BT1 Chap3 acides aminés.key

Biotech 1 - 2016-2017
Acides aminés
BIOCHIMIE STRUCTURALE– Biotech 1
Chapitre 3
Les acides aminés
1
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Acides aminés
SOMMAIRE
1. Généralités sur les protéines
2. Les acides aminés : éléments de base des protéines
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.1. Formule générale
2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires
2.1.3. Activité optique : rappels
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.4. Les 21ème et 22ème acides aminés standards
2.2.5. Acides aminés non constitutifs des protéines ou précurseurs de
composés actifs
2.3. Méthodes de séparation et d’analyse des acides aminés
2.3.1. Chromatographies
2.3.2. Électrophorèses
2
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Acides aminés
SOMMAIRE
1. Généralités sur les protéines
2. Les acides aminés : éléments de base des protéines
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.1. Formule générale
2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires
2.1.3. Activité optique : rappels
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes
2.3.2. 11 acides aminés polaires
2.3.3. Ionisation des acides aminés
2.3.4. Les 21ème et 22ème acides aminés standards
2.3.5. Acides aminés non constitutifs des protéines ou précurseurs de
composés actifs
2.3. Méthodes de séparation et d’analyse des acides aminés
2.3.1. Chromatographies
2.3.2. Électrophorèses
3
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Acides aminés
1. GÉNÉRALITÉS
SUR LES PROTÉINES
PROTÉINES :
- 1 des 4 classes de macromolécules biologiques
- à l’origine d’un haut degré de complexité et d’organisation de la cellule
- constitués d’une ou plusieurs chaînes linéaires d’unités de base : les acides aminés
NH2
aa
aa
aa
aa
aa
COOH
séquence protéique : déterminée par l’information génétique présente dans les gènes
→ ordre d’incorporation des acides aminés dicté par la séquence de l’ARNm lors de la
traduction
ADN
transcription
ARNm
traduction
(poly)peptide
enchaînement
d’acides aminés
repliement
protéine
structure 3D
- structure → fonction
- activités intracellulaires
- maladies si anormale
!
la séquence en acides aminés d’une protéine conditionne sa structure
tridimensionnelle, indispensable à l’activité biologique
4
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Acides aminés
1. GÉNÉRALITÉS
SUR LES PROTÉINES
- TOUTES les activités cellulaires impliquent directement ou indirectement des
protéines
- la structure est responsable de la fonction
- compréhension de la structure → développement de stratégies thérapeutiques
(beaucoup de maladies génétiques liées à un fonctionnement anormal d’une protéine)
BIOLOGIE
CELLULAIRE
Transformer
enzymes : catalysent l’essentiel
des réactions chimiques du vivant
Créer et maintenir une structure
- protéines du cytosquelette
- protéines des tissus de soutien
Bouger / se déplacer
- protéines à fonction motrice
- protéines des mouvements
intracellulaires
Reconnaître et se défendre
immunoglobulines
Transporter
- transporteurs de petites molécules
(dont O2)
- transporteurs trans-membranaires
Informer / signaler
- récepteurs et leurs ligands
- “interrupteurs moléculaires”
Chapitre 2 :
Cytosol et cytosquelette
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Acides aminés
SOMMAIRE
1. Généralités sur les protéines
2. Les acides aminés : éléments de base des protéines
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.1. Formule générale
2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires
2.1.3. Activité optique : rappels
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.4. Les 21ème et 22ème acides aminés standards
2.2.5. Acides aminés non constitutifs des protéines ou précurseurs de
composés actifs
2.3. Méthodes de séparation et d’analyse des acides aminés
2.3.1. Chromatographies
2.3.2. Électrophorèses
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.1. Formule générale
acides aminés = classe de molécules diverses mais structure commune :
- un carbone central, appelé carbone α (Cα) portant :
- un atome d’hydrogène
- un groupement acide carboxylique (α-COOH)
- un groupement amine (souvent primaire α-NH2, éventuellement secondaire α-NH)
- une chaîne latérale (ou radical R) variable, caractéristique de l’acide aminé
carbone α
COOH
H
C
R
NH2
COOH = fonction acide carboxylique (pK1 = 2)
NH2 = fonction amine primaire (pK2 = 9)
!
