Phosphopantétheinyl transférase (PPTase)

Projet de recherche
Développement d’une stratégie d’inhibition
de la 4’-Phosphopantétheinyl transférase
(PPTase) impliquée dans la synthèse d’acides
mycoliques chez Mycobacterium tuberculosis.
BENOIT Christelle
BRIHOUM Meryem
Projet tutoré par DEMANGE Pascal
Année universitaire 2006/2007
RÉSUMÉ
La tuberculose est une maladie transmise par l’intermédiaire d’une bactérie :
Mycobacterium tuberculosis. De nombreux traitements existent mais les bactéries acquièrent
une résistance naturelle envers ces médicaments. Dans ce projet de recherche, nous avons
voulu cibler une voie nécessaire à la virulence de la paroi de cette bactérie : la voie de
synthèse des acides mycoliques, et plus particulièrement l’enzyme multi-domaine qui réalise
la dernière étape de condensation, la polykétide synthase 13 (Pks13) qui fait l’objet de
nombreuses études. Des approches par domaines ont montré une difficulté à la cristalliser.
Cette enzyme nécessite une modification post-traductionnelle, afin d’être active : la
phospantethéinylation réalisée par la phosphopantethéinyl transferase qui catalyse le transfert
du bras P-pant du CoenzymeA sur les domaines ACP de Pks13. Il a été montré qu’une
inhibition de l’activation de Pks13 entraîne la mort de M. tuberculosis. C’est la raison pour
laquelle PptT constitue une cible judicieuse pour le criblage d’inhibiteurs.
Pour cela, dans un premier temps nous produirons ACP et PptT recombinantes.
Ensuite nous mettrons au point un test d’activité de la PptT pouvant être miniaturisable afin
de cribler à haut-débit des inhibiteurs. A long terme, cette étude pourrait permettre de trouver
de nouveaux traitements anti-tuberculeux.
ABBRÉVIATIONS
ACP : Acyl Carrier Protein
TE : thioesterase
acpS : gène acpS
UV : Ultra-violets
AcpS : protéine AcpS
ARN : Acide RiboNucléotide
AT : Acyl transferase
CCM : chromatographie en couche mince
cm : centimètre
CoA : Coenzyme A
DMACA : 7-diméthylaminocoumarin-4-acetic acid
E. Coli : Escherichia Coli
FAS : Fatty Acid Synthase
GC : chromatographie en phase gazeuse
GFP : Green Fluorescent Protein
GST : Gluthation S transférase
His : Histidine
HPLC : Hight Pressure Liquid Chromatography
kDa : kilodalton
KO : knockout
KS : β-keto-acyl synthase
M : molaire, mole par litre
Mtb : Mycobacterium tuberculosis
nm : nanomètre
NTA : Nitriloacétique
pb : paire de base
PCR : Polymerase Chain Reaction
Pks13 : Polykétide synthase 13
P-pant : Phosphopantethéinyl
PPTase : Phosphopantethéinyl transférase
pptT : gène pptT
PptT : protéine PptT
SDS-PAGE :
sodium
dodecyl
sulfate
polyacrylamid
gel
electrophoresis
SOMMAIRE
RÉSUMÉ
ABBRÉVIATIONS
I) INTRODUCTION ...............................................................................................................1
1) La tuberculose .....................................................................................................................1
2) Mycobacterium tuberculosis ................................................................................................1
3) Synthèse des acides mycoliques .........................................................................................2
4) Pks13 ....................................................................................................................................3
5) Modification post-traductionnelle et PPTase ...................................................................4
6) Traitements anti-tuberculeux ............................................................................................6
II) RESULTATS .....................................................................................................................7
1) Expression de domaines de Pks13 : Thèse Stéphanie Cabantous ..................................7
2) Caractérisation d’une transférase : Chalut C. et al. .......................................................9
III) PROJET DE RECHERCHE .........................................................................................13
1) Production et purification de PptT et des domaines ACP de Pks13 ............................14
2) Test de l’activité enzymatique de PptT ...........................................................................15
3) Criblage à haut débit d’inhibiteurs de PptT ..................................................................17
4) Validation de la cible ........................................................................................................18
IV) CONCLUSION ET PERSPECTIVES .........................................................................20
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................21
I) INTRODUCTION
1) La tuberculose
La Tuberculose est une infection bactérienne pouvant toucher de nombreux organes :
voies respiratoires, système nerveux, voies cardio-vasculaires. L’agent pathogène responsable
est une bactérie nommée Mycobacterium tuberculosis (Mtb) découverte par Robert Koch en
1882 qui infecte uniquement l’Homme. Cette maladie est en recrudescence dans le monde à
savoir une nouvelle infection chaque seconde. Un tiers de la population mondiale est
actuellement infecté ; 22 pays dans le monde concentrent à eux seuls 80% des cas. Cette
maladie fait aujourd’hui encore plusieurs victimes : 1,7 million de personnes sont mortes de la
tuberculose et 8,5 millions de nouveaux cas chaque année [données OMS 2006].
2) Mycobacterium tuberculosis
Mtb est un bacille qui ne se colore pas facilement et qui est dit « acido-alcoolorésistant ». C’est une mycobactérie entourée d’une paroi riche en acides gras complexes
rendant cette dernière peu perméable aux substances hydrophiles et naturellement résistante
aux agents anti-tuberculeux. Son enveloppe est constituée de trois couches de constituants liés
par des liaisons covalentes : le peptidoglycane, l’arabinogalactane et les acides mycoliques
(Figure 1) [Daffe et Draper, 1998 ; McNeil et Brennan, 1991].
Figure 1 : Structure de la paroi de Mtb.
