La regression du mesonephros chez Fembryon de

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 15, 3, pp. 397-419, June 1966
With 11 plates
Printed in Great Britain
397
La regression du mesonephros chez
Fembryon de poulet
Etude des activites de la phosphatase acide et des cathepsines.
Analyse biochimique, histochimique et observations
au microscope electronique
Par BERTHE SALZGEBER 1
Institut d'Embryologie et de Teratologie Experimentales du CNRS,
Nogent-sur-Marne {Directeur: Professeur Et. Wolff)
& RUDOLF WEBER2
Institut de Zoologie, Division de Biologie Cellulaire
et d'Embryologie chimique, Berne
INTRODUCTION
Au cours du developpement des vertebres, on observe de nombreux exemples
de regression spontanee de tissus ou meme d'organes (Gliicksmann, 1951).
Ainsi le canal de Miiller de l'embryon $ de poulet represente un exemple
typique d'atrophie d'un organe au cours de la vie embryonnaire (Wolff, 1953)
et le determinisme de cette regression a fait l'objet de nombreux travaux
(Wolff, 1936; Wolff, Lutz-Ostertag & Haffen, 1952; Lutz-Ostertag, 1954). Un
autre exemple est celui de la resorption de la queue des tetards d'amphibiens
anoures au cours de la metamorphose (Kendall, 1919; Vulpian, 1859; Weber,
1962, 1963a).
Des etudes biochimiques ont permis de completer les donnees morphologiques
et ont contribue a eclaircir le mecanisme de la regression de ces organes. Citons
les travaux de Scheib-Pfleger (1955), Brachet, Decroly-Briers & Hoyez (1958) et
Scheib-Pfleger & Wattiaux (1962) sur la regression des canaux de Miiller de
l'embryon $ de poulet et les travaux de Weber (1957a, b), Weber & Niehus
(1961), Weber (19636) et Eeckhout (1964) sur l'atrophie de la queue de tetards
d'amphibiens anoures. L'ensemble de ces recherches demontre que l'involution
des tissus coincide avec une augmentation significative de certaines hydrolases
1
Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie et de Teratologie Experimentales du Centre
National de la Recherche Scientifique, Nogent-sur-Marne, France.
2
Adresse de Vauteur: Institut de Zoologie, Division de Biologie Cellulaire et d'Embryologie
chimique, Berne, Suisse.
398
B. SALZGEBER & R. WEBER
acides. II convient de noter que ces travaux ont ete inspires en grande partie
par les recherches biochimiques de de Duve et collaborateurs (de Duve et al.
1955) sur la distribution intracellulaire d'enzymes dans le foie de rat. Us ont
abouti a la decouverte d'une nouvelle categorie de granules cytoplasmiques
appeles 'lysosomes'. Les auteurs ont demontre que ces organites contiennent
un assortiment specifique d'hydrolases acides. Liberees des granules, ces enzymes sont capables d'agir sur les principaux constituants cellulaires. Pour
de Duve (1958), les lysosomes sont les instruments chimiques de l'autophagie
cellulaire. Celle-ci serait declenchee par la liberation des hydrolases acides des
lysosomes, ce qui devrait expliquer l'augmentation de l'activite de ces enzymes
dans les tissus en voie de regression.
Les techniques biochimiques ayant permis de mettre en evidence des activites
enzymatiques, mais non leur localisation dans le tissu in situ, des chercheurs se
sont adresses recemment aux techniques d'histochimie et de microscopie electronique. Dans les queues de Xenopus en regression, Salzmann & Weber (1963) et
Weber (1964) observent de nombreux macrophages riches en phosphatase
acide et en esterases de type cathepsine, alors que ces elements sont peu nombreux et peu actifs au stade precedant la metamorphose.
Ces auteurs pensent a une activation locale des macrophages dans le tissu
en regression et attribuent l'augmentation de l'activite de ces enzymes a la
neosynthese d'enzymes par les cellules phagocytaires. Dans le canal de Muller de
l'embryon de poulet S, Scheib (1964) signale egalement unenette augmentation
de l'intensite de la reaction de la phosphatase acide au cours de la regression
de l'organe. De nombreuses granulations sont visibles du cote apical des cellules
epitheliales et dans le tissu conjonctif, en particulier dans les cellules de type
macrophage.
Le mesonephros de l'embryon de poulet represente un autre cas d'atrophie
spontanee d'un organe (Wolff, 1953). Au cours de son developpement embryonnaire, le mesonephros croit, augmente de poids pour atteindre un developpement maximum au stade de 14 jours, puis il entre dans une phase de regression
caracterisee par la diminution de la taille et la perte de poids de l'organe
(Firket, 1920; Atwell & Hanan, 1926; Schmalhausen, 1927; Stampfli, 1950;
Haffen, 1951a; Romanoff, 1960; Voile & Beaumont, 1964). Les etudes histologiques montrent differents aspects de la degenerescence: alteration des glomerules
de Malpighi, involution des tubes mesonephretiques qui se retrecissent et se
transforment en cordons pleins, destruction de cellules qui se detachent et
tombent dans la lumiere des tubes.
Des dosages d'azote total effectues par Haffen (1951Z?) ont montre que la
diminution du poids de l'organe entre le 15e et le 21 e jour de l'incubation
s'accompagne d'une perte en matiere azotee. Une 2e etape dans l'etude de la
regression du mesonephros consiste dans l'analyse biochimique de l'activite de
certaines enzymes dans l'organe en croissance et en regression. Ainsi l'activite
de l'hypoxanthine deshydrogenase, enzyme jouant un role important dans la
Regression du mesonephros
399
synthese de l'acide urique, augmente pendant le stade de croissance de l'organe
puis diminue au cours des derniers jours de l'incubation (Chaube, 1962;
Croisille, 1962 a). Effectuant Panalyse immunochimique du rein, Croisille
(1962&) a d'autre part montre la presence d'importantes activites esterasiques
dans les extraits de mesonephros et observe l'apparition entre le 10° et le
12e jour de l'incubation d'une esterase, specifiquement liee au rein, qui disparait
au moment ou le mesonephros entre dans sa phase de regression. Les enzymes
sont alors presentes dans le metanephros.
Junqueira (1952) et Russo-Caia (1962) ont etudie le comportement des
phosphomonoesterases acides et alcalines au cours du developpement du
systeme renal de l'embryon de poulet, au moyen de methodes quantitatives et
histochimiques. Pour la phosphatase acide, les resultats de ces auteurs different
quant a la duree de l'augmentation de l'activite enzymatique. Celle-ci, selon
Russo-Caia (1962) persiste encore pendant la regression du mesonephros, tandis
que Junqueira (1952) la constate seulement durant la croissance et signale une
diminution pendant Finvolution de cet organe. Ces resultats ne permettent pas
de tirer des conclusions precises sur le role de la phosphatase acide dans la
regression du mesonephros, d'autant plus que ces auteurs n'ont pas aborde le
probleme de la solubilisation de cette enzyme. Tout recemment, Tilney (1964)
a mis en evidence a l'aide du microscope electronique la localisation de la
phosphatase acide dans des elements cytoplasmiques du type 'corps denses',
qui apparaissent nombreux au stade de l'eclosion.
Notre travail a pour but de preciser le comportement des hydrolases acides
dans un cas modele d'autolyse cellulaire non liee a Faction des hormones. Nous
nous sommes contentes d'etudier deux enzymes typiques des lysosomes: les
cathepsines et la phosphatase acide, en comparant les activites et l'etat de ces
enzymes dans le mesonephros du 14e jour (croissance) et du 21e jour (regression).
