. Il existe deux types de Msr, MsrA et
MsrB, spécifiques d’un diastéréoisomère de méthionine : MsrA réduit la méthionine-Ssulfoxyde et MsrB la méthionine-R-sulfoxyde. Ces deux enzymes sont présentes dans la
quasi-totalité des organismes vivants. L’organisation génétique de msrA et msrB varie selon
les organismes. Dans de nombreux cas, msrA et msrB constituent deux unités séparées de
transcription. Chez certains microorganismes, ils sont organisés en opéron voire fusionnés au
sein d’un même gène.
S. typhimurium possède deux gènes codant pour les protéines MsrA et MsrB qui présentent de
fortes identités de séquence protéique avec MsrA et MsrB d’Escherichia coli (respectivement
83% et 85%). Aucune étude du rôle des méthionine sulfoxyde réductases n’a été réalisée chez
S. typhimurium. Dans le macrophage, S. typhimurium est soumise à la production d’anion
superoxyde par la NADPH phagocyte oxydase (Segal et al., 1981; Babior, 1999; Babior et al.,
2002). Elle se retrouve ainsi confrontée à une forte production de FAO et doit mettre en place
des systèmes de protection contre ce stress. La question de l’implication de MsrA et MsrB
dans la pathogénicité de S. typhimurium se pose donc.
Nous avons entrepris l’étude de ces enzymes afin d’évaluer leur contribution dans la
physiologie de la bactérie ainsi que leur rôle dans la pathogénicité. Au cours de cette étude, le
mutant ∆msrA ∆msrB a été construit. Ces deux mutations ont également été introduites dans
la souche Hpx- altérée dans sa capacité à éliminer les formes actives de l’oxygène (Voir
« Section Résultats, Chapitre : Hpx° et HpxF- de S. typhimurium), afin d’augmenter les
dommages du stress oxydant (Seaver et al., 2001).
I-
Construction de mutants des gènes msrA et msrB de S. typhimurium
Le gène msrA a été inactivé dans la souche 12023 (ATCC 14028) de S. typhimurium selon la
technique de Wanner et Datsenko (Datsenko et Wanner, 2000). Un lysat a ensuite été obtenu à
partir de la souche 12023 msrA::kan à l’aide du phage P22, spécifique de S. typhimurium. Ce
lysat a permis de transduire le gène inactivé msrA::kan dans une souche sauvage. Les gènes
msrB, ahpCF, katG et katE ont été inactivés et les mutations correspondantes transduites
selon les mêmes méthodes. Trois mutants ont été construits, 12023 msrA::kan msrB::cat
(msrAB-), 12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan (Hpx) et 12023 msrA msrB ahpCF katG::cat
87
Résultats Partie 5
(A)
1
DO 600 nm
wt
msrAB0,1
HpxmsrAB- Hpx-
0,01
0
100
200
300
400
500
Temps (min)
(B)
DO 600 nm
10
1
wt
msrAB-
0,1
HpxmsrAB- Hpx0,01
0
100
200
300
400
Temps (min)
Figure 1 : Croissance en milieu riche et en milieu minimum des quatre souches
(A) Des précultures ont été réalisées en LB, à 37°C et en aérobie avec la souche sauvage et les
mutants msrAB-, Ηpx- et msrAB- Ηpx-. Le lendemain, ces précultures ont été diluées à DO600 =
0,01 en LB et la croissance a été suivie.
(B) Des précultures ont été réalisées en milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides à 0,1%,
à 37°C et en aérobie avec la souche sauvage, le mutant msrAB- , le mutant Ηpx- et le mutant
msrAB- Ηpx-. Le lendemain, ces précultures ont été diluées à DO600 = 0,01 dans le même
milieu et la croissance a été suivie.
Résultats Partie 5
katE::kan (msrAB- Hpx). Le tableau 1 récapitule le nom et le génotype des mutants utilisés
dans cette étude.
II- Caractérisation phénotypique des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- HpxDans le but de caractériser l’implication de msrA et msrB dans la physiologie de S.
typhimurium, la croissance de la souche sauvage a été comparée à celles du mutant msrAB-,
du mutant Hpx- et du mutant msrAB- Hpx- en milieu LB et en milieu minimum (fig. 1A et
1B). En milieu LB, à 37°C et en aérobie (Fig. 1A), le temps de génération de la souche
sauvage et du mutant msrAB- est de 22 minutes, le temps de génération du mutant Hpx- et
msrAB- Hpx- est de 25 minutes. En milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1%,
le temps de génération des quatre souches est de 37 minutes. En condition de croissance en
milieu riche ou en milieu minimum, l’absence de MsrA et MsrB n’affecte donc pas la
croissance de S. typhimurium.
III- Etude de la sensibilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx- en présence
d’H2O2
Dans le but de caractériser l’implication de MsrA et MsrB dans la lutte contre le stress
oxydant, nous avons réalisé deux types d’expériences au cours desquelles nous avons analysé
le comportement des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx- en présence d’H2O2.
Dans un premier temps, nous avons analysé la capacité des souches en former des colonies
sur milieu LB en présence de peroxyde d’hydrogène dans la gélose. Pour cela, la souche
sauvage, le mutant msrAB-, le mutant Hpx- et le mutant msrAB- Hpx- ont été cultivés en
milieu LB, à 37°C et en condition aérobie. A DO600 = 1, des aliquots de cultures bactériennes
ont été prélevés et étalés sur boîte LB en présence ou absence d’H2O2 0,2 mM (Fig. 2A). Le
nombre de cfu de la souche sauvage et des trois mutants est de 1,5.109cfu/ml sur gélose LB.
Sur gélose LB/H2O2 0,2 mM, le nombre de cfu de la souche sauvage, du mutant msrAB- et du
mutant Hpx- est le même (1,2.109 cfu/ml). Celui du mutant msrAB- Hpx- est légèrement
inférieur (8,5.108 cfu/ml). Ces résultats indiquent que la souche sauvage, le mutant msrAB- et
le mutant Hpx- ne sont pas sensibles à 0,2 mM d’H2O2 tandis que le mutant msrAB- Hpx- est
légèrement plus sensible. Ainsi, l’absence de msrA et msrB affecte peu la croissance de S.
typhimurium en présence d’H2O2 0,2 mM.
88
Résultats Partie 5
LB
(A)
LB/H2O2
LB
/ H2O2 0,2 mM
1,00E+10
1,00E+09
1,00E+08
cfu/ml
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
wt
msrAB-
Hpx-
msrAB- Hpx-
wt
(B)
Hpx-
msrAB- Hpx-
1,00E+09
WT
msrAB-
1,00E+08
Hpx-
1,00E+07
msrAB- Hpx-
1,00E+06
cfu/ml
10
DO 600nm
msrAB-
1
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
0,1
0
92
184
276
368
460
1,00E+00
0'
Temps (min)
45'
90'
Temps après ajout de l’H2O2 (min)
Figure 2 : Croissance des quatre souches en présence de peroxyde d’hydrogène
(A) Une préculture des 4 souches ,réalisée en LB et en aérobiose, a ensuite été diluée dans les mêmes
conditions. A DO600 = 1, des aliquots de culture ont été prélevés puis étalés soit sur boîte LB, soit
sur boîte LB contenant 0,2 mM d’H2O2. Les colonies ont été dénombrées.
(B) Les souches ont été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3, puis 2,5 mM d’H2O2 a été rajouté
dans le milieu de croissance. 0, 45 et 90 minutes après stress, des aliquots de culture ont été
prélevés puis étalés sur boîte LB. Les colonies ont été dénombrées. La croissance est représentée à
gauche et le dénombrement à droite.
Résultats Partie 5
Dans un second temps, de l’H2O2 a été ajouté au cours de la croissance des souches. Pour
cela, des cultures bactériennes en phase exponentielle de croissance (DO600 = 0,3) ont été
exposées à de l’H2O2 en LB à une concentration finale de 2,5 mM (Fig. 2B). Des aliquots de
culture ont été prélevés 0, 45 et 90 minutes après ajout d’H2O2, et dénombrés 24h après
étalement sur boîte LB. Les résultats montrent que l’ajout d’H2O2 n’affecte pas la croissance
de la souche sauvage et du mutant msrAB-. « A l’opposé », la croissance des mutants Hpx- et
msrAB- Hpx- est immédiatement arrêtée après ajout d’H2O2.
Le dénombrement effectué sur boîte LB montre que le nombre de cfu de la souche sauvage et
du mutant msrAB- est le même 0, 45 et 90 minutes après ajout d’H2O2 (2,5.108 cfu/ml). Le
nombre de cfu du mutant Hpx- chute d’environ un demi-logarithme (2,5.108 cfu/ml à 1,6.108
cfu/ml, 90 minutes après ajout de l’H2O2) et celui du mutant msrAB- Hpx- d’un logarithme
(2,5.108 cfu/ml à 4,5.107 cfu/ml, 90 minutes après ajout de l’H2O2). Ce résultat indique que,
dans une souche accumulant du stress endogène, MsrA et MsrB sont requises pour la
réparation des protéines endommagées en présence de 2,5 mM d’H2O2.
