Stratégie de criblage de nanoparticules modulant l`activité de la
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PROJET DE THESE : STRATEGIE DE CRIBLAGE DE NANOPARTICULES MODULANT L’ACTIVITE DE LA MICROGLIE IMPLIQUEE DANS LA MALADIE PARKINSON Encadrés par Rémy POUPOT OUAZENE Abdenour PRATESI Federico MASSEMIN Amélie REMERCIEMENTS Nous souhaitons dans un premier temps, remercier Remy POUPOT pour ses nombreux conseils, sa disponibilité et son soutien. Nous remercions également Laurence NIETO pour ses conseils avisés lors des présentations orales. Nous remercions aussi Sophie Pautot pour nous avoir pour nous présenter sa technologie de tissu 3D, élément phare de notre projet. Nous remercions aussi Laurent PAQUEREAU et l’équipe pédagogique pour nous avoir permis d’intégrer ce master. Enfin, nous remercions l’ensemble de la promo, sans qui, ces longues et difficiles journée et soirées passées dans notre antre, n’auraient pas été aussi drôle. RESUME La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente, après la maladie d’Alzheimer. Actuellement, les traitements commercialisés sont efficaces sur les symptômes moteurs mais n’empêchent pas la dégénérescence des neurones dans le cas les plus graves. Il est donc impératif de trouver de nouveaux traitements permettant de sauvegarder les neurones. Cependant, la faible connaissance des causes du développement de la maladie reste un obstacle majeur. Depuis plusieurs années, le système immunitaire est connu pour jouer un rôle prépondérant dans le développement de la maladie de Parkinson. L’un des acteurs primordiaux du système immunitaire est sans aucun doute, la microglie. En effet, elle permet de réguler l’homéostasie du microenvironnement du système nerveux central (SNC) puisqu’il s’agit de la première défense du SNC face à une infection ou à une blessure. Il a été montré que la microglie était capable de s’activer en présence de protéines mal/non repliées ou agrégées comme l’αsynucléine, sécrétée par les neurones en cours de dégénérescence. Dans le cas d’une infection quelconque, la microglie activée subit de nombreux changements qui vont lui permettre de résoudre l’infection. Cependant, dans le cas de la maladie de Parkinson, la microglie s’emballe et ne parvient pas à résoudre l’inflammation : elle sécrète sans cesse des molécules proinflammatoires. Il serait donc intéressant d’établir de nouveaux traitements permettant de moduler la microglie et donc l’immunité. Dans la littérature, il a été décrit que certaines nanoparticules étaient capables de moduler l’immunité via leur fixation sur les récepteurs scavenger présents sur de nombreuses cellules de l’immunité comme les monocytes et la microglie. Notre projet consiste donc à identifier une nanoparticule permettant de diminuer l’activité proinflammatoire de la microglie afin qu’elle puisse résoudre l’inflammation. Pour le mener à bien, nous réaliserons plusieurs criblages sur des modèles plus ou moins complexes afin d’obtenir la nanoparticule la plus efficace. Ces modèles comprennent la culture de lignée de microglie BV-2, la culture de tissus neuronaux en 3D ainsi que le modèle in vivo de rat. TABLE DES MATIERES I. Introduction ............................................................................................................ 11 1. Les maladies neurodégénératives ................................................................... 11 a. La maladie de Parkinson ............................................................................. 11 b. Les thérapies actuelles ................................................................................ 13 2. Rôle de la microglie dans la neuroinflammation ............................................ 13 a. Neuroinflammation ..................................................................................... 13 b. La microglie ................................................................................................ 15 c. La microgliose réactive ............................................................................... 17 Article à l’origine du projet ............................................................................ 19 3. a. Les nanoparticules modulent l’activité des monocytes inflammatoires ..... 19 b. Les IMPs empêchent l’attraction des ФMI vers le cerveau et augmentent la survie dans le modèle de souris d’encéphalite du West Nile Virus ................................. 21 c. Le traitement au PS-IMP réduit les ФMI dans le cerveau et augmente les ФMI dans la rate ............................................................................................................... 21 d. Implication du récepteur MARCO dans l’effet thérapeutique .................... 23 e. Mécanisme thérapeutique des IMPs ........................................................... 25 f. Devenir des MI dans la rate ........................................................................ 25 4. II. Autres types de nanoparticules ....................................................................... 27 Mise en place du projet ...................................................................................... 31 1. Criblage in vitro dans la lignée BV-2 ............................................................. 31 a. Lignée cellulaire BV-2 ................................................................................ 31 b. Test de cytotoxicité ..................................................................................... 33 c. Quantification des facteurs pro-inflammatoires .......................................... 33 2. 3. III. Criblage in vitro sur réseau neuronal 3D ........................................................ 37 a. Principe de la technologie ........................................................................... 37 b. Mise en place du modèle ............................................................................. 37 c. Mesure des paramètres ................................................................................ 39 d. Aspects logistiques ...................................................................................... 41 Criblage in vivo dans le modèle de rat ........................................................... 41 Discussions ......................................................................................................... 