Électrophorèse capillaire

Électrophorèse capillaire
CHM 3102
1
Électrophorèse capillaire
† Vue d’ensemble
†
Détecteur
†
†
Tampon
Échantillon
Tampon
†
†
Électrode
Électrode
CHM 3102
Alimentation
électrique
†
†
†
†
†
Séparation basée sur la migration différentielle
des solutés sous l’influence d’un champ
électrique.
Séparation s’effectue dans des tubes de silice
fondue de petit diamètre (25µm to 75 µm id)
Haut voltages (10 to 30 kV) et haut champs
électriques (100 to 500 V/cm) sont appliques
aux extremités du capillaire.
Haute résistance du capillaire limite la
generation de courant et l’effet Joule.
Grande efficacité (N>105 to 106) et rapidité
d’analyse.
Détection “en ligne” (pas de cellule externe).
Petit volume d’injection (1 to 50 nL)
Différents modes de séparation et application.
Séparation en milieu aqueux
Automatisation
2
Électrophorèse capillaire
† Support de séparation – silice
†
†
†
†
†
Matériel le plus utilisé pour les capillaires
Tubes résistants (polyimide) et de petit diamètre
Haute constante diélectrique (isolant)
Haute transmission UV
Faible fluorescence
Gaine de polyimide
(~15 µm)
Diamètre
interne
(25-100 µm)
Diamètre externe
(70-500 µm)
CHM 3102
3
Électrophorèse capillaire
† L’instrumentation
Cartouche
avec capillaire
à °T contrôlée
Compartiment
à °T contrôlée
Détecteur (DAD)
Carrousel
d’échantillon
et de tampons
Agilent HP 3D Capillary
electrophoresis system
CHM 3102
4
Électrophorèse capillaire
† Conversion des unités
1
1
1
1
Joule (J) = 1 kg.m2.s-2
centiPoise (cP) = 10-3 kg. m-1.s-1 = 10-3 Pa.s
psi = 6.8948x103 Pa
Coulomb (C) = 1 J.V-1 = 1 kg.m2.s-2.V-1
CHM 3102
5
Électrophorèse capillaire
† Notions de base – velocité
Détecteur
Ld
Analytes
Tampon
Lt
Champ électrique:
E =
Tampon
dV
=
V
anode
dx
- V
cathode
Lt
Force électromotrice et frictionnelle
Électrode
Électrode
Champ électrique (V/cm)
Alimentation
électrique
qE=fv
Charge
où
Coefficient de
friction
et f = 6 π η ri
Vélocité
(m s-1)
q est la charge électrique possédée par un ion i (C),
E est le champ électrique (V/m),
f est le coefficient de friction (cP m), pour un ion sphérique
η est la viscosité du milieu (cP),
v est la vitesse linéaire de la particule i (cm/s), dans un champ électrique
ri est le rayon hydrodynamique (ionique) de la particule i, (une forme sphérique) (m).
CHM 3102
6
Électrophorèse capillaire
† Notions de base – Mobilité ionique
q⋅E
q
v =
=
⋅E
6πηri
f
Caractéristique physicochimique de l’ion d’intérêt
On définit la mobilité électrophorètique de l’ion comme:
µ =
ep.
Donc:
qi
6πηri
en unités de m2V-1s-1
v ep = µep E
La mobilité électrophorètique, µep, et donc la vitesse électrophorètique, vep,
dépend du milieu: pH et composition du tampon (force ionique, viscosité, etc.).
CHM 3102
7
Électrophorèse capillaire
† Notions de base – séparation
Mélange équimolaire Asp, Gly, et Lys
tampon tris, pH 6.0
Temps
Assigner les différents pics observés et justifier leurs
positions relatives.
CHM 3102
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Électrophorèse capillaire
† Notions de base – électro-osmose
† La silice fondue (SiO2.H2O) possède des groupements silanols
ionisables lui confèrant des propriétés acides
Si
O-
Si
O-
O
pKa ~ 6 (pI ~ 1,5)
≡SiOH
≡SiO-
+
O
H+
Si
O
O
Si
† La silice fondue en contacte avec le tampon formera une
double couche électrique à la paroi du capillaire:
NaOAc + H2O
CHM 3102
Na+ + OAc
-
+ H3O+ + OH-
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Électrophorèse capillaire
† Notions de base – électro-osmose
+
Que se passe t’il suite à
l’application du voltage ?
-
+
+
+
+
+
- +
+
+
+
-
+ +
+ +
+
- ++
+
Silice fondue avec cations
fortement adsorbés
-
- -
+
+
Le potentiel Zeta
correspond au
potentiel associé à
la couche diffuse
CHM 3102
+
-
La migration des cations
solvatés de la couche diffuse
occasionne un déplacement
vers la cathode, lequel est
appellé électro-osmose
+
Solution
Zone diffuse de la double couche
avec une prédominance de cations
Potentiel
(mV)
+
+
couche
diffuse
-
épaisseur de la double
couche électrique
ζ
L’épaisseur de la
couche diffuse est
d’environ 10 nm pour
une force ionique de 1
mM et 0.3 nm à 1 M.