IV- Evaluation du niveau d’oxydation protéique des mutants msrAB-, Hpx- et msrABHpx-au cours de la croissance bactérienne
En l’absence de MsrA et MsrB, les méthionines oxydées ne sont plus réparées. La présence de
méthionines sulfoxydes, au sein des protéines, entraîne le démasquage d’autres résidus
sensibles à l’oxydation. En particulier, si les résidus arginine, lysine, proline et thréonine se
retrouvent exposés à des FAO, ils subissent des réactions de carbonylation au niveau de leur
chaîne latérale. Ainsi, la présence de groupements carbonyles peut renseigner sur l’état
d’oxydation des protéines d’une souche (Maisonneuve et al., 2009). Nous avons donc analysé
la présence de groupements carbonyles dans des extraits cellulaires provenant de la souche
sauvage, du mutant msrAB-, du mutant Hpx- et du mutant msrAB- Hpx-. Après dépôt d’un
extrait cellulaire sur une membrane, les échantillons ont été dérivatisés au 2,4dinitrophénylhydrazine (DNPH) qui reconnait les groupements carbonyles. Ensuite, la
membrane a été incubée en présence d’un anticorps secondaire conjugué avec la
« Horseradish » peroxydase. Les bactéries ont été cultivées en LB jusqu’en milieu de phase
exponentielle (DO600 = 0,5), puis lysées. Pour chacune des souches, une partie des extraits
totaux obtenus a été centrifugée afin d’isoler une fraction soluble dépourvue de fragments
membranaires. Cette fraction est appelée extrait cytoplasmique dans le reste du chapitre (Fig.
3A). Dans les extraits cytoplasmiques de la souche sauvage, du mutant msrAB- et du mutant
89
Résultats Partie 5
(A)
(B)
DO600 = 0,5
Presse de French
culture
bactérienne
Centrifugation
Extraits cytoplasmiques
(C)
Figure 3 : Mesure du taux de carbonylation dans des extraits cellulaires des quatre souches
Des précultures des 4 souches ont été réalisées en LB et à 37°C. Les souches ont, ensuite, été cultivées
jusqu’à DO600 = 0,5 en milieu LB, à 37°C et en aérobie puis lysées par presse de French. Une
centrifugation de 30 minutes à 13000 rpm a été effectuée pour isoler une fraction cytoplasmique (A). La
fraction cytoplasmique a ensuite été traitée au DNPH (voir section « matériels et méthodes ») pour être
dérivatisée. Les groupements carbonyles ont alors été révélés grâce à un anticorps secondaire conjugué
avec la HRP soit par Dot Blot (deux dépôts ont été réalisés) (B) soit par Western Blot (C)
Résultats Partie 5
Hpx-, la présence de groupements carbonyles n’a pas été détectée (Fig. 3B). Dans les extraits
cytoplasmiques du mutant msrAB- Hpx-, un signal intense a été détecté, indiquant la présence
de groupements carbonyles. La présence de groupements carbonyle a également été analysée
après migration sur gel SDS-PAGE d’extraits cellulaires de la souche sauvage, du mutant
msrAB-, du mutant Hpx- et du mutant msrAB- Hpx-traités comme précédemment (Fig. 3C). La
présence de bandes de carbonylation semble plus marquée pour le mutant msrAB- Hpx-. Ce
résultat montre que les protéines de ce mutant sont plus exposées à l’oxydation que dans les
autres souches. L’ensemble des résultats semble donc indiquer que le mutant msrAB- Hpxaccumule des dommages oxydatifs au cours de la phase exponentielle de croissance. Ainsi,
l’absence de MsrA et MsrB entraîne une augmentation du taux de carbonylation des protéines
cytoplasmiques dans une souche accumulant du stress endogène (c'est-à-dire, contexte
génétique Hpx-).
V- Etude de la mobilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- HpxUne étude réalisée en 1999, dans l’équipe (Hassouni et al., 1999), a montré que le mutant
msrA d’Erwinia chrysanthemi, était moins mobile que la souche parentale sauvage. Dans le
but d’étudier l’implication des méthionine sulfoxyde réductases dans la mobilité de S.
typhimurium, des expériences de « swimming » ont été réalisées. Le swimming est un mode
de déplacement bactérien produit par l’action des flagelles. Ce déplacement est observable
lorsqu’on inocule une souche bactérienne à l’intérieur d’une gélose d’agar « molle », c'est-àdire contenant un faible pourcentage en agar (0,2 %). Les bactéries se déplacent en fonction
du gradient de nutriment, ce qui a pour conséquence la formation d’un halo bactérien dans la
gélose. Les capacités de « swimming » ont été étudiées chez la souche sauvage, le mutant
Hpx- et le mutant msrAB- Hpx-. Les expériences ont été réalisées à 37°C et à 30°C pendant
5h (Fig. 4A et 4B). Nous avons observé que la mobilité des trois souches était identique. Nous
avons reproduit l’expérience en ajoutant du peroxyde d’hydrogène dans les géloses. (Fig. 4C).
Deux concentrations ont été testées, 0,1 mM, et 0,2 mM. En présence de 0,1 mM, d’H2O2, la
souche sauvage et le mutant msrAB- se déplacent de la même façon. Le mutant Hpx-, quant à
lui, est légèrement affecté dans sa mobilité. Enfin, le mutant msrAB- Hpx- perd environ 15%
de sa mobilité en comparaison avec la souche sauvage. En présence de 0,2 mM d’H2O2, la
souche sauvage et le mutant msrAB- se déplacent toujours de la même façon. Le mutant Hpxperd 40% de sa mobilité et le mutant msrAB- Hpx- plus de 60% en comparaison avec la
90
Résultats Partie 5
(A)
(B)
3
Diamètre de croissance (cm)
Diamètre de croissance (cm)
6
5
4
3
2
1
0
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Hpx-
wt
msrAB- Hpx-
wt
Hpx-
msrAB- Hpx-
3,5
Diamètre de croissance (cm)
(C)
3
2,5
WT
2
msrAB
msrAmsrB-
1,5
Hpx- katE- katGahpCF1
- HpxmsrAB
msrA- msrBahpCF- katEkatG-
0,5
0
0
0,1 mM
0,2 mM
Concentration en H2O2
Figure 4 : Mobilité des quatre souches sur gélose nutritive avec ou sans peroxyde d’hydrogène
(A) et (B) Une préculture a été inoculée dans une gélose molle (0,2% d’agar). La mobilité a été étudiée
par mesure du diamètre d’un halo bactérien après 5 heures à 37°C (A) et à 30°C (B) et en aérobie.
(C) Même expérience que (A) mais les inoculi ont été déposés sur des géloses dans lesquelles des
concentrations croissantes d’H2O2 ont été rajoutées.
Résultats Partie 5
souche sauvage. Ainsi, ce résultat souligne qu’en présence de péroxyde d’hydrogène,
l’absence de MsrA et de MsrB altère la capacité de mobilité de S. typhimurium.
VI- Etude de la virulence des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx1- Prolifération des mutants dans des macrophages murins
Dans le but d’étudier l’effet de l’absence de MsrA et de MsrB sur la virulence de S.
typhimurium, les capacités de prolifération de S. typhimurium dans des macrophages ont été
étudiées. Les expériences d’indice de prolifération ont été effectuées dans des macrophages
murins issus de lignée cellulaire, les RAW 264.7. Les RAW 264.7 ont été infectés soit par la
souche sauvage, soit par l’un des trois mutants pendant 16h à une dose infectieuse d’environ
50 bactéries par cellule. Deux points de dénombrement ont été effectués, 2 heures après
infection et 16 heures après infection. L’indice de prolifération a été calculé. Les rapports des
indices de prolifération sont représentés.
Le rapport des indices de prolifération entre le mutant msrAB- et la souche sauvage obtenu est
de 1, indiquant que ces deux souches présentent les mêmes capacités prolifératives dans le
macrophage (Fig. 5). Le rapport des indices de prolifération entre le mutant Hpx- et la souche
sauvage obtenu est de 1,7. Celui obtenu entre le mutant msrAB- Hpx- et la souche sauvage est
de 2,7. Ainsi, de façon surprenante, Hpx- et msrAB- Hpx- prolifèrent plus que la souche
sauvage en condition d’infection.
Dans le but d’augmenter les effets liés au stress oxydant, nous avons inactivé katN dans la
souche msrAB- Hpx-. Le mutant obtenu, msrAB- Hpx° a été analysé pour sa capacité de
prolifération dans des macrophages RAW 264.7 (Fig. 6). L’indice de prolifération obtenu
pour le mutant msrAB- Hpx° est de 8,5, très proche de celui de la souche sauvage (10). Les
conditions testées n’ont pas permis de mettre en évidence un rôle de MsrA et de MsrB dans la
capacité proliférative de S. typhimurium dans le macrophage.
2- Survie des mutants dans la souris
Afin de poursuivre l’étude de l’implication de MsrA et MsrB dans la virulence de S.
typhimurium, des expériences de compétition dans la souris ont été réalisées.
Un mélange de deux cultures bactériennes a été injecté aux souris par voie intra-péritonéale
dans un ratio 1:1. La souche sauvage et un des trois mutants étudiés ont été inoculés
intrapéritonéalement à concentration équivalente (105 bactéries/ml). En parallèle de
l’injection, les concentrations bactériennes de chacune des deux souches ont été determinées
91
Résultats Partie 5
Rapport des indices de prolifération
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
msrAB-/wt
Hpx-/wt
msrAB- Hpx-/wt
Figure 5 : Rapport des indices de prolifération dans les macrophages RAW 264.7
Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 ont été infectées par les quatre souches à une
dose infectieuse de 50 bactéries par cellule pendant 16 heures. 2h et 16h après infection, les
cellules infectées ont été lysées au triton à 0,1% et les bactéries intracellulaires ont été récoltées
et étalées sur boîte LB. 24h après, les colonies ont été dénombrées et l’indice de prolifération a
été déterminé (cfu 16h/cfu 2h).
