aptitude d`une souche lactique a croitre sur un milieu de culture a
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université KASDI MERBAH Ouargla FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUE Mémoire MASTER ACADEMIQUE Domaine: Sciences de la Nature et de la Vie Filière: Biologie Spécialité: Microbiologie Appliquée Présenté par: Khacef Lynda Thème APTITUDE D’UNE SOUCHE LACTIQUE A CROITRE SUR UN MILIEU DE CULTURE A BASE DE LACTOSERUM Soutenu publiquement Le : 14 / 06 /2015 Devant le jury : Président SIBOUKEUR OEK elle SOUID Wafa Prof. ( M.A.A) U.K.M.Ouargla Encadreur M Co-Encadreur Mme BOUDJENAH Saliha (M. C. A) U.K.M.Ouargla Examinateur Mr BOURICHA U.K.M.Ouargla ( M.A.A) Année universitaire 2014-2015 U.K.M.Ouargla Remerciements Avant tout, je remercie Dieu tout puissant de m’avoir accordé la force, le courage et les moyens afin de pouvoir accomplir ce modeste travail . Tous mes vifs remerciements et ma profonde reconnaissance s'adressent à ma promotrice Mademoiselle SOUID Wafa, MA.A à l’université KASDI MERBAH Ouargla département des Sciences biologique et ma co-promotrice Madame BOUDJENAH-HAROUN Saliha , Maître de conférences A à l’université K .M . Ouargla pour leur précieuse aides, leurs conseils, tout au long de l’élaboration de ce modeste travail. Je remercie particulièrement Madame SIBOUKEUR OUMELKHEIR professeur à l’université KASDI MERBAH Ouargla pour avoir accepté de présider le jury Je remercie très particulièrement Mr BOURICHA pour m’avoir fait l’honneur d’examiner et juger mon travail Je remercie mes très chers parents pour leur soutien et leur encouragement Je remercie particulièrement mon mari Mr HAMMOUM Rachid pour ses aides, ses soutiens, tout au long de l’élaboration de ce modeste travail. Mes vifs remerciements vont également à Mr EL OUANI Safi le directeur de la laiterie de Ghardaïa. Mes remerciements vont également à tous les membres du laboratoire de microbiologie qui m’ont soutenu. Enfin je remercie toute personne ayant participé d’une manière ou d’’une autre à la réalisation de ce modeste travail Dédicaces Je dédie ce mémoire à : Mes très chers parents Mon adorable mari HAMOUM Rachid qui n’arrête pas de me soutenir Mes très chers enfants MOHAMED Arezki et Ritadje Mon cher frère Djilali. Mes très chères sœurs Nadia, Fatiha, Hassina, Razika, Sabrina, Zhira, Froudja, ainsi leurs maris La mémoire de mes grands parents, mes grandes mères Mes voisins, mes amis particulièrement AMINA et mes collègues de travail. Enfin à tous mes amis qui me sont chers. Sans oublier la promotion microbiologie 2015 Lynda Résumé Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la valorisation du lactosérum. Ce sous produit des industries laitières, constitue, d’une part un facteur de pollution redoutable et d’autre part, il renferme des constituants (lactose, éléments minéraux et protéines) ce qui en fait un excellent milieu de culture pour les micro-organismes. L’objectif de notre travail consiste à étudier l’aptitude d’une souche lactique (du genre Lactococcus) à croitre dans des milieux de culture à base de lactosérums doux (bovin et camelin) en utilisant un milieu de culture M17 comme témoin. Lors de cette étude nous avons isolé à partir du lait camelin local une souche lactique S1 Gram + en forme de cocci et catalase - qui a été purifiée par la méthode de stries sur milieu M17. L’identification phénotypique nous a permet de classer cette souche dans l'espèce : Lactococcus lactis subsp. cremoris. Nous avons par la suite testé l’aptitude de cette souche à croitre dans un milieu de culture à base de lactosérum bovin et camelin déprotéiné et non supplémenté. Les résultats obtenus ont révélé que les lactosérums bovin et camelin constituent un milieu de culture adéquat pour la croissance de cette souche avec une meilleure croissance dans le lactosérum camelin. En effet après 48h et à pH initial de 6.8 ; une acidification du lactosérum camelin a été considérable (pH 3.97) par rapport au lactosérum bovin (pH 4.20). La biomasse produite dans le lactosérum camelin était de 1.50g/1 alors que celle produite dans le lactosérum bovin était de 1g/l. Mots clé : Aptitude, Lactosérum camelin, lactosérum bovin, milieu de culture, valorisation, bactéries lactiques, industrie laitière. Summary In this work, we focused on enhancing the whey. This by-product of the dairy industry is on one hand a formidable source of pollution and secondly, it contains components (lactose, minerals and protein elements) which make it an excellent culture medium for microorganisms. The aim of our work is to investigate the ability of lactic strain (genus Lactococcus) to grow in culture media containing sweet whey (cattle and camels) using an M17 culture medium as a control. In this study we isolated from the local camel milk lactic strain S1 Gram-shaped cocci and catalase - that was purified by the method of streaks on M17 medium. Phenotypic identification has allows us to classify this strain in the species Lactococcus lactis subsp. cremoris. We subsequently tested the ability of this strain to grow in a bovine whey-based growth medium and camels and not protein-supplemented. The results showed that bovine whey and camel are an appropriate culture medium for the growth of this strain with better growth in the camel whey. Indeed after 48 hours and initial pH of 6.8; acidification of camel whey was considerable (pH 3.97) compared to bovine whey (pH 4.20). The biomass produced in the camel whey was 1.50g / 1, while that produced in the bovine whey was 1 g / l. Keywords: Fitness, Whey camel, bovine whey, culture medium, recovery, lactic acid bacteria, dairy industry. الملخص مه خالل ٌري اندزاسح وحاَل اسرغالل مصم انحهٍة انري ذىرجً َحدج معانجح انحهٍة ٌ .عرثس ٌرا األخٍس مهُثا نهطثٍعح كما ٌحرُي عهى عىاصس مغرٌح ذاخ قٍمح عانٍح ،مما جعهً َسط مالئم نىمُ انثكرٍسٌاٌٍ .دف ٌرا انعمم ندزاسح قدز خ ) une bacterie lactique (du genre lactococcusعهى انىمُ فً مصم مقازوح ومُ ٌري حهٍة مىزَع انثسَذٍاخ مه مصدزٌه ،حهٍة انىاقح َحهٍة انثقس َ ذنك مه خالل انثكرٍسٌا فً َسط M17شاٌد .مه خالل ٌري اندزاسح قمىا تعزل انثكرٍسٌا انمركُزج مه حهٍة انىاقح ثم دزسىا قدزذٍا عهى انىمُ فً مصم انحهٍة ( مصم انىاقح َ مصم انثقس) .انىرائج انمرحصم عهٍٍا ذدل عهى أن مصم انحهٍة ٌسرطٍع أن ٌكُن َسط مالئم نىمُ ٌري انثكرٍسٌا َ نكه ومٌُا فً مصم حهٍة انىاقح كان أحسه مه مصم حهٍة انثقس .حٍث تمغد انحمُضح فً مصم حهٍة انىاقح 3.97مقازوح بمصم حهٍة انثقس حٍث قدزخ انحمُضح ب ، 4.2كما أن انكرهح انحٌٍُح تهغد 1.5غ|نرس فً مصم انىاقح فًما ما تهغد 1غ| نرس تانىسثح نمصم حهٍة انثقس. الكلمات المفتاحية :انقدزج ،مصم انىاقح ،مصم انثقسَ ،سط ومُ ،اسرغاللَ ،حدج معانجح انحهٍة TABLE DE MATIERES Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux Introduction 01 Chapitre I : Synthèse bibliographique I.1. Les bactéries lactiques 02 I.1.1.Généralités 02 I.1.2. Définition des bactéries lactiques 02 I.1.3. Caractéristiques générales des bactéries lactiques 02 I.1.4. Classification des bactéries lactiques 03 I.1.5. Le genre Lactococcus caractéristiques, classification et nomenclature 03 I.1.5.1. Lactococcus lactis. 