Membrane lipidique
Acides mycoliques
Paroi
Paroi
Peptidoglycane
Porine
Acyls gras
Arabinogalactane
Lipoarabinomannane
Membrane
Acides mycoliques
1
3) Synthèse des acides mycoliques
La particularité de la paroi de ces bactéries réside dans la présence d’acides
mycoliques. Ce sont des acides gras particuliers constitués d’un acide β-hydroxylé et une
longue chaîne carbonée (60-90 carbones). Leur voie de biosynthèse est complexe et se
déroule en 6 étapes (Figure 2) [Barry, Lee et al. 1998]. Tout d’abord, la polyenzyme FAS I
(Fatty Acid Synthase I) synthétise les acides gras précurseurs à partir d’acétyl-CoA et de
malonyl-CoA. L’élongation de la chaîne d’acides gras se fait par un complexe protéique FAS
II : AcpM, KasA, KasB, InhA, MabA, FabD, AccB à partir de Malonyl-CoA pour former
l’acide α-méromycolique. Ensuite ce dernier va être modifié par l’ajout d’insaturations cis
grâce à deux Désaturases. Les enzymes CMAS-1, CMAS-2 et deux SAM vont remplacer ces
doubles liaisons par des groupes cyclopropanes qui contribuent à l’intégrité de la paroi de la
cellule et confèrent à la bactérie une protection contre le stress oxydatif [Takayama, Wang et
al. 2005]. L’étape de
condensation de l’acide méromycolique avec un acyl-CoA à 26
carbones est réalisée par la polykétide synthase 13 (Pks 13) [Portevin et al., 2004]. Enfin, une
réductase va hydroxyler le groupement carboxyle de la chaîne néoformée.
Figure 2 : Voie de biosynthèse
des acides mycoliques. L’enzyme
FAS I va synthétiser un acyl-CoA
à partir de malonyl-CoA et
d’acétyl-CoA.
Le
complexe
enzymatique FAS II va allonger la
chaîne d’acides gras néoformée.
Deux désaturases vont apporter
les insaturations. Pks13 va
permettre la condensation de
l’acide
α-méromycolique
préformée avec un acyl-CoA. Une
réductase va réduire l’acide gras
formé en acide mycolique.
Pks13
2
Les polykétides synthases impliquées dans la synthèse d’acides mycoliques, essentiels à la
virulence de Mycobacterium tuberculosis, sont des cibles envisageables pour le
développement de nouveaux anti-tuberculeux.
Les médicaments ciblant la voie de synthèse des acides mycoliques inhibent les enzymes
FAS (voir paragraphe 6)). Les mycobactéries ont acquis des systèmes de résistance leur
permettant d’échapper à leur actions. En effet, elles subissent des mutations au niveau des
gènes codant pour les cibles pharmacologiques entraînant la non-reconnaissance des drogues
(Veziris, et al 2005). C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de nous intéresser à la
protéine responsable de la modification post-traductionnelle de la protéine.
4) Pks13
Nous allons nous intéresser à l’enzyme impliquée dans l’étape de condensation de la
chaîne méromycolique, la polykétide synthase 13 (Pks13). Il s’agit d’une protéine multidomaines (Figure 3) de type I, c'est-à-dire que les domaines se trouvent sur la même chaîne
polypeptidique, composée de 1733 acides aminés et d’un poids moléculaire de 186 kDa dont
la localisation cellulaire n’est encore pas élucidée. Dans la partie N-terminale (aa 16-91) de la
protéine, le domaine Acyl Carrier Protein (ACP) est le domaine sur lequel va venir se fixer la
chaîne méromycolique via une liaison faisant intervenir un soufre après avoir été
« sélectionné » et transférer par le domaine Acyl transferase (AT, 305 aa) [Takayama, Wang
et al. 2005] (Figure 4). Un domaine identique, situé entre les acides aminés 1228 et 1276,
intervient également pour la fixation de l’acyl CoA à 26 carbones. Après l’ancrage des deux
chaînes, la délocalisation de l’acide méromycolique sur le domaine β-keto-acyl synthase (KS,
422 aa) va permettre la réaction de décarboxylation et donc de condensation pour former
l’acide mycolique après réduction. Enfin un dernier domaine est présent sur la chaîne
peptidique au niveau de l’extrémité C-terminale, il s’agit du domaine thioesterase (TE, 75aa)
qui catalyse la libération du produit.
76 aa
N
15 aa 28 aa
ACP
422 aa
304 aa
KS
AT
172 aa
49 aa
ACP
210 aa
74 aa
TE
C
217 aa
166 aa
Figure 3 : Localisation et taille des différents domaines catalytiques présents sur la protéine
Pks13 par analyse bioinformatique.
ACP : Acyl Carrier Protein ; KS : β-keto-acyl synthase ; AT : Acyl transferase ; TE : thioesterase.
On note 2 domaines ACP1 et ACP2 situés en N-terminal et en C-terminal de Pks13 respectivement
3
ACP
ACP
ACP
ACP
ACP
ACP
ACP
ACP
Figure 4 : Etape de condensation et de
réduction lors de la synthèse d’acides
mycoliques par Pks13.
(1) : liaison de la chaîne d’acides gras
préformée (α-Meroacyl-AMP) sur le
domaine ACP1 activée de Pks13. Un acyl
CoA (2-Carboxyl-C26-S-CoA) se fixe sur
l’ACP2.
(2) : délocalisation de l’acide méromycolique
greffée du domaine ACP1 sur la Sérine du
domaine KS.
(3-4) : condensation (-CO2) et réduction
(+2H) des deux chaînes.
Des essais de cristallographie ont été tentés sur cette protéine sans aucun résultat.
L’hypothèse serait que la majorité de cette protéine, comme la plupart des protéines de
Mycobaterium tuberculosis qui sont exprimées chez E. Coli, serait localisée dans des corps
d’inclusion. Ainsi, une approche par domaine a été réalisée afin d’obtenir les domaines de
Pks13 solubles et cristallisables et de pouvoir remonter jusqu’à la structure de la protéine
entière [thèse Stéphanie Canbantous, 2005].
Pour trouver ces domaines solubles, l’approche du « domaine trapping » a été utilisée. Il s’agit
d’une stratégie de fragmentation de la protéine entière suivi d’un criblage de solubilité par la
méthode du Split-GFP. Les fragments ainsi obtenus ont été séquencés et superposés à la
séquence de la protéine Pks13. La démarche ainsi que les résultats seront développés dans la
partie « résultats ». Les auteurs espèrent donc pouvoir cristalliser ces domaines et avoir accès
à la structure de la protéine. Les domaines ACP de Pks13 ont été purifiés associés à d’autres
domaines (KS ou TE). Des études ont été menées sur ce domaine ACP et il a été montré qu’il
subit une modification post-traductionnelle : la 4’-phosphopantéthéinylation.