Les expériences ont été réalisées en triplicat. Le rapport des indices de prolifération entre la
souche sauvage et le mutant msrAB-, la souche sauvage et le mutant Ηpx- et enfin la souche
sauvage et le mutant msrAB- Ηpx- sont représentés.
Résultats Partie 5
et l’input a été déterminé. Deux jours après infection, les souris ont été sacrifiées, les rates
prélevées et les bactéries intracellulaires isolées. Après dénombrement, l’output a été
déterminé. Enfin, l’index de compétition a été calculé. Dans chacune des trois expériences
testées, les index de compétition obtenus (2,4 pour le mutant msrAB-, 0,6 pour le mutant Hpxet 0,9 pour le mutant msrAB- Hpx-) ont indiqué qu’aucun des mutants n’était altéré dans sa
capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage lors de l’infection de la souris (Fig.
7). Ainsi, dans les conditions testées, nous n’avons pas pu mettre en évidence de défaut de
virulence des mutants. Au contraire, il semblerait que l’absence de msrA et msrB dans le
contexte génétique Hpx- confère un avantage à S. typhimurium en condition d’infection.
VII- Conclusion et discussion
Cette étude avait pour but d’évaluer l’implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le
métabolisme et la pathogénicité de S. typhimurium. Pour cela, nous avons construit les
souches ∆msrA ∆msrB (msrAB-) et ∆msrA ∆msrB ∆ahpCF ∆katG ∆katE (msrAB Hpx-). Ces
souches ont été caractérisées lors de croissance en présence d’H2O2, pour l’état d’oxydation
de leur protéines cytoplasmiques, pour leur mobilité et enfin pour leur virulence. Les résultats
obtenus ont montré que les caractéristiques phénotypiques du mutant msrAB- étaient proches
de celles de la souche sauvage. Les résultats obtenus avec le mutant msrAB- Hpx- ont, par
contre, révélé l’implication de MsrA et de MsrB dans la résistance de S. typhimurium face à
un stress H2O2, dans la mobilité bactérienne et enfin dans la protection de l’oxydation des
protéines cytoplasmiques.
Nous avons montré que MsrA et MsrB étaient impliquées dans la mobilité de S. typhimurium
dans un environnement oxydant. Il s’agit du deuxième exemple bactérien pour lequel
l’absence de MsrA et de MsrB diminue les capacités de mobilité d’une bactérie. Toutefois, ce
résultat est préliminaire et nécessite d’autres contrôles, étant donné la sensibilité du mutant
msrAB- Hpx- dans les conditions testées. Il sera important de caractériser la protéine oxydée
responsable du phénotype de diminution de mobilité afin de conclure sur l’impact de MsrA et
de MsrB dans la mobilité.
Nous avons observé que le niveau de carbonylation dans des extraits protéiques issus du
cytoplasme de S. typhimurium était plus important dans le mutant msrAB- Hpx- que dans la
souche sauvage. Ainsi, MsrA et MsrB participent au maintien de l’état d’oxydoréduction
cellulaire de S. typhimurium.
92
Résultats Partie 5
(A)
1,00E+07
1,00E+06
cfu/ml
1,00E+05
1,00E+04
2h pi
1,00E+03
16h pi
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
wt
(B)
msrAB- Hpx°
12
Indice de proliération
10
8
6
4
2
0
wt
msrAB- Hpx°
Figure 6 : Indice de prolifération de la souche sauvage et du mutant msrAB Hpx° dans des
macrophages RAW 264.7
Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 ont été infectées à l’aide de cultures de la
souche sauvage et du mutant msrAB Hpx° à une dose infectieuse de 50 bactéries pour une cellule
pendant 16 heures. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées au triton à 0,1%
et les bactéries intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. 24h après, les colonies
ont été dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé (cfu 16h/cfu 2h).
(A) Numération 2 heures et 16 heures après infection (pi)
(B) Indice de prolifération
Résultats Partie 5
Nous n’avons pas pu mettre en évidence l’implication de MsrA et de MsrB dans
l’établissement de la virulence chez S. typhimurium. Au contraire, nous avons observé des
phénotypes d’hyperprolifération du mutant msrAB- Hpx- en condition d’infection dans des
macrophages murins. Ce résultat suggère que le mutant msrAB- Hpx- est adapté à
l’environnement rencontré dans le macrophage. Comment expliquer ce résultat ? Le mutant
msrAB- Hpx- est altéré dans sa capacité à éliminer l’H2O2. Or, nous savons qu’en présence de
1 µM d’H2O2 (Seaver et al., 2001), OxyR est activé et déclenche la mise en place des
systèmes d’adaptation à l’H2O2. Ainsi, une hypothèse est que le mutant msrAB- Hpx- est
préadapté aux conditions rencontrées dans le macrophage, son niveau endogène d’H2O2
« activant « le régulon oxyR de façon constitutive (Ritz et al., 2000).
93
Résultats Partie 5
Souche A
wt
wt
wt
Souche B
msrABΗpxmsrAB- Ηpx-
Index de compétition
2,4
0,58
0,88
Figure 7 : Index de compétition dans la souris.
Des souris BALB/c agées de 6 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec un mélange
bactérien à un ratio 1:1 composé de la souche sauvage et d’un des mutants. En parallèle de
l’infection, les concentrations bactériennes de chacune des deux souches inoculées ont été
déterminées et l’input a été calculé. 2 jours après, les souris ont été sacrifiées, les rates collectées et
les bactéries intracellulaires étalées sur boîte LB et dénombrées, l’output a été calculé. Au final,
l’index de compétition a été déterminé (output/input)
DISCUSSION
ET
PERSPECTIVES
Discussion
Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux mécanismes moléculaires développés par S.
typhimurium pour lutter contre le stress oxydant. En condition d’infection, S. typhimurium est
phagocytée par les macrophages dans lesquels elle forme une vacuole (la SCV) pour se
protéger de l’activité bactéricide du macrophage. Toutefois, elle est exposée au stress oxydant
produit par la NADPH phagocyte oxydase. Ce complexe enzymatique est enchâssé dans la
membrane de la SCV, et produit de l’anion superoxyde dans la lumière de la vésicule. La
question de la gestion du stress oxydant par S. typhimurium en condition d’infection se pose
donc. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à trois aspects :
-
caractériser le stress oxydant perçu par S. typhimurium à l’intérieur de la SCV,.
-
identifier les enzymes impliquées dans l’élimination des FAO et étudier leur
contribution dans le métabolisme et la virulence de la bactérie.
-
étudier l’implication d’un système de réparation protéique des dommages liés aux
FAO, les méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la virulence de
S. typhimurium.
I-
La réponse oxydante produite par la NADPH phagocyte oxydase au cours de l’infection
par S. typhimurium
Le phénomène de "burst" oxydatif dans la relation hôte/pathogène est étudié depuis près d’un
siècle (Baldridge et Gerard, 1933). Cependant, aucune étude ne renseigne sur la façon dont S.
typhimurium perçoit les FAO dans sa vacuole. Par exemple, quelles FAO (O2.-, H2O2…) sont
perçues par cette bactérie ? Quelle est la cinétique de production de ces FAO par l’hôte ? En
quelle quantité sont-elles présentes ? Afin de proposer des éléments de réponse, nous avons
construit un outil génétique constitué du promoteur du gène ahpC fusionné au gène codant
pour la GFP. La bactérie transformée par ce plasmide a été nommée biosenseur vivant. A
l’aide de cet outil, nous avons observé que dans des macrophages murins RAW 264.7, le
biosenseur percevait de l’H2O2 très tôt au cours de l’infection, le pic de production ayant lieu
1h30 après le début de l’infection et le niveau d’H2O2 diminuant progressivement jusqu’à 10
heures après infection.
Il serait intéressant d’employer la même stratégie afin de sonder l’environnement de S.
typhimurium telle qu’elle le perçoit en condition d’infection afin de savoir si elle est exposée à
d’autres types de stress et si elle subit certaines carences.
94
Discussion
II- L’arsenal enzymatique impliqué dans l’élimination de l’H2O2 de S.typhimurium
Au début de nos travaux, le rôle des catalases et des peroxyrédoxines avait été analysé au
cours de deux études. Le mutant ∆katG ∆katE et le mutant ∆ahpC avaient été analysés en
condition d’infection et la conclusion fut que ces enzymes ne semblaient pas être impliquées
dans la virulence de la bactérie (Buchmeier et al., 1995 ; Taylor et al., 1998). Notre étude a
montré que cette conclusion était erronée et incomplète car S. typhimurium possède d’autres
enzymes impliquées dans l’élimination de l’H2O2. En effet, nous avons caractérisé le mutant
HpxF-, dans lequel KatG, KatE, KatN, AhpCF et TsaA ont été inactivées. Le phénotype
résultant est un phénotype de non virulence qui peut être expliqué par une incapacité totale à
dégrader l’H2O2.
S. typhimurium a donc adopté une stratégie de redondance fonctionnelle pour éliminer l’H2O2
où l’absence des cinq enzymes peut être compensée par l’apport d’une seule enzyme. Ce
résultat a été constaté plusieurs fois :
-
le mutant Hpx° (dans lequel seule la peroxyrédoxine TsaA est présente) est
toujours capable d’éliminer des concentrations micromolaires d’H2O2,
-
le mutant Hpx° ou le mutant HpxF- dans lequel les gènes katG ou tsaA sont sur un
plasmide multicopie sont capables de proliférer dans les macrophages.