03 I.1.5.1.1. Habitat de Lactococcus lactis 04 I.1.5.1.2. Exigences nutritionnelles des Lactococcus lactis 05 I.1.5.1.2.1. Exigences en acides aminés 06 I.1.5.1.2.2. Exigences en vitamines 06 I.1.5.1.2.3. Exigences en bases azotées 06 I.1.5.1.2.4. Exigences en minéraux 06 I.1.5.1.3. Intérêt technologique de Lactococcus lactis 07 I.1.5.1.4. Métabolisme de Lactococcus lactis 07 I.1.5.1.4.1. Métabolisme carboné chez Lactococcus lactis 07 I.2.Lactosérum 09 I.2.1. Définition du lactosérum 09 I.2.2. Différents types de lactosérum 09 I.2.2.1. Le lactosérum acide 09 I.2.2.2. Le lactosérum doux 09 I.2.3. Composition de lactosérum I.2.3.1. Lactose 09 10 I.2.3.2. Protéines du lactosérum 10 I.2.3.3. Les sels minéraux 11 I.2.3.4. Les vitamines 11 I.2.4. Valorisation du lactosérum 12 I.2.4.1. Domaine médical 12 I.2.4.2. Domaine alimentaire 12 I.2.4.2.1.Alimentation animale 12 I.2.4.2.2. Alimentation humaine 12 I.2.4.3. Domaine biotechnologique 12 I.2.4.3.1. Biotransformation de lactose 12 I.2.4.3.2. Substrat de fermentation 12 Chapitre II : Matériel et méthodes II.1. Matériel 14 II.1.1. Matériel biologique 14 II.I.2.Milieux de culture 14 II.I.3.Appareillage 15 II.1.4.Petits matériel 15 II.I.5.Produits chimiques 15 II .2. Méthodes 16 II.2.1.Isolement et identification phénotypique d’une souche Lactococcus lactis à partir du lait camelin 18 II.2.1.1. Collecte du lait camelin 18 II.2.1.2. Mesure du pH du lait camelin 18 II.2.1.3. Préparation des échantillons 18 II.2.1.4 Conditions de culture. 18 II.2.1.5. Isolement et purification des souches bactériennes II.2.1.6. La conservation des souches purifiées 18 19 II.2.1.6.1. Conservation de courte durée 19 II.2.1.6.2. Conservation de longue durée 19 II.2.1.7. Identification phénotypique de la souche purifiée 19 II.2.1.7.1. Étude morphologique 19 II.2.1.7.1.1. Caractérisation macroscopique 19 II.2.1.7.1.2. Caractérisation microscopique II.2.1.7.2. Critères physiologiques et biochimiques 19 20 II.2.1.7.2.1. Recherche de la catalase 20 II.2.1.7.2.2. Croissance à différents températures (10°C et 45°C) 20 II.2.1.7.2.3. La production du gaz à partir du glucose (type fermentaire) 20 II.2.1.7.2.4. Croissance à pH 9,6 20 II.2.1.7.2.5. Croissance en présence de 4% et 6.5% de NaCl 21 II.2.1.7.2.6. Croissance sur lait bleu de Sherman (1937) 21 II.2.1.7.2.7. Test de la thermorésistance 21 II.2.1.7.2.8. Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) 21 II.2.1.7.2.9. Test de fermentation des sucres 21 II.2.2. Mise en culture de la souche pré-identifiée dans un milieu de culture à base de lactosérum camelin et bovin 23 II .2.2.1. Coagulation du lait camelin par les Extraits coagulants de Dromadaire (ECD) 23 II .2.2.2. Collecte de lactosérum bovin 24 II .2.2.3. Traitement de lactosérum camelin et bovin (déprotéinisation) 24 II .2.2.4.Mise en culture 26 II .2.2.4.1. Préparation de préculture 26 II .2.2.4.2. Culture 26 II .2.2.5. Mesure de la croissance 26 II .2.2.5.1. Mesure du pH 26 II .2.2.5.2. Mesure de la densité optique II .2.2.5.3. Estimation du poids sec final 26 27 II.2.2.6. Culture sur milieu à base de lactosérum gélosé 27 Chapitre III : Résultats et discussion III.1. Isolement et identification phénotypique d’une souche Lactococcus lactis à partir du lait camelin 28 III.1.1. pH du lait camelin 28 III.1.2. Isolement et purification de la souche lactique 28 III.1.3. Identification de la souche isolée 28 III.1.3.1. Critères morphologiques 28 III.1.3.1.1. Examen macroscopique 28 III.1.3.1.2. Examen microscopique III.1.3.2. Critères physiologiques et biochimiques 28 29 III. 1.3.2.1. Test de catalase 29 III. 1.3.2.2. Tests physiologiques 30 III.1.3.2.3. Type fermentaire 30 III .1.3.2.4. Croissance sur lait bleu de Sherman 30 III.1.3.2.5. Recherche de l’Arginine dihydrolase 31 III.1.3.2.6. Test 1% de fermentation des sucres 31 III .2 Mise en culture de la souche lactique isolée dans un milieu de culture à base des lactosérums déprotéinés camelin et bovin 35 III.2.1. Traitement de lactosérum camelin et bovin (déprotéinisation) 35 III.2.2. Mesure de la croissance 36 III.2.2.1. Mesure du pH 36 III.2.2.2. Mesure de la densité optique et estimation du poids sec final 37 III.2.2.3. Culture sur milieu à base de lactosérum gélosé 39 Conclusion 40 Références bibliographiques Annexes Liste des abréviations ADH Arginine Di Hydrolase BB Bleu de Bromothymol BSA Albumine Sérique Bovine CE-pH Contrôle Externe de pH °D Degré DORNIC Do Densité optique ECD Enzymes Coagulantes de Dromadaire EMP Embden- Meyerhof-Parnas LB LC β-La α-La Ig PTS Lactosérum Bovin Lactosérum Camelin β-Lactoglobuline α-lactalbumine Immunoglobulines Système phosphotransférase Liste des tableaux Tableau Tableau 2 Titre Tests de pré-identification des sous espèces de Lactococcus lactis ( LARPENT, 2000). Besoins nutritionnels des lactocoques (Konings, 1994) Tableau 3 Tableau 4 Tableau 5 Tableau 6 Importance de certains minéraux dans le métabolisme des lactocoques. Différents types de lactosérum (ADRIAN et al., 1991). Composition de différents types de lactosérum (Sottiez, 1990) Teneur en composés protéiniques du lactosérum (De Wit, 1981). 06 09 10 11 Tableau 07 Appareillage utilisé au niveau de laboratoire 14 Tableau 08 Les produits chimiques utilisés 15 Tableau 1 Page 04 05 Tableau10 Résumé de l’observation macroscopique et microscopique de la souche isolée Résultats des tests physiologiques. Tableau 11 Résultat de la fermentation des hydrates de carbones 32 Tableau12 Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche (S1) isolée 34 Tableau 09 29 30 Liste des figures Figure Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Titre Voies métaboliques impliquées dans l'entrée et le métabolisme du glucose, du galactose et du lactose chez Lactococcus lactis (GARRIGUES et al ., 1998). Valorisation indirect de lactosérum (ZADOW, 1989) Protocole d’isolement et d’identification phénotypique d’une souche lactique lactique(Lactococcus) Procédure suivie pour l’obtention de lactosérum et la mise en culture de la souche lactique isolée Page 08 13 16 17 Figure 5 Protocole de la fermentation des hydrates de carbones. 22 Figure 6 La coagulation du lait camelin par les ECD 23 Figure 7 Diagramme de déprotéinisation du lactosérum (Moulin et al, 1976) 25 Figure 8 Observation macroscopique de la souche isolée cultivée sur milieu M17 29 Figure 9 29 Figure 10 Observation microscopique de la souche isolée après coloration de GRAM (G : 10x100). Croissance de la souche isolée à 10°C Figure11 Résultats des tests physiologiques 30 Figure12 Résultat obtenu pour le type fermentaire de la souche examinée 31 Figure13 Résultat du test de réduction de bleu de méthylène de la souche examinée sur le milieu lait Sherman (0.1%) et (0.3%). 30 31 Figure14 Aspect de la souche ADH négative sur milieu Möeller à l’arginine. 31 Figure15 Résultat de la fermentation des hydrates de carbones de la souche (S1) isolée 32 Figure16 Aspect de lactosérum brut 36 Figure17 Aspect de lactosérum deprotieiné 36 Figure18 Figure19 Evolution du pH en fonction de temps dans les trois milieux de culture M17, LB et LC Evolution de la DO en fonction de temps dans les trois milieux de culture M17, LB et LC 37 38 Figure20 Poids sec final dans les trois milieux de culture M17, LB et LC 39 Figure21 Croissance de Lc. lactis subsp cremoris (pré-identifiée) sur milieu M17 témoin (A), lactosérum bovin (B) et lactosérum camelin (C). 