5) Modification post-traductionnelle et PPTase
Mycobacterium tuberculosis contient environ 20 enzymes qui requierent une
activation afin d’être fonctionnelles. Les domaines ACP des acides gras synthases (FAS) et
4
des polykétides synthases (Pks), et notamment Pks13, subissent une modification posttraductionelle afin de passer d’une forme inactive (apo-ACP) en forme active (holo-ACP).
Cette modification se fait au niveau de la sérine (55 pour le premier domaine ACP, 1266 pour
le deuxième) conservée d’un motif GX(D/H)S(L/I)(D/K) par une 4’-phosphopantethéinyl
transferase (PPTases) [Mofid et al., 2002]. Cette dernière va catalyser le transfert du
groupement 4’-phosphopantethéine du coenzyme A (CoA) [Lambalot et al ; 1997] par une
attaque nucléophile du groupement hydroxyle de la sérine vers le lien 5’-β-pyrophosphate du
coenzyme A (Figure 5). Cette réaction est magnésium-dépendante [Lambalot et al ; 1996] et
fait intervenir deux substrats, le Coenzyme et le domaine ACP.
Figure 5 : Activation de
l’apo-carrier protéine en holo-carrier protéine. La 4’phospantethéinyl transferase (PPTase) va transférer le groupement 4’-Phospho-pantethéine (bras Ppant) du CoenzymeA sur le groupement OH de la Sérine du domaine ACP, entraînant un incrément
de masse de 340 unités de masse (holo-carrier protéine). Cette réaction est magnésium dépendante
etentraîne une libération de 3’,5’-ADP.
Les PPTases sont classées en 2 groupes en fonction de leur séquence primaire et de
leurs substrats : les AcpS et les Sfp [Reuter et al ; 1999]. Les AcpS ont une taille de 120
acides aminés, sont hétérotrimères et sont impliquées dans la modification des enzymes FAS ;
alors que les Sfp (PptT), découvertes chez Bacillus subtilis, ont une taille de 240 acides
aminés, agissent en monodimère et sont impliquées dans la modification des Pks de type I et
donc de Pks13.
Il a été montré qu’une délétion du gène codant pour l’enzyme PptT (Rv2794) chez
Mtb abolissait la synthèse d’acides mycoliques ce qui démontrerait que Pks13 serait un
substrat de PptT. La mutation a de plus entraîné la mort de la bactérie, ce qui suggère un rôle
essentiel de cette enzyme pour la viabilité de la bactérie [Chalut et al. ; 2005]. Les résultats de
cette publication seront repris dans le chapitre « résultats ».
5
De part ces observations, il s’avère que PptT est une cible très intéressante dans la
découverte de nouveaux médicaments anti-tuberculeux.
6) Mode d’action des antibiotiques anti-tuberculeux
De nos jours, il existe quatre antituberculeux principaux : l’isoniazide, la Rifampicine,
le Pyrazinamide et l’éthambutol [Veziris, Cambau et al. 2005]. Le traitement de la tuberculose
nécessite la prise quotidienne durant 6 mois de isoniazide et de rifampicine complémentés
durant les deux premiers mois des deux autres antibiotiques.
L’isoniazide (hydrazide de l’acide nicotinique) agit sur la synthèse des acides mycoliques en
inhibant une enzyme du complexe protéique FAS II, InhA impliquée dans l’élongation de la
chaîne d’acides gras et favorise la formation de radicaux libres toxiques pour la bactérie. Il
n’est actif que chez les mycobactéries. La rifampicine (famille des rifamycines) inhibe
l’initiation de la transcription en se fixant sur la sous-unité β de l’ARN polymérase empêchant
ainsi la synthèse protéique. Le pyrazinamide (dérivé du nicotinamide) n’est actif que sur deux
souches de Mycobacterium dont Mtb. Il nécessite un pH acide et une enzyme pour le
transformer en produit bactéricide l’acide pyrazinoïque qui agirait sur FAS I (synthèse des
acides gras précurseurs). La cible de l’éthambutol est une enzyme, l’arabinosyl transferase
intervenant dans la liaison arabinose-galactane. De ce fait, les acides mycoliques ne pourront
pas venir se lier sur le motif arabinogalactane (constituant de la paroi).
Les mycobactéries ont acquis des systèmes de résistance à ces antibiotiques dus aux
mutations des gènes codant pour leurs cibles. C’est la raison pour laquelle il serait
envisageable de cibler des protéines intervenant dans l’activation des enzymes essentielles à
la synthèse des acides mycoliques.
6
II) RESULTATS
1) Développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines basées sur
la GFP. Application à la définition de domaines solubles de la polykétide synthase Pks13
de Mycobacterium tuberculosis [thèse de l’Université Paul Sabatier Toulouse Cabatous,
2005].
La polyketide synthase 13 est une enzyme multi-domaine difficile à cristalliser. La
stratégie mise en place par les travaux de thèse de S. Cabantous a pour objectif de solubiliser
chaque domaine afin de pouvoir les cristalliser. Pour cela, elle a mis au point un test de
criblage de solubilité des protéines par la technique du Split-GFP.
Génération des domaines de Pks13
Après avoir amplifié le gène codant pour Pks13 (Rv3800) inséré dans le plasmide
pWM35 une digestion à la DNase I a été réalisée. Cette enzyme coupe généralement après des
bases pyrimidiques et ainsi, trois librairies de fragments ont été obtenus (librairie I contenant
les plus petits fragments 300-1500 pb, librairie II avec des fragments de 1000-3000 pb et la
librairie III comprenant les plus longs fragments 1500-400 pb). Ces trois librairies ont été
ensuite clonées dans des plasmides chez E. Coli afin de sélectionner les clones en phase.