Toutefois, il semble que la contribution physiologique des catalases et des peroxyrédoxines ne
soit pas équivalente. KatG et KatE protègent la bactérie en présence de fortes concentrations
en H2O2 (jusqu’à 10 mM) alors que le rôle de protection par les peroxyrédoxines AhpCF et
TsaA n’a pas pu être mis en évidence dans ces conditions. Le rôle physiologique des catalases
et des peroxyrédoxines avait déjà été constatée pour E. coli, chez qui AhpC élimine des
concentrations micromolaires d’H2O2 alors que les catalases éliminent de plus fortes
concentrations (Seaver et al., 2001). Dans nos expériences, nous avons vu qu’un biosenseur
vivant de l’H2O2 émet de la fluorescence dans un mutant ∆ahpCF ∆tsaA. Ce résultat indique
que le mutant ∆ahpCF ∆tsaA accumule de l’H2O2 dans son cytoplasme. La conséquence est
l’activation du régulateur transcriptionnel OxyR et ainsi la transcription d’ahpC-gfp. Un tel
résultat n’avait pas été observé pour le mutant ∆katG ∆katE ∆katN. Ainsi, chez S.
typhimurium, il semblerait que les peroxyrédoxines éliminent également les concentrations
micromolaires d’H2O2.
D’après les résultats du biosenseur vivant, dans des macrophages, S. typhimurium perçoit
différentes concentration en H2O2 : elle perçoit de l’H2O2 dès le début de l’infection, puis la
95
Discussion
concentration semble diminuer au cours de l’infection. Ainsi, dans ce cas de figure, la
différence de contribution entre catalase et peroxyrédoxine peut être utile : les catalases
détoxifieraient l’H2O2 produit au début de l’infection et les peroxyrédoxine l’H2O2 produit en
fin d’infection.
III- Implication des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium
La contribution des peroxyrédoxines à la virulence a été mise en évidence dans plusieurs
types bactériens (Baek et al., 2009 ; Cosgrove et al., 2007 ; Hu et al., 2009 ; La Carbona et
al., 2007). De plus, chez M. tuberculosis, le mutant ∆tpx, très affecté dans des macrophages
sauvages, prolifère normalement dans des macrophages dépourvus de NO. synthase inductible
(Hu et al., 2001). Enfin, il a été montré in vitro, que AhpC et TsaA de S. typhimurium
possèdent une activité péroxynitrite réductase (Bryk et al., 2000). Au cours de notre étude,
nous avons montré qu’un mutant dépourvu des gènes ahpCF, tsaA et tpx était très affecté dans
sa capacité à proliférer dans les macrophages murins.
Les peroxyrédoxines étant biochimiquement capables d’éliminer les FAO et FAN, nous avons
fait l’hypothèse que la bactérie était exposée à ces deux espèces en condition d’infection.
Ainsi, nous avons exposé le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à un traitement successif
H2O2/ONOO- et dans ces conditions, la viabilité de ce mutant est très affectée. Le
peroxynitrite est éliminé notamment par les composés thiolés présents dans le cytoplasme
bactérien tels que le glutathion. Or, l’H2O2 est capable d’oxyder le glutathion, ce qui permet
au pool intracellulaire de peroxynitrite de rester stable. Ainsi, une possibilité pour expliquer le
défaut de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en condition d’infection est que les
peroxyrédoxines sont impliquées dans la détoxication de l’H2O2 et également du
peroxynitrite. Leur absence résulterait en l’oxydation ou la nitration des cibles du
peroxynitrite (Voir Introduction chapitre « Stress oxydant ») et entraînerait la mort de la
bactérie.
Toutefois, les résultats obtenus lors d’infections dans des macrophages dépourvus de NADPH
phagocyte oxydase ou altérés dans la capacité à produire des FAN indiquent que l’hypothèse
du peroxynitrite doit être considérée prudemment. En effet, dans ces expériences, la
contribution individuelle des deux enzymes eucaryotes a été testée et conclue pour être faible.
Le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est toujours affecté dans son développement en l’absence de
NADPH phagocyte oxydase et de la NO. synthase inductible, donc de peroxynitrite.
96
Discussion
Toutefois, il existe dans le macrophage d’autres enzymes produisant de l’anion superoxyde :
la myeloperoxydase ainsi que la xanthine oxydase. De plus, dans les expériences de
prolifération dans des macrophages altérés dans leur capacité à produire des FAN, la synthèse
de NO. se poursuit faiblement. Ainsi, à ce jour, on ne peut conclure de façon définitive sur la
raison du défaut de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx dans des macrophages
murins. Deux expériences pourraient permettre d’évaluer l’impact du peroxynitrite en tant
qu’espèce responsable de la diminution de la prolifération intracellulaire du mutant ∆ahpCF
∆tsaA ∆tpx :
-
l’infection des macrophages dépourvus de NADPH phagocyte oxydase et de NO.
synthase inductible (donc incapables de produire de l’H2O2 et de l’ONOO-), où
l’indice de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx devrait être le même que
celui de la souche sauvage,
-
l’analyse du contenu cytoplasmique de S. typhimurium en 3-nitro-tyrosines après
passage dans des macrophages sauvages. Les résidus 3-nitro-tyrosines constituent
un indicateur de la présence de peroxynitrite et sont détectables par
immunodétection.
IV- Le macrophage murin est il un « bon » modèle cellulaire permettant l’étude de la
virulence de S. typhimurium ?
Au cours de ce travail, la virulence de S. typhimurium a été évaluée selon deux indicateurs : la
prolifération dans des macrophages et l’infection de souris. Nous avons observé que les
résultats obtenus n’étaient pas toujours superposables. Par exemple, lorsque la souche sauvage
et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ont été inoculés dans la souris, l’index de compétition
obtenu a été de 0,5. Ce résultat indique que le mutant est faiblement altéré dans sa capacité à
entrer en compétition avec la souche sauvage. Or dans les macrophages, nous avons observé
que le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx n’est plus capable de proliférer. Alors comment expliquer
qu’un défaut de prolifération aussi marqué dans les macrophages ne se traduise pas par un
défaut de survie plus grand dans la souris ? Lors des expériences de compétition dans la
souris, nous calculons la prolifération intracellulaire de la bactérie à partir de cellules de rate
qui est constituée de plusieurs types cellulaires. De plus, il n’existe aucune étude montrant
qu’au cours de l’infection systémique, dans les organes lymphoïdes secondaires, S.
typhimurium se niche exclusivement dans le macrophage. Au contraire, une étude réalisée en
97
Discussion
2007 a montré que dans la rate, S. typhimurium s’établit dans les lymphocytes B et T, les
monocytes, les cellules dendritiques et les macrophages et semblait préférentiellement cibler
les neutrophiles (Geddes et al., 2007). Ce résultat pose ainsi la question du modèle cellulaire
adéquat permettant l’étude des capacités de virulence de S. typhimurium. De plus, la coinoculation des bactéries au moment de l’infection dans la souris peut entraîner un biais dans
les résultats. En effet, on peut imaginer que la bactérie sauvage protège le mutant en
détoxifiant l’environnement. Afin de tester cette hypothèse, il serait intéressant d’effectuer des
expériences de dose létale 50. Ces expériences qui consistent à estimer le pouvoir de virulence
d’une souche permettrait de répondre à nos interrogations puisque nous testerions directement
les capacités de virulence du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx.
V- Implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la virulence de
S. typhimurium
L’importance des méthionine sulfoxyde réductases dans la pathogénicité bactérienne a été
illustrée chez plusieurs microorganismes (Hassouni et al., 1999 ; Dhandayutapani et al.,
2001 ; Wizemann et al., 1996). Concernant S. typhimurium, une étude transcriptomique
comparant le profil d’ARNm isolés de bactéries intracellulaires et de bactéries en milieu de
culture a révélé que la transcription de msrA était activée après 4h et 12h d’infection d’un
facteur 5 et 6 respectivement dans des macrophages murins (Eriksson et al., 2003). De façon
surprenante, nous avons observé qu’en condition d’infection dans les macrophages, le mutant
msrAB- avait le même indice de prolifération que la souche sauvage. Ainsi, l’absence de
MsrA et MsrB n’altère pas la virulence de S. typhimurium. Par contre, dans le contexte
génétique Hpx-, le mutant msrAB- semble mieux adapté à l’environnement rencontré dans le
macrophage que la souche sauvage puisque son indice de prolifération est supérieur à celui de
la souche sauvage. Une hypothèse est que le mutant msrAB- Hpx- n’élimine pas le stress
endogène produit par la chaîne respiratoire et pourrait donc avoir un niveau d’expression de
base du régulon oxyR élevé. Ceci permettrait la mise en place des systèmes de défense
antioxydants. Ainsi, cette souche serait présensibilisée à l’H2O2 et prolifèrerait mieux que la
souche sauvage.