Les etudes biochimiques ont ete completees par des recherches histochimiques
et par des observations faites au microscope electronique.
MATERIEL ET METHODES
(1) Techniques biochimiques
Les embryons de poulet ages de 14 jours (stade de croissance) et 21 jours
(stade de regression) sont disseques dans du liquide de Ringer froid. Les
mesonephros sont preleves et immerges dans du saccharose 0,25 M glace.
Pour chaque experience qui comprend une determination de l'activite des
cathepsines, de la phosphatase acide et de l'azote total, on utilise 2 ou 3 embryons, soit 4 ou 6 mesonephros selon le stade de prelevement de ces organes.
Apres prelevement, on homogeneise les organes avec une solution glacee de
saccharose 0,25 M + versene 10~ 3 M, de facon a obtenir un homogenat de concentration 10%. On determine ensuite par pesee le volume de Phomogenat
ainsi obtenu. Les activites enzymatiques sont rapportees: soit a l'unite d'azote
400
B. SALZGEBER & R. WEBER
total utilisee pour le test (activite specifique) soit a la quantite d'azote total de
l'organe (activite totale).
L'activite des cathepsines est determinee selon la methode colorimetrique
de Duspiva (1939) modifiee par Von Hahn & Herrmann (1962). A 50/^1 de
substrat, contenant 1% de caseine et 36% d'uree, ajuste a pH 5,0 par le
tampon Mcllvaine, on ajoute 10 y\ d'homogenat a 1,25 ou 2,5 %. Apres 2 heures
d'incubation a 37 °C, le melange est precipite par 60 jul d'acide trichloracetique
10% et conserve pendant 12 heures a basse temperature (0-4 °C). Apres centrifugation, 100 {A de surnageant sont recueillis et traites par le reactif de FolinCiocalteu; l'intensite de la couleur est mesuree au spectrophotometre Zeiss
PMQ II a 780 m/*. La concentration de substances 'Folin' positives a ete
determinee parallelement sur des echantillons temoins non incubes. En retranchant ces valeurs temoins des mesures d'extinction d'echantillons incubes, on
obtient la valeur d'extinction qui correspond reellement a l'activite enzymatique
de l'homogenat.
Pour le dosage de la phosphatase acide, nous avons suivi la methode decrite
par Weber & Niehus (1961). 30 fi\ de substrat, contenant 0,028 M de /?-glycerophosphate de sodium dans un tampon acetate a pH 5,0, sont incubes pendant
30min. a 37° avec 30 [A d'homogenat a 0,5 et 1,0% en milieu hypotonique.
Le melange est ensuite precipite avec 60/*1 d'acide trichloracetique a 5%.
Apres centrifugation, on recueille 100 /d du surnageant. Les phosphates liberes
dans le surnageant sont doses d'apres la methode colorimetrique de Kuttner &
Cohen (1927). La mesure des valeurs d'extinction est effectuee a 710 m/i. Des
temoins non incubes ont servi a la determination de la teneur en phosphate libre
dans l'homogenat. Celle-ci sert de correction pour l'obtention des valeurs
d'extinction des echantillons incubes.
Les determinations d'enzymes ont ete realisees dans des conditions telles
que le phenomene de latence soit exclu, soit par l'utilisation d'un milieu hypotonique (phosphatase acide) soit par l'emploi de forte concentration d'uree
provoquant une solubilisation des proteines (cathepsines).
Afin de comparer le degre de solubilisation des enzymes dans les tissus en
croissance et en regression (cf. p. 406) des fractionnements ont ete effectues
dans des conditions iso- et /*y/?otoniques.
L'azote total qui permet d'evaluer la teneur en tissus des homogenats est
dose selon une ultramicromethode de type Kjeldahl mise au point par Boell &
Shen (1954). Quelques dosages d'azote proteinique ont ete effectues selon la
methode de Von Hahn & Herrmann (1962).
(2) Techniques histochimiques
Les organes sont fixes pendant 16 heures a 0 °C dans une solution de formol
a 4 % neutralisee avec CaCO3 en presence de saccharose a 10%. Apres lavage
dans l'eau courante, les pieces sont incluses dans du muscle de Rat et immediatement congelees a l'azote liquide (15 a 20 secondes). Les sections effectuees au
cryostat ( - 1 0 °C) sont recueillies sur lamelles.
Regression du mesonephros
401
Dans le cas de la phosphatase acide, la localisation de l'activite enzymatique
a ete demontree selon les methodes de Burstone (1958) et de Barka &
Anderson (1962).
Le substrat utilise est le naphtol AS-TR-Phosphate. Le naphtol libere par
l'hydrolyse enzymatique est visualise par couplage avec un sel de diazonium
(FastDark Blue RapH 5,2 selon Burstone (1958) ou rhexazonium pararosaniline
a pH 5,0 (Barka & Anderson, 1962).
Les esterases non specifiques sont mises en evidence selon la methode de
Holt (1958) avec l'o-acetyl-5-bromoindoxyle a pH 7,0 comme substrat.
(3) Etudes au microscope electronique
Des fragments de mesonephros, stades de croissance (12 jours) et stades de
regression (21 jours, 2e et 7e jour apres l'eclosion) sont fixes a l'acide osmique
1 % dans le tampon de Michaelis a pH 7,2 et en presence de 10 % de saccharose.
Apres deshydratation par l'acetone, les tissus sont inclus soit dans PAraldite, le
Vestopal W ou le Durcupan AMC. Les pieces sont coupees a l'aide d'un
ultramicrotome Porter-Blum. Les coupes sont colorees par une solution de
citrate de Pb (Reynolds, 1963) et observees au microscope electronique Siemens
Elmiskop I.
Les lieux d'activite de la phosphatase acide sont mis en evidence a l'aide de la
methode de Miller (1962) utilisant la technique de Gomori.
RESULTATS
(A) Evolution de Vazote total
Les recherches confirment les travaux de Haffen (19516) et montrent que
l'involution du tissu se manifeste par une perte considerable de la substance
azotee (Tableau 1). Les pourcentages de perte de poids frais et d'azote total entre
le 14e et le 21 e jour de l'incubation sont semblables et atteignent respectivement
58,6% et 62,2%.
\
Tableau 1. Perte en azote total et en poids fra\s dans le mesonephros
*
Poids frais par
mesonephros
(mg)
1
Azote total par
mesonephros
Stades
(x±sz)
N
(x±sz)
N
14 j .
21 j .
Perte en % du 14e
au 21ejour
12,7910,65!
5,310,36!
58,6%
10
10
—
228,2± 10,13
86,13 ±7,90
62,2%
8
8
—
Valeurs approximatives (liquide adherent).
x = moyenne, s^ = erreur standard de la moyenne, N = nombre de determinations.
402
B. SALZGEBER & R. WEBER
L'azote proteinique represente 74% de l'azote total a 14 jours et 7 1 % de
l'azote a 21 jours (Tableau 2). II est interessant de constater que la proportion
d'azote proteinique reste pratiquement inchangee entre le 14e et le 21° jour.
La perte d'azote proteinique durant cette periode est sensiblement egale a la
perte d'azote total. Ces dosages effectues sur des organes entiers (les mesonephros droits etant utilises pour les mesures d'azote total, les mesonephros
gauches pour les mesures d'azote proteinique) ont donne 63,3% dans le cas
de l'azote total et 64,7% dans le cas de l'azote proteinique. Par consequent
l'azote total peut etre considere comme valeur representative pour le tissu des
stades de croissance et d'involution.