39 Introduction Introduction L’industrie agro alimentaire doit faire face à un problème devenu au fil de ces dernières années de plus en plus crucial. Il s’agit de la pollution crée par les déchets et les rejets de cette industrie. Parmi ceux-ci, nous nous sommes intéressés à l’industrie laitière. L'évolution des industries fromagères conduit à une production de plus en plus importante de lactosérum. Le lactosérum représente 90% du volume original de lait utilisé en fromagerie et en est le principal sous produit (MOLETTA, 2002). Les quantités de lactosérum rejetées dans la nature sont sans cesse en progression. Par sa composition biochimique (lactose, protéines, vitamines,.), ce qui en fait un excellent milieu de culture pour les micro-organismes et devient un facteur de pollution redoutable (GANA et al., 2001 , ELOUTASSI, et al., 2011). Le lactosérum camelin et particulièrement celui d’origine bovine sont considérés comme polluants lorsqu'ils sont rejetés dans les cours d'eau et les égouts, le déversement du sérum doit être nécessairement précédé d'une épuration très coûteuse (AUDIC et al., 2003). Pour diminuer le risque polluant du lactosérum, ce dernier est utilisé dans différents domaines tels que l'alimentation humaine, l'alimentation animale et éventuellement dans le domaine de la biotechnologie afin de produire des enzymes, vitamines, alcool, acides organiques (acide citrique, acide lactique,…etc) (K.BOUDJEMA, 2009). Il est aussi utilisé comme milieu de culture à moindre coût. C’est cette caractéristique que nous avons exploité dans ce travail dans le but est d’étudier l’aptitude d’une souche lactique (du genre Lactococcus) à croitre dans un milieu de culture à base de lactosérum d’origine bovin et camelin. Pour cela nous nous somme fixés plusieurs objectifs, à réaliser en 4 étapes: La 1ère étape est l’isolement et la purification d’une souche lactique (du genre Lactococcus) à partir de lait de chamelle collecté de la région d’Ouargla. La 2éme étape est l’identification phénotypique de la souche purifiée selon les critères morphologiques, physiologiques et biochimiques. La 3éme Consiste a testé l’aptitude de la souche isolée à croitre dans des milieux de culture à base de lactosérum bovin et camelin en utilisant un milieu de culture M17 comme témoin. La 4ème étape enfin, consiste à comparer la croissance de la souche lactique isolée dans le lactosérum doux d’origine bovine et celui d’origine cameline avec la croissance en milieu de culture M17 utilisé comme témoin. 1 Chapitre I Synthèse bibliographique I.1. Les bactéries lactiques I.1.1.Généralités Les bactéries lactiques sont de très anciens microorganismes. Elles seraient donc apparues avant les cyanobactéries (DRIDER D, 2009). Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des siècles pour la fermentation d’un grand nombre de produits comme le yaourt, le fromage et le beurre (CHAMPAGNE, 1998). Elles interviennent également dans la fabrication des salaisons, et peuvent aussi produire de nombreux agents antibactériens tels que les bactériocines (BOURGEOIS et LARPENT, 1996). I.1.2. Définition des bactéries lactiques En 1919 ORLA-JENSEN a défini les bactéries lactiques comme étant un groupe de bactéries à GRAM positif, non mobiles, asporogènes et fermentant les hydrates de carbone et certains alcools en acide lactique. Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes procaryotes, hétérotrophes et chimio organotrophes (DELLAGLIO et al., 1994). I.1.3. Caractéristiques générales des bactéries lactiques • Les bactéries lactiques sont des anaérobies facultatifs, mais certains les considèrent comme des anaérobies aérotolérants et ne produisent pas de catalase .Ces bactéries peuvent avoir des formes de bâtonnet ou de coque (PRESCOTT et al., 2013). • Les bactéries lactiques sont des bactéries exigeantes d’un point de vue nutritionnel. Elles ne peuvent croître facilement que dans des milieux riches en vitamines, en acides aminés, en purines et en pyrimidines, parce que leurs capacités biosynthétiques sont limitées (DRIDER D, 2009 ., PRESCOTT et al., 2013). • Les bactéries lactiques ont en commun la capacité de fermenter les sucres en acide lactique. La synthèse de l’acide lactique, la tolérance de ces bactéries à cet acide organique et aux pH très inferieur à 7 sont utilisées dans la conservation des aliments (BOURGEOIS et LARPENT, 1996). • La production d’acide facilite la coagulation des protéines par la présure ainsi que la synérèse. L’abaissement du pH limite aussi la croissance des bactéries indésirables (DOLEYRES, 2003). • La température optimale de croissance des bactéries lactiques diffère selon les espèces, elle varie entre 28 et 45°C (PRESCOTT et al., 2013). • Certaines bactéries lactiques sont dites homofermentaires car elles produisent uniquement de l’acide lactique alors que d’autres sont dites hétérofermentaires produisent de l’acide lactique en même temps que d’autres composés (acétate et éthanol en général). (VANDAMME et al., 1996) 2 Chapitre I • Synthèse bibliographique Les bactéries lactiques sont ubiquistes et on les trouve dans différentes niches écologiques comme le lait et les produits laitiers, les végétaux, la viande, le poisson, les muqueuses humaines et animales et dans le tractus digestif (DROUAULT et CORTHIER, 2001). I.1.4. Classification des bactéries lactiques En 1919 ORLA-JENESN a établie la première classification des bactéries lactiques basée sur les propriétés observables à savoir les propriétés morphologiques, biochimiques et physiologiques. La taxonomie actuelle investie le progrès de génétique de l'écologie, elle inclue également les techniques modernes de séquençage d'ADN, de micro galerie d’identification, des banques de données informatisées. Onze genres bactériens figurent dans la catégorie de bactéries lactiques : Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et Vagococcus. Les bactéries du genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques typiques, mais leur usage se répand en industrie laitière (DOLEYRES, 2003). Les genres les plus étudiés sont : Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus et Pediococcus (DROUAULT et CORTHIER, 2001). I.1.5. le genre Lactococcus caractéristiques, classification et nomenclature Le groupe de lactocoques correspond aux streptocoques mésophiles de la flore lactique. Ce sont des bactéries homofermentaire ne produisant que l’acide lactique L (+), et sont généralement microaérophiles et se développent à 30°C. Ils fermentent les sucres en acide lactique et peuvent croitre à 10°C mais non à 45°C (PRESCOTT et al., 2013). Ces bactéries sont thermosensibles et ne peuvent pas croître en présence de 6.5% de NaCl ou à pH 9.6 (DELLAGLIO et al., 1994). Le genre Lactoccoccus est formé de bactéries à Gram positif dont les cellules, en forme de coques associées par paires ou en chaînettes de longueur variable. Elles sont dépourvues de catalase et ne sont pas capables d’utiliser l’oxygène mais se multiplient en sa présence (anaérobies aérotolérantes) (GUIRAUD, 2012). Le genre Lactococcus comporte plusieurs espèces(DELLAGLIO et al., 