R = chaîne latérale variable
- masse moyenne : 110 Da (de 75 à 200 selon la nature de R)
1 dalton (Da) = unité de masse des protéines
= masse d’un atome d’hydrogène
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.1. Formule générale
carbone α
COOH
H
C
R
NH2
COOH = fonction acide carboxylique (pK1 = 2)
NH2 = fonction amine primaire (pK2 = 9)
R = chaîne latérale variable
- tous les acides aminés sont relativement solubles dans l’eau
- existent à l’état libre
- rôle spécifique : métabolique, médiateurs ou précurseurs de médiateurs
- 20 à 22 acides aminés dans la composition des protéines = acides aminés
protéinogènes
structure conservée, des archéobactéries à l’homme
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires
RAPPELS SUR LES COUPLES ACIDO-BASIQUES
selon Brönsted :
- acide = entité capable de libérer un proton H+ en solution
- base = entité capable d’accepter un proton en solution
Ka
AH
-
A +H
+
[A − ].[H+ ]
Ka =
[AH]
un couple acido-basique AH/A- est caractérisé par :
- sa constante d’acidité Ka
- un pKa associé (souvent noté pK) tel que pKa = -log Ka
= pH de demi-neutralisation (ou demi-dissociation)
→ la moitié des groupements sont dissociés
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires
carbone α
COOH
H
C
R
NH2
COOH = fonction acide carboxylique (pK1 = 2)
NH2 = fonction amine primaire (pK2 = 9)
R = chaîne latérale variable
au moins 2 groupements ionisables sur le Cα :
- acide carboxylique α-COOH : couple acido-basique COOH/COO- (pK1 ≃ 2,1)
!
- amine α-NH2 (α-NH pour la proline) : couple acido-basique NH3+/NH2 (pK2 ≃ 9)
- un 3ème couple acido-basique selon la nature de la chaîne latérale de l’acide aminé
→ pKR spécifique
valeur pK dépend de :
- température
- force ionique
- micro-environnement de la fonction
→ peut varier légèrement d’un acide aminé à un autre
→ on retient pK1 ≃ 2,1 et pK2 ≃ 9
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires
!
acides aminés = espèces amphotères (ou ampholytes)
= peuvent se comporter comme des acides ou comme des bases grâce à
leurs 2 couples acido-basiques
carbone α
COOH
H
C
R
NH2
COOH = fonction acide carboxylique (pK1 = 2)
NH2 = fonction amine primaire (pK2 = 9)
R = chaîne latérale variable
- état d’ionisation global dépend de l’état de chacune des fonctions ionisables en
fonction du pH
- milieux biologiques (aqueux, pH physiologique) : acides aminés libres toujours
ionisés
- acide aminé libre = non engagé dans des liaisons peptidiques
- dans peptides ou protéines : fonctions α-COOH et α-NH2 engagées dans des liaisons peptidiques
→ ne sont plus ionisables (sauf extrémités)
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.1. Structure et activité optique des acides aminés
2.1.3. Activité optique : rappels
- tous les acides aminés, sauf glycine : Cα asymétrique → molécules chirales
→ 2 énantiomères de chaque acide aminé (et 2n stéréoisomères avec n = nombre de C*)
- acides aminés naturels de la série L (α-NH2 à gauche en projection de Fischer)
représentation de Ficher
COOH
H2N Cα H
R
gauche (left)
série L
COOH
H Cα NH2
R
droite
série D
molécule chirale → activité optique (= pouvoir rotatoire) (d, +) ou (l, -)
= classification empirique, aucune application courante pour les acides aminés
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
- 20 acides aminés naturels entrent dans la composition des protéines = acides aminés
protéinogènes
- répartition en 3 classes selon la nature de la chaîne latérale (forme, charge, capacité à
former des liaisons hydrogène, réactivité chimique…)
- 9 acides aminés apolaires → dans protéines, chaînes latérales orientées vers l’intérieur