Test de solubilité par la méthode du Split-GFP
La méthode du Split-GFP utilise la propriété de complémentation de fluorescence de
la Green Fluorescent Protein (GFP). Cette protéine a un poids moléculaire de 30 kDa et
comporte 11 feuillets β et une hélice α qui forme le chromophore. La GFP peut être clivée en
deux fragments, un qui contient les feuillets β 1 à 10 qui va pouvoir venir complémenter le
11ème feuillet β fusionné à une protéine (Figure 6).
X
Aggrégation
Figure 6 : Principe du Split-GFP
La protéine recombinante X est liée au petit
fragment de la GFP (s11 : feuillet β 11) par un linker
L. Si X est soluble alors s11 va se complémenter
avec le grand fragment de la GFP (1-10 : feuillet β
1 à 10) co-exprimée, ainsi une émission de la
fluorescence est visualisée. Si la protéine est agrégée
(insoluble), la complémentation ne se fera pas et
donc il n’y aura pas émission de fluorescence.
7
Cette méthode permet donc de tester la solubilité des protéines in vivo. Dans sa thèse, S.
Cabantous utilise cette méthode pour cribler les clones qui expriment les fragments de Pks13
solubles.
Figure 7 : Criblage de solubilité
utilisant le Split-GFP des trois
librairies. Images de colonies
cellulaires fluorescentes après
complémentation des fragments
de GFP pour les 3 librairies.
D’après la Figure 7, peu de fragments de la troisième librairie apparaissent fluorescents. Ceci
s’explique en partie par le fait que cette librairie contient les fragments les plus longs et donc
peu solubles.
Caractérisation des fragments
Après le criblage, les fragments solubles sont récupérés par PCR sur colonies et
séquencés puis alignés sur la séquence de Pks13 par bio-informatique (Figure 8).
Figure 8 : Carte des domaines
solubles de Pks13 obtenus après
la méthode du domaine trapping.
Alignement des fragments solubles
criblés par Split-GFP et séquencés
sur la protéine Pks13.
8
La carte des domaines solubles révèle une hétérogénéité, en effet, la plupart des fragments
sont alignés avec la partie C-terminale et plus particulièrement au niveau des domaines ACP2
et TE. Peu de fragments solubles correspondant au domaine KS ont été trouvés. Dans la partie
N-terminale, quelques fragments s’alignent avec la séquence du domaine ACP1.
L’approche de l’étude par domaine de Pks13 par Split-GFP a permis de montrer d’une
part que les domaines structuraux de Pks13 ayant une taille de plus de 100 acides aminés sont
peu solubles. D’ou la difficulté de cristalliser cette dernière. Des 2 domaines ACP, il en
résulte que celui situé dans la partie C-terminale présente une solubilité supérieure à celui
situé en N-terminal. Cette différence s’expliquerait par leur différence de taille : ACP2 (49
acides aminés) est plus petit que ACP1 (76 acides aminés). Dans notre projet, nous nous
intéresserons aux domaines ACP pouvant être produits chez E. Coli sous forme solubles et
plus particulièrement le domaine ACP2.
2) Rôles non redondants de deux 4’-phosphopantetheinyl transferases chez Mycobacteria
[Chalut et al., 2006]
La 4’-phosphopantéthéinylation est catalysée par l’enzyme PPTase (cf introduction).
Dans le génome de la souche M. tuberculosis H37Rv (Cole et al, 1998) deux gènes codant
pour des enzymes de ce type ont été identifiés : acpS et pptT. Cependant aucune étude sur le
rôle de chacune de ces enzymes n’a été entreprise chez Mycobacteria. Dans des travaux
publiés par Chalut et al. en 2006, les auteurs ont rapporté que des orthologues de ces deux
PPTases ont été trouvés dans le génome des espèces Corynebacterinea. Ils ont démontré
qu’elles sont essentielles pour la viabilité des mycobactéries et qu’elles présentent des
fonctions identiques chez les mycobacteries et les corynebacteries : AcpS est responsable de
la modification post-traductionnelle de Fas-I, alors que PptT active l’enzyme Pks13 ainsi que
des polykétides synthases de type I.
AcpS et PptT sont impliquées dans la biosynthèse des acides gras et des acides mycoliques
respectivement, chez C. glutamicum
Des expériences de chromatographie en phase gazeuse (GC) et de chromatographie en
couche mince (CCM) ont démontré que des mutations de acpS par knockout (KO) chez C.
glutamicum entraînait l’absence de synthèse d’acides gras en C16-C18 et de l’activation de
Fas-I alors que la synthèse d’acides mycoliques et l’activation de Pks13 n’étaient pas
9
affectées. Par contre, la délétion de pptT
abolissait la synthèse d’acides mycoliques et
l’activation de Pks13, mais n’avait aucun effet sur la production d’acides gras
et sur
l’activation de Fas-I. Ces résultats démontrent que Pks13 est un substrat de PptT et que AcpS
est responsable de l’activation de Fas-I.
PptT catalyse la 4’-Phosphopantethéinylation des Pks de type I chez M. tuberculosis
Les auteurs ont coproduit les protéines recombinantes de M. tuberculosis Pks13 et
PptT à partir des plasmides pMW35 et pLSfp respectivement sous le contrôle du promoteur
T7. La souche transformée est une souche bactérienne de E.Coli BL21ΔentD, mutée en
PPTase endogène susceptible d’activer Pks13. Afin de visualiser le transfert du groupement
prosthétique, un pool de coenzymeA a été radiomarqué avec du β−[β−14C]alanine. Un
plasmide pWM35γ, porte le gène qui code pour une protéine Pks13 dont les 2 résidus sérines
(S55 et S1266) responsables de l’attachement du groupement P-pant du coenzymeA, ont été
mutés par des résidus alanine. Lorsque ce mutant est co-exprimé avec PptT, Pks13 ne porte
pas le groupement P-pant radioactif (Figure 9). Ce résultat indique que les 2 résidus sérines
sont essentiels à l’attachement du groupement prosthétique.
Figure 9 : Marquage de la 4’-Phosphopantetheinylation
utilisant β-[β-14 C]alanine.