Distance à partir de la
paroi du capillaire (nm)
10
Électrophorèse capillaire
† Notions de base – électro-osmose
Le potentiel zeta associé à la couche
diffuse est obtenue à partir de
l’équation de Helmholtz
4π
ς =
où :
µeo est la mobilité électro-osmotique (m2V-1s-1)
ε est le constant diélectrique du milieu
ζ est le potentiel Zeta (quelques mV)
η est la viscosité du milieu (cP)
η µeo
ε
Donc la mobilité électro-osmotique, µeo, et la
vitesse électro-osmotique, vep sont obtenu par:
v eo
CHM 3102
ες
= µeo E =
E
4π η
11
Électrophorèse capillaire
† Notions de base – les mesures de mobilité
† Le mouvement d’un soluté chargé à travers le capillaire est la
somme des deux phénomènes : électrophorèse et électroosmose.
†On définit la vélocité apparente (vélocité totale) d’un soluté,
vapp , et la mobilité apparente µapp comme:
v app = v ep + v eo
µ app = µep + µeo
( où
µep =
q
6π ηr
et
µeo =
ες
)
4π η
v app = (µep + µeo )E
CHM 3102
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Électrophorèse capillaire
† Notions de base – les mesures de mobilité
Détecteur
Ld
Analytes
v app = (µep + µeo )E
Tampon
Lt
Tampon
v app
Ld
=
tm
et
V
E =
Lt
Électrode
Électrode
CHM 3102
Alimentation
électrique
donc
tm =
Ld
Ld Lt
=
v app (µep + µeo )V
13
Électrophorèse capillaire
† Notions de base –
Caractéristique du débit
électro-osmotique
A
pressure driven
parabolic flow
temps
voltage driven
electroosmotic
A
flow
temps
Le débit électro-osmotique issu de la couche diffuse est uniforme et a un profile
étroit contrairement à celui associé aux systèmes utilisant une pression appliquée
pour éluer les analytes (HPLC). Le débit électro-osmotique ne cause pas un
élargissement significatif de la bande.
CHM 3102
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Électrophorèse capillaire
† Notions de base – l’ordre d’élution
v eo
v ep
Mais aussi:
CHM 3102
v app
++
++
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
v =
q
6πηri
⋅E
15
Électrophorèse capillaire
† Notions de base – calculs de mobilité
(307 s)
(353 s)
(416 s)
Séparation effectuée à 20 kV dans un
capillaire de 60 cm (50 cm au détecteur)
Temps
veo
Quelle est la mobilité electrophorétique de chaque
acide aminé (ordre est le meme que
précédemment?
CHM 3102
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Électrophorèse capillaire
† Notions de base – efficacité et plateau théorique
En chromatographie liquide
H = A +
Diffusion d’Eddy,
chemin multiple
B
+ Cu
u
Résistance au
transfert de masse
En electrophorèse capillaire
L’electro-osmose ne cause pas d’élargissement significatif mais affecte le temps
auquel un ion prendra pour etre detecte. Seul la diffusion longitudinale a un
impact important sur la diffusion des bandes.
CHM 3102
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Électrophorèse capillaire
† Notions de base – efficacité et plateau théorique
coefficient de diffusion (m2s-1)
tm
Ld
=
v app
σ
2
Aussi:
CHM 3102
=
( µ ep
Ld Lt
+ µ eo )V
2 D m Ld Lt
=
( µ ep + µ eo )V
⎛ tm ⎞
⎟⎟
N = 16 × ⎜⎜
⎝ wb ⎠
et
et
σ2 = 2Dm tm
H =
2
N =
σ2
Ld
=
Dm (x10-11 m2s-1)
Glycine
Insulin
Hemoglobin
Catalase
Urease
Tob. mos. virus
106.0
8.2
6.3
4.1
3.5
0.53
2LtDm
µapp.V
Ld
µ app. V
=
H
2Dm
•
Ld
Lt
18
Électrophorèse capillaire
† Notions de base – résolution
R=
2(t mB − t mA )
wB + w A
N
R=
4
CHM 3102
tm =
et
⎛ ∆µep ⎞
⎜
⎟
⎜µ + µ ⎟
eo ⎠
⎝ ep
et
Ld Lt
( µ app . )V
N =
µ
app.