- 6 acides aminés polaires neutres à pH physiologique
→ dans protéines, chaînes latérales
- 5 acides aminés polaires chargés à pH physiologique
orientées vers l’extérieur
Rappel :
polarité : due à un déséquilibre du nuage électronique dans la liaison chimique
→ pôle électronégatif δ- sur un atome
→ pôle électropositif δ+ sur l’autre atome
→ possibilité d’établir des liaisons H
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
20 ACIDES AMINÉS PROTÉINOGÈNES
- 9 acides aminés apolaires
- à chaîne aliphatique : glycine, alanine, valine*, leucine*, isoleucine*
- à chaîne soufrée : méthionine*
- à chaîne cyclique : proline
- à chaîne aromatique : phénylalanine*, tryptophane*
- 6 acides aminés polaires neutres à pH physiologique
- à fonction alcool : sérine, thréonine*, tyrosine
- à fonction soufrée : cystéine
- à fonction amide : glutamine, asparagine
- 5 acides aminés polaires chargés à pH physiologique
- à fonction acide : acide glutamique, acide aspartique
- à fonction basique : histidine (*), lysine*, arginine (*)
* acides aminés indispensables (ou essentiels) : ne peuvent pas être synthétisés,
doivent être apportés par l’alimentation
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
20 ACIDES AMINÉS PROTÉINOGÈNES
codes à 3 lettres ou à 1 lettre utilisés pour écrire les séquences protéiques
glycine
Gly
G
méthionine Met M
alanine
Ala
A
proline
Pro
P
glutamine
Gln
valine
Val
V
sérine
Ser
S
asparagine
Asn N
leucine
Leu
L
thréonine Thr
T
acide glutamique Glu
isoleucine Ile
I
Y
acide aspartique Asp D
tyrosine
Tyr
cystéine
Cys C
Q
E
!
phénylalanine Phe
tryptophane
F
Trp W
histidine
His
H
lysine
Lys
K
arginine
Arg
R
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
20 ACIDES AMINÉS PROTÉINOGÈNES
synthèse des acides aminés difficile (à cause fonction -NH2)
→ certains acides aminés proviennent exclusivement de l’alimentation et ne peuvent être
synthétisés
= acides aminés indispensables (ou essentiels)
- essentiels : leucine, thréonine, lysine, tryptophane, phénylalanine, valine, méthionine,
isoleucine
- semi-essentiels (indispensables chez l’enfant) : histidine et arginine
À retenir :
“(Hystérique), le très lyrique Tristan fait vachement méditer Yseult (en Argentine)”
(His)
Leu Thr Lys
Trp Phe
Val
Met
Ile
(Arg)
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes
chaîne latérale :
- peut être impliquée dans interactions hydrophobes
- généralement orientée vers l’intérieur des protéines
2.2.1.1. 5 acides aminés non polaires à chaîne latérale aliphatique
aliphatique = non aromatique = pas de délocalisation d’électrons
+
H3N
COO-
+
H3N
glycine
Gly, G
COO-
alanine
Ala, A
+
H3N
COO-
valine *
Val, V
encombrement
+
H3N
(cf cours de chimie pour les définitions)
COO-
leucine *
Leu, L
+
H3N
COO-
isoleucine *
Ile, I
hydrophobicité
- seul acide aminé optiquement
inactif (pas de C*)
- très peu encombrant → grande
flexibilité
Remarque : représentation des acides aminés à leur état d’ionisation à pH physiologique
- C* supplémentaire (Cβ)
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes
2.2.1.2. 1 acide aminé non polaire soufré
+
H3N
COO-
S
- donneur de méthyle par réduction de la fonction thioéther (-S-)
en fonction thiol (-SH)
méthionine *
Met, M
2.2.1.3. 1 acide aminé non polaire cyclique
H
N
COO-
- α-amine engagée dans un cycle avec radical → cycle pyrrolidine
- seul acide aminé à ne pas posséder de fonction amine primaire
(= amine secondaire)
proline
Pro, P
- structure cyclique, pas de libre rotation autour de la liaison Cα-N
→ très grande rigidité dans les chaînes peptidiques, angulation