Des extraits cellulaires de E .Coli ont été séparés par SDSPAGE puis colorés au Bleu de Coomassie (gel du bas). Les
flèches indiquent la présence de Pks13 à 186 kDa. Une
autoradiographie a été réalisé afin de visualiser la
radioactivité du bras P-pant au niveau de Pks13 (partie du
haut).
Pks13* : enzyme recombinante portant la mutation au
niveau des 2 sérines S55 et S1266.
Des expériences similaires sur d’autres Pks de type-I (Mas et PpsA-D) impliquées dans la
biosynthèse des lipides nécessaires à la virulence de M. tuberculosis ont permis de démontrer
qu’elles sont également activées par PptT.
Les auteurs démontrent qu’ils arrivent à produire la PptT et Pks13. De plus, ces expériences
permettent de mettre en évidence que Pks13 est un substrat de PpT chez M.tuberculosis.
PptT ne catalyse donc pas seulement l’activation de Pks13 mais de d’autres enzymes Pks de
type-I.
10
PptT est essentiel pour la viabilité de Mycobacterium Bovis
A présent, les auteurs ont voulu savoir si PptT serait essentielle à la survie d’une des
souches de M. tuberculosis. Pour cela, ils ont généré des mutants conditionnels ΔpptT d’une
souche du bacille M. bovis par knockout en utilisant le système d’expression TetR (Ehrt.S et
al ; 2005). Cette souche recombinante PMM99 (ΔpptT : pC-pptTmb) contient un plasmide de
complémentation pC-pptTmb codant pour le gène fonctionnel pptT de M. bovis sous le
contrôle du promoteur pmyc1tetO inductible à l’anhydrotetracycline (ATc). Les souches
sauvages WT et mutées PMM99 poussent normalement quand pptT est exprimé (+ATc)
(Figure 10) mais une inhibition de la croissance de PMM99 est observée en absence de pptT
(-ATc).
Ces résultats démontrent l’importance de pptT sur la viabilité des souches de M.
tuberculosis et que l’absence de pptT ne peut pas être complémentée par l’AcpS endogène.
Figure 10 : Effet de la déplétion de PptT
sur la croissance de M. Bovis CalmetteGuérin.
Les souches sauvages WT et mutées PMM99
(ΔpptT : pC-pptTmb) ont été cultivées dans
un milieu de croissance à 37°C pendant 20
jours supplémenté en anhydrotetracycline
(+ATc) ou non (-ATc).
Les auteurs proposent un modèle du métabolisme lipidique chez les mycobactéries et
les corynebactéries dans lequel AcpS est responsable des modifications post-traductionnelles
de Fas-I et de la sous-unité AcpM de FAS-II alors que PptT active de nombreuses polykétides
synthase de type-I impliquées dans la biosynthèse des lipides nécessaires à la virulence de M.
tuberculosis dont Pks13 (Figure 11). Les enzymes MbtB et MbtD-F, activées par PptT, sont
impliquées dans l’assemblement de mycobactines qui représentent des facteurs de virulence.
Ces résultats démontrent que les 2 PPTases ne sont pas redondantes et agissent sur des
répertoires de substrats différents.
L’intérêt d’inhiber la protéine PptT, dans ce projet de recherche, réside dans
l’importance du nombre de protéines qu’elle régule. De plus les mycobactéries ayant
développé des phénomènes de résistance aux antibiotiques (cf. introduction), il est judicieux
de cibler des modifications post-traductionnelles.
11
Figure
11
Figure 11 : Diagramme schématique du rôle de AcpS et PptT dans les voies de biosynthèses
des acides gras, des acides mycoliques, des lipides contenant des méthyls branchés et des
siderophores chez M. tuberculosis.
Seules les protéines nécessitant une 4’-phosphopantethéinylation sont indiquées. Les protéines
activées par PptT sont encadrées dans des rectangles et celles modifiées par AcpS sont
encerclées.
p-HBA :
acide
para-hydroxybenzoique ;
SL-1 :
sulfolipide ;
PAT :
polyacyltréhaloses.
12
III) PROJET DE RECHERCHE
Ce projet de recherche a pour objectif le développement d’une stratégie afin d’inhiber
l’activité post-traductionnelle de la 4’-Phosphopantétheinyl transférase (PPTase) impliquée
dans la synthèse d’acides mycoliques chez Mycobacterium tuberculosis à deux niveaux (FAS
I et Pks 13).
Tout d’abord, la protéine devra être produite dans un hôte où elle sera soluble et
active. La stratégie envisagée consistera à produire la protéine chez E. Coli. Chalut et al. ont
montré que la protéine recombinante produite chez E. Coli est fonctionnelle. Ensuite, un test
d’activité in vitro de la PPTase (PptT) sera mis en place en vue d’un criblage haut débit
d’inhibiteurs, en utilisant la réaction catalysée par cette enzyme, à savoir le transfert du motif
4’-p-pant du Coenzyme A, sur le domaine ACP de la polykétide synthase.
STRATEGIE EXPERIMENTALE
Production chez E.coli - domaines Acp-6His
- PptT-GST avec site de clivage à la thrombine
Purification des domaines ACP sur colonne Nickel NTA
de la PptT sur billes glutathion (achat sur catalogues)
Etapes de concentration ? (précipitation au sulfate d’ammonium, …)
Mise en place du test d’activité enzymatique avec le coenzymeA fluorescent
Miniaturisation du protocole du test d’activité sur plaques greffées avec NTA 96 puits
Criblage haut-débit plaques noires greffées avec NTA 384 puits avec chimiothèque du CNRS (3000 molécules)
Confirmation des inhibiteurs potentiels sur la protéine Pks13 en entière
Test de perméabilité de la paroi de M. tuberculosis
Détermination des paramètres biochimiques d’interactions
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1) Production et purification de PptT et du domaine ACP2 de Pks13
Production et purification de PptT
Afin de produire l’enzyme d’intérêt, nous utiliserons le matériel et les conditions
utilisés par Chalut et al. en 2006. La séquence du gène d’intérêt pptT (Rv2794c) est
récupérée par PCR à partir de l’ADN génomique de la souche M. tuberculosis H37Rv. Le
gène est inséré dans un vecteur d’expression procaryote pET26b en aval d’un promoteur T7
inductible à l’IPTG. Afin de purifier la protéine recombinante PptT, une séquence codant pour
la GST (Glutathion S-transferase) sera clonée dans le vecteur de façon à se retrouver en Cterminale de la PptT. Une séquence de coupure à la thrombine sera également insérée entre le
gène d’intérêt et le tag. La production s’effectuera dans une souche bactérienne d’expression
de E.Coli BL21. Après croissance bactérienne, induction et récupération du lysat cellulaire,
une étape de purification sera réalisée sur colonne glutathion.