Tableau 2. Relation entre Vazote total et Vazote proteinique dans
le mesonephros en croissance et en regression
Azote total par
mesonephros
(pig)
Stades
14 j .
21 j .
Perte en % du 14e
au 21ejour
254,5 ±7,03
93,3 ±28,8
63,3%
Azote
proteinique
G"g)
(x±sd
N
A. proteinique
Azote total
188,1 ±8,98
66,15 ±21,6
64,7%
3
3
74%
71%
00%
Pour legendes voir Tableau 1.
(B) Etude des activites enzymatiques, cathepsine et phosphatase acide,
au cows de la croissance et de la regression du mesonephros
(1) Activites enzymatiques specifiques et activites totales
Les resultats consignee dans les Tableaux 3 et 4 montrent des differences
nettes dans revolution des activites specifiques de la phosphatase acide et des
cathepsines au cours des phenomenes de regression.
Dans le cas des cathepsines, les activites specifiques sont presque identiques
aux deux stades de croissance et de regression. Au stade de 14 jours, cette
activite specifique exprimee en fig caseine decomposed par heure par /ig
d'azote total est de 5,36, et a 21 jours, elle est de 6,40. Deux jours apres la
naissance, elle est de 7,47. L'activite totale ou absolue par organe diminue
parallelement a la perte d'azote total. De 1202,8 au stade de 14 jours, l'activite
totale (absolue) exprimee en fig de caseine decomposed par heure passe a 509,3
au stade de 21 jours, soit une diminution de 57,6%.
A l'inverse, l'activite specifique de la phosphatase acide augmente et atteint
au 21 e jour le double de sa valeur initiale; de 9,98 a 14 jours, elle est de 21,4
a 21 jours, soit une augmentation de 114,4%. L'activite totale ou absolue est un
peu plus faible a 21 jours qu'a 14 jours (diminution: 24,7%).
403
Regression du mesonephros
Tableau 3. Activites des cathepsines et de la phosphatase acide dans
le mesonephros en croissance (14e jour)
Cathepsines
Phosphatase acide
A
' A t' V
specifique
Exp. no.
5
6
8
9
13
14
18
7
20
22
X
Azote total
(/tg/mesonephros)
Og
caseine/h/
figTN)
216,3
255,8
173,7
231,4
239,7
211,7
296,1
217,0
214,3
226,0
228,2
±10,12
Activite
Activite
Activite
specifique
totale
totale
(/*g caseine/h/ (10- 3 /*mol (10- 3 /tmol P/h/
mesonephros) P/h//tgTN) mesonephros)
6,48
4,07
5,94
—
—
3,78
4,89
3,42
7,68
6,69
5,368
± 0,548
1400,8
1042,1
1030,0
—
—
800,0
1449,1
742,1
1646,4
1511,9
1202,8
±121,4
12,54
8,89
—
12,59
8,30
10,15
11,49
9,14
6,19
10,57
9,984
± 0,698
2711,9
2273,7
—
2913,4
1988,5
2148,5
3402,7
1984,1
1326,8
2388,1
2348,63
±201,24
Pour legendes voir Tableau 1.
Tableau 4. Activites des cathepsines et de la phosphatase acide dans
le mesonephros en regression
Cathepsines
Activite
specifique
(/tg
Azote total
(/ig/meso- caseine/h/
fig TN)
Exp. no. nephros)
4
10
11
15
16
12
21
24
X
sx
17
25
X
99,1
95,5
76,2
80,8
111,2
112,6
62,5
51,1
86,13
±7,903
41,4
51,6
46,5
5,28
6,13
6,94
5,23
4,12
3,97
9,20
10,38
6,406
±0,800
7,33
7,62
7,475
Phosphatase acide
Activite
Activite
Activite
totale
totale (ftg
caseine/h/ specifique (10- 3 /tmol
mesone- (10- 3 /tmol P/h/mesonephros)
P/h//tg TN)
phros)
523,3
588,8
528,6
422,3
458,4
447,3
575,0
530,9
509,3
±21,44
303,3
393,3
348,3
16,06
21,23
27,98
20,34
17,82
16,85
23,13
27,78
21,40
±1,64
31,48
19,66
25,57
Pour legendes voir Tableau 1.
1591,5"
2027,8
2131,9
1642,9
1981,7
1897,9
1445,9
1420,3
1767,5
±97,6.
1303,2]
1014,7 \
1158,95]
Stades
21 e jour
(eclosion)
Poussin
2 e jour
404
B. SALZGEBER & R. WEBER
II ressort de Fensemble de ces experiences, que seule l'activite specifique de la
phosphatase acide augmente dans l'organe en regression, l'activite des cathepsines etant peu modifiee. Mais dans les deux cas, l'activite totale par organe
diminue pendant la regression.
30 r-
25
z
21 jours
20
m
O
'3
«J
15
x:
a
o
14 jours
10
I
I
I
I
I
I
I
I
10
12
Cathepsines (jig caseine/h//*g TN)
Fig. 1. Correlation entre les activites specifiques de la phosphatase acide et des
cathepsines, determinees simultanement sur des homogenats de mesonephros du
14e et 21e jour d'incubation.
En etudiant la correlation entre les activites specifiques des cathepsines d'une
part et de la phosphatase acide d'autre part, on observe une difference marquee
entre les stades de croissance et de regression. La figure 1 montre qu'il existe
une correlation positive entre les deux enzymes et que l'activite de la phosphatase
acide est proportionnellement plus elevee dans les stades de regression. Cependant l'analyse statistique des coefficients de correlation revele que la difference
entre les stades de croissance et de regression n'est pas significative; dans les
deux cas, l'augmentation de l'activite specifique de la phosphatase acide par
rapport a celle des cathepsines est semblable.
Etant donne l'importance du phenomene de latence d'activite dans le dosage
Regression
du mesonephros
405
des hydrolases acides (de Duve, 1958), nous avons compare les activites de ces
enzymes dans des echantillons prepares a partir du meme homogenat, dans des
conditions iso- et /*y/?otoniques. Afin de provoquer la rupture complete des
granules cytoplasmiques, l'echantillon hypotonique a ete preincube a 37 °C
pendant 2 heures avant l'essai enzymatique. La figure 2 montre que, dans le cas
•1,4 r-
Hypotonique
1.2
1.0
.£ 0.8
6
o
5? 0,6
Isotonique
—O
0,4
0,2
0,0
8
12
16
20
24
28
yff-Glycerophosphate 10~3M
Fig. 2. Activites de la phosphatase acide des homogenats prepares en milieu
/sotonique (0,25 M saccharose+10~3M versene) et hypotonique (0,06 M saccharose+
10~3M versene). Le traitement hypotonique provoque, non seulement, une activation
considerable de l'enzyme mais parait aussi influencer la reaction enzymatique, car
la concentration de saturation pour le substrat est plus elevee pour l'homogenat
/ry/ratonique.
0,2
Hypotonique
0,1
0,0
0,0
0,25
0,5
0,75
1.0
Concentration caseine %
Fig. 3. Activites des cathepsines d'homogenats prepares en milieu wotonique et
/isotonique. Le traitement Ziy/ratonique ne provoque pas d'activation, et n'influence
pas la reaction enzymatique.