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes
2.2.1.4. 2 acides aminés non polaires à chaîne aromatique
+
H3N
COO-
+
H3N
COO-
NH
phénylalanine *
Phe, F
tryptophane *
Trp, W
- cycles aromatiques : électrons π délocalisés → forte absorption dans l’UV à 280 nm
- phényl dans phénylalanine : R = benzyle (= CH2 + phényl) hydrophobe
- phénol dans tyrosine (cf acides aminés polaires)
- indole dans tryptophane
→
dosage des protéines en solution par spectrophotométrie, évaluation de la
contamination d’une solution d’acides nucléiques par des protéines
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.2.1. 2 acides aminés polaires acides (chargés négativement à
pH physiologique)
acides aminés chargés :
- très hydrophiles
- impliqués dans des liaisons ioniques dans la structure 3D des protéines
+
H3N
COO-
+
COO-
H3N
O
pKR = 4,0
O-
acide aspartique
Asp, D
O
O-
pKR = 4,3
acide glutamique
Glu, E
- acides aminés acides : fonction -COOH supplémentaire dans la chaîne latérale
- acides plus faibles que α-COOH mais chargés négativement à pH physiologique
→ charge nette négative de l’acide aminé
20
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.2.2. 3 acides aminés polaires basiques (chargés positivement à
pH physiologique)
- fonction amine basique supplémentaire dans la chaîne latérale
- chargée positivement à pH physiologique
→ charge nette positive de l’acide aminé
+
H3N
COO-
+
H3N
COO-
+
H3N
COO-
+
NH
N
NH
fonction
guanidinium
H2N
arginine
Arg, R
pKR = 12,8
NH2+
NH3+
lysine *
Lys, K
pKR = 10,8
histidine *
His, H
pKR = 6,0
COO-
H3N
+
NH
HN
pH 5,0
- à pH physiologique, His pas chargée sur sa chaîne latérale mais fonction amine ionisable
- His : noyau imidazole très réactif, pKR très proche de pH physiologique → état d’ionisation
varie en fonction environnement
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.2.3. 2 acides aminés polaires neutres à fonction amide
+
H3N
COO-
+
COO-
H3N
O
NH2
asparagine
Asn, N
O
NH2
glutamine
Gln, Q
- dans glycoprotéines : Asn peut subir une modification post-traductionnelle
= N-glycosylation (= ajout de sucre sur un atome N)
- Gln à l’état libre : rôle de transport et de mise en réserve de l’ammoniac (déchet du
métabolisme des acides aminés), très toxique pour l’organisme
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.2.4. 3 acides aminés polaires neutres à fonction alcool ou
phénol
+
H3N
COO-
OH
+
H3N
COO-
+
H3N
COO-
HO
OH (pKR = 10,9)
sérine
Ser, S
(alcool primaire)
thréonine *
Thr, T
(alcool secondaire)
tyrosine
Tyr, Y
(phénol)
- Thr : C* supplémentaire (Cβ) Thr et Ile sont les seuls acides aminés naturels à posséder 2C*
- Tyr : pKR = 10,9 → non ionisée à pH physiologique
- Tyr : aromatique → absorbe dans l’UV à 280 nm
- dans les protéines, fonction alcool peut subir des modifications posttraductionnelles :
- Ser et Thr : O-glycosylation (= ajout de sucre sur un atome O)
- Ser, Thr et Tyr : phosphorylation
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.2.4. 3 acides aminés polaires neutres à fonction alcool ou
phénol
- phosphorylation = ajout d’un groupement phosphate, catalysé par une protéine kinase
groupement
phosphate
OH
ATP
O
ADP
O
O-
kinase
fonction alcool
libre
O-
P
fonction alcool
phosphorylée
- déphosphorylation = retrait du groupement phosphate, catalysé par une phosphatase
groupement
phosphate
O
O
P
O-
OH
O-
+
phosphatase
fonction alcool
phosphorylée
O
-
O
P
O-
Ofonction alcool
libre
phosphate inorganique
(Pi)
phosphorylation / déphosphorylation → régulation de très nombreuses
protéines impliquées dans des voies de signalisation
!