47 LISTE DES ABREVIATIONS ATP : Adenosine Tri-Phosphate CPA : Cellules Présentatrices d’Antigène CCR2 : Récepteur au chimiokine a motif C-C IL : Interleukine IMAO-B : Inhibiteur de la Monoamine Oxydase INF-γ : Interféron γ L-Dopa: L-Dopamine LPS: Lipopolsaccharide Lyc6+ : Complexe 6 de l’antigène des lymphocytes MARCO : Récepteur Macrophage associé aux structures collagéneuse MEA : Matrice de MicroElectrode MI : Monocyte Inflammatoire MOG : Myelin OliGodendrocyte NO : Oxygène Nitrique (Monoxyde d’Azote) PAMAM: PolyAMidoAMine PPH: PolyPhosphoHydrazone PS-IMP : Particule de Polystyrène Immuno-Modulatrice PS-NP : Particule neutre de Polystyrène ROS: Espèces Réactives de l’Oxygène SNC: Système Nerveux Central TNF-α : Facteur de Nécrose Tumorale TGF-β : Facteur de Croissance Transformant SIGLEC: Acide Scialique liant les lectines similaires à l’immunoglobuline WNV : Virus du Nil Oriental I. Introduction 1. Les maladies neurodégénératives Les maladies neurodégénératives constituent un groupe de maladies chroniques neurologiques caractérisées par un dysfonctionnement progressif du système nerveux central (SNC). Ce dysfonctionnement est directement lié à la perte de neurones dans des zones spécifiques du cerveau. En fonction de la zone du cerveau et du type de neurones affectés, différentes maladies neurodégénératives peuvent se développer. Dans le cas de la maladie d’Alzheimer, la perte de mémoire et la perte des fonctions cognitives sont très caractéristiques, alors que dans le cas de la maladie de Parkinson, les tremblements involontaires et la perte du contrôle des activités motrices sont les principaux symptômes. Il s’agit de la première et de la seconde maladie neurodégénérative les plus fréquentes, respectivement. En plus de ces deux principales maladies neurodégénératives, il existe aussi, par exemple, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose multiple et la maladie de Huntington. a. La maladie de Parkinson La maladie de Parkinson se manifeste spécifiquement par la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques dans la substance noire du cerveau, qui s’accompagne de perturbations des réseaux neuronaux dans différentes zones du cerveau. De plus, la maladie de Parkinson est une maladie chronique avec une évolution lente et progressive, ce qui rend difficile sa détection à des stades précoces. En effet, les patients restent asymptomatiques jusqu’à ce que 50 à 70% des neurones dopaminergiques soient détruites et que le cerveau ne parvienne plus à compenser cette perte (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale). Par ailleurs, les causes étiologiques de la maladie sont incertaines. Le diagnostic de la maladie de Parkinson repose sur l’identification de trois principaux symptômes moteurs. Il s’agit : - de l’akinésie et de la bradykinésie qui définissent une lenteur dans la mise en place et dans la coordination des mouvements. - de l’hypertonie qui décrit une rigidité excessive des muscles - des tremblements 1 b. Les thérapies actuelles Aujourd’hui, les thérapies mises en place consistent à compenser le déficit en dopamine par un apport exogène en précurseur de la dopamine (L-dopa) ou, par des agonistes de la dopamine qui vont mimer son effet. D’autres médicaments agissent en inhibant les enzymes qui dégradent la dopamine du cerveau comme par exemple, les inhibiteurs de la monoamine oxydase de type B (IMAO-B), dans le but de conserver la dopamine endogène (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale). Ces thérapies ont montré une certaine efficacité chez les patients diagnostiqués précocement mais celles-ci restent limitées chez les patients à un stade avancé. La faible connaissance des causes de la maladie est un obstacle au développement de nouvelles thérapies. De plus, les chances qu’une seule stratégie thérapeutique soit efficace sont réduites, compte tenu de l’implication de nombreux processus cellulaires et de nombreux facteurs extérieurs et génétiques. Par ailleurs, l’absence de modèle animale, reflétant avec précision l’évolution de la maladie, limite les chercheurs dans la compréhension de l’étiologie1. 2. Rôle de la microglie dans la neuroinflammation a. Neuroinflammation Depuis quelques années, de nouveaux mécanismes et de nouvelles cibles ont été identifiés ce qui permettra d’améliorer les traitements et du développer de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson. La neuroinflammation correspondant à l’inflammation du SNC est une caractéristique partagée par de nombreuses maladies neurodégénératives, dont la maladie de Parkinson. Cependant, son implication dans le développement de la maladie reste incertaine. En effet, l’inflammation est nécessaire puisqu’elle constitue la première ligne de défense face à une infection ou à une blessure. Cependant, une neuroinflammation non contrôlée et soutenue peut contribuer à la perte des neurones dans les maladies neurodégénératives et conduire à d’importants dommages non réversibles. De nombreuses cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine (IL)-1β, l’IL-6 et le TNF-α (Facteur de Nécrose Tumorale α) ont été retrouvées surexprimées au niveau du liquide cérébro-spinal et dans le cerveau2. Ces cytokines pro-inflammatoires sont sécrétées entre autres, par la microglie qui est un des acteurs fondamentaux de la neuroinflammation. 2 A B Figure 1 : Sécrétion de facteurs pro-inflammatoires par la microglie activée par l’α-synucléine. Les cellules BV-2 ont été transfectées par un plasmide permettant l’expression de la protéine αsynucléine sous forme de monomère, d’oligomères et de fibrilles Quantification du TNF-α (A) et d’IL-1β (B) par ELISA en présence des trois formes d’α-synucléine à différentes concentrations. Etat au repos Etat activé Figure 2 : Etat de la microglie dans le cerveau humain au cours de son activation. A l’état de repos, la microglie présente un certain nombre de ramifications. Au cours de son activation, elle passe dans un état « ultra-ramifié », qui se décrit par un allongement et une augmentation du nombre de ramifications afin de capter efficacement le signal inflammatoire. Ensuite, ces ramifications vont s’épaissir, puis peu à peu disparaître pour conduire finalement à une forme amiboïde. b. La microglie La microglie a été décrite pour la première fois en 1920 par Pio del Rio Hortega. Il s’agit d’une population de cellules gliales constituée de macrophages résidents du cerveau et de la moelle épinière, qui forme la première défense immunitaire du SNC. A l’état de repos, la microglie est quiescente mais elle n’est pas statique : elle est en constant mouvement3 et ses nombreuses ramifications lui permettent de surveiller le microenvironnement du SNC afin de détecter d’éventuels pathogènes ou dommages tissulaires. En réponse à une infection ou à une blessure, la microglie a la capacité de fixer une grande quantité de molécules comme les cytokines, les chimiokines, les protéines mal/non repliées ou encore l’ATP, grâce à la présence de nombreux récepteurs spécifiques à sa surface. Dans la littérature, il a été montré que l’α-synucléine sécrétée par les neurones dopaminergiques en cours d’apoptose était un facteur important pour l’activation de la microglie. Dans l’article de A. Hoffman et collaborateurs4, les auteurs ont voulu savoir quel était l’impact des différents états d’agrégation de l’α-synucléine (monomère, oligomère et fibrilles) sur la réponse inflammatoire de la lignée de microglie BV-2. Ils ont ainsi montré, que l’α-synucléine sous forme de fibrilles et de monomères induisait l’activation de la microglie, qui se traduit par une forte sécrétion de TNF-α et d’IL-1β, mais pas avec l’α-synucléine sous forme oligomérique. Les auteurs n’ont pas encore élucidé pour quelles raisons certains états d’agrégation étaient mieux internalisées par la microglie et allaient l’activer (Figure 1). Cette liaison ligandrécepteur conduit alors, à son activation. Une fois activée, elle subit alors plusieurs changements afin de répondre rapidement et efficacement à l’inflammation. Au cours de l’activation, les ramifications de la microglie s’allongent afin d’augmenter l’efficacité de détection puis, elle perd peu à peu ses ramifications et passe sous une forme amiboïde5 (Figure 2). Ces changements morphologiques lui permettent d’augmenter ses capacités de migration, de prolifération et de phagocytose4, qui sont essentielles pour l’internalisation et l’élimination des particules ou des cellules endommagées. La microglie agit également comme une cellule présentatrice d’antigène (CPA) puisqu’elle présente les particules internalisées aux cellules de l’immunité du SNC permettant de générer une réponse immunitaire adaptative. 