26
JEEM 15
406
B. SALZGEBER & R. WEBER
de la phosphatase acide, le choc osmotique produit un gain important de
l'activite enzymatique. II n'en est pas de meme pour les cathepsines (Fig. 3).
II est probable que la teneur en uree (18 %) du melange de reaction suffise pour
solubiliser les enzymes lies dans l'essai zsotonique.
(2) Le probleme de la solubilisation des hydrolases acides dans le mesonephros en
regression
Afin de comparer la proportion d'enzymes lies et solubles aux stades de
croissance et d'involution, nous avons soumis deux echantillons prepares par
dilution d'un homogenat concentre a un fractionnement rapide, l'un en milieu
wotonique (0,25 M saccharose + 10~ 3 M versene) et l'autre en milieu /ry/wtonique
(0,06M saccharose + 10~ 3 M versene). Ce dernier est preincube pendant 2 heures
a 37°. Par centrifugation a 18'000 x g pendant 5 min. on obtient un surnageant
transparent qui contient les enzymes a l'etat soluble et un culot dans lequel on
Recuperation
100
des fractions
.55 50
Fractionnement:
U Isotonique
|
14 j
Phosphatase acide
Hypotonique
21 j
Cathepsines
Fig. 4. La solubilisation de la phosphatase acide et des cathepsines dans des
homogenats de mesonephros en croissance et en degenerescence. Le graphique
montre le pourcentage d'activite soluble par rapport a l'homogenat total (=100 %).
Les traits horizontaux indiquent la somme des activites liees et solubles par rapport
a l'homogenat total d'un essai.
recupere les elements structuraux. Ceux-ci sont remis en suspension au volume
original de l'echantillon dans le milieu correspondant. Les determinations
enzymatiques ont ete effectuees parallelement sur l'homogenat total, le surnageant (activite soluble) et le culot (activite liee). Afin d'eliminer tout phenomene
de latence dans les dosages de la phosphatase acide, l'homogenat total et les
fractions ont ete prealablement dilues pour assurer ainsi dans tous les echantillons les memes conditions de tonicite (0,06 M saccharose + 10~ 3 M versene) et
des concentrations correspondantes d'enzyme. Cette mesure est indispensable
pour obtenir une recuperation satisfaisante des fractions par rapport a 1'homo-
Regression du mesonephros
407
genat total. La figure 4 represente les pourcentages des activites solubles par
rapport aux homogenats non-fractionnes pour des stades de croissance (14e
jour) et de regression (21e jour). Dans les conditions wotoniques, on constate
que la proportion d'enzymes solubles au 14e jour est identique pour les cathepsines et la phosphatase acide. La proportion d'enzymes solubles augmente
tres nettement durant la regression (21e jour). L'augmentation atteint 28,4%
dans le cas des cathepsines et 44 % pour la phosphatase acide.
Les resultats des fractionnements realises dans des conditions /*y/?otoniques
montrent que la solubilisation des enzymes est tres importante au stade de
croissance; par rapport aux essais fcotoniques. le pourcentage d'activites
solubles augmente de 43 % pour les cathepsines, et de 71 % pour la phosphatase
acide. A l'inverse, cet effet de solubilisation—provoque par choc osmotique—
n'est pas visible aux stades de regression. II convient de souligner que la
recuperation des activites relatives des fractions solubles et liees montre
tres peu d'ecart, soit 82,5-109,5 % des valeurs determinees sur les homogenats
non-fractionnes ( = 100%).
L'ensemble de ces resultats, corroborant ceux de Scheib-Pfleger et Wattiaux
(1962) pour les canaux de Miiller de l'embryon de poulet, demontrent clairement
que dans le mesonephros une liberation et une solubilisation des hydrolases
acides doivent inter venir au cours de la regression de cet organe. Le fait que le
traitement hypotonique n'augmente guere la proportion d'enzymes solubles
dans le cas des organes en regression, pourrait indiquer que les enzymes en
question sont deja entierement solubilisees. II reste a expliquer la diminution
d'activite soluble des cathepsines dans l'essai hypotoniqus du 21 e jour. Celle-ci
pourrait etre due a des phenomenes de readsorption des cathepsines solubles
lors de la preincubation /lypotonique. Dans tous les cas, une inactivation des
enzymes est peu vraisemblable, car la recuperation des fractions atteint la
valeur de l'homogenat non fractionne.
(C) Distribution de la phosphatase acide et des esterases dans le mesonephros
Le mesonephros etant compose de differents elements cellulaires, on pouvait
se demander quelle partie du tissu etait responsable des changements observes
dans l'activite des hydrolases acides. Selon Stampfli (1950) et Romanoff (1960),
le canal mesonephretique comprend 4 segments:
(1) Le segment principal, proximal ou secreteur, a bordure en brosse, communique avec la cavite glomerulaire.
(2) Le segment intermediate, tres court, relie le segment proximal au segment
moyen.
(3) Le segment moyen ou distal.
(4) Le segment collecteur ou excreteur qui debouche dans le canal de Wolff.
Les techniques histochimiques appliquees aux coupes de tissus faites au
cryostat ne permettent pas de distinguer nettement ces differentes structures.
Aussi nos observations ont-elles porte essentiellement sur les glomerules, les
26-2
408
B. SALZGEBER & R. WEBER
tubes proximaux reconnaissables a leurs cellules hautes et cylindriques pourvues
d'une bordure en brosse, et les tubes distaux, a cellules moins hautes depourvues
de bordure en brosse.
(1) La phosphatase acide (Planches 1 et 2)
Au 14e jour de l'incubation, les cellules du canal secreteur sont hautes et
cylindriques, les reactions enzymatiques y sont intenses. Les granulations sont
visibles dans toute la cellule mais c'est du cote apical, cote bordure en brosse,
que la localisation des granulations est la plus intense (Planche 1, figs. A, B;
Planche 2, fig. B). Le tissu conjonctif et le glomerule contiennent egalement quelques cellules a reaction positive, mais celle-ci reste tres discrete
(Planche 1, fig. A; Planche 2, fig. A). Signalons encore que des cellules en
degenerescence qui se trouvent dans la lumiere des tubes secreteurs du mesonephros au terme de la croissance ne montrent pas de reaction phosphatasique
(Planche 2, fig. B.)
Des essais de localisation a l'aide de la methode de Barka & Anderson (1962)
montrent une reaction intense, liee a des granulations assez volumineuses dans
les tubes secreteurs (Planche 2, fig. C) du mesonephros de 14 jours. Cette
derniere observation laisse entrevoir une difference dans la localisation intracellulaire de la phosphatase acide entre la methode de Burstone (1958) et celle
de Barka & Anderson (1962), bien que, dans les deux cas, on ait utilise le meme
substrat. La cause de cette difference meriterait une etude plus approfondie, car
Novikoff (1963) a, lui aussi, constate des resultats differents entre la methode
de Gomori et celle de Barka & Anderson (1962) pour la localisation de la
phosphatase acide.
A 21 jours, les canalicules sont petits et la lumiere des tubes s'est retrecie.
Dans les cellules des canaux secreteurs, on observe toujours une reaction
intense (Planche 1, figs. A, B) mais la distribution intracellulaire de la phosphatase acide ne revele aucun changement significatif par rapport au stade de
croissance. Quelques grains volumineux sont visibles, soit dans la zone
basale, soit dans la region apicale de la cellule. Le tissu conjonctif s'est modifie.