24
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.2. 11 acides aminés polaires
2.2.2.5. 1 acide aminé polaire neutre à fonction thiol (-SH) très
réactive
+
H3N
COO-
SH
cystéine
Cys, C
+
H3N
COO-
SH
+
H3N
HS
COO-
oxydation
-
réduction
+
(pKR = 8,3)
OOC
S
S
NH3+
COO-
H3N
cystine
- tous les acides aminés standards sont de configuration (2S) sauf cystéine (à cause
numéro atomique)
- pKR fonction thiol = 8,3 → non ionisée à pH physiologique
- fonction thiol très réactive → formation de pont disulfure par oxydation de 2
fonctions thiol de 2 cystéines → cystine
pont disulfure S-S :
- liaison covalente, forte
- relie 2 chaînes ou parties de chaînes peptidiques → participe au maintien de la
structure 3D de certaines protéines
- peuvent être rompus par des agents chimiques réducteurs : β-mercaptoéthanol
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.1. Rappels sur les couples acido-basiques
- couple acido-basique caractérisé par une constante d’acidité Ka :
Ka
AH
- passage aux logarithmes décimaux :
-
A +H
+
[A − ].[H+ ]
Ka =
[AH]
[A − ]
log Ka = log [H ] + log
[AH]
+
pH = -log [H+]
pKa = -log Ka
- équation d’Henderson-Hasselbach :
→ proportion des différentes espèces en solution
[A − ]
pH = pKa + log
[AH]
Rappel : pKa = pH de demi-neutralisation
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.1. Rappels sur les couples acido-basiques
domaines de prédominance :
→ proportion des différentes espèces en solution
pH < pKa
pKa
[A − ]
pH = pKa + log
[AH]
pH > pKa
pH
[A − ]
log
<0
[AH]
[A − ]
log
=0
[AH]
[A − ]
log
>0
[AH]
[A − ] < [AH]
[A − ] = [AH]
[A − ] > [AH]
27
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.2. Notion de pHi
- acides aminés = espèces amphotères :
- groupement acide α-COOH/α-COO- pK1 ≃ 2,1
- groupement basique α-NH3+/α-NH2 pK2 ≃ 9
COOH
H
C
NH2
pK1 = 2,1
pK2 = 9
R
COOH
NH3
+
K1
K2
COO- + H+
pK1 = -log K1
NH2 + H+
pK2 = -log K2
- 7 acides aminés protéinogènes possèdent un groupement ionisable supplémentaire
sur leur chaîne latérale → pKR associé
- pour chaque fonction ionisable :
- forme protonée pour pH < pK
- forme déprotonée pour pH > pK
→ prédiction de l’état d’ionisation en fonction du pH : domaines de prédominance sur
échelle de pH
28
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.2. Notion de pHi
ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE NON IONISABLE
COO-
COOH
H
NH3+
C
H
R
NH3+
C
H
R
cation
charge
globale
COO-
+
pK1
2,1
C
NH2
R
zwitterion
pK2
9
0
pH
anion
-
- pH physiologique (7,4) : acides aminés doublement ionisés, sous forme de zwitterion
zwitterion = forme neutre qui possède autant de charges positives que de charges
négatives
→ α-amine protonée, chargée positivement (NH3+, pH < pK2)
→ α-acide déprotoné, chargé négativement (COO-, pH > pK1)
29
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.2. Notion de pHi
ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE NON IONISABLE
COO-
COOH
H
NH3+
C
H
R
NH3+
C
H
R
cation
charge
globale
COO-
+
pK1
2,1
C
NH2
R
zwitterion
0
pK2
9
pH
anion
-
- pH isoélectrique pHi (ou point isoélectrique pI)
= LE pH pour lequel la molécule a une charge électrique globalement nulle
= somme algébrique de ses charges nulle