1994): Lc.plantarum, Lc.garvieae, Lc.piscium, Lc.raffinolactis, Lc.lactis . I.1.5.1. Lactococcus lactis. Lactococcus lactis est une bactérie hétérotrophe à Gram positif, homofermentaire. anaérobie facultative, catalase négative, non sporulante, non mobile, formant des cellules sphériques ou ovoïdes, isolées ou en courtes chaînettes. Ce sont des bactéries mésophile possédant une température optimale de croissance d’environ 30°C, et neutrophile puisque 3 Chapitre I Synthèse bibliographique sa gamme de pH optimale varie de 6,3 à 6,9 (GUIRAUD, 2012). L’espèce Lc. lactis r e gr o u p e trois sous-espèces, Cremoris, hordniae et lactis qui elle-même comprend le biovar diacetylactis, capable de surproduire le diacétyle. Actuellement, les espèces et sous-espèces les plus importantes en industrie laitière sont (DELLAGLIO ,1994): Lactococcus lactis subsp. lactis ; Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis ; Lactococcus lactis subsp. crémoris. • Lactococcus lactis subsp lactis : est la plus abondante dans le lait à température ambiante. Elle se présente sous forme de diplocoques, capable de produire de l’ammoniac à partir d’arginine grâce à la voie de l’arginine déiminase qui est très rare chez cremoris. Elle fermente plusieurs sucres et capable de pousser à température de 40°C et en présence de 4 % de NaCl ( LARPENT, 2000). • Lactococcus lactis subsp lactis biovar Diacetylactis : cette espèce possède un plasmide encodant la dégradation du citrate en diacétyle, ils capables de croite à 40°C, et en présence de 4% de NaCl et à pH 9.6 (DE ROISSART et LUQUET, 1994) • Lactococcus lactis subsp crémoris : qui est caractérisée par ses propriétés acidifiantes. La distinction entre les sous-espèces de Lactococcus lactis est donnée par le tableau1. Tableau 1: Tests de pré-identification des sous espèces de Lactococcus lactis ( LARPENT, 2000). Sous espèce et biovar Croissance à 40°C Croissance à 4% de NaCl Croissance à pH 9.6 Arginine dihydrolase Maltose sorbitol Acetoine Citratase + Lactococcus lactis subsp. lactis Diacetylactis + + + - + + + - + + + + + - Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp crémoris - I.1.5.1.1. Habitat de Lactococcus lactis Les habitats les plus importants des lactocoques demeurent le lait, les laits fermentés ainsi que les fromages où ils constituent la flore dominante. Cependant, on peut également les isoler des végétaux ainsi que de la peau de certains animaux (DE ROISSART et LUQUET, 1994). 4 Chapitre I Synthèse bibliographique I.1.5.1.2. Exigences nutritionnelles de l’espèce Lactococcus lactis Les Lactocoques se caractérisent sur le plan nutritionnel par une importante déficience biosynthétique. Ils requièrent non seulement des substrats complexes carbonés, azotés, phosphatés et soufrés mais d'autres facteurs de croissance sont nécessaires à leur multiplication en particulier des acides aminés et des vitamines de groupe B (DOLEYES, 2003)(Tableau 2). Tableau 2 : Besoins nutritionnels des Lactocoques (KONNINGS, 1994) Substances de croissance Acides aminés Lysine Leucine Histidine Valine Cystéine Aspartate Glutamate Isoleucine Tyrosine Méthionine Vitamines Vit. B12 Biotine Niacine Pantothénate Riboflavine Thiamine Pyridaxol Acide folique Acides organiques Acide acétique Acide oléique Acide orotique Acide formique Acides nucléiques Hypoxanthine Adénine Guanine Thymine Uracile Thymidine Lc.Lactis subsp.lactis Lc. Lactis subsp.cremoris Lc.Lactis subsp.lactis biovar diacetylactis + + + S nd + + nd + + + + + nd + + nd + + + + S nd + + nd + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + nd nd + + nd nd + + nd nd S S S S S S S - Symboles : + : Essentiel à la croissance, - : Non requise pour la croissance, S : Stimulant, nd : Non déterminé. 5 Chapitre I Synthèse bibliographique I.1.5.1.2.1. Exigences en acides aminés Les acides aminés libres du lait ne représentent qu'une faible part de l'azote aminé nécessaire à la croissance des lactocoques, puisqu'ils interviennent pour seulement 2 % de la croissance totale. La bactérie lactique modèle, L. Lactis, est auxotrophe pour 7 à 12 acides aminés selon les souches, la sous espèce lactis étant moins exigeante que la sous espèce cremoris (FOUCAUD et al., 2001). Les acides aminés à chaîne ramifiée, la leucine, l’isoleucine et la valine, sont tous trois essentiels à l’espèce Lactococcus lactis (DESMAZEAUD, 1994). Parallèlement, des études montrent que certaines souches de L. Lactis possédent des voies de biosynthèse d’acides aminés fonctionnelles comme celles de l’Histidine, Tyrosine, de l’Asparagine (DUDLEY et al., 2001, RENAULT et al., 1995). I.1.5.1.2.2. Exigences en vitamines Les bactéries lactiques sont incapables de synthétiser les vitamines qui jouent un rôle irremplaçable de cœnzymes dans le métabolisme cellulaire (DESMAZEAUD, 1983). Les vitamines essentielles pour la croissance de Lactococcus lactis sont représentées dans le tableau 2 (KONINGS, 1994). I.1.5.1.2.3. Exigences en bases azotées Les bases puriques et pyrimidiques ne sont pas vraiment essentielles au métabolisme des bactéries Lactococcus (Tableau 3) (KONINGS, 1994). I.1.5.1.2.4. Exigences en minéraux : Les exigences nutritionnelles de ces bactéries en minéraux sont mal connues. La nécessité des ions dans le métabolisme s’explique d’abord par leur fonction de cofacteur pour de nombreuses enzymes (NOVEL, 1993). Le tableau 3 montre l’importance de certains minéraux dans le métabolisme des lactocoques. Tableau 3 : Importance de certains minéraux dans le métabolisme des lactocoques. Minéral Potassium Calcium Cuivre Magnésium Importance Régulation du pH intracellulaire. Rôle dans la paroi cellulaire en particulier pour l’activité des protéases de paroi Augmente la production de diacétyle -Indispensable pour de nombreuses enzymes nécessaires à la croissance cellulaire ou à la production d’arômes. -Important pour la survie des Lactococcus lactis -Améliore l’activité des protéases par son rôle dans la paroi cellulaire 6 Référence (KASHKEet al., 1973). (NOVEL, 1993) (KANEKO et al, 1987) (THOMAS et al.,1979) LEVEAU et BOUIX (1993). Chapitre I Synthèse bibliographique I.1.5.1.3. Intérêt technologique de l’espèce Lactocuccus lactis Lactococcus lactis est une bactérie modèle pour la recherche fondamentale qui est depuis plusieurs décennies, l'objet de très nombreuses études (DRIDER D et HERVE P, 2009). Elle est parmi les micro-organismes les plus importants pour l’industrie laitière (MOFREDJ et al., 2007): - Les deux sous-espèces lactiques L.lactis subsp.lactis et subsp.cremoris sont largement utilisées dans les levains laitiers pour la fabrication de fromages ou d'autres produits laitiers fermentés. - La sous-espèce Lc. Lactis.subsp cremoris est particulièrement préférée pour la production du cheddar mais elle est aussi présente dans le camembert. - Un biovar de la sous-espèce lactis, nommé diacetylactis, est capable de métaboliser les citrates en diacétyle et acétoïne, conduisant à la flaveur caractéristique des fromages frais. I.1.5.1.4. Métabolisme de Lactococcus lactis Lc. lactis, et plus généralement les bactéries lactiques homolactiques, sont couramment rencontrées dans l'industrie agro-alimentaire. Elles sont notamment utilisées dans