Plus developpe et plus dense qu'au stade de 14 jours, il contient en outre des
PLANCHE 1
Localisation de la phosphatase acide dans le mesonephros de l'embryon de poulet. Methode
de Burstone (1958) utilisant le substrat Naphtol AS-TR-Phosphate.
Fig. A. Mesonephros en croissance (14e jour). Tres forte localisation dans les cellules des
canaux secreteurs (CS).
Fig. B. Un canal secreteur (meme stade que A) avec des granulations visibles dans l'ensemble
des cellules, mais plus nombreuses du cote apical des cellules (^).
Fig. C. Mesonephros en regression (21e jour). Localisation intense du cote apical des cellules,
et presence de quelques grosses granulations du cote de la membrane basale. Dans le tissu
conjonctif, on apercoit de gros amas a reaction phosphatase acide positive ( j ) .
Fig. D. Canalicule secreteur en regression, avec des depots d'activite phosphatasique.
J. Embryo/, exp. Morph., Vol. 15, Part 3
B. SALZGEBER & R. WEBER
PLANCHE 1
facing p. 408
J. Embryo/, exp. Morph., Vol. J5, Part 3
B. SALZGEBER & R. WEBER
PLANCHE 2
facing p. 409
Regression du mesonephros
409
inclusions volumineuses et nombreuses, signe manifeste de la degenerescence
des tissus (Planche 1, fig. C). La presence de ces elements, vraisemblablement
de type macrophage dans le conjonctif, est un caractere particulier au mesonephros de 21 jours. Notons que les canaux distaux peuvent presenter une legere
reaction positive.
(2) Les esterases non specifiques (Planche 3)
Les enzymes sont localisees dans les cellules des canaux secreteurs a bordure
en brosse, alors que les tubes distaux sont depourvus de toute activite. A14 jours,
on observe des granulations dans l'ensemble de la cellule (Planche 3, figs. A, B);
on les trouve aussi bien dans la zone basale que dans la zone apicale. Quelques
elements de type esterasique sont visibles dans le glomerule.
A 21 jours (Planche 3, figs. C, D), les activites esterasiques sont essentiellement localisees du cote apical des cellules. Dans les canaux, en voie de degenerescence avancee, la densite des granulations dans la cellule diminue.
L'ensemble de ces recherches montrent la presence de phosphatase acide et
d'esterases non specifiques dans les canaux proximaux secreteurs du mesonephros. La localisation des deux enzymes est tres semblable; elle est surtout
intense du cote apical des cellules. Au stade de regression, on peut observer une
intensification de la reaction de la phosphatase acide qui se traduit par 1'apparition de granulations plus volumineuses dans les cellules des canaux et d'elements,
vraisemblablement de type macrophage, dans le tissu conjonctif.
(D) Observations au microscope e'lectronique
Les methodes histochimiques ayant revele une localisation semblable des
esterases et de la phosphatase acide dans les segments proximaux du mesonephros, nous avons decide de suivre les transformations ultrastmcturales dans
les cellules en voie de degenerescence. Une etude detaillee sur revolution du
mesonephros durant la vie embryonnnaire du poulet est en cours (par D.
Cuminge). Ces recherches complementaires devraient nous fournir des renseignements plus precis sur les caracteres morphologiques des organites qui contiennent les hydrolases acides.
PLANCHE 2
Localisation differentielle de la phosphatase acide dans le mesonephros du 14e jour.
Methode deBurstone (1958) en A et B; et methode de Barka & Anderson (1962) en C et D.
Fig. A. La reaction varie selon les structures. Dans les cellules du canal secreteur, les granules
positifs sont plus nombreux dans la region apicale des cellules. On note une faible reaction
dans des canaux non secreteurs et dans quelques cellules du glomerule (G).
Fig. B. Fragment du canal secreteur dont la cavite est remplie de paquets de cellules detachees
de l'epithelium tubulaire (\). Ces cellules, bien qu'etant en degenerescence, ne montrent pas
de reaction phosphatasique.
Fig. C. La reaction selon Barka & Anderson (1962) est positive dans les canaux secreteurs (CS),
mais elle parait liee a de plus grandes granulations.
Fig. D. Tube proximal au fort grossissement. Presence de granulations volumineuses.
410
B. SALZGEBER & R. WEBER
(1) Stade de croissance (12e jour)
Les cellules du segment secreteur, hautes et cylindriques a ce stade, sont
riches en mitochondries (Planche 4, fig. A). Celles-ci, allongees, presentent des
cretes typiques. Dans le cytoplasme on apercoit egalement des inclusions rondes,
de taille tres variable, caracterisees par une ultrastructure granuleuse. Vu leur
pouvoir de diffraction pour les electrons, ils se classent parmi les corps denses
('dense bodies'). Du cote apical du noyau, on distingue un appareil de Golgi
bien developpe. La bordure en brosse consiste en villosites fines du cytoplasme
apical; celui-ci contient de nombreuses vacuoles apicales de diametre variable
et a contenu peu dense, des mitochondries, des amas de ribosomes (polysomes?)
et des membranes doubles (ou microtubes) orientees dans l'axe apico-basal de
la cellule (Planche 5).
(2) Stade de regression (2e jour apres l'eclosion)
Au stade de 21 jours, les phenomenes de regression sont caracterises par le retrecissement de la lumiere des tubes, et surtout par une desintegration structurale
de la bordure en brosse, dont les villosites se gonflent et se detachent. Les noyaux
presentent des contours irreguliers, et la proliferation du systeme de Golgi est
tres marquee a ce stade. Les transformations regressives sont encore plus nettes
dans le mesonephros du poussin 2 jours apres l'eclosion (Planche 4, fig. B). Outre
les changements dans les structures cytoplasmiques deja mentionnes, on distingue
differentes inclusions dans les cellules des canaux secreteurs:
(a) des 'corps denses'' d'aspect homogene, pourvus d'une membrane, probablement riches en lipides; ces inclusions sont localisees le plus souventdans
le cytoplasme apical (Planche 6) et parfois associees avec
(b) des'corps denses' typiques, caracterises par une structurefinetres variable
qui consiste en petites vesicules, granules et surtout en structures membraneuses
(Planches 6, 7); il s'agit probablement des vacuoles de digestion intracellulaire,
ou 'autophagic vacuoles' (de Duve, 1963).
PLANCHE 3
Localisation des esterases non specifiques dans le mesonephros de l'embryon de poulet
de 14 jours et de 21 jours. Methode de Holt (1958) utilisant comme substrat l'o-acetyl-4chloro-5-bromoindoxyle.
Fig. A. Mesonephros au terme de la croissance (14e jour). Seuls les canaux secreteurs, a
bordure en brosse (CS) presentent une reaction positive.
Fig. B. Segment proximal. Localisation cytoplasmique, parfois plus intense dans la region
basale des cellules ( | ) .
Fig. C. Mesonephros en regression (21e jour). Intense localisation dans les canaux secreteurs
a bordure en brosse (CS). Les canaux distaux, excreteurs, et les glomerules (G) sont depourvus
de granulations.
Fig. D. Segment secreteur au fort grossissement. Localisation cytoplasmique des granulations,
particulierement nombreuses a la partie apicale des cellules (I).
J. Embryo I. exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE 3
*
B. SALZGEBER & R. WEBER
facing p. 410
/. Embryo!, exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE 4
Cellules du canal secreteur en croissance et en degenerescence. Observations au microscope
electronique.
