CORRIGÉ DU DS N°5 Thème 1 1A1) En conditions d`hypoxie, la

CORRIGÉ DU DS N°5
Thème 1
1A1) En conditions d’hypoxie, la quantité d’ARNm NOS produits est 2 fois plus grande qu’en conditions
de normoxie.
une faible concentration en O2 active la transcription du gène NOS.
1A2) Principe : l’expression de la luciférase est facilement quantifiable en évaluant la fluorescence.
Si la luciférase est exprimée, cela signifie que la région en amont a activé la transcription.
Sans séquence en amont, l’intensité de la luciférase vaut 1.
Avec 5039 pb amont, l’expression est à peine plus grande : rapport de 1,3.
Avec 5523 ou 6047 pb en amont, l’expression est multipliée par 2,3.
=> La région située entre 5039 et 5523 pb en amont du gène semble impliquée dans l’activation de la
transcription ici de la luciférase, donc de nos in vivo.
1B1) La technique de footprinting permet de localiser la fixation d’une protéine sur une séquence d’ADN.
En effet, la liaison à l’ADN protège celui-ci d’une hydrolyse par l’endonucléase : certains fragments
d’ADN ne seront donc pas visibles sur le gel d’électrophorèse.
Ici, on teste la liaison de HIF1 sur une séquence comprise entre 5515 et 5250 pb en amont du gène nos,
c’est-à-dire dans la région identifiée au 2A2.
Témoin : dans la colonne 1, on observe les fragments de toutes les tailles, générés par la digestion à
l’ADNase1.
Colonne 2 : on remarque une zone du gel sans bande : les fragments de 217 pb à 210 pb
n’apparaissent pas. L’ADNase1 n’a en fait pas pu digérer cette petite zone car la protéine HIF1 s’y est
fixée.
On localise ainsi la séquence TGTACGTG de fixation de HIF1.
1B2) Le retard sur gel est une technique permettant de mettre en évidence la liaison d’une protéine, ici
HIF1, sur un fragment d’ADN, ici l’oligonucléotide contenant la séquence TGTACGTG située dans la
région entre 5000 et 6000 pb en amont du gène nos.
Le gel révèle l’oligonucléotide, car il est radioactif.
colonne 1 = ce témoin montre jusqu’où migre l’oligonucléotide seul.
colonne 2 : en normoxie, l’oligonucléotide migre aussi loin que le témoin : il n’est donc pas retenu par
une protéine nucléaire.
colonne 3 : en hypoxie, l’oligonucléotide migre moins loin, ce qui suggère sa liaison avec une protéine
nucléaire.
colonne 4 : en hypoxie, avec un Ac anti-HIF1, l’oligonucléotide migre encore moins loin : on peut alors
suggérer que sur l’oligonucléotide s’est lié HIF1 (comme dans la colonne 3) sur lequel est fixé
l’anticorps. L’ensemble étant plus lourd migre donc moins. La fine bande conforte notre hypothèse
(oligonucléotide + HIF1).
colonne 5 : un anticorps non spécifique d’HIF1 ne perturbe pas la migration par rapport à la colonne 3 : il
s’agit bien d’HIF1 qui est lié à l’oligonucléotide.
Interprétation : en hypoxie, dans le noyau apparaît la protéine HIF1 qui se lie à la région en amont du
gène nos.
1C) L’histogramme évalue la quantité de protéine HIF1 dans les cellules.
Comme attendu, la protéine HIF1 est absente en normoxie mais abondante (100 unités) en hypoxie.
Etant transcrit, l’absence de protéine HIF1 en normoxie peut résulter :
- soit d’une absence de traduction de l’ARNm en protéine HIF1
- soit d’une destruction ultérieure de HIF1 en cas de normoxie.
Si on tronque la région ODD de HIF1, alors les protéines sont également présentes, en normoxie
comme en hypoxie. Il y a donc bien eu traduction. La deuxième hypothèse est plus recevable.
La séquence ODD ajoutée à la protéine Gal induit une absence de Gal en cas de normoxie. La
séquence ODD est donc responsable de la disparition de Gal.