l'industrie laitière pour leur capacité à produire de l'acide lactique (rendement ˃ 90 %) en excès de sucre. Dans certaines conditions cependant, ces bactéries homolactiques peuvent présenter un métabolisme diversifié, appelé métabolisme mixte, au cours duquel des quantités importantes de formiate, d'acétate et d'éthanol sont produites (GARRIGUES et al., 1998) (figure1). Les produits du métabolisme mixte sont pourtant plus inhibiteurs que le lactate Le métabolisme mixte a été observé par THOMAS (1976) lors de cultures de Lc. lactis en mode continu, limitées par le glucose. I.1.5.1.4.1. Métabolisme carboné chez Lactococcus lactis Le métabolisme des sucres conduit, notamment, à la production de l'acide lactique et à un fort abaissement du pH, ce qui est recherché pour la fabrication des produits alimentaires. Mais, ce processus est avant tout indispensable aux bactéries elles-mêmes, en leur fournissant de l'énergie (ALAIS, 1984). Lorsque la glycolyse se déroule de façon optimale, les souches de Lc. lactis suivent principalement une voie homofermentaire dans laquelle 90 à 95 % des sucres consommés sont convertis en acide lactique (GARRIGUES et al, 1998). Chez les lactocoques, le transport membranaire du lactose et du glucose est assuré par le système phosphotransférase-phosphoénol pyruvate dépendant (système PEP-PTS). Le transport du galactose est effectué par le système PEP-PTS et une perméase d'affinité élevée. Suite à leur transport dans la cellule, les composés glucidiques libres ou 7 Chapitre I Synthèse bibliographique modifiés sont catabolisés selon 3 voies: la voie glycolytique principale de Embden-MeyerhofParnas (EMP), la voie du Dtagatose- 6-phosphate ou la voie de Leloir (DESMAZEAUD, 1983). Les lactocoques utilisent la voie EMP dans la dernière étape de la glycolyse et convertissent le pyruvate en acide lactique. Les voies cataboliques du lactose et du citrate sont les plus impliquées car ils sont respectivement la source de carbone principale du lait, et également présent en milieu laitier (Figure 1) (GARRIGUES et al, 1998). Glc Glc kinase hh Formiate PTS, phosphotransférase ; Perm, perméases ; Gal6P, galactose-6-phosphate ; Lac6P, Lactose-6phosphate ; Tag6P, tagatose-6-phosphate ; TDP, tagatose-1,6-diphosphate; FBP : fructose-1,6diphosphate; P βgal : phospho-β-galactosidase; βgal : β-galactosidase ; GAPDH : glycéraldehyde 3-phosphate déshydrogénase; PK : pyruvate kinase; LDH : Lactate déshydrogénase; PDH, pyruvate déshydrogénase; PFL : pyruvate formiate Lyase. Figure 1. Voies métaboliques impliquées dans l'entrée et le métabolisme du glucose, du galactose et du lactose chez Lactococcus lactis (GARRIGUES et al., 1998). 8 Chapitre I Synthèse bibliographique I.2.Lactosérum I.2.1. Définition du lactosérum : Le lactosérum, encore appelé sérum ou petit-lait, est un sous produit liquide de la fromagerie et de la caséinerie où l’on retrouve la majeure partie de l’eau avec toutes les substances du lait. Le lactosérum peut être considéré comme du lait dépourvu de matière grasse et de caséines (KOSIKOWSKI, 1979). I.2.2. Différents types de lactosérum On distingue deux types de lactosérums : I.2.2.1. Le lactosérum acide C’est la fraction liquide résultant de la fabrication des fromages à coagulation lactique très marquée, pour lesquels le caillage a lieu sans emprésurage (SYLACT, 1991). La coagulation du lait est réalisée par précipitation des caséines à leur pH isoélectrique de 4.6 par ajout d'acide fort ou d'acide lactique. La caséine est combinée à des sels de calcium, l'acidification entraîne sa déminéralisation qui fait passer dans le sérum une part importante d'élément minéraux, notamment le calcium et le phosphore (SOTTIEZ, 1990) (tableau 4). I.2.2.2. Lactosérum doux Il est obtenu par hydrolyse enzymatique des caséines du lait par la présure sans acidification préalable, on obtient alors un sérum doux, pauvre en sels minéraux et riche en lactose et en protéines (SOTTIEZ, 1990) (tableau 4).. Tableau 4. Différents types de lactosérum (ADRIAN et al., 1991). Degré d’acidité Type pH < 18° D Lactosérum doux 6,5 – 6,7 > 18° D Lactosérum acide 4,5 - 5 production -Fromagerie à pâte pressée - Fromagerie à pâte cuite - Caséinerie présure. - Fromagerie à pâte fraiche - Fromagerie à pâte molle - Caséinerie acide I.2.3. Composition de lactosérum La composition chimique de lactosérum varie considérablement d’un lait à un autre. Selon, la source et la composition initiale du lait, les traitements chimiques et les procédés de fabrication. Le lactosérum est un produit intéressant non seulement par la présence du lactose, mais aussi par la teneur en protéines, riches en acides aminés indispensables (lysine et tryptophane) et par la présence de nombreuses vitamines du groupe B (thiamine, acide pantothénique, riboflavine ...) (DRIDER D et HERVE P, 2009). 9 Chapitre I Synthèse bibliographique Le tableau 5 donne les compositions moyennes des deux types de lactosérums produits en fromagerie. Tableau 5: Composition de différents types de lactosérum (SOTTIEZ, 1990) Lactosérum doux Pate pressée cuite(Emmental) Liquide(%) Extrait sec(%) pH 93.5 Pâte pressée non cuite (Edam) 95 6.5 5.00 Lactose Protéine Cendres Acide lactique Matière grasse 76.00 13.50 8.00 Ca P NaCl 6.70 Lactosérum acide camembert Pâte caséine fraîche 93.5 94 94 Lactosérum déprotéiné Perméat doux d’ultrafiltrat ion - 6.50 6.00 6.00 4.50 6.00 4.60 6.40 65.50 12.00 9.00 74.00 12.00 12.00 85.00 4.00 9.00 6.50 6.10 Composition (en g/l) 75.00 75.00 13.50 13.50 8.00 8.25 1.80 2.80 2.20 10.00 1.80 2.00 1.50 1.50 1.50 0.50 0.50 0.00 1.90 1.50 2.50 1.80 1.50 7.50 0.60 0.60 2.80 0.60 0.60 2.50 Matière minérale (en %) 0.65 0.75 0.65 0.70 2.50 2.50 I.2.3.1. Lactose Le lactose est le principal constituant du lactosérum de fromagerie. C’est un diholoside constitué par l’union d’une molécule de α ou β -D- glucose et d’une molécule de β-Dgalactose. Ce sucre représente principale source de carbone pour les microorganismes qui intéressent l’industrie agroalimentaire (LUQUET et FRANCOIS, 1990). La teneur en lactose dans le lait de chamelle varie de 2,40 à 5,85 % et est légèrement plus élevée que la teneur en lactose du lait de vache (FARAH, 2004 ; FARAH, 2011). I.2.3.2. Protéines du lactosérum Les protéines sérique ou protéines du lactosérum constituent la fraction soluble des protéines du lait après précipitation des caséines à pH isoélectrique. Les entités protéiques les plus représentatives constituées essentiellement de la β-lactoglobuline (β-LG) ;α-lactalbumine (α-LA) ; l'albumine sérique bovine(BSA) ;les immunoglobulines(Ig) ; les proteoses peptones ; les protéines mineures (lysozyme, lactoperoxydase, lactoferrine). (FARRELL et al, 2004). 