Au cours de cette étude, nous avons également constaté que le mutant msrAB- Hpx- présentait
un défaut de mobilité. Dans ce contexte, il est néanmoins curieux que les effets des mutations
de msrA et de msrB sur la mobilité ne se reflètent pas dans la virulence étant donné le rôle
98
H2O2
Cytosol eucaryote
O2.O2
O2.-
O2.-
O2.-
H2O2
SodCI
H2O2
H 2O 2
H2O2
AhpCF, TsaA, Tpx
ONOO- + Cys SH
SH
NO2- +Cys
S
H2O2
S
H2O
H2O
ONOO-
KatG, KatE, KatN,
AhpCF , TsaA
H2O2
SodA, SodB
O2.-
ONOO-
S. typhimurium
O2
SodCII
O2
O2.-
H2O2
Salmonella Containing vacuole
O2.- NO.
H2O2
Légende
iNOs
Canal spécifique des solutés anioniques
Arginine
NO.
Chaine respiratoire aérobie
NADPH phagocyte oxydase
Figure 1 : Perception et prise en charge des FAO par S. typhimurium dans le macrophage
S. typhimurium perçoit des FAO et des FAN en condition d’infection dans le macrophage. Les catalases
et les peroxyrédoxines participent à leur élimination (voir texte). Les enzymes figurées en orange
appartiennent au métabolisme de S. typhimurium, les enzymes figurées en vert sont des facteurs de
virulence. Dans le cas de l’élimination du peroxynitrite, les cystéines catalytiques d’AhpCF et de TsaA
participent à sa réduction.
Discussion
bien établi de la mobilité dans la virulence bactérienne. Il est donc, à nouveau, légitime de se
poser la question du macrophage comme modèle cellulaire. Une étude réalisée en 2009 a
montré que lorsque E. coli ou S. aureus étaient internalisées pendant 1 heure dans des
neutrophiles polymorphonucléaires (PMN), seuls 15% de la population bactérienne avait
survécu et 50 % de leur contenu en résidus méthionine étaient oxydés (Rosen et al., 2009).
L’activité bactéricide des neutrophiles est améliorée en l’absence de MsrA et MsrB. Ces
résultats suggèrent qu’il existe une relation entre l’environnement oxydant des cellules hôtes
et l’implication de MsrA et MsrB pour la survie d’E. coli en condition d’infection. Ainsi, il
serait intéressant de tester le mutant msrAB- de S. typhimurium en condition d’infection dans
des neutrophiles.
VI- Modèle proposé pour la perception et l’élimination des FAO et FAN produites dans le
macrophage
L’ensemble de nos résultats ainsi que des informations disponibles dans la littérature nous
conduisent à proposer le modèle suivant pour la perception et la prise en charge des FAO et
des FAN par S. typhimurium dans le macrophage (Fig. 1) : l’anion superoxyde produit par la
NADPH phagocyte oxydase peut être dismuté spontanément en H2O2 dans la lumière du SCV
ou peut pénétrer directement dans le périplasme bactérien par des canaux spécifiques des
solutés anioniques. L’H2O2 est alors capable de traverser librement les barrières
membranaires en empruntant les aquaporines pour atteindre le cytoplasme bactérien. L’anion
superoxyde situé dans le périplasme est dismuté en H2O2 par SodCI puis traverse la
membrane cytoplasmique afin d’atteindre le cytoplasme. Dans le cytoplasme, KatG, KatE,
KatN, AhpCF et TsaA transforment l’H2O2 en H2O. En parallèle, la NO. synthase inductible
produit du NO. dans le cytosol du macrophage. Ce composé diffuse librement à travers les
membranes. Dans la lumière de la SCV, il peut interagir avec l’O2.- pour former du
peroxynitrite. Le peroxynitrite formé diffuse sous forme HOONO à l’intérieur du cytoplasme
de S. typhimurium. AhpCF, TsaA et Tpx transforme le peroxynitrite en nitrite et en H2O.
Enfin, la chaîne respiratoire aérobie produit de l’anion superoxyde qui est dismuté par SodA
et SodB dans le cytoplasme et SodCII dans le périplasme.
Notre modèle donne une plus large place aux défenses cytoplasmiques dans la protection des
stress produits par l’hôte. Ainsi, outre les facteurs de virulence spécifiques, les enzymes
99
Discussion
métaboliques de S. typhimurium garantissent également le succès de l’infection. Cette étude a
ainsi démontré que la frontière entre métabolisme et virulence pouvait être mince.
100
Matériels
et
Méthodes
Techniques de microbiologie cellulaire
1- Milieux et réactifs
Les macrophages RAW 264.7 ont été cultivés en milieu Dulbecco's modified Eagle medium
(DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FCS) (HyClone).
Les macrophages dérivés de moelle osseuse ont été isolés à partir du fémur de souris
C57BL/6 de 8 à 10 semaines et différenciés selon la méthode de De Chastellier et al (1993)
ou de souris C57BL/6 dépourvues de NADPH phagocyte oxydase.
2- Infection de macrophages
La capacité de prolifération des souches testées a été testée en triplicat au sein de la même
expérience (3 puits ont été infectés avec la même souche bactérienne). Deux temps ont été
testés, 2h et 16 h après le début de l’infection. Pour cela, 24 heures avant le début de
l’infection, une suspension de macrophages à 250000 cellules/ml est réalisée en milieu de
culture cellulaire (DMEMc). 2 ml par puits ont été distribués dans les 24 puits. Les plaques
sont incubées à 37°C, en présence de 5% de CO2.
En parallèle, des cultures bactériennes à tester ont été réalisées. Pour cela, une colonie de
chacune des souches a été ensemencée dans 5 ml de milieu LB. La préculture a ensuite été
placée à 4°C pendant 6 à 8 heures. Trente minutes avant le début de l’infection, 30 µl de la
souche bactérienne ont été opsonisés en présence de 300 µl d’un mélange de DMEMc et de
sérum de souris à 10 % (Perbio). Les mélanges ont été placés à 4°C.
Après les 30 minutes d’incubation, le mélange bactérien/DMEMc/sérum de souris a été ajouté
à 12 ml de DMEMc et réparti à raison de 2 ml/ puit dans les plaques 6 puits préparées la
veille. Chacune des souches a été répartie dans 6 puits. Les plaques ont été centrifugées à 400
g pendant 5 minutes, puis elles ont été incubées pendant 30 minutes à 37°C et à 5% CO2.
Après les 30 minutes d’incubation, les puits ont été lavées 3 fois avec un tampon phosphate
(PBS) puis le milieu DMEMc comprenant 100 mg/ml de gentamycine pour tuer les bactéries
extracellulaires a été rajouté. L’infection s’est poursuivie pendant 2 h, les puits ont, à
nouveau, été lavés 2 fois avec du PBS. Pour l’une des deux plaques, nous avons rajouté du
DMEMc comprenant 10 mg/ml. Cette plaque a ensuite été incubée pendant 16 heures à 37°C
et à 5% CO2.
La plaque restante a été traitée comme suit : dans chacun des 6 puits, 500 µl de
DMEMc/Triton 0,1 % ont été rajoutés. Les 500 µl ont été collectés dans des tubes Eppendorf,
101
puis les puits ont été nettoyés avec 500 µl de DMEMc/Triton 0,1 % qui ont également été
collectés. Au final, 1 ml de suspension cellulaire a été obtenu pour chacun des 6 puits. Cette
suspension a été diluée de façon appropriée en milieu PBS. 20 µl de chacune des dilutions a
été déposé trois fois soit sur boite LB, soit sur boite LB additionnée de catalase à 2000 U/ml.
Les boites ont ensuite été incubées à 37 °C. La deuxième plaque est traitée de la même façon,
16 heures après infection.
Au final, les dénombrements 2 heures ou 16 heures après infection ont été obtenus. Ils
permettent de calculer l’indice de prolifération qui est défini comme étant le rapport entre le
dénombrement à 16 heures et le dénombrement à 2 heures après infection.
Les variantes
1- L’utilisation de l’interféron gamma (IFN γ)
De l’IFNγ à une concentration finale de 10 U/ml (ImmunoTools) finale a été parfois rajouté
directement dans la suspension de macrophages.
2- L’utilisation de PMA
Dans certaines expériences, du phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma Aldrich) été
rajouté dans les macrophages afin de stimuler l’activité de la NADPH phagocyte oxydase.
Pour cela, 30 minutes avant le début de l’infection, 0,2 µM final de PMA ont été rajoutés dans
les puits contenant les cellules. Le PMA est présent durant les 16 heures d’infection.
3- L’utilisation du DPI
Le protocole utilisé pour le DPI est détaillé dans la partie « matériel et méthode » de l’article
Hébrard et al., 2009.
4- L’utilisation du 1400W
Dans certaines expériences, du 1400W a été rajouté dans les macrophages afin d’inhiber la
NO synthase inductible. Pour cela, 2 heures avant le début de l’infection, 2 µM de 1400W ont
été rajoutés dans les puits contenant les cellules. Ils sont présents durant les 16 heures
d’infection
3- Dosage des nitrites
102
Le dosage de nitrites a étét effectué avec le réactif de Griess. Des aliquots de culture d’1 ml
ont été prélevés à partir de macrophages infectés comme précédemment expliqués, 2 heures et
16 heures après infection. En parallèle, le réactif de Griess a été préparé. Il est composé de la
solution S (1% de sulfanilamide, 30% acide acétique et eau milliQ qsp 100 ml) et de la
solution N (0,1% de 1-naphtylethyl-enediamide, 60 % d’acide acétique et eau milliQ qsp 100
ml).
200 µl d’aliquot de culture ont été ajouté à 400 µl de solution S et 400 µl de solution N. La
présence de nitrite se caractérise par l’apparition d’une coloration rose dosable au
spectrophotomètre à 543 nm.