Fig. A. Stade de croissance (12e jour). Cellules allongees avec bordure en brosse (BB) epaisse,
mitochondries (M) nombreuses et relativement grandes, zone de Golgi (ZG) bien developpee
dans le cytoplasme apical, noyaux (AO plus ou moins ronds, des corps denses (CD) de differente
taille.
Fig. B. Stade de regression (2e jour apres l'eclosion). Cellules retrecies, bordure en brosse
(BB) en degenerescence (\), mitochondries (M) petites et moins nombreuses, des gouttelettes
lipidiques (GL) a contours irreguliers, des corps denses de grande taille et de structure
variable, noyaux ronds ou lobules. (4.500 :1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE 5
Canal secreteur du mesonephros en croissance (12e jour); partie du cytoplasme apical.
Villosites cytoplasmiques formant la bordure en brosse (BB), vacuoles apicales (VA) de
differente taille a contenu peu dense formant une structure reticuleuse, mitochondries (M)
bien developpees, amas de ribosomes ( | ) libres et gouttelettes lipidiques (GL). Filaments
cytoplasmiques (F) ou microtubules. (25.000 :1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE 6
Canal secreteur du mesonephros en regression (2e jour apres l'eclosion); partie du cytoplasme apical. A noter le corps dense (CDM) qui consiste en elements membraneux et qui
est associe avec des corps denses (CDH) a structure homogene; il est localise du cote apical
du noyau (TV). On distingue en outre des mitochondries (M), une zone de Golgi (ZG), des
ribosomes Jibres ou associes avec des membranes formant un reticule endoplasmique (RE).
(25.000:1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
facing p. 411
Regression du mesonephros
411
(c) des vesicules contenant de multiples petits granules denses (0,1 jn) localises
dans la zone apicale ou basale (Planche 8). Certains canaux secreteurs contiennent des gouttelettes lipidiques, a contours irreguliers, dans la partie basale
des cellules epitheliales.
Quelles sont, parmi ces inclusions, celles qui interviennent dans la regression
des canaux du mesonephros? II est difficile de repondre a cette question, car le
rudiment mesonephretique qui subsiste chez le poussin de 21 jours contient
egalement des 'corps denses typiques' de taille considerable. Us sont presents
dans le cytoplasme apical des cellules dont la bordure en brosse s'est transformee
en cils classiques (Planche 9).
(3) Localisation de la phosphatase acide
Les recherches sur la localisation de la phosphatase a l'echelle ultrastructurale,
au moyen de la methode de Miller (1962) ont fourni des resultats demonstrates.
Les seules structures qui, invariablement, aient donne une reaction phosphatasique positive sont les corps denses a structure membraneuse (Planche 10). Dans
ces preparations, les corps denses a structure homogene montrent aussi plus de
contraste, mais celui-ci est du a une impregnation par le plomb, contenu dans le
substrat, car cet effet de coloration aussi est visible chez les temoins, incubes
sans ytf-glycerophosphate.
Nous avons observe, en outre, une reaction phosphatasique positive dans de
petites inclusions cytoplasmiques, ressemblant a des mitochondries transformees
(Planche 11). II pourrait s'agir du debut de la transformation de mitochondries
en corps denses a structure membraneuse, comme nous l'avons deja note lors
des observations precedentes (cf. Planche 7).
CONCLUSIONS
(A) Criteres biochimiques de Vinvolution du mesonephros
Les dosages d'azote ont demontre que l'involution du mesonephros entre le
14e et le 21 e jour de l'incubation est caracterisee par une perte d'azote total de
62 %; celle-ci est pratiquement identique a la perte d'azote proteinique. On peut
done conclure que, dans le mesonephros en regression, iln'y a pas d'accumulation
de substances azotees non proteiniques.
Les recherches enzymatiques ont donne un resultat inattendu en ce qui
concerne l'activite des cathepsines dans le mesonephros en regression. Malgre
une perte de proteine considerable entre le 14e et le 21 e jour, l'activite specifique
des cathepsines reste inchangee; par consequent l'involution de l'organe se
manifeste par une diminution de l'activite totale. A l'inverse, dans le cas de la
phosphatase acide, l'activite specifique atteint le 21 e jour le double de la valeur
du 14e jour, ce qui reflete la perte en proteines de l'organe. Cependant, l'activite
totale a son tour diminue de facon appreciable pendant l'involution du
mesonephros.
412
B. SALZGEBER & R. WEBER
II convient de noter que d'autres cas d'involution spontanee d'organes, tels
les canaux de Miiller de l'embryon de poulet <$ (Scheib-Pfleger & Wattiaux,
1962; Scheib, 1963) et la queue du tetard de Xenopus en metamorphose (Weber,
1957 a, b; Weber & Niehus, 1961; Weber, 19636; Eeckhout, 1964), sont
caracterises par une augmentation plus ou moins marquee de l'activite de ces
enzymes. Les activites totales dans les canaux de Miiller <J sont inferieures a
celles des canaux $, de meme stade. Elles augmentent dans la queue des tetards
malgre l'involution progressive de cet organe larvaire (Weber, 19636; Eeckhout,
1964). La regression du mesonephros est partielle, alors que celle des canaux
de Miiller <J ou de la queue des tetards en metamorphose est complete. En effet,
une partie du mesonephros persiste et se transforme environ 15 jours apres
l'eclosion, en epididyme chez l'embryon <J, en paroophore chez l'embryon $. On
peut admettre qu'une activite proteolytique faible permettrait l'histolyse partielle
de cet organe.
Contrairement aux resultats de Junqueira (1952) et de Russo-Caia (1962)
demontrant une diminution progressive de l'activite de la phosphatase acide
pendant l'involution du mesonephros, nous avons constate une augmentation
significative de l'activite specifique durant cette periode. Russo-Caia (1962)
ayant utilise des homogenats en milieu hypotonique, eau distillee et le /?-glycerophosphate comme substrat, il ne nous parait guere possible d'attribuer la
difference des resultats a des phenomenes de latence de l'enzyme, ou au substrat.
Nous ne pouvons actuellement expliquer cette difference des resultats concernant
la phosphatase acide.
Enfin nos resultats, obtenus apres fractionnement de l'homogenat, mettent
en evidence une notable augmentation du taux d'activite soluble dans le
mesonephros en regression. Le fait que l'activite liee, recuperee dans les mesonephros en croissance, peut etre solubilisee quantitativement par choc osmotique
pourrait indiquer 1'intervention d'un mecanisme de solubilisation au moment de
l'involution du mesonephros. Nos resultats sont en accord avec les observations
de Scheib-Pfleger & Wattiaux (1962) sur les canaux de Miiller de l'embryon de
poulet <J, ou le taux de l'activite soluble des hydrolases acides passe d'une
moyenne de 15% (croissance) a 50% (regression). Ces auteurs en deduisent que
les hydrolases acides confinees dans des granules de type lysosome subissent
une solubilisation au moment de la regression.
Les recherches de Weber (1963 c) et, recemment, celles de Eeckhout (1964) sur
l'atrophie des queues de tetards montrent, cependant, que dans cet organe le
pourcentage d'activite soluble est deja eleve au stade de croissance; l'effet de
solubilisation, par choc osmotique, est par consequent tres peu marque. II convient d'aj outer que la queue des tetards est beaucoup plus resistante au broyage
que les organes de l'embryon de poulet. Actuellement, nous ne savons pas si le
taux d'activite soluble resulte de lesions provoquees par l'homogeneisation du
tissu ou bien s'il s'agit la d'un caractere propre a l'organe intact.