10 Chapitre I Synthèse bibliographique Les protéines lactosériques camelines, solubles à pH 4.3, se caractérisent par l’absence de la β-lactoglobulines (EL-AGAMY et al., 2009). L’α-Lactalbumine est la principale composante de la fraction protéinique du lactosérum camelin (AL HAJ et Al KANHAL, 2010). Le tableau 6 donne la teneur en composés protéiniques du lactosérum. Tableau 6 : Teneur en composés protéiniques du lactosérum (DE WIT, 1981). Composés protéiques Masse moleculaire (KDa) Teneur (°o) Point isoélectrique Protéines β- LG 18.362 50 5.2 α-LA 14.147 22 4,5 – 4,8 BSA 69,000 5 4,7 – 4,9 150,000-1000.000 12 5,5 – 8,3 80,000 <1 8,4 – 9,0 Ig Lactoferrine Enzymes Lactoperoxydases 78,000 9,5 Lysozyme 18,000 9,5 Phosphatase alcaline 160,000-190.000 non déterminée <1 Catalase 60,000 5,7 Sulphydryle oxydase 89,000 non déterminée Plasmine non déterminée non déterminée Peptides Proteose-peptones Glyco macropeptides non déterminée non non déterminée 7,000 déterminée non déterminée I.2.3.4. Les vitamines Les vitamines de lactosérum sont des vitamines hydro solubles constituées essentiellement de : Riboflavine (B2) en quantités importantes ; Acide pantothénique (B5) ; thiamine (B1) ; pyridoxine (B6) ; l'acide ascorbique (vit C) (LINDEN et LORIENT, 1994). 11 Chapitre I Synthèse bibliographique I.2.4. La valorisation de lactosérum Il existe de nombreuses utilisations possibles du lactosérum, en particulier dans le domaine médical, le domaine alimentaire et le domaine biotechnologique. I.2.4.1. Domaine médical Utilisation des fractions de protéines de lactosérum contre les maladies du cœur (réduction du cholestérol et de la tension artérielle), les ulcères, les cancers, le sommeil, l’hypertension. La valorisation de lactosérum va aujourd’hui jusqu’à produire des protéines individuelles telles que l’alfa-lactalbumine, la beta-lactoglobuline, la lactoferrine, la lactoperoxydase, le lysozyme, des phospholipides (croissance cérébrale de l’enfant) (LORTALS et BOUDIER J.F.2011). - Les protéines sériques contiennent des séquences bioactives, qui sont obtenues par hydrolyse ciblée, éventuellement par voie microbienne, et dont la valeur ajoutée atteint celle pratiquée dans l’industrie pharmaceutique (JEANTET et al., 2008 ; SCHUCKS, 2009). I.2.4.2. Domaine alimentaire I.2.4.2.1.Alimentation animale Une quantité considérable de lactosérum est utilisée dans l’alimentation animale (l'élevage industriel des porcs). De plus, il est utilisé pour enrichir les aliments ou les régimes pauvres en protéines (AGNES, 1986). I.2.4.2.2. Alimentation humaine - Les concentrés protéiques et leurs hydrolysats sont utilisés en nutrition infantile, dans les régimes protéiques, l’accroissement de la masse musculaire. Il est utilisé pour les diabétiques ou les sujets souffrant de malnutrition. - Le lactosérum déprotéiné est utilisé aussi dans la panification, la confiserie, la chocolaterie, les sauces, la fabrication des boissons rafraichissantes et nutritives (LORTALS.,BOUDIER J.F.2011). I.2.4.3. Domaine biotechnologique I.2.4.3.1. Biotransformation de lactose Production des solvants, des vitamines, des polysaccharides du méthane, des enzymes, des acides aminés et organiques et de nombreux autres composés à partir de lactose de lactosérum (ZADOW, 1989). L'ensemble des procédés de fermentation du lactosérum montre que le système de production d'acide lactique est l'un des plus avantageux (Figure 2). I.2.4.3.2. Substrat de fermentation Le lactosérum par sa composition biochimique possède d’intéressantes propriétés comme milieu de fermentation pour plusieurs microorganismes assimilant le lactose comme 12 Chapitre I Synthèse bibliographique source de carbone et d’énergie (ALAIS, 1975) : • Les levures : La production de levures lactiques à titre d’exemple Candida kefyr et Kluyveromyces (GANA et TOUZI, 2001). • Les bactéries: à titre d’exemple Lactobacillus casei pour la production d’acide lactique. (MORABITO, 1994) • Les moisissures : à titre d’exemple Penicillium camemberti producteur de protéases (MEKAKRA et al .,1999). SOLVANTS Ethanol ,butanol et acétone ACIDES ALIMENTAIRES ET DERIVES acide lactique acide citrique acide acétique acide lactobionique acide itaconique acide malique LEVURES / CHAMPIGNONS Protéines, cellules levures VITAMINES : Riboflavines vitamines B12, Acide 2-céto-L-gluconique LACTOSERUM (Lactose) - ENZYME : Lactase - BIOGAZ : Méthane -ACIDES AMINES : Variables AUTRES acide gibbérélique 2,3 butane-diol Hydrogène, diacétyl gluconate de Ca acide propionique acide pyruvique galactose bactériocines POLYSACCHARIDES xanthane pullulane acide alginique indicane Figure 2. Valorisation indirecte du lactosérum (ZADOW, 1989) 13 Chapitre II Matériel et Méthodes II.1. Matériel II.1.1. Matériel biologique Dans la présente étude un échantillon de lait de chamelle a été collecté de la région d’Ouargla, une petite fraction de ce lait est utilisée pour l’isolement d’une souche lactique (du genre Lactococcus). Le reste du lait (2 litres) est utilisé pour l’obtention de lactosérum camelin après coagulation. II.1.2. Milieux de culture Les milieux utilisés sont : Milieu M17 (TERZAGHI ET SANDINE., 1975). Le milieu de culture de base utilisé est le milieu M17. Ce milieu a été mis au point pour la culture et le dénombrement des lactocoques dans le lait et les produits laitiers (TERZAGHI ET SANDINE., 1975). Le milieu déshydraté prêt à l’emploi est utilisé pour préparer du bouillon M17 ou de la gélose M17. Ce milieu est stérilisé par autoclavage à 120°C pendant 20mn avant son utilisation (voir annexe 1). Milieu de MÖELLER à l’arginine (MÖELLER, 1955) Ce milieu permet de révéler les décarboxylases liées au métabolisme de l’arginine en milieu liquide. L’enzyme recherchée est l’arginine dihydrolase (ADH). (Voir annexe 1). Milieu M16-BCP (THOMAS, 1973) Ce milieu permet de révéler les décarboxylases liées au métabolisme de l’arginine en milieu solide. L’enzyme recherchée est l’arginine dihydrolase (ADH). (Voir annexe 1). • Milieu MRS-BCP (KIHEL, 1996) Ce milieu est utilisé pour l’étude du profil fermentaire (voir annexe 1). Lait écrémé Ce milieu est utilisé pour les cultures bactériennes et pour la conservation de la souche lactique purifiée à longue durée (voir annexe 1). Milieux de culture à base de lactosérum déprotéiné non supplémenté Deux milieux de culture à base de lactosérum ont été utilisés : 1- Lactosérum d’origine bovine (LB) provient de la laiterie SAFI de Ghardaïa ; 2- Lactosérum cameline (LC) issu de la coagulation de lait camelin par les enzymes gastriques coagulantes (ECD). Ces enzymes sont extraite à partir de l’estomac d’un dromadaire âgé de 14 mois (BOUDJENAH- HAROUN, et al., 2011). . Avant son utilisation comme milieu de culture, ce lactosérum est déprotéiné selon le protocole proposé par MOULIN et al (1976). 14 Chapitre II Matériel et Méthodes II.1.3. Appareillage Les appareils utilisés dans le cadre de cette étude au niveau de laboratoire sont indiqués dans le tableau 07 Tableau 07: Appareillage utilisé au niveau de laboratoire Appareils Marque -Balance électronique (OHNAUS) - Centrifugeuse 10000 tours/mn.