3 Figure 3 : Cycle vicieux de la neuroinflammation dans la maladie de Parkinson. De nombreux facteurs comme des facteurs environnementaux, des protéines mal/non repliées ou encore des protéines agrégées comme l’α-synucléine vont conduire à l’activation de la microglie. En réponse, la microglie secrète de nombreuses cytokines qui iront endommagés les neurones. L’inflammation n’est pas résolue et un cercle vicieux s’installe. L’activation de la microglie se caractérise aussi, par une libération massive de cytokines inflammatoires dans le but de résoudre l’infection. Dans un premier temps, la microglie sécrète des molécules pro-inflammatoires comme l’IL-1β, le facteur TNF-α4, l’interféron γ (INF- γ) ainsi que des espèces réactives à l’oxygène (ROS), et du monoxyde d’azote (NO). L’ensemble de ces molécules va induire le recrutement d’autres cellules de l’immunité au niveau du site de l’inflammation, activer leur prolifération et augmenter la production d’autres cytokines. Lorsque la microglie ne reçoit plus de signaux pro-inflammatoires, elle va entrer dans une phase de résolution de l’inflammation. D’une part, elle va sécréter des cytokines inhibitrices comme le facteur de croissance transformant β (TGF-β) et l’IL-10 afin de diminuer le recrutement et la prolifération des cellules de l’immunité, ainsi que de diminuer la production de NO. D’autre part, la microglie sécrète des facteurs neurotrophiques qui vont protéger et réparer les neurones en stimulant la croissance, la prolifération et la différenciation de ces derniers6. c. La microgliose réactive L’activité de la microglie est vitale pour le bon fonctionnement du SNC puisqu’elle a un effet neuroprotecteur en régulant l’homéostasie du microenvironnement. Cependant, dans des conditions pathologiques comme la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson, la microglie ainsi que les autres cellules de l’immunité ne parviennent pas à résoudre l’inflammation. En effet, compte tenu de l’implication de la microglie dans le développement de la maladie de Parkinson, il a été décrit l’apparition d’un cercle vicieux inflammatoire conduisant à la progression de la maladie,7 (Figure 3). De ce fait, l’activation de la microglie, et donc la neuroinflammation, se prolongent anormalement ce qui se traduit par le processus de microgliose réactive, caractéristique des maladies neurodégénératives. La microgliose réactive conduit à l’exacerbation des dommages neuronaux due à la libération de facteurs proinflammatoires et neurotoxiques. Cependant, à l’heure actuelle, les mécanismes qui déclenchent la microgliose réactive ne sont pas encore bien connus. L’une des hypothèses serait que des composants libérés dans le microenvironnement de la microglie par les neurones en cours de nécrose seraient responsables du déclenchement de la microgliose réactive. Ces composants peuvent être des protéines mal/non repliées ou bien des agrégats protéiques comme l’α-synucléine4. 4 3. Article à l’origine du projet : « Therapeutic Inflammatory Monocyte Modulation Using Immune-Modifying Microparticles » L’ensemble de ces preuves indique que la microglie joue un rôle prépondérant dans le déclenchement et dans le développement de la neuroinflammation dans la maladie de Parkinson. Ainsi, la modulation du système immunitaire dans le SNC pourrait être une stratégie prometteuse afin de traiter cette pathologie. Il a été décrit dans la littérature que certaines nanoparticules avaient un effet immunomodulateur, via leur fixation sur les récepteurs scavenger présents sur de nombreuses cellules de l’immunité comme les monocytes et la microglie8. La microglie est impliquée dans la neuroinflammation, dans le cas de la maladie de Parkinson de manière similaire aux monocytes inflammatoires (ФMI) dans le développement de maladies inflammatoires chroniques d’origine auto-immunes. L’inflammation chronique et non résolue est donc le point commun à ses pathologies. L’article à l’origine de notre projet se nomme « Therapeutic Inflammatory Monocyte Modulation Using Immune-Modifying Microparticles » et traite de l’effet de nanoparticules dans la modulation de l’activité des фMI pour résoudre l’inflammation chroniques d’origine auto-immunes. Différents modèles sont utilisés dans l’article comme le modèle d’encéphalite induite par le virus du Nil Occidental (WNV) qui reproduit l’inflammation d’origine autoimmune. a. Les nanoparticules modulent l’activité des monocytes inflammatoires Les фMI sont des cellules de l’immunité qui jouent un rôle important dans les maladies auto-immunes. Ils présentent à leur surface de nombreux récepteurs comme le récepteur Récepteur à Chimiokine à motif C-C (CCR2) qui est responsable de leur migration vers le site inflammatoire ainsi que le marqueur LyC6+ (chez la souris) et le récepteur macrophage associé aux structures collagéneuse (MARCO). Lors d’une inflammation, les ФIM vont être attirés vers le site inflammatoire où ils se différencient en macrophages et en cellules dendritiques. Malheureusement, il n’existe pas à l’heure actuelle de thérapie efficace permettant de cibler de manière spécifique les ФMI impliqués dans les maladies auto-immunes. Depuis quelques années, de nouvelles thérapies se développent basées sur l’utilisation de nanoparticules. Dans cet article, les auteurs ont utilisé des microparticles appelées PS-IMPs (PolyStyrène Immune- 5 Figure 4: Les PS-IMPs améliorent la survie des souris infectées au WNV en redirigeant les ф MI vers la rate. (A) Survie des souris infectées au WNV traitées au PS-IMP, PS-NP ou au véhicule contrôle. (B) Nombre de macrophages dérivés des фMI dans le cerveau de souris contrôles ou infectées au WNV après traitement au PS-IMP, PS-NP ou au véhicule contrôle. (C) Distribution des PS-IMPs marqués au FITC (vert) dans la rate et le cerveau. (D) Localisation des PS-IMPs dans les cellules de l’immunité provenant de la rate de souris contrôles ou infectées par le WNV par cytométrie en flux Modifying Microparticles) qui vont permettre de moduler l’immunité. Ils ont donc utilisé la capacité d’internalisation des monocytes et