Pour déterminer les concentrations en nitrites présents dans les surnageants de culture, une
gamme étalon a été réalisée à partir de nitrite de sodium (0 à 150 µM).
4- Infection de souris
Des souris BALB/c âgées de 6 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec
2,5.105 ml d’un mélange bactérien (la souche sauvage et un mutant portant une cassette de
résistance à un antibiotique). La concentration bactérienne de chacune des deux souches a été
contrôlée par dénombrement soit sur boite LB, soit sur boite LB et antibiotique. Les boites LB
permettent de dénombrer la population totale, les boites avec antibiotiques, le nombre de cfu
du mutant. L’input a été calculé, il est défini comme le rapport entre le dénombrement du
mutant et le dénombrement de la souche sauvage avant infection. Les souris ont été
euthanasiées 48 heures après infection par dislocation des vertèbres. La rate a été prélevée,
placée dans 2 ml d’eau stérile et homogénéisée mécaniquement. La suspension cellulaire a été
ensuite placée dans de la glace pendant 5 minutes pour permettre aux débris de tissus de
sédimenter. Un aliquot de suspension a ensuite été prélevé, dilué de façon approprié et étalé
soit sur boite LB, soit sur boite LB avec antibiotique. L’output a été calculé, il est défini
comme le rapport entre le dénombrement du mutant et le dénombrement de la souche
sauvage, 48 heures après infection. Au final, l’index de compétition a été déterminé, il est
défini comme étant le rapport entre l’output et l’input.
5- Extraction d’ARN à partir de bactéries intracellulaires
Le protocole utilisé pour l’étape d’extraction d’ARN à partir de bactéries intracellulaires est
détaillé dans la partie « matériel et méthode » de l’article Hébrard et al., 2009.
.
103
Techniques de microbiologie moléculaire
1- Milieux de culture
Le milieu de culture LB (Luria Bertoni) a été préparé selon la méthode décrite par Miller
(Miller, 1972). Il contient 10 g/L de bactotryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 5 g/L de NaCl.
Le pH final du milieu est de 7,4. Le milieu gélosé correspondant contient 15 g d’agar par litre
de milieu.
Le milieu M9 est composé de 6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl et de
1g/L de NH4Cl. Ce milieu de base est complété extemporanément par 1mM final de MgSO4,
0,2 mM final de CaCl2, 50 µg/ml de vitamine B1 et d’une source de carbone (0,2 % pour le
glycérol et le glucose et 0,05% pour l’acide pétrosélinique et l’acide oléique). Des casamino
acides sont rajoutés si nécessaire (0,1%).
Le milieu LPM est composé de 5 mM final de KCl, 7.5 mM final de (NH4)2SO4, 0.5 mM final
de K2SO4, 38 mM final de glycérol (0.3% v/v), 0.1% final de casamino acides, 8 µM MgCl2,
337 µM de PO43- et 80 mM de MES. Le pH final du milieu est de 5,8.
Le milieu de transduction du phage P22 est composé d’un volume de LB, 1 volume de E Salts
et 0,2 % final de glucose.
Le E Salts est composé de 50 g/l d’acide citrique, 5 g/l de MgSO4, 250 g/L K2HPO4, 90 g/L
NaNH4HPO4.
Les boites LB agar avec indicateur de pH sont composées de 25 ml de base LB-agar
précédemment décrite, de 250 µl de stock colorant et de 1,05 ml de glucose 20%.
Le stock colorant est composé de 6,5 mg/ml d’Aniline Blue, 62,2 mg/ml d’Alizarin Yellow, et
d’eau (qsp 200ml).
Les antibiotiques sont rajoutés aux concentrations finales suivantes : ampicilline 50 µg/ml,
kanamycine 25 µg/ml, chloramphénicol 25 µg/ml, tétracycline 25 µg/ml. L’arabinose 0,2%
est ajouté pour induire l’expression du gène codant pour la recombinase sur le plasmide
pKD46.
2- Conditions de conservation des souches
Les souches bactériennes sont conservées dans leur milieu de culture additionné de glycérol
20% final à -80°C.
3- Méthodes de transfert d’information génétique
a. Transformation d’E. coli
104
i. Electroperméabilisation
Des bactéries de la souche DH5α ont été cultivées en milieu LB. En milieu de phase
exponentielle (DO600 = 0,4-0,6), les bactéries ont été centrifugées. Les culots sont lavés 3 fois
avec de l’eau à 4°C puis concentrés 100 fois. 50 µl de cellules compétentes et 100 ng d’ADN
sont mélangés. Le transfert se fait par électroperméabilisation selon la méthode décrite par
Sambrook (Sambrook et al., 1989 issu de « Molecular Cloning : a laboratory manual. Cold
Sping Harbor) à 400 Ω et 25 V, immédiatement suivi de l’ajout de 1 ml de LB. Les bactéries
sont incubées pendant 1 h à 37°C pour l’étape d’expression, avant d’être étalées sur milieu
gélosé sélectif.
ii. Perméabilisation au chlorure de calcium
Des bactéries de la souche DH5α ont été cultivées en milieu LB. En milieu de phase
exponentielle (DO600 = 0,4-0,6), les bactéries ont été incubées à 4°C pendant 2 minutes.
Ensuite, les bactéries ont été centrifugées. Les culots ont été lavés deux fois dans une solution
de CaCl2 50 mM. Une dernière centrifugation est effectuée, le culot bactérien est alors
solubilisé dans une solution de CaCl2 50 mM et de glycérol 15%. Les bactéries ainsi traitées
sont appelées bactéries compétentes.
1 µl de plasmide a été mélangé à 50 µl de bactéries compétentes. Le mélange a été placé 30
minutes à 4°C, puis 45 secondes à 42°C et enfin 2 minutes à 4°C. Puis, 0,5 ml de LB ont été
ajoutés et les bactéries ont été incubées 1 h à 37°C pour l’étape d’expression, avant d’être
étalées sur milieu gélosé sélectif.
b. Transformation chez S. typhimurium
Le protocole d’électroperméabilisation précédemment décrit pour E. coli a été reproduit chez
S. typhimurium.
c. Transduction de S. typhimurium
i. Préparation du lysat
100 µl d’une préculture ont été mélangés dans 1 ml de milieu de transduction et 20 µl de
phage P22 à 5.1011 pfu/ml (unités formant des plages de lyse). Le mélange a été incubé sur la
nuit à 37°C. 20 µl de chloroforme ont été ensuite ajoutés, le mélange a été centrifugé à 13000
rotations par minute, le surnageant a été prélevé et 20 µl de chloroforme ont été encore ajouté.
105
ii. Transduction
Des bactéries ont été cultivées en milieu LB. A DO600 = 0,3, 500µl de culture bactérienne ont
été mélangés à 100 µl de lysat (titre : 109 à 1011 plages formant des unités) pendant 30 minutes
à 37°C. Le mélange a été étalé sur boite LB-EGTA (10 mM) additionné de l’antibiotique
correspondant. Les clones obtenus ont été purifiés 2 fois sur LB-EGTA. La présence de
phages persistants a été testée sur boite avec indicateur de pH.
106
Techniques de biologie moléculaire
1- Réaction de polymérisation en chaine (PCR)
La matrice d’ADN (0,1 µg-0,75µg), les 4 dNTPs (200 µM final), un couple d’amorce
oligonucléotidiques (500 nM final), l’enzyme (DyNAzyme EXT DNA polymerase de
Finnzymes), son tampon contenant des ions MgCl2 sont mélangés dan un volume final de 50
µl. L’ADN est, dans un premier temps, dénaturé à 94°C pendant 2’30’’. L’amplification est
réalisée par une succession de trente cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C
pendant 1’, puis une étape d’hybridation à 55°C pendant 1’, puis une étape d’élongation à
72°C pendant 1’/kb. Enfin, la PCR se termine par 10’ d’élongation à 72°C. L’ADN ainsi
amplifié est purifié par fixation spécifique à une résine puis élution à l’aide du kit « QIAquick
PCR putification » (QIAGEN) ou après migration sur gel d’agarose, à l’aide du kit
« QIAquick Gel extraction » (QIAGEN).
2- Coupure, ligature
Les enzymes de restriction et la T4 DNA ligase utilisées proviennent principalement de la
société Biolabs.
3- Construction des plasmides
La construction des plasmides pACYC katG et pACYC tsaA est détaillée dans la partie
« matériel et méthode » de l’article Hébrard et al., 2009.
4- Construction des plasmides PahpC-GFP et PytfE-GFP
Le promoteur du gène ahpC a été amplifié par PCR partir de l’ADN chromosomique de la
souche 12023 et avec les oligonucléotides ahpC5’ et ahpC3’, qui s’hybrident respectivement
sur la région débutant au niveau de la 300ème paire de base en amont de l’ATG et au niveau de
la 3ème paire de base en amont de l’ATG. Les oligonucléotides ahpC5’ et ahpC3’ possèdent,
au niveau de leur extrémité 5’ des sites de restriction reconnues par les enzymes XbaI et NdeI
respectivement. Ces sites de restriction permettent le clonage du promoteur ahpC sur le
plasmide pFPV25 en amont du gène codant pour la GFP mut3a et dans le cadre de lecture de
celui-ci afin d’obtenir une fusion transcriptionnelle. Pour cela, le fragment PCR est digéré par
XbaI et NdeI ainsi que le plasmide pFPV25. Le fragment digéré et le plasmide linéarisé sont
ensuite purifiés sur gel d’agarose. L’étape de ligation entre le vecteur et l’insert se fait
107
pendant 16 heures à 15°C. Puis, on introduit le produit de ligation dans des DH5α
compétentes au CaCl2. Les bactéries ainsi transformées sont étalées sur boite contenant une
résistance à la pénicilline afin de sélectionner les bactéries portant le plasmide pFPV25. Le
plasmide transformant sont extraits.