Production et purification des domaines ACP de Pks13
De même que précédemment, les conditions de production des domaines ACP seront
identiques à celles utilisées par les travaux de Chalut. La séquence du domaine ACP2 sont
récupérées à partir du gène pks13 (Rv3800) par PCR à partir de l’ADN génomique de M.
tuberculosis H37Rv. Les fragments sont insérés dans un vecteur d’expression procaryote
pET26b en aval d’un promoteur T7. Ce vecteur contiendra une séquence codant pour un tag
6-His. La production s’effectuera dans une souche d’expression E.Coli BL21ΔentD dont la
PptTase endogène est mutée, évitant ainsi l’activation des domaines ACP produits. La
purification sera réalisée par colonne de Nickel-NTA. De même, que précédemment, nous
nous attendrons à obtenir une production de l’ordre de 20mg/L.
Afin de s’assurer que les protéines récupérées correspondent bien à celles attendues,
nous allons réaliser un gel SDS-PAGE où nous déposerons dans un puits les marqueurs de
poids moléculaire (PM), dans un autre puits le domaine ACP2 que nous détecterons à un PM
de 5,4 kDa et dans un dernier puits la PPTase attendue à un PM de 25 kDa.
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2) Mise en place d’un test d’activité enzymatique de PptT
PptT catalyse le transfert du bras P-pant du CoA sur la Sérine du domaine ACP de
Pks13. Les études réalisées jusqu’à présent pour détecter le transfert de ce groupement
prosthétique repose sur l’utilisation de techniques basées sur la radioactivité et sur la HPLC
[Liu Q. et al.]. Cependant, en vue d’un criblage à haut-débit, il est difficile voire impossible
de les miniaturiser. A présent, il est nécessaire de mettre en place un test d’activité
enzymatique permettant de visualiser ce transfert. La littérature rapporte que seule une équipe,
Meier J.L. et Burkart M.D., ont développé un test basé sur la synthèse d’analogues du CoA à
partir d’analogues de groupements pantethéines fluorescents. Ils ont ainsi visualisé in vitro la
phosphopantethéinylation du domaine VibB de Vibriobacter cholerea par l’enzyme Sfp
(PPTase) de Bacillus subtilis. Nous allons appliquer cette technique à notre projet de
recherche, afin de détecter l’activité enzymatique de PptT.
Synthèse de l’analogue du Coenzyme A
L ’analogue du CoA fluorescent est produit suivant la voie de biosynthèse du CoA
chez E.Coli selon le modèle suivant (Figure 12) : un analogue de la pantethéine contenant un
groupement fluorescent est synthétisé chimiquement et incorporé dans la cellule bactérienne
qui va l’intégrer dans la voie de biosynthèse du Coenzyme A. Tout d’abord, l’enzyme CoaA
réalise la phosphorylation de la pantethéine, ensuite le CoaD greffe un AMP au niveau du
groupement phosphate, enfin le CoaE va phosphoryler l’extrémité 3’ de l’AMP greffé pour
obtenir un analogue du CoA fluorescent.
Figure 12 : Voie de biosynthèse du Coenzyme A chez E. Coli. L’enzyme CoaA va phosphoryler
l’analogue du bras P-pant fluorescent incorporée dans la cellule bactérienne à partir de l’ATP
endogène. Le CoaD va rajouter un ADP au niveau du groupement phosphate. Le CoaE va
phosphorylé l’ADP précedemment greffé grâce à de l’ATP pour obtenir l’analogue du coenzyme A
fluorescent.
fluorophore.
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Cette voie de synthèse va être appliquée in vitro en apportant les enzymes nécessaires (CoaA,
CoaD, CoaE) et l’analogue de pantethéine. Ce dernier va être synthétisé par voie chimique en
utilisant comme groupement fluorescent l’acide 7-diméthylaminocoumarin-4-acétique
(DMACA) (Figure 13). Il a la particularité d’absorber la lumière à une longueur d’onde de
370 nm (UV) et d’émettre une fluorescence bleue à un longueur d’onde de 459 nm. Son
coefficient d’extinction molaire a une valeur d’environ 22000 cm-1.M-1.
Figure 13 : Analogue de la
pantethéine fluorescente utilisé
contenant
un
groupement
Coumarine fluorescent et un
linker PEG2. PEG2 Linked
DMACA Pantoic.
Les enzymes CoaA, E recombinantes (données par Suzanne Jackowski) et CoaD (donnée par
D. Drueckhammer) ainsi que de l’ATP vont être rajoutées à l’analogue de la pantethéine
fluorescente pour former l’analogue du CoA (Figure 14) que nous allons utiliser par la suite.
Figure 14 : Analogue du
CoA fluorescent utilisé. PEG2
Linked DMACA Pantoic.
Meier et al. en 2006 ont testé la fluorescence de nombreux composés et l’analogue ci-dessus
PEG2 Linked DMACA Pantoic semble présenter une intensité de fluorescence plus
importante que les autres après quantification.
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Test enzymatique
La réaction enzymatique va être réalisée in vitro en incubant 1µM de domaines ACP,
25nM de PPTase, analogue du CoA, 10mM de MgCl2 dans du Tris/HCl 50mM pH 7,5
pendant 30 min à 37°C selon le protocole de Mofid et al. en 2002.
Afin de déterminer la concentration nécessaire en Coenzyme A, nous allons tester une gamme
de concentrations entre 25 et 100µM.
La détection du transfert du bras P-pant sur le domaine ACP va être réalisée sous UV.