des macrophages afin de tester l’effet des PS-IMPs à réduire l’inflammation dans les modèles murins de maladies auto-immunes. a. Les IMPs empêchent l’attraction des ФMI vers le cerveau et augmentent la survie dans le modèle de souris d’encéphalite du West Nile Virus Dans un premier temps, l’effet thérapeutique des PS-IMPs a été mis en évidence dans un modèle de souris d’encéphalite qui reproduit un type de maladie auto-immune. Pour cela, les souris ont été infectées par le West Nile Virus (WNV) et traitées avec du PS-IMPs, du PSNPs (particule neutre) ou avec le véhicule contrôle (PBS). La totalité des souris traitées au véhicule contrôle meurent au bout du 14ème jour après infection. Celles qui ont été traitées au PS-NP (particule neutre) ont une survie de 10% alors que celles qui ont été traitées avec le PSIMPs ont une survie qui se stabilise à 60% (Figure 4A). Au cours de l’étude, l’impact du traitement aux PS-IMPs sur les macrophages dérivés des monocytes a été analysé dans le cerveau puisque les macrophages et les monocytes sont impliqués dans l’inflammation. Les souris contrôles ont reçu une injection de PBS au lieu du WNV et ne développent donc pas d’inflammation. Ainsi, dans les souris infectées par le WNV, le traitement PS-NP réduit le nombre de macrophage dérivés des ФMI de 1,4.106 à 1,0.106 par rapport aux souris WNV traitées au PBS. Le traitement au PS-IMP quant à lui, réduit de moitié le nombre de macrophages dérivés des ФIM par rapport au véhicule dans les souris infectées au WNV (Figure 4B). Ainsi, les PS-IMPs augmentent la survie des souris infectées par le WNV en réduisant le nombre de macrophages dérivés ФMI. b. Le traitement au PS-IMP réduit les ФMI dans le cerveau et augmente les ФMI dans la rate Ensuite, les PS-IMPs ont été marqués au FITC et injectés dans les souris WNV afin de suivre leur localisation dans les différents organes au microscope à fluorescence. Les PS-IMPs marqués au FITC se localisent de manière prédominante dans la rate, un petit peu dans le foie et les poumons mais les particules FITC+ sont absentes du cerveau bien qu’il s’agisse du lieu de l’inflammation (Figure 4C). Dans la rate des souris WNV, la cytométrie en flux révèle quelques cellules B et T IMP+. De plus, le nombre de ФMI IMP+ est 2 à 4 fois plus important par rapport aux autres types cellulaires IMP+ ce qui suggère que les ФMI sont les premières cibles des PS-IMPs (Figure 4D). 6 Figure 5: Le traitement aux PS-IMPs réduit la migration des фMI dans le système nerveux central inflammé des souris. (A) Les фMI sont isolés de la moelle osseuse de souris donneuses contrôles ou WNV, 6 jours après infection puis marqués au PKH26 fluorescent. Ils sont ensuite injectés dans les souris correspondantes, 6 jours après infection, puis suivi d’un traitement au PS-IMP ou PS-NP ou véhicule. (B à E) Les cellules du cerveau (B et C) et la rate (D et E) sont récupérés 24h après et analysées par cytométrie en flux. (B et C) La population de macrophages lo lo SSC /FSC /CD11b+/CD45+ (R1) et PKH26 (R2) est sélectionnée progressivement (B) et dénombrée (C). (C et E) La population de macrophages CD11c-/CD45hi/CD11b+ (R1) et PKH26+ (R2) sont progressivement sélectionnée (D) et dénombrée (E). De plus, les auteurs ont montré que le nombre de ФMI dans la rate est inversement proportionnel au nombre de ФMI dans le système circulatoire après traitement aux PS-IMPs. Ainsi, il est émis l’hypothèse que les PS-IMPs abrogent la migration des ФMI vers les sites inflammés et les redirigent vers la rate. Afin de valider cette hypothèse, la migration des ФMI est suivie après traitement aux PS-IMPs. Pour cela, des monocytes provenant de la moelle osseuse de souris donneuses infectées 6 jours auparavant au WNV, sont marqués au PKH26 (marqueur membranaire) puis transférés dans des souris receveuses infectées 6 jours auparavant par le WNV (Figure 5A). Les souris sont traitées aux PS-IMPs ou avec différents contrôles puis les cellules sont extraites 24h après du cerveau et de la rate. Les cellules CD45+, CD11b+ et PKH26+, correspondantes aux macrophages dérivés des ФMI des cellules donneuses, sont sélectionnées en cytométrie en flux (Figure5B-E). Les résultats observés montrent que le traitement au PS-IMPs induit une forte diminution du nombre de ФMI dans le site inflammé et une augmentation du nombre de ФMI dans la rate. Ainsi, les PS-IMPs abrogent la migration de MI vers le site inflammé et les redirigent vers la rate. c. Implication du récepteur MARCO dans l’effet thérapeutique Dans la littérature, il est décrit que la rate est un organe essentiel pour l’élimination de microparticules chargées négativement via le récepteur scavenger MARCO exprimés notamment à la surface des monocytes, des macrophages et des cellules dendritiques. Afin de vérifier si les PS-IMPs sont pris en charge par ces derniers, une expérience d’immunohistochimie (Figure 6A) est réalisée. Les PS-IMPs marqué au FITC co-localisent de manière prédominante avec les cellules exprimant le récepteur MARCO. Par la suite, l’implication du récepteur MARCO dans l’effet thérapeutique des PS-IMPs est vérifiée dans un modèle de péritonite en utilisant des souris MARCO déficientes traitées ou non au le PS-IMPs (Figure 6B-C). Les souris MARCO déficientes ne présentent pas de diminution des фMI au niveau du site inflammé après traitement aux PS-IMPs et perdent donc l’effet thérapeutique de ces derniers. Ces données montrent donc que le récepteur MARCO est impliqué dans l’effet thérapeutique des PS-IMPs. 7 Figure 6: Identification et rôle du récepteur impliqué dans la réponse thérapeutique. (A) FITC-PS-IMPs (vert) ou le véhicule sont injectés 6 jours après infection dans les souris WNV ou contrôle. L’expression de MARCO ou SIGLEC sont analysés 24h après, en immunohistologie : DAPI (bleu), MARCO/SIGLEC (rouge). Les triangles blancs indiquent une co-localisation entre le FITC-PS-IMP et MARCO représenté en jaune. (B et C) PS-IMPs ou le véhicule ont été injectés par voie intraveineuse dans les souris de type sauvage (WT) ou MARCO -/-, 24 heures après infection. Les cellules sont ensuite récupérées après lavage péritonéale, puis examinés par cytométrie en flux (B) et le nombre total les macrophages est déterminé (C). d. Mécanisme thérapeutique des IMPs Les auteurs ont ensuite voulu analyser le mécanisme thérapeutique des PS-IMPs. Deux hypothèses peuvent alors se poser : il s’agit soit d’un mécanisme direct impliquant les PS-IMPs et le récepteur MARCO présent sur les monocytes dans la circulation, qui va conduire à la redirection des ФMI vers la rate ; soit il s’agit d’un mécanisme indirect entre les PSIMPs et le récepteur MARCO qui est, cette fois-ci, exprimé sur la membrane des macrophages, présents dans la zone marginale de la rate. Cette liaison déclenche la sécrétion de cytokines qui va attirer et rediriger les ФMI vers la rate. Pour identifier quel est le mécanisme impliqué, la population de macrophages MARCO+ dans la rate est délétée avec un traitement aux liposomes chargés avec du clodronate, dans le modèle murin