V
2Dm
•
Ld
Lt
19
Électrophorèse capillaire
† Facteurs affectant l’efficacité et sources de
variance
σ2obs.= σdif.2 + σinj.2 + σtemp.2 + σads.2 + σdet.2 + σ∆k2 ...
dif.: Diffusion longitudinale, limite fondamentale déterminée par le coefficient de
diffusion
inj.: Longueur de la bande d’injection doit être moindre que la longueur associée à
la diffusion. Contrainte de sensibilite nécessite bien souvent un compromis.
temp.: Effet Joule et gradient de °T avec augmentation de V
ads.: Interaction de l’analyte avec la paroi du capillaire
det.: Détecteur être relativement petit p/r à la largeur de pic.
∆k:
CHM 3102
Différence de conductivité entre l’analyte et le tampon
20
Électrophorèse capillaire
† Température
Tampon
Silice
Polyimide
°T
Environnement
extérieur
375
390
25
0
25
d (µm)
375
390
r (µm)
25
50
75
100
125
°T (paroi)
∆°T
299.0
301.2
304.2
307.7
311.6
0.53
1.39
3.14
5.58
8.72
HPCE – An introduction
D. Heiger
Les effets d’échauffement peuvent causer un gradient de température non-uniforme, un
changement local de viscosité, et une diffusion de l’analyte. L’augmentation de V peut
avoir des effets néfaste lorsque l’effet Joule (augmentation de °T suite au passage de
courant électrique celle-ci dépendant de la puissance = V.I).
CHM 3102
21
Électrophorèse capillaire
† Volume d’injection
Variance associée a l’injection :
σ2dif. = 2Dm tm
2D
H =
v
∆t max = 24Dmeht m
σinj.2 = (∆tm)2/12
Largeur de la bande
d’injection; doit être < à la
déviation std associée à la
diffusion
∆tmax: Largeur max. acceptable de la bande
eh :
Accroissement acceptable de Hobs.
comparativement a Hmin (dif. seul.)
E.Grushka, R. McCormick, J. Chrom., 471, 421 (1989)
CHM 3102
22
Électrophorèse capillaire
† Volume d’injection
Le nombre de plateau varie
significativement avec le
volume d’injection. La
variance associée à la
diffusion représente la limite
minimale d’élargissement et
Nmax. Celle-ci varie
egalement avec Dm. De
façon pratique on limite la
longueur de la bande
d’injection à ~ 1% de L.
10000000
~5000000
Glycine
insulin
1000000
N
L: 0.7 m
tm: 600 s
~385000
100000
10000
0
0.005
0.01 0.015
0.02 0.025
W/L
CHM 3102
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Électrophorèse capillaire
† Adsorption
La variance associée due l’adsorption à la surface du
capillaire est exprimée par:
σ
2
ads
k ' veoLd ⎛ r 2k '
2 ⎞
⎜
⎟⎟
=
+
2 ⎜
(Ld + k') ⎝ 4Dm Kd ⎠
où:
On voit que qu’une augmentation significative de
σ2ads survient lorsque k’ (tm-teo/teo) augmente et
ce même avec k’<1. La séparation de protéines
avec CE peut devenir problématique a cause de
l’adsorption à la surface. Afin de limiter cette
source d’élargissement de pic on peut diminuer
les charge effective à la surface en augmentant la
force ionique, en diminuant le pH ou en modifiant
la surface du capillaire.
CHM 3102
k’: Facteur de capacité
veo: vélocité électro-osmotique
Dm: Coeff. diffusion
Kd: Const. de dissociation
r: Rayon du capillaire
HPCE – An introduction
D. Heiger
24
Électrophorèse capillaire
† Electrodispersion et différence de conductivité
La différence de conductivite, ∆k entre la zone de l’analyte et celle du
tampon avoisinant est donnée par:
∆k =
CF
µ
σ ∆2k =
CHM 3102
(µB − µ )(µC
− µ)
(µEt ) ⎛ ∆ke ⎞
⎜
⎟
16 ⎝ ke ⎠
2
2
où:
C:
F:
µ:
µB:
Concentration de l’analyte
Constante de Faraday
Mobilité de l’analyte
Mobilité de l’ion de même charge
que l’analyte
µC: Mobilite de l’ion de charge
opposé à l’analyte
ke: Conductivité du tampon
Hjerten, S. Electrophoresis, 11, 665 (1990)
25
Électrophorèse capillaire
† Electrodispersion et différence de conductivité
Échantillon de conductivité
comparable κ ~ κe
Échantillon de faible
conductivité κ < κe
Pour un échantillon de faible
conductivité, l’analyte entrera dans la
region du tampon moins rapidement
car le champ électrique est plus faible.
Pour un échantillon de grande
conductivité, l’analyte entrera dans la
region du tampon plus rapidement car
le champ électrique est plus grand.
Pour minimiser les effects de diffusion
associes aux differences de conductivite
on ajuste le tampon pour avoir ∆ke/ke
<0.5%.
CHM 3102
Échantillon de grande
conductivité κ > κe
µ
+
+
++
++
+
+
++
+
+
+
+ ++
++
++
+
+
+ +
+
+
+
++
++
+
+
+ +
+
Tampon
26