(Universal 16R) - pH-mètre INOLAB, pH 720, Germany -Etuve MEMMERT - Four pasteur MEMMERT - Spectrophotomètre visible (UV-1800) SCHIMADZU, UV, 1800 - autoclave SYSTEC, 5075 MLV - Microscope optique. Laboscope 200 - Four pasteur HEARAEAUS -Bain marie Raypa - Incubateur Heidolph Unimax 1010 II.1.4. Petit matériel Le petit matériel utilisé dans le cadre de cette étude est : Micropipettes, micro- seringues, entonnoirs, papier filtre, spatule, différents types de verrerie (béchers, fioles jaugées, fiole à vide, pipettes graduées, tubes à essais, Erlen mayer , tubes à essais en verre, bécher ….). II.1.5 .Produits chimiques : Les produits chimiques utilisés sont présentés dans le tableau 08 Tableau 08 : Les produits chimiques utilisés • Solvants -Acide chlorhydrique Sels -Chlorure Colorants -Bleu de bromothymol • Matériel biologiques Enzymes coagulantes de • -Acide sulfurique de sodium• -Bleu de méthylène 1% dromadaire (ECD) • -Hydroxyde de sodium • -Glycérol • -Ethanol • - Bleu de méthylène 3% 15 Chapitre II Matériel et Méthodes II .2. Méthodes La méthodologie de travail adoptée est récapitulée dans les figures 3 et 4. Lai cru de chamelle collecté 1- Isolement d’une souche lactique S1 (Lactococcus) 2- Purification de la souche S1 isolée S1 Sisolée Conservation à 4°C sur milieu M17 incliné 3- Conservation de la souche S1 purifiée Conservation à -20°C sur milieu lait écrémé 4-Identification phénotypique de la souche isolée par une étude : - Morphologiques ; - Physiologiques ; - Biochimiques. Souche (S1) lactique préidentifiée (Lactococcus) Figure 3: Protocol d’isolement et pré-identification d’une souche lactique (du genre Lactococcus) 16 Matériel et Méthodes Lai cru de chamelle collecté Lait de la vache pasteurisé 1-Mesure du pH 1-Traitement thermique 37°C/25mn 2-Pasteurisation à 72°C /15 secondes 2- Emprésurage 3- Coagulation de lait par les ECD (42°C /1h). 3- Caillage et moulage 4-Filtration du lait coagulé 4- Egouttage/30mn 5- Lactosérum camelin 5- Lactosérum bovin Lactosérum bovin obtenu au niveau de la laiterie SAFI Ghardaïa Lactosérum camelin obtenu au niveau de laboratoire d’Ouargla par coagulation Chapitre II Déprotéinisation de lactosérum Stérilisation à 120°C /20mn Lactosérum déprotéiné et stérilisé Mise en culture de la souche lactique isolée Lactosérum camelin Lactosérum bovin Milieu M17 témoin Mesure de la croissance par : - Mesure de pH - Mesure de la densité optique (DO) - Estimation du poid sec final de la souche ensemencée Interprétation des résultats Figure 4 : Procédure suivie pour l’obtention de lactosérum et la mise en culture de la souche lactique isolée 17 Chapitre II Matériel et Méthodes II.2.1.Isolement et identification phénotypique d’une souche Lactococcus lactis à partir du lait camelin II.2.1.1. Collecte du lait camelin La collecte du lait camelin cru de la région d’Ouargla, à été réalisée selon les règles d’hygiène et d’asepsie recommandées en microbiologie, c'est-à-dire après avoir bien lavé le pis de la mamelle et éliminé les deux ou trois premiers jets de lait (KARAM Z H et KARAM N-E, 2006). Deux litre de lait cru ont été recueilli dans des flacons stériles de 250ml et transporté à 4°c jusqu’au laboratoire. Une petite fraction de ce lait est utilisée pour l’isolement d’une lactocoque. Le reste, est traité par les ECD pour obtenir de lactosérum après coagulation et qui sera utilisé comme milieu de culture ultérieurement. II.2.1.2. Mesure de pH du lait camelin Le pH du lait collecté est mesuré à l’arrivée. La mesure du pH est effectuée à une température du lait à 20°C à l’aide d’un pH-mètre. Un volume de 10ml du lait cru est mis dans un bécher, le bout de l’électrode du pH-mètre est immergé dans le lait. La valeur du pH s’affiche instantanément sur l’écran (DEBOUZ et al ., 2014). II.2.1.3. Préparation des échantillons Après homogénéisation de l’échantillon du lait on a réalisé une série de dilutions décimales à l’aide de l’eau physiologique. Le nombre de dilutions varie selon le produit et sa charge microbienne, les plus souvent trois dilutions sont nécessaires. Les dilutions peuvent être réalisées de façon classique (1ml dans 9 ml de diluant) (GUIRAUD, 1998). (voir annexe 2). II.2.1.4 Conditions de culture. En raison des exigences nutritionnelles complexes des lactocoques, ces bactéries lactiques sont cultivées sur u n milieu riche : le milieu M17 mis au point par (TERZAGHNI et SANDINE, 1975). Les cultures bactériennes ont été réalisées sur milieu liquide ou solide. et ont été portées à l’étuve à 30°C pendant 24 à 72 heures. II.2.1.5. Isolement et purification des souches bactériennes Les ensemencements sont effectués simultanément pour chaque dilution sur deux boites de pétri sur milieu M17. A partir de chaque dilution 0,1ml est ensemencé aseptiquement dans le milieu gélosé M17 pour avoir des colonies bien séparées. Les boites sont incubées à 30°C pendant 48h à 72h (Voir annexe 2). Les bactéries lactiques ont été obtenues à partir des dilutions ayant donnés moins de 10 colonies par boite de pétri (LEISNER et al, 1997). 18 Chapitre II Matériel et Méthodes Les souches bien isolées sont repiquées (2 à 3 repiquage) sur le même milieu de culture M17 et porté à l’incubation à 30°C pendant 24 heures jusqu’à l’obtention des souches pures. Les colonies obtenues sont examinées macroscopiquement et microscopiquement une recherche de la catalase est également effectuée. Seules les isolats en forme de cocci, GRAM (+) et catalase(-) ont été retenues et purifiés par la méthode de stries sur milieu solide M17. La pureté de la souche est vérifiée par une observation microscopique. Ces colonies pures sont retenues pour la suite de l’étude. II.2.1.6. La conservation des souches purifiées II.2.1.6.1. Conservation de courte durée La conservation à court terme de la souche pure est effectuée sur milieu M17 solide incliné. Après croissance à température optimale, les cultures sont maintenues à +4°C et leur renouvellement se fait par repiquage toutes les 4 semaines (Voir annexe 3). II.2.1.6.2. Conservation de longue durée Après la centrifugation à 3000 tr/min de la souche purifiée pendent10 min et après rinçage avec de l’eau physiologique, la souche est congelée à -20°C dans un milieu contenant 70% de lait écrémé (enrichi par 0.05 % d’extrait de levure) et 30% de glycérol (SAMELIS et al., 1994). La culture peut être conservée plusieurs mois. II.2.1.7. Identification phénotypique de la souche purifiée L’identification a été établie en se basant sur des caractères morphologiques et divers caractères biochimiques : production d’enzymes, température de croissance, production de gaz carbonique, fermentation de divers sucre (GUIRAUD, 2012). II.2.1.7.1. Étude morphologique II.2.1.7.1.1. Caractérisation macroscopique Un examen macroscopique permet d’observer les colonies en indiquant leur taille, leur formes, leur couleur et leur aspect (lisse, rigoureuses) (GUIRAUD, 1998). II.2.1.7.1.2. Caractérisation microscopique Un examen microscopique permet de déterminer la morphologie des cellules bactériennes (taille, forme et leur mode de regroupement). La coloration de GRAM nous permet une séparation entre deux grands groupes : les bactéries à GRAM négatives et les bactéries à GRAM positives (DELARRAS, 2007). Apres la coloration de GRAM. Les formes des colonies et leur mode de développement sont notés. Les bactéries GRAM positives et catalase négatives sont présumées des bactéries lactiques. 