/. Embryol. exp. Morph., Vol. J5, Part 3
PLANCHE7
Evolution des corps denses a structure membraneuse dans le mesonephros en degenerescence
(2C jour apres l'eclosion). Les cellules du canal secreteur montrent de nombreux corps denses
(CDM), dont les plus petits contiennent des membranes doubles ( | ) semblables a celles des
mitochondries (M). Parfois ces inclusions se trouvent a proximite de la zone de Golgi (ZG)
bien developpee, et sont entourees de nombreux ribosomes (R). (15.000 :1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
facing p. 412
/. Embryo/, exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE 8
Canal secreteur du mesonephros en regression (2e jour apres Teclosion). Degenerescence
avancee de la bordure en brosse (BB) et du cytoplasme apical. Inclusions avec de petites
granulations (IG) et un corps dense a contenu membraneux (CDM); les mitochondries (M)
ont une apparence gonflee et les 'cretes' sont moins nombreuses. Dans la zone de Golgi (ZG)
on apercoit de nombreuses petites vesicules ( | ) . (15.000 :1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE 9
Canal secreteur du mesonephros transforme (22 jours apres l'eclosion). Dans la partie
apicale du cytoplasme, la bordure en brosse (BB) est reduite a de petites villosites cytoplasmiques; mais on y trouve un grand nombre de cils (C). Du cote apical des noyaux (N) il y a
de volumineux corps denses a structure membraneuse (CDM), ou des zones de Golgi (ZG)
bien developpees. (13.000 :1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE 10
La localisation de la phosphatase acide dans le mesonephros en regression (2e jour apres
l'eclosion); coupe tangentielle d'un canal secreteur, montrant trois cellules contenant des
corps denses a structure membraneuse {CDM) avec intense reaction phosphatasique ( + = depots de phosphate de plomb). Par contre les corps denses (CDH) a structure homogene sont
depourvus de toute activite enzymatique. /V = noyaux, M = mitochondries. (15.000:1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
facing p. 413
Regression du mesonephros
413
(B) Localisation des hydrolases acides et identification des lysosomes
Bien que la notion biochimique des lysosomes et leur role physiologique
paraissent bien definis, leur equivalent morphologique est loin d'etre etabli de
facon satisfaisante (Novikoff, 1963). Dans la plupart des cas, l'identification des
structures est basee uniquement sur la presence de l'activite phosphatasique
acide, methode particulierement exploitee a l'aide du microscope electronique.
Nos recherches histochimiques portant sur la distribution de la phosphatase
acide et des esterases dans le mesonephros demontrent une localisation identique
des deux enzymes. Seuls les canaux secreteurs a bordure en brosse (segments
proximaux) presentent une reaction positive.
Les preparations histochimiques ne presentent aucune difference nette concernant la quantite ou la distribution de ces enzymes entre les stades de croissance et de regression; la reaction pour ces deux enzymes dans les canaux
secreteurs est intense dans les deux cas. On observe, neanmoins, une augmentation importante de l'activite phosphatasique dans le tissu conjonctif du mesonephros de 21 jours. De grandes cellules, riches en phosphatase acide, apparaissent
entre les canaux mesonephretiques. L'apparition de ces elements, probablement
de type macrophage, pourrait expliquer l'activite plus elevee de la phosphatase
acide observee a ce stade, au moyen de methodes biochimiques. Dans le cas
des canaux de Miiller de l'embryon de poulet <$, Scheib (1964) signale egalement
la presence de cellules riches en phosphatase acide dans le tissu conjonctif qui
entoure les canaux en voie de regression. L'auteur, ayant observe la disparition
des grains d'activite phosphatasique a des stades plus avances de la regression,
en deduit que l'enzyme passe de la forme sedimentable ou liee a la forme soluble,
une interpretation qui est en accord avec les donnees biochimiques.
La microscopie electronique apporte quelques precisions sur les phenomenes
de regression dans le cytoplasme des cellules des canaux secreteurs. Les cellules
retrecissent, des vesicules proliferent dans la zone de Golgi, des corps denses
de taille et de structure variees apparaissent. Seuls les corps denses, de structure
membraneuse, presentent une reaction phosphatase acide positive, et par consequent appartiennent aux structures de type lysosome. La masse cytoplasmique
diminuant dans les cellules en degenerescence, on peut penser que les corps
denses a reaction phosphatasique pourraient etre des vacuoles autophagiques.
En poursuivant ses recherches sur l'involution des canaux de Miiller dans
l'embryon de poulet, Scheib (1965) observe des structures semblables dans
l'epithelium et le tissu conjonctif de ces organes a l'aide du microscope electronique. Selon cet auteur, corps denses et vacuoles autophagiques sont plus
frequents dans les canaux en regression. On peut penser que ces structures sont
fonctionnellement liees a la degenerescence cellulaire.
Ayant aborde le probleme de l'existence des lysosomes dans le mesonephros
en degenerescence, Tilney (1964) observe au microscope electronique des corps
denses a reaction positive pour la phosphatase acide. Ces inclusions cytoplas-
414
B. SALZGEBER & R. WEBER
miques, peu nombreuses dans le mesonephros d'embryons ages de moins de
15 jours (croissance), deviennent abondantes et augmentent de taille au stade
de l'eclosion. L'auteur admet que ces inclusions representent des lysosomes.
L'etude du mesonephros, et d'autres recherches sur la regression des tissus, se
heurtent a la difficulty d'identifier sans equivoque et surtout de suivre revolution
des organites qui contiennent les hydrolases acides. Ainsi, dans le cas du
mesonephros, en utilisant des methodes histochimiques, soit de couplage soit
de Gomori, on observe une reaction tres intense dans de petits granules localises
dans les cellules des canaux secreteurs en croissance ou en regression. A l'echelle
ultrastructurale, une variante de la methode de Gomori revele une reaction de
la phosphatase acide beaucoup plus discrete, localisee dans des inclusions
cytoplasmiques de taille plus grande.
L'evolution des corps denses, qui peut etre considered comme une contribution
importante de la microscopie electronique a la morphologie de l'autolyse
cellulaire, pourrait meme suggerer la neosynthese d'hydrolases acides; ce phenomene parait plus marque dans les cas de regression, ou l'activite phagocytaire
des macrophages est tres importante (Weber, 1963 &, 1964, 1965).
(C) Le mecanisme de la regression du mesonephros
Au cours des dernieres annees, la notion du determinisme de l'autolyse
cellulaire, originellement attribute a la liberation d'enzymes cataboliques (de
Duve, 1958), a ete sensiblement elargie. Dans une recente discussion, de Duve
(1963) propose meme cinq modes de regression tissulaire, admettant, entre
autres possibilites, une lyse initiale de cellules sans intervention notable de
lysosomes, suivie d'une phase heterolytique, caracterisee par l'activation de
macrophages qui debarrassent le tissu des debris cellulaires.
Le fait que la regression du mesonephros se produise sans accumulation
d'enzymes proteolytiques, indiquerait une lyse initiale des canaux mesonephretiques sans intervention appreciable d'enzymes cataboliques. D'autre part,
l'augmentation de la phosphatase acide pourrait indiquer une stimulation de
l'activite phagocytaire des macrophages, laquelle a ete demontree par des
methodes histochimiques. II est evident que l'activite phagocytaire implique la
neosynthese d'enzymes hydrolytiques dans les macrophages. La possibility
d'une neosynthese de telles enzymes lors de la regression des queues de tetards
en metamorphose a ete discutee par Weber (1963b, 1964). Tout recemment, cet
auteur (Weber, 1965) a reussi a demontrer que sous l'influence de l'actinomycine
D, inhibiteur de la phase initiale de la synthese des proteines, la regression de la
queue est considerablement ralentie. Dans ce cas, on constate que l'augmentation de l'activite des cathepsines dans les queues est supprimee. II nous semble
que l'application de cet antibiotique pourrait aider a mieux eclaircir le determinisme biochimique des phenomenes de regression en general.