= 1/2 somme des pK qui entourent la forme neutre
pHi =
pK1 + pK2
2
acides aminés non
ionisables
30
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.2. Notion de pHi
ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE ACIDE : EXEMPLE DE L’ACIDE ASPARTIQUE
+
H3N
+
COOH
COO-
H3N
O
+
COO-
H3N
O
OH
charge
globale
+
O
0
O
O-
OH
pK1
2,1
COO-
H2N
pKR
4,1
-
OpK2
9
2-
forme zwitterion pour :
- α-amine protonée, chargée positivement (NH3+, pH < pK2)
- α-acide déprotoné, chargé négativement (COO-, pH > pK1)
- acide chaîne latérale protonée et neutre (COOH, pH < pKR)
pHi = 1/2 somme des pK qui entourent la forme neutre
pHi =
pK1 + pKR
2
acides aminés
acides
31
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.2. Notion de pHi
ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE BASIQUE : EXEMPLE DE L’ARGININE
+
H3N
+
COOH
H3N
COO-
NH
H2N
charge
globale
2+
H2N
COO-
NH
NH2+
H2N
pK1
2,1
+
H2N
COO-
NH
NH2+
H2N
pK2
9
0
NH
NH2+
NH
H2N
pKR
12,5
-
forme zwitterion pour :
- α-amine déprotonée et neutre (NH2, pH > pK2)
- α-acide déprotoné, chargé négativement (COO-, pH > pK1)
- amine chaîne latérale protonée et chargée positivement (N+, pH < pKR)
pHi = 1/2 somme des pK qui entourent la forme neutre
pHi =
pK2 + pKR
2
acides aminés
basiques
32
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.2. Notion de pHi
CAS SIMPLES : RÈGLE DES PK DOMINANTS
- cas simples = acides aminés libres, peptides comprenant peu de fonctions ionisables
→ molécules acides : pHi = 1/2 somme des pK les plus faibles
→ molécules basiques : pHi = 1/2 somme des pK les plus forts
!
- cas plus complexes : dessiner échelle de pH et déterminer les domaines de
prédominance des différentes espèces
33
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.3. Courbes de titration
- obtenue par dosage des fonctions acides : ajout d’équivalents HO- basiques
ou dosage des fonctions basiques par ajout de H+ (rarement utilisé en biochimie)
- chaque acide aminé possède sa courbe de titration spécifique
allure générale de la courbe pour un acide aminé non ionisable sur sa chaîne latérale :
→ 2 fonctions ionisables
Z = zwitterion
A+ = forme cationique
A- = forme anionique
2
- 1 fonction ionisable → 1 palier, pK au milieu
du palier
- pHi = pH à l’équivalence, point d’inflexion
- si fonction ionisable sur chaîne latérale → 3ème
palier (pour pH = pKR)
1
34
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.3. Ionisation des acides aminés
2.2.3.4. Pouvoir tampon
- solution tampon = même quantité d’acide faible et de sa base conjuguée
- pourvoir tampon = capacité d’une solution tampon à maintenir son pH à peu près
constant, malgré l’ajout d’une quantité modérée d’ions HO- ou H+
- pouvoir tampon maximal à pH = pKa
2.2.3.5. Solubilité dans l’eau
- tous les acides aminés possèdent α-COO-, α-NH3+ polaires → tous solubles dans l’eau
- chaînes latérales hydrophobes, aliphatiques encombrées (Leu et Ile) → solubilité ↓
- solubilité dépend de l’état d’ionisation (donc du pH) : si charge ↑, solubilité ↑
→ solubilité minimale pour pH = pHi (charge nulle)
utilité pour séparer et
précipiter des protéines
35
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.4. Les 21ème et 22ème acides aminés standards