5- Extraction d’ARN
Le protocole d’extraction d’ARN est détaillé dans la partie « matériel et méthode » de l’article
Hébrard et al., 2009.
6- PCR quantitative en temps réel
Le protocole de PCR quantitative en temps réel est détaillé dans la partie « matériel et
méthode » de l’article Hébrard et al., 2009.
108
Tests phénotypiques
1- Croissance en milieu LB et milieu minimum
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit soit en milieu LB, soit en milieu minimum.
Le lendemain, les cultures bactériennes sont diluées entre DO600 = 0,05 ou DO600 = 0,1. La
croissance est suivie par spectrophotométrie à 600 nm au cours du temps.
Le milieu minimum de base est dépourvu de casamino acides. La présence de casamino
acides et de la source de carbone est précisé en fonction des expériences.
2- Stress H2O2 sur boite LB
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures
sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. Les croissances sont arrêtées soit à DO600 = 0,2, soit
à DO600 = 1. Des aliquots de cultures bactériennes sont dilués en milieu PBS puis étalées sur
boite LB contenant 0,2 ou 0,3 mM d’H2O2. Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le
lendemain, le nombre de cfu est déterminé.
3- Croissance en présence d’H2O2
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures
sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, de l’H2O2 est
ajoutée, soit à 2,5 mM, soit à 1 mM final. La croissance est suivie par spectrophotométrie à
600 nm au cours du temps et des aliquots de cultures bactériennes sont prélevés à différents
temps, dilués de façon appropriée en milieu PBS puis étalés sur boite LB. Les boites sont
incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé.
Dans certaines expériences, 1 mM de paraquat ou 50 µM d’hydroperoxyde de cumène ou 50
µM de Noc5/Noc7sont ajoutés à la place de l’H2O2.
4- Survie en présence d’H2O2
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures
sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, la croissance est
arrêtée, 1 ml de culture bactérienne est centrifugée 5’ à 5000 rpm puis repris dans du tampon
PBS. Les bactéries sont prétraitées pendant 30 minutes avec 10 mM d’H2O2. Puis 0, 120 et
240 minutes après le prétraitement, les bactéries sont diluées de façon appropriée en PBS puis
109
étalés sur boite LB. Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de
cfu est déterminé.
5- Survie en présence de SIN-1
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures
sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, la croissance est
arrêtée, 1 ml de culture bactérienne est centrifugée 5’ à 5000 rpm puis repris dans du tampon
PBS. 1 mM de SIN1 est ajouté à la culture bactérienne. Puis 0, 120 et 240 minutes après le
prétraitement, les bactéries sont diluées de façon appropriée en PBS puis étalés sur boite LB.
Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé.
6- Survie en présence d’H2O2 et de SIN-1
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures
sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, la croissance est
arrêtée, 1 ml de culture bactérienne est centrifugée 5’ à 5000 rpm puis solubilisé dans du
tampon PBS. Les bactéries sont prétraitées pendant 30 minutes avec 10 mM d’H2O2, puis 1
mM de SIN1 est ajouté à la culture bactérienne. 0, 120 et 240 minutes après le prétraitement,
les bactéries sont diluées de façon appropriée en PBS puis étalés sur boite LB. Les boites sont
incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé.
7- Expérience de mobilité bactérienne
Les boites de « swimming » sont constituées d’agar « mou » (0,3% final) préparé dans du
milieu LB. Les boites sont inoculées par pénétration de 2µl d’une préculture bactérienne au
centre de la gélose à l’aide d’un cône. Les boites sont incubées soit à 30°C, soit à 37°C
pendant 5 heures en aérobiose.
110
Expériences avec les sondes PahpC-GFP et PytfE-GFP
1- Croissance en milieu minimum et activation par l’H2O2
Les souches portant le plasmide sont cultivées en milieu minimum, casamino acides 0,1% et
glycérol 0,2% jusqu’à DO600 = 0,4. Ensuite, différentes concentrations en H2O2 sont ajoutés
dans le milieu minimum : 0, 2, 4, 6, 8 et 10 µM. La croissance est suivie à DO 600 nm et la
fluorescence à 530 nm (longueur d’excitation 485 nm) pendant 180 minutes. L’autofluorescence générée par la souche sauvage a été soustraite à la fluorescence mesurée De
même, la fluorescence a été divisée par la DO 600 nm pour obtenir une valeur de GFP par
bactérie.
Dans l’expérience d’ajout consécutif d’H2O2, la souche sauvage portant le plasmide est
cultivée de la même façon. Puis, de l’H2O2 est ajouté dans le milieu de culture à différentes
concentrations (2, 4, 6 et 8 µM d’H2O2) toutes les 20 minutes. La fluorescence est suivie
pendant 180 minutes à 530 nm.
2- Suivie de la fluorescence dans les bactéries intracellulaires
Des bactéries opsonisées, portant le biosenseur PahpC-GFP ou PytfE-GFP, sont phagocytées
dans des macrophages RAW 264.7 ou dans des macrophages dérivés de moelle osseuse
fraichement différenciés. A différents temps après infection, les macrophages sont lysés et les
bactéries intracellulaires sont isolées puis resuspendues en PBS/10 mM NH4Cl. Les bactéries
sont ensuite marquées avec des anticorps anti-LPS de Salmonella. L’intensité de fluorescence
relative est déterminée par FACS.
111
Techniques de biochimie
1- Dérivatisation des groupements carbonyles
a. Préparation des extraits protéiques
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, la préculture
est diluée à DO600 = 0,1 dans 50 ml de LB. A DO600 = 0,5, la culture bactérienne est
centrifugée à 5500 rpm pendant 10 minutes. Le culot est repris dans 2 ml de PBS. Les
bactéries sont lysées par plusieurs passages à la presse de French. L’extrait cellulaire est traité
à la DNase SI puis une partie est centrifugée à 13000 rpm pendant 30 minutes. Le surnageant
est récolté (S1).
b. Dosage des échantillons cellulaires
Seules les protéines du surnageant S1 sont dosées. Le dosage est réalisé à l’aide d’un kit
« BCA Protein Assay Kit ». Il s’agit d’une détection colorimétrique basée sur la
reconnaissance de certains acides aminés par l’acide bicinchoninique. En présence de
protéines, la solution vire du vert au pourpre. Le dosage est effectué à une DO de 562 nm.
c. Dérivatisation des groupements carbonyles.
La dérivatisation des groupements carbonyles est effectuée à l’aide du kit de détection
« OxyBlot protein oxidation » ( Chemicon International).
Les échantillons sont dilués pour obtenir 1,25 µg de protéine dans 5 µl. Ils sont dénaturés par
ajout de 5µl de SDS à 12% puis dérivatisés par ajout de 10 µl de DNPH 1X. Ils sont ensuite
incubés à 25°C pendant 15 minutes. Enfin, 7,5 µl de solution de neutralisation est ajouté au
mélange protéique.
2- Dot blot
a. Transfert des protéines sur membrane
Des membranes PVDF sont pré-humectées avec de l’éthanol ou tout solvant polaire. Elles
sont ensuite rincées dans de l’eau et enfin dans un tampon Tris 25 mM, Glycine 192 mM et
éthanol 20%. Les échantillons sont déposés sur une membrane PVDF par aspiration sous vide.
Après le transfert, la membrane est saturée avec un tampon Tris-glycine-ethanol/ régilait 5%.
b. Immunodétection
112
La membrane est incubée avec l’anticorps primaire dilué au 1/100ème dans du tampon TrisGlycine/ régilait 5% 1 heure à 25°C et sous agitation. Les membranes sont ensuite rincées 2
fois avec du tampon Tris-Glycine-éthanol, puis lavées pendant 15’ avec du tampon TrisGlycine-éthanol. Puis, l’anticorps secondaire dilué au 300ème est ajouté. Il reconnait
l’anticorps primaire et est conjugué avec la « Horseradish Peroxydase ». L’incubation dure 1
heure à 25 °C sous agitation, puis la membrane est rincée avec du tampon Tris-Glycine.
L’immunodétection est réalisée à l’aide du kit « ECL » (Amersham) qui consiste à une
réaction de chimioluminescence en présence de la « Horseradish péroxydase ».
3- Immunodétection des groupements carbonyles après migration sur gel SDS-PAGE.
a.
Migration des échantillons protéiques sur gel SDS-PAGE 10 %.
Un gel SDS-PAGE à 10 % en acrylamide/bisacrylamide est réalisé. 20 µg de protéines sont
dérivatisés au DNPH comme précédemment décrit puis chauffés à 95°C et enfin déposés dans
chaque puits du gel. Les échantillons migrent dans un tampon Tris 25 mM, Glycine 192 mM
et SDS 20%.
b. Transfert sur membrane PVDF
Une membrane de PVDF ainsi que deux morceaux de papier Wattman sont découpés à la
taille du gel SDS-page, puis humidifiés avec le tampon Tris-glycine-Ethanol. Le gel est
déposé en « sandwich » sur la membrane PVDF et entre les papiers Wattman. Les protéines
sont transférées du gel SDS-page vers la membrane pendant 15 minutes à 15 volts.
