Phosphopantétheinyl transférase (PPTase)

Développement d’une stratégie d’inhibition
de la 4’-Phosphopantétheinyl transférase
(PPTase) impliquée dans la synthèse d’acides
mycoliques chez Mycobacterium tuberculosis.
Projet de recherche
BENOIT Christelle
BRIHOUM Meryem
Année universitaire 2006/2007
Projet tutoré par DEMANGE Pascal

RÉSUMÉ
La tuberculose est une maladie transmise par l’intermédiaire d’une bactérie :
Mycobacterium tuberculosis. De nombreux traitements existent mais les bactéries acquièrent
une résistance naturelle envers ces médicaments. Dans ce projet de recherche, nous avons
voulu cibler une voie nécessaire à la virulence de la paroi de cette bactérie : la voie de
synthèse des acides mycoliques, et plus particulièrement l’enzyme multi-domaine qui réalise
la dernière étape de condensation, la polykétide synthase 13 (Pks13) qui fait l’objet de
nombreuses études. Des approches par domaines ont montré une difficulté à la cristalliser.
Cette enzyme nécessite une modification post-traductionnelle, afin d’être active : la
phospantethéinylation réalisée par la phosphopantethéinyl transferase qui catalyse le transfert
du bras P-pant du CoenzymeA sur les domaines ACP de Pks13. Il a été montré qu’une
inhibition de l’activation de Pks13 entraîne la mort de M. tuberculosis. C’est la raison pour
laquelle PptT constitue une cible judicieuse pour le criblage d’inhibiteurs.
Pour cela, dans un premier temps nous produirons ACP et PptT recombinantes.
Ensuite nous mettrons au point un test d’activité de la PptT pouvant être miniaturisable afin
de cribler à haut-débit des inhibiteurs. A long terme, cette étude pourrait permettre de trouver
de nouveaux traitements anti-tuberculeux.

ABBRÉVIATIONS
ACP : Acyl Carrier Protein
acpS : gène acpS
AcpS : protéine AcpS
ARN : Acide RiboNucléotide
AT : Acyl transferase
CCM : chromatographie en couche mince
cm : centimètre
CoA : Coenzyme A
DMACA : 7-diméthylaminocoumarin-4-acetic acid
E. Coli : Escherichia Coli
FAS : Fatty Acid Synthase
GC : chromatographie en phase gazeuse
GFP : Green Fluorescent Protein
GST : Gluthation S transférase
His : Histidine
HPLC : Hight Pressure Liquid Chromatography
kDa : kilodalton
KO : knockout
KS : β-keto-acyl synthase
M : molaire, mole par litre
Mtb : Mycobacterium tuberculosis
nm : nanomètre
NTA : Nitriloacétique
pb : paire de base
PCR : Polymerase Chain Reaction
Pks13 : Polykétide synthase 13
P-pant : Phosphopantethéinyl
PPTase : Phosphopantethéinyl transférase
pptT : gène pptT
PptT : protéine PptT
SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis
TE : thioesterase
UV : Ultra-violets

SOMMAIRE
RÉSUMÉ
ABBRÉVIATIONS
I) INTRODUCTION ...............................................................................................................1
1) La tuberculose .....................................................................................................................1
2) Mycobacterium tuberculosis ................................................................................................1
3) Synthèse des acides mycoliques .........................................................................................2
4) Pks13 ....................................................................................................................................3
5) Modification post-traductionnelle et PPTase ...................................................................4
6) Traitements anti-tuberculeux ............................................................................................6
II) RESULTATS .....................................................................................................................7
1) Expression de domaines de Pks13 : Thèse Stéphanie Cabantous ..................................7
2) Caractérisation d’une transférase : Chalut C. et al. .......................................................9
III) PROJET DE RECHERCHE .........................................................................................13
1) Production et purification de PptT et des domaines ACP de Pks13 ............................14
2) Test de l’activité enzymatique de PptT ...........................................................................15
3) Criblage à haut débit d’inhibiteurs de PptT ..................................................................17
4) Validation de la cible ........................................................................................................18
IV) CONCLUSION ET PERSPECTIVES .........................................................................20
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................21

I) INTRODUCTION
1) La tuberculose
La Tuberculose est une infection bactérienne pouvant toucher de nombreux organes :
voies respiratoires, système nerveux, voies cardio-vasculaires. L’agent pathogène responsable
est une bactérie nommée Mycobacterium tuberculosis (Mtb) découverte par Robert Koch en
1882 qui infecte uniquement l’Homme. Cette maladie est en recrudescence dans le monde à
savoir une nouvelle infection chaque seconde. Un tiers de la population mondiale est
actuellement infecté ; 22 pays dans le monde concentrent à eux seuls 80% des cas. Cette
maladie fait aujourd’hui encore plusieurs victimes : 1,7 million de personnes sont mortes de la
tuberculose et 8,5 millions de nouveaux cas chaque année [données OMS 2006].
2) Mycobacterium tuberculosis
Mtb est un bacille qui ne se colore pas facilement et qui est dit « acido-alcoolo-
résistant ». C’est une mycobactérie entourée d’une paroi riche en acides gras complexes
rendant cette dernière peu perméable aux substances hydrophiles et naturellement résistante
aux agents anti-tuberculeux. Son enveloppe est constituée de trois couches de constituants liés
par des liaisons covalentes : le peptidoglycane, l’arabinogalactane et les acides mycoliques
(Figure 1) [Daffe et Draper, 1998 ; McNeil et Brennan, 1991].
Membrane
Paroi
Acides mycoliques
Membrane
Paroi
Acides mycoliques
Figure 1 : Structure de la paroi de Mtb.
Membrane lipidique
Peptidoglycane
Porine
Acyls gras
Acides mycoliques
Arabinogalactane
Lipoarabinomannane
1