3) Criblage à haut débit d’inhibiteurs de PptT
Pour réaliser le criblage haut débit des inhibiteurs potentiels de la PPTase, il faut tout
d’abord passer par une étape de miniaturisation pour pouvoir ensuite cribler la chimiothèque
choisie.
Miniaturisation de l’essai
Nous allons faire des essais de miniaturisation du test d’activité enzymatique décrit cidessus. En effet, nous allons vérifier avec des volumes finaux de 25 µL que le fluorophore
présente la même sensibilité sur des plaques 384 puits (Invitrogen).
Criblage haut débit
Les plaques utilisées sont de couleur noire pour éviter une interférence de fluorescence
avec les puits voisins, elles seront greffées avec du nickel afin de pouvoir retenir le domaine
ACP2. Ensuite, après plusieurs lavages pour éliminer les protéines non attachées, l’analogue
du Coenzyme A fluorescent sera rajouté avec l’inhibiteur. Enfin, l’enzyme (PPTase) sera
incorporée au mélange. La réaction se fera durant 30 minutes. Les puits des plaques seront
lavés afin de retirer tous les fluorophores non fixés sur le domaines ACP, nous visualiserons
ainsi le transfert du bras P-pant sous UV à 370nm. Les concentrations (quantités) utilisées
seront déterminées lors de la miniaturisation.
Les contrôles de ce test se feront en mettant dans différents puits de chacune des plaques 384
puits : le domaine ACP2 avec l’analogue CoA seul et du Mg2+ ; le domaine ACP2 avec
l’enzyme seule et du Mg2+ ; le domaine ACP2, l’analogue du CoA, l’enzyme et le Mg2+.
L’inhibiteur provient de la chimiothèque que nous avons choisi à savoir celle du CNRS. Elle
est composée de plus de 3000 molécules (extraits naturels et produits de synthèse).
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4) Validation de la cible
Une fois le criblage réalisé, les inhibiteurs « positifs » devront être validé c'est-à-dire
vérifier que se sont bien des inhibiteurs et non des faux-positifs.
Vérification de l’inhibiteur
Tout d’abord, il est nécessaire de vérifier si l’inhibiteur potentiels n’interfère pas dans
la mesure de fluorescence en faisant un spectre d’absorption et d’émission. Le spectre ne doit
pas se chevaucher avec celui de notre analogue fluorescent.
Confirmation des inhibiteurs potentiels sur la protéine Pks13 entière
Afin de s’assurer que les « hits » inhibent bien la phosphopantethéinylation, des tests
vont être réalisés in vitro.
Tout d’abord, les conditions du criblage vont être reproduites afin d’être confirmée. Ensuite,
le(s) inhibieur(s) sera (seront) testés sur la protéine Pks13. La polykétide sera produite chez E.
Coli. Le gène de Pks13 (Rv3800) sera amplifié par PCR à partir de l’ADN total de Mtb et
inséré dans un vecteur d’expression pET26b de E. Coli sous le contrôle du promoteur T7 pour
obtenir le plasmide pWM35 ; la souche E. Coli transfectée sera délétée de la PPTase
endogène pour ne pas interférer dans notre expérience (souche BL21ΔentD) . La protéine sera
fusionnée avec un tag poly-His qui permettra ensuite sa purification.
L’apoenzyme et l’holoenzyme ont une différence de taille de 340 uma ; cette différence est
détectable en HPLC. En effet, la polykétide synthase non activée a un volume d’élution plus
important que celui de l’holoenzyme. Ainsi, une expérience avec la polykétide synthase, la
PPTase, le Coenzyme A et l’inhibiteur potentiel pourra être menée pour vérifier si le transfert
du bras P-pant a eu lieu ou pas [Liu et al.].
Toutes ces expériences vont permettre de vérifier que la molécule criblée agit en tant
qu’inhibiteur de la phosphopantethéinylation de la Pks13.
Test de perméabilité de la paroi de Mycobacterium tuberculosis
L’inhibiteur potentiel devra être capable de franchir la paroi de la bactérie afin de
pouvoir agir sur la synthèse des acides mycoliques. Afin de tester la perméabilité de la
mycobactérie, des cellules de Mtb vont être cultivées pendant 21 jours (temps nécessaire
d’apparition des colonies) dans un milieu de culture liquide enrichie (milieu à l’œuf) Si
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l’inhibiteur criblé est une molécule synthétique alors on pourra le marqué par un élément
radioactif 3H. Une étape de filtration est nécessaire afin d’éliminer le milieu de culture et de
récupérer les mycobactéries. Une analyse par scintillation liquide permettra de détecter la
radioactivité sur les bactéries lysées. Si l’inhibiteur est une molécule naturelle on pourra le
marquer par fluorescence.
Détermination des paramètres biochimiques d’interactions
A présent, il faut déterminer les paramètres biochimiques d’interactions de l’inhibiteur
avec les substrats. En effet, la réaction fait intervenir deux substrats : le domaine ACP et le
coenzyme A. Nous allons déterminer le type d’inhibition mis en jeu. Pour cela, nous
utiliserons la stratégie expérimentale suivante : dans une solution contenant une concentration
saturante en ACP, nous ferons varier la concentration en coenzymeA à une concentration
d’inhibiteur donnée. Une autre série d’expériences sera réalisée à une autre concentration
d’inhibiteur et ainsi de suite. L’allure du tracé de Lineweaver-Burk ((1/vi)=f(1/CoA))
permettra de déterminer le type d’inhibition avec une vitesse maximale d’inhibition (vmax).
La représentation en double inverse ((1/Kapp)=f(Inhibiteur)) nous informera sur la constante
d’inhibition. De même, nous allons nous placer en condition saturante en Coenzyme A et faire
varier la concentration en ACP à une concentration donnée en inhibiteur et déterminer le type
d’inhibition et la constante (Ki).
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IV) PERSPECTIVES ET CONCLUSION
Ce projet de recherche a pour objectif de rechercher des inhibiteurs de la modification
post-traductionnelle de Pks13, la 4’-phosphopantethéinylation (transfert du bras P-pant), par
la PPTase.
