GTPase

Signalisation par activité enzymatique - GTPases
 la transduction des signaux est un événement transitoire (de courte durée)
 la signalisation par Ras et protéines G requière l'hydrolyse de GTP
o la réaction d’hydrolyse dépend de Mg2+ comme cofacteur; Mg2+
compense en partie les charges négatives portées par les phosphates
o la réaction est lente; si Ras et protéines G étaient des enzymes efficaces
i.e. possédant un taux d’hydrolyse élevée, les signaux transmis par ces
enzymes seraient trop courts pour être utilisables
 par conséquent ces enzymes ont évolué de manière à avoir des
vitesses catalytiques peu élevées
 la transduction et la durée de vie du signal dépendent de l'exploitation d'un état
conformationnel métastable provoqué par la liaison du GTP
 la signalisation est terminée lorsque GTP est hydrolysé en GDP
Signalisation membranaire par les protéines G
 les sous-unités Galpha sont en général des catalyseurs peu efficaces
 l'hydrolyse du GTP par le sous-unité Galpha est lente (2 à 4 min-1)
 la dissociation de GDP de la sous-unité α est encore plus lente (0.03 min-1)
o elle n'est pas détectable dans son complexe quaternaire en présence des
sous-unités βγ
 leur taux d'hydrolyse est accéléré par des RGS afin de désactiver leur
signalisation.
o le taux d'hydrolyse du GTP augmente jusqu'à 100 min-1 dans ce cas
Signalisation cytoplasmique par Ras
 l'hydrolyse du GTP est très lente (0.02 min-1)
 les signaux sont désactivés par des GAPs afin d’accélérer la réaction
o le taux d'hydrolyse du GTP par Ras en présence de GAP est de l'ordre de
10 5 plus rapide et ce qui est presque identique à celui de Galpha en
présence de RGS
BCM 2505
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 1 / 10
Transducine
 la protéine Gt-alpha ou transducine est parmi les protéines Galpha les plus étudiées
au niveau structurel
o Rappel ici : comment la transducine fonctionne comme médiateur de la
vision dans la rétine.
 Bref, la transducine couple les signaux de la lumière captés par
le récepteur des photons, la rhodopsine, à l'effecteur la cGMP
dépendante phosphodiestérase (PDE)
 L’essentiel dans ce schéma est la liaison du GTP et son hydrolyse impliquant
des changements conformationnels
 la protéine Gt-alpha, montrée en figure 1a, possède deux domaines structuraux :
o Domaine hélicoïdal = GDI (chez Ras) – identifié en figure 1a
o Domaine GTPase = Ras – figure 1a et 1b
 à noter : absence du domaine hélicoïdal (GDI) en Ras
Domaine
GTPase
GDI
GDP
Gt-alpha
Figure 1a.
Ras
Figure 1b.
 Gt-alpha possède deux états conformationnels;
o Un état inactif liant GDP (montré dans la figure 1a et 2a en rouge; GDP
en jaune)
o Un état actif auquel GTP est lié (montré superposé dans la figure 2a; les
éléments de structure qui diffèrent par rapport à la liaison du GDP sont
colorés dans la figure 2a: en bleu pour des différences importantes et
désignées « switch » afin de les distinguées des différences moins
importantes en vert)
BCM 2505
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 2 / 10
o les trois régions correspondantes aux différences conformationels
importantes, « switch » I, II, et III, sont identifiées en figure 2a;
l’agrandissement des régions « switch » I et II en figure 2b.
GTP ( P)
II
III
I
II
I
Régions « Switch »
Figure 2a.
Figure 2b.
 L’hydrolyse de GTP inactive l'effet stimulateur de Gt-alpha permettant au cycle
de signalisation de recommencer
 Les changements conformationnels (« switch » I, II, III) sont donc impliqués
dans 1) l'échange de GDP avec GTP, stimulé par le GPCR activé, et 2) dans
l'hydrolyse du GTP
o la liaison de GTP au sous-unité α de l'hétérotrimère (rouge en figure 3a)
occasionne non seulement sa dissociation du Gt-alpha du récepteur, mais
produit également le déplacement des sous-unités βγ de l'hétérotrimère
(voir comment dans la comparaison par superposition de Gt- alpha-GTPS
avec Gt- alpha-GDP dans l'hétérotrimère en figure 3b)
GTP ( P)
Galpha- GDP- Gbeta Ggamma
Région d’interaction
Figure 3a.
BCM 2505
N - terminus
Perte d’interaction
Figure 3b.