- résidus rares découverts récemment
- incorporés dans les protéines lors de la traduction, possèdent leur propre ARNt
HSe
+
O
H3N
-
O
sélénocystéine
Sec, U
- cystéine modifiée : S remplacé par Se
- codon UGA
- retrouvée chez tous les mammifères
(site actif de la glutathion peroxydase)
-
H
N
OOC
NH3+
N
O
pyrrolysine
Pyl, O
- décrite chez certaines archéobactéries
36
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.5. Acides aminés non constitutifs des protéines ou précurseurs de
composés actifs
- rôle important à l’état libre, mais n’entrent pas dans la composition des protéines
- ornithine et citrulline : acides aminés libres qui participent à la synthèse de l’urée
(H2N-CO-NH2, forme d’élimination de l’azote chez l’homme)
- acides aminés biogènes = molécules biologiquement actives, beaucoup sont obtenues
par décarboxylation (= perte de CO2) d’acides aminés
- exemples :
- histamine impliquée dans réactions allergiques
= décarboxylation de l’histidine sur son Cα
H
N
N
NH2
histamine
37
Biotech 1 - 2016-2017
Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.2. Nomenclature, classification et propriétés des acides aminés standards
2.2.5. Acides aminés non constitutifs des protéines ou précurseurs de
composés actifs
COO+
- tyrosine = précurseur du DOPA (ajout
phénol) qui donne la dopamine par
décarboxylation du Cα
↑ dopamine → psychoses
↓ dopamine → maladie de Parkinson
H3N
H
C
CH2
NH3+
+
H3N
C
H
CO2
+
H3N
C
H
OH
+
H3N
C
C
H
CH2
CH2
CO2
CH2
OH
OH
DOPA
OH
dopamine
H
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
COO-
COO-
COO-
acide γ aminobutyrique
(GABA)
neuromédiateur
H3N
OH
CH2
Glu
+
OH
tyrosine
COO-
NH3+
COO-
GHB
drogue des violeurs
- acide glutamique = précurseur du
GABA
GHB = anesthésiant utilisé en milieu
hospitalier depuis 40 ans
38
Séparation selon la charge
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Acides aminés
Séparation selon la taille
2. LES
ACIDES AMINÉS
Séparation par adsorption
spécifique
2.3. Méthodes de séparation et d’analyse des acides aminés
2 grandes techniques de séparation des acides aminés en solution :
- chromatographie
- électrophorèse
2.3.1. Chromatographies
- sur colonne ou papier, même principe
9
- 2 phases :
- phase stationnaire (gel, résine, silice, papier,…)
l'extrémité inférieure de la colonne.
- phase mobile (liquide, gaz)
Un détecteur enregistre l'absorbance de la solution en sortie de colonne à u
déterminée.
Il permet de
détecter les protéines : un
profil laquelle
d'élution eston
le plus
→ choix des phases en fonction de
la propriété
physico-chimique
selon
temps réel sur un enregistreur.
cherche à séparer (charge, masse, polarité,
affinité)
Chromatographie échangeuse d!’ions
échantillon :
± adsorbé sur phase stationnaire
± entraînée le long de la phase stationnaire par
la phase mobile
colonne de
chromatographie
tampon d’élution
Tampon mobile)
d’élution
(phase
(phase mobile)
échantillon
échantillon
billes
Billes fonctionnalisées
fonctionnalisées
(phase
(Phase fixe) fixe)
Chromatographie de filtration sur gel
= séparation basée sur différence d’affinité vis-à-vis de
Les trois grands types de chromatographie
l’une ou l’autre des 2 phases
6 5 4 3
!