de péritonite. Les cellules provenant de la rate et du lavage péritonéal sont analysées par cytométrie en flux et les cellules Ly6C+ et CD11b+, correspondant aux monocytes inflammatoires, sont sélectionnées. Les résultats de cette expérience montrent que le traitement aux PS-IMPs induit l’abrogation de la migration des ФMI vers le site inflammé et les redirigent vers la rate où ils vont s’accumuler et ce, même si les macrophages de la zone marginale sont délétés (Figure 7AB). Ces macrophages ne sont donc pas impliqués dans la réponse thérapeutique, ce qui confirme l’hypothèse d’un mécanisme direct impliquant la liaison des PS-IMPs avec le récepteur MARCO exprimé sur les ФMI présents dans la circulation sanguine. e. Devenir des MI dans la rate Après avoir caractérisé le mécanisme thérapeutique des PS-IMPs, les auteurs veulent analyser le devenir des ФMI dans la rate (Figure 7C-D). Ils émettent l’hypothèse que ces cellules entrent en apoptose lorsqu’elles s’accumulent dans la rate. Pour vérifier cela, les cellules de la rate provenant de souris infectées au WNV, traitées ou non au PS-IMPs sont analysées en cytométrie en flux. Les cellules Annexin 5+ et PS-IMPs+ correspondant aux ФMI en apoptose ayant intégré les nanoparticules sont alors sélectionnées. Cette expérience montre qu’après traitement, le nombre de monocytes en apoptose dans la rate augmentent par rapport aux monocytes provenant de la rate de souris traitées au véhicule. Ainsi, la liaison entre les PS-IMPs et les récepteurs MARCO présents sur les ФMI induit un signal provoquant la séquestration de ces ФMI dans la rate et leur apoptose. 8 Figure 7: Etude du mécanisme thérapeutique des PS-IMPs et devenir des фMI dans la rate. (A et B) Macrophages dérivés des ФMI (Ly6C+ et CD11B+) dans le péritoine et de la rate ont été dénombrées en cytométrie en flux. (C et D) Dans le modèle de colite, le nombre des ФMI Annexine V+/ CD11b+/ Ly6Chi /Ly6G- ont été examinés. A B f. Figure 8 : Structure générale des dendrimères. Le nombre de branches dendritiques connectées au cœur central polyvalent est défini par la connectivité du cœur (Nc), et chaque unité de branchement de multiplicité (Nb), caractérise une génération, (G), du dendrimère. Conclusion Dans le cas d’inflammation chronique comme les maladies auto-immunes, les ФMI sont recrutés au niveau du site inflammatoire où ils vont entretenir l’inflammation. Pour enrayer ce processus, les auteurs ont utilisés les PS-IMPs pour moduler l’immunité. Ces derniers sont des nanoparticules chargées négativement qui se lient au récepteur MARCO présent entre autre à la surface des ФMI. Cette liaison spécifique entre MARCO et les PS-IMPs induit la séquestration des ФMI dans la rate suivie de leur apoptose. Ainsi, lors d’une inflammation chronique, le nombre de ФMI présent dans la circulation sanguine diminue, ce qui conduit à une diminution du nombre de ФMI susceptibles d’être recrutés au niveau du site inflammatoire. Au vue de ces résultats, il semblerait que les PS-IMPs améliorent l’état général des souris modèles et constituent une thérapie prometteuse. 4. Autres types de nanoparticules Par ailleurs, d’autres types de nanoparticules sont capables de moduler l’activité des cellules de l’immunité. Parmi ces nanoparticules, on retrouve la famille des dendrimères qui sont des polymères hautement substitués. Ils se caractérisent par une forme globulaire et peuvent porter à leur surface diverses fonctions chimiques. Ils sont composés d’un cœur central, de branches dendritiques ainsi que des groupements de surface. Les points de divergence présents sur les branches dendritiques nous donnent les séries de branche, correspondant au nombre de génération du dendrimère. Leur structure est schématiquement représentée dans la Figure 8 (Institut de physique et chimie des materiaux de Strasbourg). De plus, leur taille augmente proportionnellement au nombre de génération des dendrimères. Ainsi, un dendrimère de première génération mesure de 2 nm à 3 nm et chaque génération supplémentaire augmente sa taille d’environ 1 nm. De plus, la diversité des fonctions greffées à la surface des dendrimères permet de leur conférer une charge soit positive soit négative ou encore neutre. Ainsi les charges négatives des dendrimères permettent une meilleure interaction avec les récepteurs scavenger présents à la surface des monocytes et de la microglie. 9 A B Figure 9 : Effet du dendrimère ABP sur l’expression des marqueurs de l’inflammation. (A) Quantification de cytokines inflammatoires après induction de lymphocyte-T CD4+ par le MOG et traitées ou non par l’ABP. (B) Quantification par RT-qPCR de 9 ARNm codant pour des marqueurs de l’inflammation provenant de monocytes activés par l’ABP. Les résultats qui suivent sont normalisés par l’ARNm de la GAPDH. Parmi les dendrimères ayant un effet immunomodulateur, il existe la famille des Poly(PhosphorHydrazone) (PPH) dans laquelle on retrouve le dendrimère azabisphosphonate (ABP), en cours de tests de précliniques9. Chez le modèle murin de l’encéphalomyélite induite par la Glycoprotéine Myéline Oligodendrocyte, l’ABP a la capacité d’augmenter la production d’IL-10 qui est une cytokine anti-inflammatoire, par les lymphocytes T CD4+. De plus, l’APB diminue la production d’IFNγ et d’IL-17 qui sont des molécules pro-inflammatoires (Figure 9A). Ainsi, l’ABP a permis de ralentir le développement de la maladie et de diminuer les symptômes associés aboutissant à la survie des souris10. Dans un autre article, il a été démontré que l’activation des monocytes humains par l’ABP module l’expression de différents gènes codant pour des cytokines et chimiokines. Ainsi, l’analyse du transcriptome par puce à ADN suivie d’une RT-qPCR a révélé une surexpression des gènes codant pour des molécules anti-inflammatoires et une sous-expression de gènes codant pour des molécules pro-inflammatoires (Figure 9B). Les auteurs de cet article ont analysé l’expression de marqueurs spécifiques de l’activation des monocytes par cytométrie de flux. Les différents résultats observés ont permis d’en déduire que, l’ABP a un effet immunosuppresseur sur les monocytes humains11. Dans l’article de Tang et collaborateurs12, il a été démontré que les dendrimères polyamidoamine (PAMAM) de 5éme génération avec à leur surface le groupement COOH ou OH ont un effet protecteur chez le modèle murin de la pancréatite aiguë induite par la Ceruléine. En effet, ces dendrimères diminuent le nombre de macrophage au niveau des tissus pancréatiques inflammés et diminuent la production de molécules pro-inflammatoires (Figure 10). Nous avons montré au travers des articles précédents, que la microglie est impliquée dans la neuroinflammation et qu’elle joue un rôle clé dans le développement de la maladie de Parkinson. Notre projet consiste donc à reverser le phénotype pro-inflammatoire de la microglie vers un phénotype « anti-inflammatoire » afin de réguler la neuroinflammation et de stopper le processus de microgliose réactive. 