L'involution des canaux de Miiller de l'embryon de poulet S est sous la
dependance d'hormones (Wolff, 1936; Lutz-Ostertag, 1954; Scheib-Pfleger,
J. Embryo!, exp. Morph., Vol. 15, Part 3
PLANCHE II
Localisation de la phosphatase acide dans le mesonephros en regression (2e jour apres
Peclosion). Inclusions a reaction positive ( + ) de petite taille, ayant des membranes doubles
( I ) semblables aux mitochondries (M). En haut, corps dense a structure membraneuse
(CDM) ne demontrant qu'une faible activite phosphatasique. (30.000:1.)
B. SALZGEBER & R. WEBER
facing p. 414
Regression du mesonephros
415
1955) et la thyroxine declenche l'atrophie des organes larvaires lors de la
metamorphose des tetards (Kendall, 1919), mais dans les deux cas, on ne
connait pas encore le mecanisme d'action de ces hormones sur l'equipement
enzymatique des tissus.
On peut se demander si le mesonephros, qui subit une regression partielle
en se transformant en annexe des gonades, est sous la dependance d'hormones
sexuelles. Stoll & Maraud (1955) etudiant l'action de la testosterone sur le
mesonephros de l'embryon <$ constatent que l'hormone ne modifie pas les
phenomenes d'involution pendant la vie embryonnaire. Apres l'eclosion, elle
freine le processus de regression et favorise la transformation des canalicules
mesonephretiques qui participeront at la morphogenese de l'epididyme. Tilney
(1964), qui a egalement analyse les effets d'hormones sexuelles sur les inclusions
cytoplasmiques, a l'aide du microscope electronique, n'observe aucune augmentation des corps denses dans les canalicules mesonephretiques. On doit
deduire de ces observations que l'involution du mesonephros est determinee
par des facteurs intracellulaires.
RESUME
1. Les activites des cathepsines et de la phosphatase acide, ainsi que le taux
d'azote total, ont ete determines dans des homogenats de mesonephros au stade
de croissance (14 jours) et au stade de regression (21 jours).
2. La perte d'azote total entre le 14e et le 21 e jour de l'incubation s'eleve a
oz / 0 .
3. L'activite specifique des cathepsines, exprimee en fig de caseine decomposee par heure par /ig d'azote total, varie peu entre le stade de croissance
et le stade de regression. L'augmentation de l'activite (19,4%) observee entre
14 et 21 jours, n'est pas significative.
4. L'activite specifique de la phosphatase acide, exprimee en 10~3 JUM de
phosphate liberees par heure par /.ig d'azote total, s'accroit de maniere appreciable au cours de la regression. L'augmentation est de 114,4% entre le 14e et
le 21 e jour de l'incubation.
5. Les activites totales ou absolues des cathepsines et de la phosphatase
acide diminuent pendant la regression de l'organe. Cette perte atteint 57,6%
dans le cas des cathepsines et 24,7 % dans le cas de la phosphatase acide.
6. Les experiences de fractionnement ont en outre montre que les enzymes
etudiees sont solubilisees au moment de la regression de l'organe. La proportion
d'enzymes solubles augmente de 28,4% dans le cas des cathepsines et de 44%
dans le cas de la phosphatase acide.
7. Les etudes histochimiques portant sur la phosphatase acide et les esterases
non specifiques montrent une localisation preferentielle de ces enzymes dans
la region apicale des tubes proximaux ou secreteurs a bordure en brosse. Au
stade de regression, on observe une augmentation de l'intensite de la reaction
phosphatase acide avec apparition de granulations plus volumineuses dans les
416
B. SALZGEBER & R. WEBER
cellules des canaux et d'inclusions vraisemblablement de type macrophage dans
le tissu conjonctif.
8. Les observations au microscope electronique revelent d'importantes modifications dans les cellules des canaux secreteurs en voie de regression: d'une
part, des alterations cytoplasmiques avec degenerescence des mitochondries;
d'autre part, la presence d'inclusions cytoplasmiques parmi lesquelles les corps
denses a structure membraneuse presentent une reaction phosphatase acide
positive.
9. La discussion porte sur le mecanisme de la regression du mesonephros
et ce phenomene d'involution est compare a celui d'autres organes regressant
spontanement pendant la vie embryonnaire ou larvaire.
SUMMARY
The regression of the mesonephros in the chick embryo: a study of acid
phosphatase and cathepsin activity analysed biochemically,
histochemically, and by electron microscopy
1. Cathepsin and acid phosphatase activity and total nitrogen were determined in homogenates of mesonephros during growth (at 14 days) and regression
(at 21 days).
2. The loss of total nitrogen in this period is as much as 62%.
3. Specific cathepsin activity, expressed as /tg casein destroyed per hour
per /ig total nitrogen, does not change much. The increase of 19-4% observed
was not significant.
4. Specific acid phosphatase activity, expressed as 10~3 JU,M phosphate liberated
per hour per /tg of total nitrogen, increases appreciably during regression. The
increase between the 14th and 21st day of incubation is by 114-4%.
5. The absolute levels of cathepsin and acid phosphatase activity are reduced
during mesonephric regression by 57-6 % and 24-7 % respectively.
6. Fractionation showed that these enzymes were solubilized during mesonephric regression. The soluble component increased by 28-4% in the case of
cathepsin and by 44% in the case of acid phosphatase.
7. Histochemical preparations for acid phosphatase and for non-specific
esterases showed that these enzymes were most abundant in the apical part of
the cells of the proximal tubules (secretory region with brush border). During
regression, the intensity of the acid phosphatase reaction increased and large
granules appear in the cells of the tubules, while the connective tissue shows
cells with inclusions which could be macrophages.
8. Electron microscopy revealed important changes in the cells of the
secretory tubules during regression. On the one hand mitochondria degenerate
while on the other hand cytoplasmic inclusions appear, among which are
dense membranous bodies reacting positively for acid phosphatase.
9. Mesonephric regression is compared with that of other larval and embryonic organs and its mechanism is discussed.
Regression du mesonephros
All
Nous adressons nos plus vifs remerciements a Monsieur le Professeur Novikoff qui a bien
voulu nous envoyer les produits chimiques necessaires a la reaction de Barka Anderson.
Ce travail a ete subventionne par le 'Fonds National Suisse' pour la Promotion de la
Recherche Scientifique (Projet No 2546) par le Centre National de la Recherche Scientifique,
Paris (annees 1962-63) et par la 'Fondation de 1' Universite de Berne'.
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WEBER,
(Manuscrit recu le 23 Decembre 1965)
ADDENDUM
Depuis que ce memoire a ete remis a l'editeur, nous avons pris connaissance
d'un travail recent de Russo-Caia & Hassan (1965, Acta Embryol. Morph.
exp. 8, 119-131) sur la solubilisation de la phosphatase acide dans le mesonephros de Pembryon de poulet. Nos observations corroborent celles de ces
auteurs.