L’étape de révélation est la même que celle réalisée pour le Dot Blot.
4- Immunodétection des protéines après migration sur gel SDS-PAGE en deux
dimensions
a. Préparation des extraits protéiques
Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, la préculture
est diluée à DO600 = 0,1 dans 800 ml de LB. A DO600 = 1, la culture bactérienne est
centrifugée à 7500 rpm pendant 30 minutes. Le culot est solubilisé dans 10 ml de PBS. Les
bactéries sont lysées par plusieurs passages à la presse de French. L’extrait cellulaire est traité
à la DNase SI puis est centrifugée à 13000 rpm pendant 30 minutes. Le surnageant est
conservé.
113
b. Dosage des échantillons cellulaires
Le dosage est réalisé comme précédemment indiqué avec le « BCA Protein Assay Kit ». 200
µg de protéines sont déposés sur les gels SDS-PAGE.
c. Focalisation électrique
Des bandes sur lesquelles est établi un gradient de pH sont réhydratées dans un tampon de
réhydratation. Le tampon de réhydratation contient 21 g d’urée, 7,6 g de thio-urée, 2 g de
CHAPS, 100 mg de DTT, 1% de bleu de bromophénol pour un volume final de 50 ml. 110 µl
de ce tampon de réhydratation est ajouté à 2,5 µl d’IPG buffer et de DTT 1M.
200 µg de protéine sont distribuées dans le tampon de réhydratation afin d’obtenir un volume
final de 350 µl. Ce mélange est déposé sur la bande réhydratée et incube pendant la nuit. Le
lendemain, la bande est déposée sur un cycle électrique suivi est 10’ à 200 v puits 1h 30 à
3500 v et enfin 2h à 3500 v.
d. Electrophorèse en gel SDS-page
Des gels SDS-PAGE 10 % sont réalisés. Les bandes sont déposées au dessus des gels puis
recouverts de tampon Tris-Glycine-SDS. Le gel migre pendant 3 heures à 70 v. Les protéines
sont révélées au bleu colloïdal.
114
Espèce
E.coli
S. typhimurium
Souche
description
Référence ou
origine
Collection du
laboratoire
MG1655
E. coli souche sauvage
fadH
MG1655 ∆fadH
E. coli Hpx
MG1655 ∆ahpCF ∆katG ∆katE
Collection du
laboratoire
12023
S. typhimurium NTCC 14028
Collection du
laboratoire
msrAB
12023 msrA::kan msrB::cat
cette étude
msrAB curée
12023 ∆msrA ∆msrB
cette étude
Hpx
12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan
cette étude
msrAB Hpx
12023 ∆msrA ∆msrB ∆ahpCF katG::cat katE::kan
cette étude
msrAB Hpx°
12023 msrA::kan ∆msrB ∆ahpCF ∆katG ∆katE
cette étude
Hpx°
12023 ahpCF::kan ∆katG ∆katE ∆katN
cette étude
HpxF
12023 ahpCF::kan ∆katG ∆katE ∆katN tsaA::cat
cette étude
HpxF curée
12023 ∆ahpCF ∆katG ∆katE ∆katN ∆tsaA
cette étude
Px
12023 ∆ahpCF ∆tsaA tpx::cat
cette étude
Kat
12023 ∆katG ∆katE katN::kan
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oxyR-
12023 oxyR::Tn10 (TetR)
Collection du
laboratoire
ahpCF- tsaA-
12023 ∆ahpCF tsaA::kan
cette étude
ahpCF- tpx-
12023 ahpCF::kan tpx::cat
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tsaA- tpx-
12023 tsaA::kan tpx::cat
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Tableau 1 : Liste des souches utilisées dans cette étude 1/2
cette étude
Souches, plasmides et oligonucléotides utilisées dans cette étude.
1. Souches
La liste des souches utilisées dans cette étude est reportée ci-contre (Tableau 1).
2. Liste des plasmides
Nom du
plasmide
pKD46
Description
Red recombinase λ-ApR
pCP20
Recombinase FLP ApR et CmR
pKD3
Plasmide matrice, kanR et ApR
pKD4
Plasmide matrice, CmR et ApR
pACYC 184 CmR et TcR, origine de réplication p15A
pkatG
pkatE
pFPV25
Région codante de katG clonée aux sites BamHI et HindIII clonée dans
pACYC184
Région codante de katE clonée aux sites BamHI et HindIII clonée dans
pFPV25 clonée dans pACYC184
gfp mut3a, ApR
pahpC-GFP Région promotrice d'ahpC fusionnée à la séquence codante de la gfp mut3a
dans pFPV25
pytfE-GFP Région promotrice d'ytfE fusionnée à la séquence codante de la gfp mut3a
Dans pFPV25
Référence
Wanner et
Datsenko, 2000
Wanner et
Datsenko, 2000
Wanner et
Datsenko, 2000
Wanner et
Datsenko, 2000
Wanner et
Datsenko, 2000
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Collection du
laboratoire
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3. Liste des oligonucléotides
Oligonucléotide
katG 5'
katG 3'
katE 5'
katE 3'
ahpC 5'
ahpC 3'
ytfE 5'
ytfE 3'
pFPV25 NdeI Fw
Séquence
CCCAAGCTTCCGGGAGCTTTATTACAACTC
GGGGGATCCCTGGTTGTGCATAACATAGGC
CCCAAGCTTTCCCGCTCTCCCCCAGCATAA
GGGGGATCCCTCAAGGCAGCGATTGCGGAA
CCCTCTAGAGTAATGTAGAGCGCAACACTT
CCCCATATGTACTTCCTCCGTGTTTTCGTT
CCCTCTAGACAAAAATTGCCAACCGTTATT
CCCCATATGCGTTACCTCATTTGCAATAAT
ATATACATATGAGTAAAGGAGAAGAA
pFPV25 NdeI Rv TGTTTCATATGATCTGGGTATCTCGC
Origine
Cette étude
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Résumé
Les Formes Actives de l’Oxygène (FAO), molécules dérivées de l’oxygène, sont capables
d’oxyder et d’endommager les macromolécules biologiques. Au cours de son cycle de vie,
Salmonella typhimurium est exposée à des FAO provenant de deux sources : soit de son
métabolisme aérobie, soit du macrophage, sa cellule hôte au cours de l’infection. Parmi les
FAO existantes, l’H2O2 est l’une des plus néfastes. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la
contribution des catalases et des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S.
typhimurium. Cinq enzymes ont ainsi été identifiées pour leur capacité à éliminer l’H2O2 : les
catalases KatG, KatE, KatN et les peroxyrédoxines AhpCF et TsaA. Des tests de virulence ont
également permis de montrer que ces enzymes participaient à l’établissement de la virulence.
A l’aide d’une sonde moléculaire capable de détecter et de signaler l’H2O2, nous avons
montré que S. typhimurium percevait cette FAO au cours de l’infection dans des macrophages
murins. Ces résultats ont souligné l’importance des catalases et des peroxyrédoxines au cours
de la vie intracellulaire de S. typhimurium. L’analyse du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a
également révélé que les peroxyrédoxines AhpCF, TsaA et Tpx contribuaient à la capacité de
prolifération de la bactérie dans le macrophage. Enfin, l’étude des méthionine sulfoxyde
réductases a montré que les caractéristiques d’un mutant ∆msrA ∆msrB étaient proches de
celles de la souche sauvage. Les gènes msrA et msrB ont également été inactivés dans une
souche dépourvue de katG, katE et ahpCF. Dans cette souche accumulant de l’H2O2
endogène, la contribution de MsrA et MsrB devient évidente pour lutter contre les effets liés
au stress oxydant. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier et de caractériser
l’implication de systèmes antioxydants dans la virulence et le métabolisme de S. typhimurium.
Contribution of antioxidant systems in Salmonella virulence and oxidative stress
resistance
Abstract
Reactive Oxygen Species (ROS), produced from molecular oxygen, can oxidize and damage
biological macromolecules. During its lifestyle, Salmonella typhimurium is submitted to ROS
coming from two sources: its aerobic metabolism and its host cell upon infection, the
macrophage. Among the ROS, H2O2 is one of the most toxic. In this work, the contribution of
catalases and peroxiredoxins in the metabolism and the virulence of S. typhimurium was
studied. Five enzymes are implied in H2O2 degradation, the catalases KatG, KatE, KatN and
the peroxiredoxins, AhpCF and TsaA. Virulence tests showed that these enzymes were
involved in virulence. Using a molecular probe able to detect and quantify H2O2, we showed
that S. typhimurium sensed H2O2 during infection in murine macrophages. These results
underlined the importance of catalases and peroxoxyredoxines for the intracellular life of S.
typhimurium. Analysis of the mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx revealed that the peroxiredoxins
AhpCF, TsaA and Tpx contributed to the bacterial proliferation inside macrophage. Finally,
the study of the methionine sulfoxyde reductases showed that the phenotype of the mutant
∆msrA ∆msrB was related to the wild type strain. Then, msrA and msrB were inactivated in a
strain deleted of katG, katE and ahpCF. In this strain impaired in H2O2 degradation, the
contribution of MsrA and MsrB to fight against oxidative stress effect is stronger. Altogether,
these results allowed the identification and the contribution of antioxidant systems in S.
typhimurium virulence and metabolism.