10 Figure 10 : Quantification par RT-qPCR des ARNm codant pour différentes cytokines présentes dans le pancréas, après induction de la pancréatite. IL-1β (A), IL-6 (B), TNF-α (C), TGFβR-1 (D) et des cytokines anti-inflammatoires : IL-10 (E) et TGF-β (F) provenant de tissus pancréatique inflammés et traités par du tampon salin, PAMAM (COOH), PAMAM (OH). Nous avons montré que les ФMI peuvent être modulés à l’aide de nanoparticules de différents types. Sachant que les monocytes et la microglie partagent des caractéristiques communes comme les récepteurs scavenger ainsi que leur implication dans l’immunité, notre projet consisterait à appliquer la stratégie utilisée pour moduler les monocytes, à la microglie. Les étapes de notre projet s’appuieroent sur un criblage de différentes nanoparticules candidats comprenant les PAMAM, les PPH, les PS-IMP, les PLGA ainsi que des variantes de ces dernières. Ces variantes se distingueront par leur taille, leur charge et leurs fonctions chimiques portées à leur surface. La variation de taille du dendrimère sera effectuée en jouant sur le nombre de générations de ce dernier. Les charges, seront modulées en fonction des groupements chimiques greffés à la surface des dendrimères. Ces nanoparticules doivent être chargées négativement pour pouvoir être reconnues efficacement par les récepteurs scavenger. II. Mise en place du projet Pour mener à bien notre projet, nous allons réaliser plusieurs criblages pour identifier la nanoparticule présentant la meilleure réponse. La complexité des modèles de criblage sera augmentée au fur et à mesure de la sélection des nanoparticules. 1. Criblage in vitro dans la lignée BV-2 a. Lignée cellulaire BV-2 Pour le premier criblage de notre banque de nanoparticules, nous testerons l’efficacité d’une cinquantaine de nanoparticules candidates in vitro, dans la lignée BV-2 de microglie de souris. Nous réaliserons ce criblage dans un premier temps car il nous permettra de réaliser des expériences simples et rapides sur un grand nombre de nanoparticules. La lignée BV-2 a été dérivée des cellules de la microglie murine, grâce à un virus recombinant exprimant les oncogènes raf et myc avant d’être immortalisées. Il s’agit du modèle le plus fréquemment utilisé pour reproduire la microglie primaire. La lignée BV2 est cultivée dans des flasques de 72 mm2 en utilisant le milieu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec 5% de sérum de bœuf fœtal (FBS) et 1% de peniciline-streptomycine à 37° C et 5% CO213. Le repiquage sera réalisé en moyenne toutes les 48h avant d’arriver à confluence. 11 Figure 11 : Représentation schématique du test de cytotoxicité sur la lignée BV-2. Chaque nanoparticule candidate sera testée en 5 concentrations différentes dans une plaque 96 puits contenant la lignée BV-2. Le taux de cytotoxicité de nanoparticules sera mesuré après comptage de cellules mortes par rapport au contrôle. La flèche rouge indique la concentration maximale de nanoparticule à utiliser qui induit une cytotoxicité inférieure à 10%. Au préalable, il faudra vérifier que la lignée n’a pas dérivé, en mesurant le taux d’expression de la NADPH-oxydase dans la lignée BV-2 puisqu’il s’agit d’une enzyme importante dans le cas de la neuro-dégénération13. b. Test de cytotoxicité Dans un premier temps, il faudra déterminer les concentrations maximales qui présentent la plus faible cytotoxicité pour chaque nanoparticule en utilisant un test de cytotoxicité dans des plaques 96 puits. Nous établirons un seuil de mortalité cellulaire de 10% : les concentrations qui présenteront un seuil de cytotoxicité supérieur à celui déterminé ne seront pas retenues (Figure11). Les nanoparticules présentes dans la banque seront testées à différentes concentrations (ng/mL) en triplicata. Pour cela, une quantité de 5 x 103 cellules par puits sera ensemencées et incubée à 37° C durant la nuit. Pour déterminer la cytotoxicité des nanoparticules candidates, les cellules mortes seront dénombrées au bleu de Trypan sur cellule de Malassez ou sur cellule de Thoma. Un contrôle positif sera mis en place avec des puits traités avec le milieu seul. Une fois la concentration maximale de chaque candidat établi, le premier criblage pourra être réalisé. Il s’agit de mesurer l’efficacité de chaque nanoparticule sur la lignée BV-2 c’est-àdire, de mesurer la capacité de la nanoparticule à donner une réponse biologique. Dans notre cas, l’effet recherché est de diminuer l’activité pro-inflammatoire de la microglie. c. Quantification des facteurs pro-inflammatoires L’activation de la microglie peut être induite par administration de LPS dans le milieu comme décrit dans l’introduction. En effet, le LPS se fixe au TLR4 présent sur la surface de la microglie. La liaison LPS-TLR4 vas induire son activation14. Le traitement sera réalisé dans des plaques 24 puits à une concentration de 105 ȼ/mL et incubées pendant 24h. Après incubation, le milieu sera remplacé par du milieu DMEM (sans sérum) avec du LPS (100 ng/mL) et la nanoparticule à tester (concentration maximale déterminée) pendant 3h. Différentes concentrations de nanoparticules seront aussi testées autour de la concentration maximale. Le surnageant sera ensuite remplacé par du milieu DMEM sans sérum avec du LPS à 100ng/mL pour déclencher une inflammation prolongée durant les 48/72h suivantes. Un contrôle positif devra être réalisé avec du LPS mais sans nanoparticules. Un control négatif en absence de LPS et de nanoparticules sera aussi nécessaire pour normaliser l’expérience (Figure 12)13. 12 Pour mettre en évidence l’effet obtenu par notre banque, différents marqueurs proinflammatoires comme les ROS, le NO ou encore le TNFα peuvent être testés. Chacun de ces tests pourront être réalisés dans des plaques 96 puits avec des méthodes différentes : - pour les ROS, le taux de H2O2 sera mesuré avec du colorant Amplex Red (10 acetyl3,7- dihydroxyphenoxazine) en spectrofluorimetrie. - pour le NO, nous pourrions mesurer son niveau grâce à un test colorimétrique (Griess reagent system). Les données de l’absorbance seront comparées avec des concentrations de nitrite standard. - enfin le taux de TNFα sera mesuré par un test ELISA avec des anticorps monoclonaux spécifiques. Ces mesures nous permettront de déterminer quels sont les candidats capables d’induire un changement d’activité dans la ligné BV-2, c’est-à-dire ceux qui sont capables de diminuer l’activité pro-inflammatoire. Pour confirmer le premier criblage, il pourra être aussi intéressant de mesurer l’activité phagocytaire de la microglie en mesurant la quantité des nanoparticules internalisée par les cellules, en cytométrie en flux ou en microscopie confocal. Pour cela, les nanoparticules de notre banque seront couplées avec des marqueurs comme l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Suite au premier criblage, nous sélectionnerons les 5 meilleurs candidats. Cependant, il est important de noter que la ligné BV-2, dans laquelle le premier criblage sera effectué, ne reproduit pas un modèle de maladie de Parkinson. En effet, elle ne prend pas en considération les autres cellules du SNC impliquées dans la pathologie puisqu’il s’agit d’une population cellulaire unique. C’est également un système de culture cellulaire en 2D qui ne reproduit pas l’environnement natif de la microglie. 