2 1
utilisés pour purifier les protéines
6 5 4 3 2 1
39
T
(
é
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Acides aminés
2. LES
ACIDES AMINÉS
2.3. Méthodes de séparation et d’analyse des acides aminés
2.3.1. Chromatographies
CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE SUR COUCHE MINCE = SÉPARATION SELON POLARITÉ
- échantillon déposé sur phase stationnaire polaire (silice greffée…)
→ bonne affinité des acides aminés polaires, s’accrochent
- phase mobile = mélange de solvants plus ou moins apolaires
→ entraîne les acides aminés apolaires lors de son déplacement par capillarité le
long de la phase stationnaire
- molécules polaires :
→ bonne affinité pour phase stationnaire
→ peu entraînées par phase mobile
- molécules apolaires :
→ moins d’affinité pour phase stationnaire
→ très entraînées par phase mobile
40
Séparation selon la charge
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Acides aminés
Séparation selon la taille
2. LES
ACIDES AMINÉS
Séparation par adsorption
spécifique
2.3. Méthodes de séparation et d’analyse des acides aminés
2.3.1. Chromatographies
CHROMATOGRAPHIE ÉCHANGEUSE D’IONS = SÉPARATION SELON LE PHI (CHARGE)
- phase stationnaire : groupements chargés
→ retiennent les molécules de charge opposée, les autres sont éluées
9
- élution en faisant varier le pH
→ les molécules qui atteignent leur pHi deviennent non chargées et sont éluées
-
l'extrémité inférieure de la colonne.
Un détecteur
enregistre
l'absorbance de la solution en sortie de colonne à une lon
ou élution en augmentant la force
ionique
de l’éluant
déterminée. Il permet de détecter les protéines : un profil d'élution est le plus souven
→ déstabilisation des interactions
entre
molécules et la colonne
temps
réel surles
un enregistreur.
Chromatographie échangeuse d!’ions
chromatographie échangeuse de cations :
- chargée négativement
- retient les cations
- séparation selon les pHi croissants
colonne de
chromatographie
tampon d’élution
Tampon mobile)
d’élution
(phase
(phase mobile)
échantillon
échantillon
billes
Billes fonctionnalisées
fonctionnalisées
(phase
(Phase fixe) fixe)
chromatographie échangeuseChromatographie
d’anions :
de filtration sur gel
- chargée positivement
- retient les anions
Les trois grands types de chromatographie
- séparation selon les pHi décroissants
6 5 4 3 2 1
!
utilisés pour
purifier les protéines
6 5 4 3 2 1
Tampon d’é
(phase mob
41
échantillon
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Acides aminés
2. LES
# Electrophorèse
ACIDES AMINÉS
L’expérience consiste à faire migrer une molécule chargée dans un support solide fibreux ou
poreux (papier, gel) imprégné d’un tampon de pH donné, sous l’effet d’un champ électrique
(généralement constant).
Comme la charge globale
apparente
de l’AA varie
en fonction du pH du
2.3. Méthodes de séparation
et d’analyse
des
acides
aminés
tampon, cette méthode permet de séparer plusieurs AA contenus dans un mélange.
2.3.2. Électrophorèses
Pour déterminer le sens de migration d’un AA, il faut connaître :
le pH poreux
de la solution (papier,
tampon
gel) imprégné d’un tampon à pH donné
- support solide fibreux- ou
- le pHi de l’AA
champ électrique
- migration sous l’effet d’un
- la polarité du champ électrique auquel le système est soumis (orientation du support)
# Si pH < pHi, l’AA aura une charge apparente + → migration vers la cathode
à ce pH donné :
ou - selon nature de l’acide aminé) migrent vers la borne de
- acides aminés chargés (+
# Si pH= pHi, la charge apparente de l’AA est nulle → aucune migration, l’AA reste sur la zone
charge opposée
de dépôt
→ si pH < pHi : charge apparente positive → migration vers la cathode
Si pH > pHi, l’AA aura
une charge
migration vers l’anode.
→ si pH = pHi : charge #apparente
nulle
→ apparente
pas de →
migration
→ si pH > pHi : charge apparente négative → migration vers l’anode
Exemple d’une électrophorèse sur papier à pH 10,8
dépôt
-
+
Anode
1
2
3
4
1 = Asp
2 = Val
3 = His
4 = Arg
Cathode
# Chromatographie sur colonne échangeuse d’ions
À retenir : lors d’une électrophorèse
L’expérience consiste à adsorber des molécules chargées (anions ou cations) sur des billes de
vers l’anode (borne +)
- les anions migrent
résine sur lesquelles sont fixées de façon covalente des radicaux chargés appartenant à différentes
migrent vers la cathode (borne -)
- les cations familles.
42