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 3 / 10
 Des évidences cristallographiques des Galpha en présence de GTPγS, GDPNHP,
GDP, et GDP.AlF4- ont permis l'analyse du mécanisme d'hydrolyse
o l'hydrolyse non-enzymatique du GTP en GDP qui sera catalysé par
l’enzyme consiste en une attaque nucléophile en ligne sur le phosphate 
Réaction
nonenzymatique
O O
P
O
O
GDP
O
H
O
H
O
P
O
GDP
H
O
H
O
o le GTPγS et GDPNHP sont des inhibiteurs compétitifs de la liaison par
GTP tandis que GDP.AlF4-, provoque une forme activée de protéine
Galpha et agit comme analogue de l'état de transition
Analogues
O
GDP
O
S
P
O
GTPS
F F
H
Al
O
O
H
H
O
H
GDP
F
F
GDP-AlF4-- H2O
à noter que GTPγS > 102 moins réactif que GTP; S - faible donneur d’électrons
Mécanisme d'hydrolyse enzymatique de GTP
 L'hydrolyse du GTP en GDP par une attaque nucléophile en ligne directe par
une molécule d'eau sur le phosphate γ prévoit une catalyse enzymatique de type
base générale par un résidu capable d’accepter un proton d’une molécule d’eau
et ainsi générer un nucléophile hydroxyle
 Les études cristallographiques ont en effet montré la présence d'une molécule
d'eau dans une position cohérente avec un tel mécanisme catalytique.
o dans la structure du complexe Gt-alpha.GTPγS, cette molécule d'eau est
positionnée afin d'interagir avec le S du thiophosphate et pourra faire une
attaque directe en ligne sur le phosphate γ
Molécule
d’eau
o dans la structure du complexe Gt-alpha.GDP.AlF4-, une molécule d'eau
fait partie de l'intermédiaire pentavalent
o il est donc probable que cette molécule d'eau joue le rôle d'un nucléophile
une fois activée
BCM 2505
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 4 / 10
HN
Arg 174
H
HN
Arg 174
H
N
N
H
H
H
H
O
O
P
N
H
O
O
H
GDP
H
F F
H
Gln 200
N
H
N
H
O
GDP
N
Gln 200
H
S
H
Al
O
H
O
F F
H
O
O
GtaGTPS
Thr 177
GtaGDP-AlF4-- H2O
Thr 177
 GTP est très stable en milieu aqueux parce qu’il est difficile de faire une attaque
nucléophile par OH-, qui est chargé négativement, sur le phosphate γ aussi
chargé négativement. De ce fait, une réduction dans les charges négatives
portées par les phosphates devrait se réaliser au sein du site actif afin de
stabiliser l’état de transition et d’accélérer la réaction
 les études fonctionnelles dans la famille de protéines G ont démontré qu'Arg
174 (178 en Gi-alpha-1) joue un rôle essentiel dans l'hydrolyse du GTP
o des mutations de l'Arg 174 empêchent l'hydrolyse du GTP et
bloque Galpha dans son état toujours actif
Stabilisation
des charges
o dans certaines tumeurs endocrines humaines, des mutants de R174
stimulent toujours l'adényl cyclase
o l'inhibition, par la toxine du choléra, de l'hydrolyse du GTP en GDP se
fait par l'entremise de la ribosylation de R174
 le résidu R174 se retrouve dans la cavité du site actif proche de la région de
jonction (linkers) des deux domaines structuraux
 dans la structure de Gt-alpha.GTPγS, l'Arg 174 joue un rôle critique à travers ses
ponts hydrogènes avec le sulfure du phosphate γ et possiblement avec l'oxygène
ester entre les phosphates β et γ
 une pareille interaction de l'Arg 174 avec un fluor de AlF4- et l'oxygène ester
entre les phosphates β et γ est observée dans le complexe Gt-alpha.GDP.AlF4 ce résidu est donc bien placé pour stabiliser la charge négative qui se développe
dans l'état transitionnel sur le phosphate γ pentacoordiné
BCM 2505
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 5 / 10
o à noter que Mg2+ stabilise également les charges négatives
 le rôle de Gln 200 (203 en Gi-alpha-1) sert aussi à stabiliser l'intermédiaire
pentacoordiné
o la tautomérie de la Gln 200 pourrait stabiliser la coordination pentacoordinée par la formation de deux ponts hydrogènes, et par ce fait
augmentera la nucleophilicité de l'eau axiale attaquante et diminuera la
charge négative sur le phosphate γ dans l'état transitionnel
Base
générale
HN
Arg 174
H
H
N
H
H
H
O
N
H
O
N
H
P
Gln 200
O
O
O
GDP
HN
Arg 174
H
H
H
O O
N
H
O
H
N
N
H
O
H
GDP
P
O
Gln 200
O
H
O
H
O
Intermédiaire
Forme GTP
Thr 177
pentacoordiné
Thr 177
 même si Gln 200 participe dans l'état transitionnel, son rôle n'est pas celui d'une
base générale qui pourra activer la molécule d'eau, car son pKa est très élevé
O
o l'échange par mutagenèse dirigée
de ce résidu en Glu augmente très peu kcat
mais considérablement Km
 le résidu voisin Glu 203 (207 en Gi-alpha-1)
pourra jouer ce rôle à cause de sa proximité
de la molécule d'eau, 3.5Å
o la rotation autour du lien Cβ-Cγ de
la chaîne latérale placera le groupement
carboxylique chargé négativement en
position d’effectuer l'abstraction du proton
activant ainsi la molécule d'eau
o cependant ce rôle est peu probable
parce que Glu 203 forme un pont salin avec
une lysine et la rupture de cette interaction
dans l'activation de l'eau par Glu 203 est
BCM 2505
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 6 / 10
énergiquement très défavorable
o de plus, le remplacement par mutagenèse dirigée de Glu 203 par Ala ou
Gln a seulement diminué kcat très légèrement
 l'absence d'un résidu qui pouvant jouer le rôle d'une base générale et ainsi
déprotoner un nucléophile est cohérent avec le fonctionnement des protéines G
 ceci assure une très lente hydrolyse du GTP pour maximiser leur signalisation
o la modélisation de la réaction de Ras par des calculs de dynamique
moléculaire et des études physico-chimiques suggèrent en effet qu'il n'y a
pas de base générale pour activer l'eau, mais que c'est le phosphate γ qui
lui-même joue ce rôle comme montré ci bas (à noter que Gln 61 chez Ras
= Gln 200 chez Galpha)
H
Gln 61
N
H
Mécanisme
réactionnel
O
H
P
O
GDP
O
O
O
H O
H
Gln 61
N
O
O
O
H
O
P
O
H
OH
GDP
H
N
H
O
O
GDP
BCM 2505
O
O
P
OH
Gln 61
O
H
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 7 / 10
Signalisation conformationelle
 la superposition entre les structures Galpha.GTPγS et Galpha.GDP indique que les
changements conformationnels importants sont aux alentours du site de liaison
du GTP. Voir les figures 4a et 4b, la partie GDP est montrée en jaune et celle
du Pγ en bleu, Mg2+ en rose – la présentation des figures 4 diffère par rotation
de 90° sur l’axe vertical.