13 Figure 12 : Construction du réseau neuronale 3D. 1 – Prélèvement de l’hippocampe d’embryon de rat (embryon à 18 jours); 2- Traitement à la trypsine pour séparer les cellules; 3 – Séparation de la solution contenant les cellules du tissu pour ensemencer en parallèle les billes en verre et la MEA; 4 – Le mélange billes-cellules sera étalé sur la couche cellulaire basale adhérente aux électrodes; 5 – Le mélange billes-cellules sera ensemencé par couches successives pour former la structure 3D; 6 – Les cellules présentes sur la MEA formerons des connexions avec les réseau des cellules sur les billes; 7 – Le réseau 3D connecté aux électrodes de la MEA est prêt pour lancer le criblage. 2. Criblage in vitro sur réseau neuronal 3D a. Principe de la technologie Afin de trouver une solution à ce problème, nous avons trouvé une nouvelle technologie capable de mimer un environnement de tissu neuronal en 3D. Cette stratégie présente des avantages par rapport au modèle in vitro et in vivo chez le rat. En effet, la complexité du réseau neuronal 3D est plus représentative que le modèle in vitro 2D. De plus, cette technique est plus facile et plus rapide à mettre en place que le modèle in vivo. De ce fait, cette technologie est un compromis entre la complexité du réseau neuronal et la simplicité de la mise en œuvre. Notre deuxième criblage sera effectué sur les 5 candidats, obtenus après le criblage sur BV-2, dans le système de tissus 3D in vitro breveté par l’entreprise de biotechnologies SYNAXIS. Il s’agit d’une reconstruction d’un modèle de tissu neuronal à partir de cellules provenant du rat ou de l’humain15. b. Mise en place du modèle Le modèle 3D que nous voudrions utiliser pour notre deuxième criblage s’établit à partir de culture primaire d’hippocampes provenant d’embryons de rat (embryon à jour 18). Il s’agit d’une culture tissulaire complexe où la microglie est présente et nécessaire pour favoriser la culture de neurones sains. Les cellules provenant de l’hippocampe d’embryons de rat sont récupérées puis traitées à la trypsine pour les séparer. Une partie des cellules sera ensemencée (concentration 700ȼ/µL) sur des billes de verre stériles, traitées avec des facteurs d’adhésion comme la Poly L-lysine (PLL) ou la laminine. Le mélange de billes et de cellules sera placé dans un milieu de culture Neurobasal® (2% SVF) et incubé à 37°C pendant 12h. En parallèle, l’autre partie des cellules sera ensemencée sur une plaque de micro-electrode arrays (MEAs), prétraitée avec les mêmes facteurs d’adhésion que précédemment. Cette dernière étape est importante pour former la couche basale, en contact avec les 60 électrodes présentes au fond de la plaque. Celles-ci nous permettrons d’enregistrer l’activité électrique du réseau (Figure 12)15. 14 Figure 13 : Caractérisation de l'activité spontanée des neurones. Activité électrophysiologique d'un réseau neuronal représentatif, en 2D (A) et en 3D (B). En haut, un exemple de données brutes enregistrées pendant 10s avec une microélectrode. En bas, une représentation d’enregistrement des données de l’activité électrique de 300 s. Pour les zones mises en évidence, le cadre vert montre l’activité isolée et courte dans le cas du système 2D. Les cadres bleu et rouge montrent la complexité, l’activité aléatoire et l’intensité de « parole » neuronale dans le cas du système 3D. A la fin du temps d’incubation des deux cultures, le mélange billes-cellules sera étalé sur la couche basale de cellules qui aura adhéré aux électrodes. Cette étape permettra la formation de la structure 3D, capable de soutenir les connexions tridimensionnelles entre les neurones. Après la première semaine de culture, le milieu neurobasal® avec 2% de SVF sera remplacé avec du milieu neurobasal® sans sérum. Ce changement de milieu permet de limiter la division excessive de la microglie et de la répartir uniformément dans le réseau. Après la quatrième semaine, le deuxième criblage des nanoparticules pourra alors commencer. A ce stade, les neurones dans le réseau sont considérés comme matures et leur activité est la plus proche de l’activité physiologique16. c. Mesure des paramètres Pour rappel, ce criblage est mis en place pour tester l’efficacité des nos 5 nanoparticules candidates à l’aide de différents paramètres mesurés dans ce système. Le taux d’activité neuronal qui correspond à la capacité conductrice des signaux électriques entre les neurones est le paramètre le plus important. Cette variable prend en considération la vitesse du signal, son profil (intensité), la distance ainsi que la fréquence de ‘‘parole’’ entre les neurones concernées par la stimulation. Ce paramètre est mesuré grâce aux électrodes présentes sur la MAE qui enregistre les signaux électriques envoyés par les neurones. On pourra mesurer soit le taux d’activité neuronale basale lors d’une communication spontanée, soit le taux d’activité neuronale sous stimulation externe (Figure 13). L’expérimentateur pourra envoyer un signal électrique à une électrode spécifique en contact avec les cellules neuronales présentes dans cette région. Ainsi, plusieurs réponses provenant de différentes électrodes pourront être visualisées, grâce aux connections intercellulaire dans le réseau. L’ensemble de ces mesures permettra de créer une cartographie des connections, présentes dans le modèle sain en 3D, qui servira de contrôle pour les expériences avec les nanoparticules. Une fois la cartographie contrôle établie, nous pourrons alors commencer le criblage des nanoparticules en testant 5 concentrations différentes pour chaque candidat, en triplicata. 15 Comme nous l’avons vu dans l’introduction, l’inflammation prolongée conduit à des dommages neuronaux qui se traduiront par une réponse électrique différente par rapport au contrôle. Ainsi, après induction de l’inflammation avec le LPS, nous testerons l’efficacité de chaque nanoparticule à rétablir un signal électrique similaire au contrôle. L’activité électrique peut également être mesurée de manière indirecte grâce à la concentration calcique (seconds messagers dans les signaux de neurotransmission) dans le milieu et à des colorants voltage-sensibles (voltage-sensitive dyes, VSDs). A l’aide d’un microscope confocal, nous pourrons observer une variation d’intensité du marquage fluorescent du Ca2+ qui représentera la différence de sa concentration dans le milieu17. En plus de l’activité électrique, nous pourrons mesurer la concentration de facteurs proinflammatoires comme le TNF-α, l’IL-1β, les ROS ou encore le NO dans le milieu. d. Aspects logistiques La durée de l’expérience durera 6 semaines et aura un coût total de 56250€ qui comprend 450€ pour chaque plaque MEA (75 plaques en totale) et 300€ pour chaque culture cellulaire d’hippocampe d’embryon de rat (1M ȼ). L’ensemble des expériences sera pris en charge par l’entreprise SYNAXIS. Mais, nous pourrions aussi être formés pour certaines étapes comme par exemple, les analyses d’imagerie au microscope confocal. Par contre, l’analyse des données sera réalisée par l’équipe spécialisée de Sophie Pautot. Suite à l’ensemble de ces expériences, nous choisirons les deux nanoparticules qui présenteront la cartographie la plus proche de celle du contrôle. 