Microscopie Multiphotonique In-Situ et Tissus Clarifiés - gdr-Miv
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Microscopie Multiphotonique In-Situ et Tissus Clarifiés Valérie DROUET Thomas GUILBERT Ecole Thématique MiFoBio 2016 Atelier 56 I\ Présentation de la microscopie multiphotonique II\ Microscopie In‐Situ – préparation – acquisition III\ Imagerie d’organes entiers – Clarification IV\ Microscopie Intra‐Vitale Microscopie Multiphotonique Confocale Rejet de la lumière produite hors du point focal • excitation laser continu visible dans tout le volume Limitations : collection des photons ballistiques forte limitation pour l’imagerie des milieux diffusants dégradations biologiques point focal Microscopie Multiphotonique laser SHG TPEF Intérêts : - excitation dans l’infrarouge, peu absorbé, peu diffusé - excitation intrinsèquement localisée au foyer - imagerie en profondeur - deux contrastes complémentaires distincts, TPEF et SHG diffusion non linéaire, cohérent absorption non linéaire, incohérent Génération de Seconde Harmonique (SHG): 2 protéines fibrillaires : processus cohérent de diffusion non linéaire de photons par une molécule non centro-symétrique présentant une organisation non centrosymétrique sensible à l’organisation / orientation des molécules - Collagène : protéine majoritaire du corps humain, fonction de maintien tissus - Myosine : protéine fibrillaire, complexe actine-myosine, contraction musculaire diffusion de seconde harmonique Génération de Seconde Harmonique (SHG): la myosine les collagènes (code couleurs : TPEF - SHG) réponse de la myosine sarc~ 2.5 µm Colocalisation du collagène après immunomarquages → collagènes I et III fibrillaires, pas celui de type IV Guo, 1997 ; Plotnikov, 2006 - dystrophie, myopathie… - propriétés structurales - maladies fibroprolifératives - peau, cornée, foyers cancéreux 10 Complémentarité des contrastes TPEF / SHG hépatocytes et collagène fluorophores endogènes / collagène (élastine, protéoglycanes, NADH) TPEF 50µm SHG merge 60µm Contrastes endogènes complémentaires 20µm actine/myosine (muscle en coupe longitudinale) Odin, Opt. Express, 2008 13 Exemple d’application de pSHM : Reconstruction de champs d’orientations : - image instantanée d’une situation - signature, prédiction - réticulation ISHG(,,r)= U(r)+V(r) cos(2(r)+2) +W(r) cos(4 (r)+4) tendon d’agneau collagène type I champ reconstruit 14 SHG et THG Etude de la fibrose de différents organes, foie, poumon, peau… Elhai et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 113 (27), E3901E3910 Tumeur glande mamaire, signaux endogènes, SHG - collagène, THG – adypocytes, excitation @ 1200nm (MiFoBio 2014) II\ Microscopie In‐Situ – préparation – acquisition ‐ Coupes au vibratome ‐ Système de perfusion pour le Multiphton ‐ Protocole de clarification d’organes II\ Microscopie In‐Situ – préparation LA COUPE AU VIBRATOME LEICA VT1200s - FIXATION DES ECHANTILLON - LE MATERIEL - LES PRODUITS - L’INCLUSION - LA COUPE II\ Microscopie In‐Situ – préparation - LE PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS ET LE FIXATEUR PFA 4% Fournisseur: Dutscher Référence: 11699408 - LE MATERIEL Etuve Micro-ondes Boites diamètre 35mm Boites à puits Petits béchers Eprouvette Pinces Scalpel Lames de rasoir pour vibratome: Fournisseur: Euromedex, Réf: 72000 - LES PRODUITS PBS 1x Alcool 70% Azide Agarose: Fournisseur: SIGMA, Référence: A0701-100g Colle chirurgicale: Fournisseur: Vetbond, Référence: N°1469SB II\ Microscopie In‐Situ – préparation - Préparer l’agarose pour l’inclusion des échantillons Dans un petit bécher, faire un gel à 5% dans PBS 1x (Pour une petite boite de pétrie il faut préparer 10ml) Chauffer quelques secondes à plusieurs reprises (en tout 30 sec.) Mettre à l’étuve à 37° pendant 30mn minimum pour éviter les bulles - L’Inclusion Sécher sur papier sopalin les échantillons, retirer la graisse s’il en reste, Couler l’agarose dans une boite de pétrie, dia 35 mm, Prendre l’échantillon avec une pince et le positionner au fond Puis mettre la boite au frigo (surface plane), pendant 20 mn (Remettre