Interprétation :
En normoxie, les protéines HIF1 présentes sont détruites par un système qui reconnaît spécifiquement
la séquence ODD. En hypoxie, HIF1 persiste. Il y a donc en hypoxie quelque chose qui empêche la
destruction d’HIF1.
SCHEMA BILAN
THÈME 2
2.1 – Le mutant apetala2 (sans protéine AP2) présente des fleurs n’ayant que des carpelles mais ni
sépale ni pétale, et 2 étamines probables. La protéine AP2 semble nécessaire à la formation des pièces
stériles (pétales et sépales).
Le mutant agamous (sans protéine AG) présente des fleurs constituées uniquement de sépales et
pétales. La protéine AG semble impliquée dans la formation des pièces fertiles (étamines et carpelles).
Dans une fleur sauvage, AG ne s’exprime que dans les pièces fertiles alors que AP2 seulement dans les
pièces stériles. Quand on inactive AP2, alors AG est retrouvée partout. Quand on inactive AG, alors AP2
s’exprime partout.
Interprétation : ag et ap2 sont deux gènes qui s’inhibent l’un l’autre. AG empêche l’expression de ap2
dans les pièces fertiles et AP2 empêche l’expression de ag dans les pièces stériles. Chacun de ces
gènes donne l’identité des pièces florales : il s’agit de gènes du développement.
2.2 – Quand on surexprime mir, cela induit une fleur de type apetala2, c’est-à-dire sans AP2. L’idée est
que mir inhibe ap2. A vérifier !
Plante sauvage = témoin : ARN et protéines sont tous retrouvés
Pistes UBQ5 et PEPC = pistes validant les expressions, extractions et révélations des différents essais.
Analyse
Plante surexprimant mir : la présence de l’ARN MIR172 est bien supérieure au témoin (cela valide
l’expérience) mais les ARN totaux ne sont pas augmentés : seul mir est donc surexprimé. La quantité
d’ARNm d’AP2 semble inchangée par rapport au témoin mais la protéine AP2 est absente.
Interprétation : le gène mir est transcrit en ARN MIR172 qui empêche la traduction de l’ARN d’AP2 en
protéine AP2.
Analyse
Plante agamous : sans la protéine AG exprimée dans la plante, l’ARN MIR172 est quasiment absent
(mais pas les autres ARN). L’ARNm AP2 est de quantité identique au témoin mais la protéine AP2 est
fortement présente, plus que sur le témoin.
Interprétation : cela conforte notre hypothèse car sans ARN MIR172, la protéine AP2 semble davantage
traduite. De plus, on peut aussi postuler que la protéine AG active la transcription du gène mir.
2.3 – Le promoteur fort permet d’augmenter la transcription des ARN d’AP2 normal ou muté.
Analyse des phénotypes
P-AP2 : fleurs de type sauvage : la quantité d’AP2 n’influence pas la mise en place des pièces florales.
P-AP2m : la fleur est de type agamous : c’est-à-dire comme si l’ARN MIR172 était absent.
MIR172 ne s’exprime que dans les pièces fertiles des plantes sauvages, c’est-à-dire là où est exprimé
AG mais pas AP2.
Analyse des gels
Les résultats sont validés grâce aux pistes d’ARNm UBQ5 et de protéine PEPC.
Une plante sauvage exprime peu (voire pas) le gène AP2. Si on surexprime AP2, le taux d’ARNm AP2
est multiplié par 4 mais il y a peu d’effet visible sur la protéine AP2 (+ 10%).
Si on surexprime la protéine AP2 mutée, le taux d’ARNm P-AP2 est multiplié par 6,1 et la quantité de
protéine AP2 est triplée.
La forme mutée de ap2 donne un ARNm AP2m qui n’est pas complémentaire de l’ARN MIR172 présent
dans la cellule.
Interprétation : pour que MIR172 interfère dans la traduction de l’ARNm d’AP2, il faut une
complémentarité des séquences entre l’ARN MIR172 et l’ARNm d’AP2. Il s’agit d’interférence.