3. Criblage in vivo dans le modèle de rat Suite à cette sélection, nous réaliserons un criblage in vivo dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ce modèle nous permettra de mieux évaluer l’efficacité de ces nanoparticules à reverser le phénotype pro-inflammatoire de la microglie. Il existe plusieurs modèles murins reproduisant la neuroinflammation observée dans les pathologies neurodégénératives. Cette neuroinflammation peut-être induite par des toxines telle que la 6-Hydroxydopamine (6-OHDA), le Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) ou encore par le LPS. Cependant chaque modèle murin n’induit pas le même mécanisme de neuroinflammation18. 16 Ainsi, l’induction par le 6-OHDA provoque une activation de la microglie ainsi que son internalisation par les neurones dopaminergiques via le transporteur de la dopamine (DAT). Ceci provoque une mort sélective des neurones ayant internalisés le 6-OHDA par génération de radicaux libre. Pour le modèle de la maladie de Parkinson induit aux MPTP, ce dernier va être métabolisé en 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) qui, à son tour, bloque le complexe 1 de la chaine respiratoire. Ce blocage entraîne la production de ROS, une diminution d’ATP suivi du recrutement des lymphocytes T périphériques au niveau du site inflammé. Une alternative aux deux premières méthodes d’induction de la neuroinflammation est d’utiliser le LPS. Celui-ci induit l’activation de la microglie qui va secréter de l’IL-1β et du TNF-α, qui sont des molécules pro-inflammatoires. De plus, l’injection de LPS dans la substance noire entraîne la mort des neurones dopaminergiques18. Ainsi pour réaliser notre criblage in vivo, nous utiliserons des rats Sprague-Dawley (SD) âgés de 60 jours. Il s’agit de rats les plus couramment utilisés car ils sont faciles à manipuler et dociles. Ces rats seront hébergés dans une animalerie avec de niveau A1 dans des conditions standards. L’eau et la nourriture seront ab libitum et le cycle de 12h de jour et de 12h de nuit sera respecté durant toute la durée de l’expérience. De plus, toutes les expériences seront effectuées dans le respect des directives, émises par le comité éthique de la région où seront menées les expériences19. Il existe plusieurs méthodes d’injection du LPS. La première, consiste à l’injecter directement dans la substance noire riche en neurones dopaminergiques. La deuxième méthode est de réaliser une injection cortico-spinal du LPS, ou alors de l’injecter dans le péritoine20. Notre choix s’est porté sur l’injection de 10 µg de LPS dilué dans 4 µl de solution physiologique, directement dans la substance noire en utilisant un système steréotaxique. Ce système permet l’immobilisation du rat, préalablement anesthésié avec une solution à 10% d’Hydrate de chloral avec une dose de 3ml/kg19. 17 Figure 14 : Schéma récapitulatif de la stratégie de criblage in vivo. Induction au LPS suivi au but de 5 semaine, les rats seront sacrifiés pour analyser ensuite l’état d’activation de la microglie du traitement aux nanoparticules ou du PBS tous les 3 jours pendant 5 semaines. Suite à l’injection du LPS, il faut maintenant choisir le mode d’injection de la nanoparticule pour qu’elle atteigne le cerveau. Il existe 3 modes d’injection : intra-spinal, intraveineuse et intranasale. Pour nos expériences, nous avons choisi d’injecter la nanoparticule en intranasal car il s’agit d’un mode d’injection simple et efficace. Pour réaliser cette injection, il faut utiliser une micropipette afin d’avoir le volume exact du produit à administrer, maintenir la tête de l’animal et approcher l’embout de la pipette d’une narine et enfin, il suffit d’administrer la dose sur la narine et non à l’intérieur, afin de ne pas blesser l’animal 21. La nanoparticule sera injectée par voie intranasale tous les 3 jours. Suite à l’induction au LPS, les rats seront traités au PBS ou bien avec l’une des deux nanoparticules à une concentration ayant était sélectionnée précédemment. Ainsi les rats seront traités aux nanoparticules tous les 3jours pendant 5 semaines (Figure 14). A la fin de la dernière semaine de traitement, les rats seront sacrifiés afin d’estimer la perte des neurones. Pour cela, nous réaliserons une immunohistochimie sur des coupes de cerveau. Nous utiliserons pour cela, des anticorps anti-tyrosine hydroxylase, car il s’agit d’une enzyme présente au niveau des neurones qui atteste de leur viabilité. Nous utiliserons aussi un deuxième anticorps dirigé contre l’antigène F4/80 porté par la microglie. L’utilisation de ces marqueurs nous renseignera sur la morphologie de la microglie et donc nous indiquera son état d’activation20. La distribution des neurones et de la microglie retrouvés chez les rats induits ou non au LPS et traités ou non avec les nanoparticules sera observée par microscopie optique. De plus une extraction des ARN totaux sera effectuée sur les cerveaux des rats précédemment sacrifiés précédemment qui sera suivie d’une reverse transcription et d’une PCR quantitative (RT-qPCR) permettant ainsi, d’estimer le niveau de transcription des différents gènes codants pour des molécules pro-inflammatoire et anti-inflammatoires. Enfin, une quantification des différentes molécules pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β, ROS et NO) antiinflammatoires (IL-10 et TGF-β) sera effectuée sur les mêmes cerveaux, par ELISA. 18 III. Discussions Grâce à cette stratégie de criblages successifs sur des modèles avec une complexité croissante, nous espérons identifier une nanoparticule candidat avec un effet thérapeutique. Cette nanoparticule devra être capable de reverser les phénotype pro-inflammatoire de la microglie. Par la suite, nous souhaitons coupler la nanoparticule à un médicament via une liaison labile pour induire un double effet : -la réversion du phénotype pro-inflammatoire de la microglie via la nanoparticule, -la neuroprotection, palliation des symptômes… via le médicament. Il sera donc possible de créer différentes combinaisons en couplant différents médicaments au nanoparticule candidat. Pour tester l’efficacité de ces dernières, nous pourrons mettre en place un nouveau criblage, mais cette fois sur un modèle de tissue neuronale 3D humain. L’utilisation de ce modèle nous aidera à nous rapprocher des conditions pathologiques retrouvé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. 19 IV. 1. REFERENCES BIBLIOGRAPHIE Aldakheel A, Kalia L V, Lang AE. Pathogenesis-Targeted, Disease-Modifying Therapies in Parkinson Disease. 2013. doi:10.1007/s13311-013-0218-1. 2. Bassani TB, Vital MABF, Rauh LK. 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