l’agarose à l’étuve entre 2 inclusions car elle se solidifie assez vite) II\ Microscopie In‐Situ – préparation - Démoulage Passer un scalpel entre la boite et le gel pour décoller l’agarose puis découper en cube en laissant une épaisseur autour de l’échantillon pour pouvoir le prendre avec des pinces - Collage Mettre préalablement la cuve du vibratome à -20°C ou +4°C (on y mettra le PBS 1X sortant du frigo) Sur le support, dessiner un carré de colle à l’aide d’un cône et poser le cube échantillon (côté le + épais de l’agarose vers le bas) il est possible de mettre plusieurs échantillons sur la plaque Couper au vibratome le jour même II\ Microscopie In‐Situ – préparation - Les coupes épaisses Récupérer chaque coupe avec une pince sans toucher au tissus (le vibratome peut être mis sur « pause » ) et déposer dans une plaque 6 ou 12 puits contenant du PBS 1X Lorsque les coupes sont terminées, faire descendre le bloc de coupe (bouton down) et retirer l’échantillon inclus dans l’agarose. Vitesse de coupe: « speed » entre 0,30 et 0,40 (à régler en temps réel), 0,2 pour aller + doucement L’amplitude de vibration : « AMPL »entre 0 et 3mm, choisir 1.5mm L’épaisseur de coupe : « step size » 250µm (tourner bouton noir) II\ Microscopie In‐Situ – perfusion Système de perfusion de tranches de tissus frais : imagerie in-situ II\ Microscopie In‐Situ – perfusion 37,4°C 38,3°C Bouteille avec bulleur permettant d’oxygéner le milieu nutritif avec 95%O2 et 5%CO2 (réf PR 23074). II\ Microscopie Multiphotonique In‐Situ – applications Tranche de tumeur humaine, carcinome ovarien : dépôt de cellules endogènes Cellules tumorales – EpCam Lymphocytes T – anti-CD8 Collagène fibrillaire – SHG Localisation, mobilité. Collaboration Emmanuel Donnadieu / Elisa Peranzoni, Institut Cochin – Dynamique des interactions lymphocytaires II\ Microscopie Multiphotonique In‐Situ – applications Tranche de tumeur humaine, carcinome ovarien : dépôt de cellules exogènes, purifiées Cellules tumorales – EpCam Lymphocytes T – anti-CD8 Collagène fibrillaire – SHG Localisation, mobilité, activité calcique (Indo1, Fluo4, Fura 2) Collaboration Emmanuel Donnadieu / Elisa Peranzoni, Institut Cochin – Dynamique des interactions lymphocytaires Lymphocytes B – B220 Lymphocytes T – CD4 + 8 Fibroblastes II\ Microscopie In‐Situ – acquisition soft stiff Tumeurs ovariennes Contrastes endogènes Collaboration Camille Garnier, Institut Curie – U830 Stress et Cancer III\ Imagerie d’organes entiers : Clarification - Imager un organe entier - Respecter la morphologie de l’échantillon - Coupes sériées (chronophage, erreurs de reconstruction logicielle, petits volumes) - Microscopie multiphotonique = 300µm - Modèles transparents (C. Elegans, Zebrafish, Drosophile) - Clearing / Clarification = adapter l’indice de réfraction - Werner Spalteholz utilise du Benzyl Benzoate en 1911 !!! - Utilisation moderne en 2001 (Steinke & Wolf) III\ Imagerie d’organes entiers : Clarification « A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue » Azaripour et al., 2016 Types de tissus Durée BABB Cerveau de souris, embryon, mouche, cœur de rat, poumon, tumeur, rein 8-10j avec marquage Scale Cerveau de souris et embryon 2 sem 3DISCO Glande mammaire de souris, ganglion lymphatique, moelle épinière, poumon, rate, tronc cérébral, cerveau et pancréas 4j ClearT Cerveau de souris et embryon 1j SeeDB Cerveau de souris 3j CLARITY Cerveau de souris, cerveau humain, pancréas, rein, poumon, intestin, foie, moelle épinière 8-22j CUBIC Cerveau de souris 15-19j III\ Imagerie d’organes entiers : Clarification « A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue » Azaripour et al., 2016 Types de tissus Durée BABB Cerveau de souris, embryon, mouche, cœur de rat, poumon, tumeur, rein 8-10j avec marquage Scale Cerveau de souris et embryon 2 sem 3DISCO Glande mammaire de souris, ganglion lymphatique, moelle épinière, poumon, rate, tronc cérébral, cerveau et pancréas 4j ClearT Cerveau de souris et embryon 1j SeeDB Cerveau de souris 3j CLARITY Cerveau de souris, cerveau humain, pancréas, rein, poumon, intestin, foie, moelle