Pks13 est une protéine clé dans la voie de synthèse des acides mycoliques [Portevin et
al., 2004]. L’équipe de Mofid a démontré que cette enzyme devait être modifiée posttraductionnellement pour être active. Chalut et al., en 2006, ont confirmé que la PptT est
responsable de l’activation des domaines ACP de Pks13 de Mtb. Il a également démontré que
Pks13 inactive ne permet pas la synthèse d’acides mycoliques et entraîne la mort la bactérie.
De nos jours, il n’existe aucune donnée structurale sur Pks13, nous avons donc voulu inhiber
la modification post-traductionnelle responsable de son activation. Nous avons donc dû mettre
en place un test d’activité enzymatique pour visualiser le transfert du bras P-pant réalisé par la
PptT qui devait être optimiser pour être miniaturiser en vue d’un criblage haut débit
d’inhibiteurs potentiels.
De nos jours les traitements anti-tuberculeux sont lourds car nécessitent la prise
quotidienne pendant six mois voire plus de plusieurs antibiotiques. De plus, des formes
résistantes de Mtb apparaissent à cause de mutations des gènes codant pour les cibles
pharmacologiques. C’est pour cela que nous avons voulu cibler cette enzyme (PptT).
En vue d’un développement d’un médicament anti-tuberculeux, il est nécessaire de
vérifier que l’inhibiteur de la PptT n’est pas toxique pour les cellules humaines. Pour cela, un
comptage de la mortalité de plusieurs types cellulaires (cellules endothéliales, fibroblastes,
cellules épithéliales) pourra être réalisée après culture de ces dernières en présence
d’inhibiteur(s).
Des études sont menées afin de cristalliser la PptT. Une fois sa structure
cristallographique déterminée, il serait intéressant d’optimiser l’action de l’inhibiteur par
« Drug Design » en modifiant la composition chimique de la molécule inhibitrice lui
permettant une reconnaissance plus spécifique.
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BIBLIOGRAPHIE
Barry C.E 3rd., Lee R.E., Mdluli K., Sampson A.E., Schroeder B.G, Slayden R.A., and Yuan
Y. “Mycolic acids: structure, biosynthesis and physiological functions.” Progress in Lipid
Research, 1998. 37(2-3): 143-179.
Cabantous S. “Développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines
basées sur la GFP. Application à la définition de domaines solubles de la polykétide synthase
Pks13 de Mycobacterium tuberculosis ” Thèse Université Paul Sabatier Toulouse III. 2005.
Chalut C., Botella L., de Sousa-D’Auria C., Houssin C. and Guilhot C. “The nonredundant
roles of two 4′-phosphopantetheinyl transferases in vital processes of Mycobacteria.” Proc
Natl Acad Sci U S A. 2006. 103(22): 8511–8516.
Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier
K., Gas S., and Barry C.E. 3rd. “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from
the complete genome sequence.” Nature, 1998. 393: 537-544.
Daffe M., and Drapper P. “The envelope layers of mycobacteria with reference to their
pathogenicity.” Advances in Microbial Physiology, 1998. 39: 131-203.
Ehrt S., Guo X.V., Hickey C.M., Ryou M., Monteleone M., Riley L.W., and Schnappinger D.
“Controlling gene expression in mycobacteria with anhydrotetracycline and Tet repressor.”
Nucleic Acids Research, 2005. 33: e21.
Lambalot R.H., and Walsh C.T., “Holo-[acyl-carrier-protein] synthase of Escherichia coli.”
Methods in Enzymology, 1997. 279: 254-262.
Lambalot R.H., Gehring A.M., Flugel R.S., Zuber P., LaCelle M., Marahiel M.A., Reid R.,
Khosla C. and Walsh C.T. “A new enzyme superfamily - the phosphopantetheinyl
transferases.” Chem Biol. 1996. 3(1): 923-936
21
Liu Q., Ma Y., Zhou L. and Zhang Y. “Gene cloning, expression and functional
characterization of an acyl carrier protein AcpV from Vibrio anguillarum” Arch. Microbiol.
2006. 185: 159–163.
Meier J.L., Mercer A.C., Rivera H. Jr. and Burkart M.D. “Synthesis and Evaluation of
Bioorthogonal Pantetheine Analogues for in vivo Protein Modification.” J. Am. Chem. Soc.
2006. 128: 12174-12184.
McNeil M.R., and Brennan P.J. “Structure, function and biogenesis of the cell envelope of
mycobacteria in relation to bacterial physiology, pathogenesis and drug resistance; some
thoughts and possibilities arising from recent structural information.” Research in
Microbiology, 1991. 142(4): 451-463.
Mofid M.R., Finking R. and Marahiel M.A. “Recognition of Hybrid Peptidyl Carrier
Proteins/Acyl Carrier Proteins in Nonribosomal Peptide Synthetase Modules by the 4’Phophopantetheinyl Transferases AcpS and Sfp.” The Journal Of Biological Chemistry. 2002.
277(19): 17023–17031.
Portevin D., De Sousa-D'Auria C., Houssin C., Grimaldi C., Chami M., Daffé M., and
Guilhot C. “A polyketide synthase catalyzes the last condensation step of mycolic acid
biosynthesis in mycobacteria and related organisms.” Proc Natl Acad Sci U.S.A, 2004. 101(1):
314-319.
Reuter K., Mofid M.R., Marahiel M.A. and Ficner R. “Crystal structure of the surfactin
synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase
superfamily.” EMBO J. 1999. 18(23): 6823–6831.
Takayama K., Wang C., and Besra G.S. “Pathway to synthesis and processing of mycolic
acids in Mycobacterium tuberculosis.” Clinical Microbiology Reviews, 2005. 18(1): 81-101.
Veyron-Churlet R., Bigot S., Guerrini O., Verdoux S., Malaga W., Daffé M., and Zerbib D.
“The biosynthesis of mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis relies on multiple
specialized elongation complexes interconnected by specific protein-protein interactions.”
Journal of Molecular Biology, 2005. 353(4): 847-858.
22
Veziris N., Cambau E., Sougakoff W., Robert J. and Jarlier V. “Resistance to antituberculous
drugs”. Archives de pédiatrie, 2005. 12(Suppl 2): 102-109.
23