o le GTP est tenu entre deux régions flexibles, "switch I et II", en figure
4a et 4b, où les changements sont concentrés
Switch II
III
Switch I
Figure 4a.
Figure 4b.
 ces régions flexibles contiennent les résidus catalytiques essentiels tandis que la
reconnaissance du nucléoside ainsi que les phosphates α et β implique des
interactions plutôt peu flexibles
 la région switch I dans le cas de Galpha correspond à une région de jonction
(linker) entre le domaine hélicoïdal GDI et la partie GTPase
o elle contient le résidu Arg 178 de Galpha (Arg 174 chez Gt-alpha)
 la région switch II contient Gln 204 chez Galpha-i1 (Gln 61 chez Ras et Gln 200
chez Gt-alpha)
 les changements conformationnels sont tous directement ou indirectement
provoqués par la liaison du phosphate γ et son hydrolyse
 ces résidus ainsi que leurs régions "switch" doivent être réorientés afin de
stabiliser l'état de transition
Mobilité
BCM 2505
o cette réorientation ainsi que l'absence d'une base générale a été
postulée d’être à l’origine du faible taux d'hydrolyse de Ras et Galpha
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 8 / 10
 dans la liaison de Galpha-i1 avec son RGS les deux régions « switch I et II »sont
impliquées et leurs interactions réduisent leur mobilité (dans les figures 5a et 5b,
switch I est montrée en rouge et switch II en vert)
o au site actif, l’Asn 128 de RGS contribue par cette interaction à stabiliser
la conformation de Gln 204 (Gln 200 chez Gt-alpha)
Galpha-i1-GDP-RGS
Ras-GDP-AlF3-GAP
Figure 5a.
Figure 5b.
 dans la liaison de GAP avec Ras, GAP oriente Gln 61 à travers une interaction
entre un carbonyle du squelette peptidique de GAP
o et il y a insertion par la « finger loop » de GAP d'un résidu Arg 789 (vert)
dans le site actif de Ras (voir figure 6a, Ras montré en cyan)
RAS
AlF3
Arg 178
Arg 789
finger
loop
GAP
Figure 6a.
BCM 2505
GAP
Figure 6b.
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 9 / 10
o et ceci dans une position quasiment identique par rapport à Arg 178 dans
le site actif d'Galpha (voir figure 6b, Galpha-GDP-AlF4 montré en rouge)
 chez Ras, qui possède un pouvoir catalytique nettement moindre que celui de
Galpha, le résidu Arg est absent et celui fourni par GAP, Arg 789, augmente
considérablement son activité GTPase
o cependant la mutation d'Arg 789 en Lys dans GAP ne change pas
l'activité catalytique de façon importante;
 il était attendu que l’interaction faite par Lys à l’état de transition
sera moins efficace (le résidu Lys étant plus court qu’Arg par
~1.5Å) et devrait donner une réduction importante en activité
catalytique
o ce qui indique que la stabilisation de l'état de transition par une charge
positive voisine explique seulement une partie de l'activité catalytique
 le supplément en pouvoir catalytique nécessaire doit donc avoir
une origine autre
 l’explication réside dans la réduction de flexibilité aux régions "switch I et II"
due à la liaison par GAP et RGS
o la stimulation de Ras et Galpha provient non seulement de la capacité par
GAP et RGS à fournir des résidus aux sites actifs respectifs, mais réside
aussi dans la capacité par GAP et RGS à stabiliser des conformations
complémentaires à l'état de transition
o les études démontrent en effet une plus forte liaison par Ras et G alpha en
état activé (complexé avec GTPγS par exemple) à des facteurs
stimulateurs
BCM 2505
Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme
Page 10 / 10