épinière 8-22j CUBIC Cerveau de souris 15-19j III\ Imagerie d’organes entiers : Clarification Produits utilisés pour la Méthode BABB Produits utilisés pour La Méthode 3Disco PFA 4% PBS Ethanol Absolu H2O2 Triton x- 100 Tween 20 BABB PFA PBS THF ( Tétrahydrahydrofurane) DCM (DichloroMéthan) DBE (Dibenzyl Ether) Avantages: - Utilisé pour différents tissus - Transparence satisfaisante - L’étape du quenching pour réduire l’autofluo est performante - Remplacement du Méthanol par l’Ethanol Absolu Inconvénients: - Perte des fluorophores endogènes Avantages: Fluorescence endogène mieux préservée 8-10 jours Alanentalo et al., Nature Methods 2007 Inconvénients: Produits très toxiques (CMR) La structure reste intacte mais rétrécissement des tissus 17-18 jours Renier et al., Cell 2014 III\ Imagerie d’organes entiers : Clarification Produits utilisés pour la Méthode BABB Produits utilisés pour La Méthode 3Disco PFA 4% PBS Ethanol Absolu H2O2 Triton x- 100 Tween 20 BABB PFA PBS THF ( Tétrahydrahydrofurane) DCM (DichloroMéthan) DBE (Dibenzyl Ether) Avantages: - Utilisé pour différents tissus - Transparence satisfaisante - L’étape du quenching pour réduire l’autofluo est performante - Remplacement du Méthanol par l’Ethanol Absolu Inconvénients: - Perte des fluorophores endogènes Avantages: Fluorescence endogène mieux préservée 8-10 jours Alanentalo et al., Nature Methods 2007 Inconvénients: Produits très toxiques (CMR) La structure reste intacte mais rétrécissement des tissus 17-18 jours Renier et al., Cell 2014 III\ Clarification : protocole BABB R Rinçage à l’Ethanol Absolu Eth.Abs EthE : DMSO: H2O2 à l’Ethanol Absolu Étapes non réalisées si utilisation d’Ac1R directement couplés DéshydratationDdans l’Ethanol Absolu Chambre via imprimante 3D sur lame en verre alvéolée - Compatibilité des acides avec différents matériaux - Fabriqués en FabLab à très bas coûts Basé sur Renier et al., Cell 2014 Organes frais Rein Organes en cours de traitement Intestin Rein clarifié et marqué avec la Rhodamine Peanut Agglutinin III\ Imagerie d’organes entiers : Applications Clarification BABB : Rein de souris WT Griffonia simplicifolia agglutinin / Peanut Agglutinin (lectines) Collaboration Marco Pontoglio – Institut Cochin - 16 III\ Imagerie d’organes entiers : Applications Clarification BABB : Rein de souris entier MUTANT Griffonia simplicifolia agglutinin / Peanut Agglutinin (lectines) Collaboration Marco Pontoglio – Institut Cochin - 16 III\ Imagerie d’organes entiers : Applications Intestin de souris transparisé IV\ Microscopie Intra‐Vitale : préparation • Imager au sein même du petit animal, éviter les contraintes au maximum, encombrement, mouvements. In-Ovo, embryon de poulet Souris anesthésiée IV\ Microscopie Intra‐Vitale : applications 25°C Microscopie In Ovo d’embryon de poulet. Cellules souches (Tomato) (recalage, correction de drift 2D - StackReg - et 3D - Correct_3D_drift.py) Collaboration Anne Poliard, P5 Fac Dentaire, médecine régénérative 12°C IV\ Microscopie Intra‐Vitale : préparation Signal TTL pour synchroniser l’acquisition (Oscar Pereiras, stage BTS 2016) IV\ Microscopie Intra‐Vitale : applications Calvaria de souris Cellules souches dentaires (tomato) Collagène fibrillaire 3 weeks Collaboration Anne Poliard, P5 Fac Dentaire, médecine régénérative IV\ Microscopie Intra‐Vitale : applications Calvaria de souris Cellules souches dentaires (tomato) Collagène fibrillaire 8 weeks Collaboration Anne Poliard, P5 Fac Dentaire, médecine régénérative Autre exemple d’application : Morphogénèse : Time lapse dev embryon Zebrafish. Membranes cellulaires (eGFP, @ 980 nm) et noyaux (mCherry, @ 1041 nm) (N. Peyriéras) Microscope horizontal LaVision BioTech - MiFoBio 2014 15 Place aux manips… et aux questions ! Références des produits - Ethanol Absolu DMSO (SIGMA: D5879-100ml) H2O2 30% (SIGMA: H1009-100ml) TBST (SIGMA: Sodium Chloride réf: 5586, TritonX-100, TRIS HCL pH 7,4) - Sérum normal de chèvre (Vector: S1000) - BABB (SIGMA: Benzyl alcool réf:305197, Benzoate de Benzyle réf:B6630 II\ Microscopie In‐Situ – perfusion 37,4°C