19 Chapitre II Matériel et Méthodes II.2.1.7.2. Critères physiologiques et biochimiques II.2.1.7.2.1. Recherche de la catalase La catalase est une enzyme présente chez la plupart des bactéries aérobies strictes et anaérobies facultatives. Elle décompose l’eau oxygénée formée, en eau et en oxygène qui se dégage. La réaction catalysée est la suivante : 2H2O2 O2 + 2H2O Cette enzyme est mise en évidence par l’émulsion de la suspension bactérienne dans une goutte d’eau oxygénée à 10 volumes sur une lame. Le dégagement de bulles de gaz indique la présence de la catalase (DELARRAS, 2007). II.2.1.7.2.2. Croissance à différents températures (10°C et 45°C) Les cultures des bactéries se distinguent par leur température optimale de croissance (CORRIEU et LUQUET, 2008). Les bactéries lactiques contenant les genres Lactococcus et Leuconostoc sont dits mésophiles, c'est-à-dire que leur croissance optimale se situe entre 25 et 35°C (DJAMEL et HERVE, 2009). L’aptitude à la culture est testée à 10°C et à 45°C sur un bouillon M17. La croissance est appréciée par l’examen des milieux (présence de trouble) après 24heures à 72 heures en comparaison avec un tube témoin non ensemencé. II.2.1.7.2.3. La production du gaz à partir du glucose (type fermentaire) Ce test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné est transformé. Depuis 1920, ORLA-JANSEN à montré que les bactéries lactiques peuvent se subdiviser en deux groupes biochimique : Les homofermentaires et les hétérofermentaires, la différence entre ces deux groupes est détectable par le dégagement de Co2 (BOURGEOIS et al., 1996). Donc ce test permet de mètre en évidence le Co2 produit. Il est effectué dans un milieu dépourvu de citrate pour éviter la formation de Co2 liée à ce métabolisme particulier (DICKS et VAN VUUREN, 1987). La méthode consiste à ensemencer abondamment deux tubes de 10 ml de bouillon M17 (sans citrate) dans le milieu on introduit une cloche de Durham, le Co2 dégagé par les bactéries hétérofermentaires s’accumule dans la cloche après l’incubation à 30°C pendant 24 à 48 h. II.2.1.7.2.4. Croissance à pH 9,6 Ce test est réalisé par ensemencement des tubes de 10 ml de bouillon M17dont un PH est ajusté à 9,5 (GUIRAUD, 2012). La croissance est appréciée par un trouble de milieu après incubation à 30°C pendant 24 heures à 72heures en comparaison avec un tube témoin non ensemencé. 20 Chapitre II Matériel et Méthodes II.2.1.7.2.5. Croissance en présence de 4% et 6.5% de NaCl Ce test permet de savoir si les bactéries ont la capacité de croitre dans un milieu hepersalé. Les lactocoques ne poussent pas à 6,5% de NaCl, ce test permet de séparer les lactocoques des entérocoques (GUIRAUD, 2012). La méthode consiste à ensemencer ces bactéries dans des tubes en milieu M17 à 6,5% et à 4% de NaCl et les incuber à 30°C pendant 24h à 48h, la croissance de ces bactéries se manifeste par un trouble du milieu en comparaison avec un tube témoin non ensemencé. II.2.1.7.2.6. Croissance sur lait bleu de Sherman (1937) Nous avons testé le développement de la souche isolée en présence de 1% et 3% de bleu de méthylène. Une série de tubes à essais de 9ml de lait stérilisé à 0,1% et à 0,3% de bleu de méthylène (1ml de solution à 1% et/ou 3% par tube de 9ml de lait) est ensemencé par des cultures pures puis incubés durant une période de 24 à 48 heures à 30°C (LEVEAU et al., 1991). II.2.1.7.2.7. Test de la thermorésistance La thermorésistance est réalisée pour les cocci, un tube contenant 10 ml de M17 liquide est inoculé par la souche isolée, ensuite le tube est déposé dans un bain marie à 63,5°C pendant 30 minutes, après refroidissement brusque, la souche est incubée à 30°C pendant 48 à 72h. Un résultat positif se traduit par un trouble (BADIS et al., 2005). II.2.1.7.2.8. Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) La mise en évidence de cette enzyme est intéressent pour la caractérisation des bactéries lactiques. Le rôle de cette enzyme est de libérer l’ammoniac à partir de l’arginine. Pour effectuer ce test on a utilisé le milieu gélosé M16 BCP de THOMAS (1973), et le bouillon de Möeller a l’arginine (milieu liquide) (MOELLER, 1955). C es milieux contiennent un indicateur de pH, le bleu de bromothymol, si la couleur du milieu vire au jaune puis vers le vert (réalcalinisation de milieu) ceci indique la présence de l’enzyme et la dégradation de l’arginine. Si elle reste jaune cela veut dire que la bactérie est ADH négative. II.2.1.7.2.9. Test de fermentation des sucres Il s’agit d’apprécier l’aptitude des souches à métaboliser divers substrats carbonés en particulier les sucres. Le milieu de base utilisé est le bouillon MRS-BCP (sans le glucose et sans l’extrait de viande) additionné d’un indicateur de pH (le bleu de bromothymol à 0,05g/ l ) ,et additionné de 1% des sucres suivants: mannitol, saccharose, sucrose, xylose Rhamnose, galactose, sorbitol, arabinose, maltose, fructose, lactose, glucose, thylose et raffinose. Les solutions de sucres ont été préparées dans 10 ml d’eau distillée contenant 1% des 21 Chapitre II Matériel et Méthodes différents sucres. Ces préparations sont stérilisées par chauffage au bain marie à 100°C pendant 10 min puis conservées au réfrigérateur. Une culture bactérienne de 24h est centrifugée à 3000 tr/min pendant 10min, le culot est rincé 2 fois à l’eau physiologique stérile, une suspension est réalisé avec l’eau physiologique. 0,1 ml de cette suspension est ensemencé dans 2ml du MRS-BCP-sucre recouvrir avec une couche mince d’huile de paraffine stérilisé (SAMELIS et al., 1994). Après incubation pendant 48h à 30°C, le développement de la culture et le virage au jaune de l’indicateur coloré traduit la fermentation du sucre (Figure 5). Milieu MRS (sans extrait de viande et sans citrate) Culture bactérienne de 24h Milieu MRS Centrifugation 3000 tr/min pendant 10min MRS+ le Bleu de bromothymol(BB) Rinçage du culot deux fois MRS-BB MRS-BB+ Solution sucre Suspension : culot + eau physiologique Milieu MRS-BB-sucre + 0,1 ml Recouvrir avec 4 à 5 mm d’huile de paraffine Incubation à 30°C/ 48h virage au jaune de l’indicateur = fermentation du sucre Figure 5: Protocole de la fermentation des hydrates de carbones. 22 Chapitre II Matériel et Méthodes II.2.2. Mise en culture de la souche pré- identifiée dans un milieu de culture à base des lactosérums camelin et bovin II .2.2.1. Coagulation du lait camelin par les ECD La coagulation du lait camelin est réalisée au niveau de laboratoire en utilisant l’extrait coagulant ECD : Enzymes gastriques de dromadaire comme seul agent de coagulation. (BOUDJENAH- HAROUN, et al., 2011). Le procédé de coagulation utilisé découle d’un protocole établi par RAMET (1993) pour la fabrication des fromages frais à partir du lait de dromadaire. Le lait est réparti dans des béchers de 500ml. Après abaissement du pH à une valeur voisine de 5.8 (pH optimal des extraits enzymatiques), on ajoute 5ml de cet extrait dans chaque bécher et on laisse coaguler à une température de 42°C (température optimale de l’extrait coagulant). Dès la séparation de deux phases du lait (lactosérum et mélange sur un tissu filtrant pour faciliter l’égouttage. Le caillé) on verse le dispositif est mis dans le réfrigérateur durant une nuit. Le lactosérum qui s'égoutte est recueilli en totalité. Les étapes suivies dans cette fabrication sont illustrées par la Figure 6. 1- Le lait camelin (2 litres) • Les deux litres de lait cru sont réparti dans des béchers de 500 ml, à raison de 500 ml de lait par béche 2- Pasteurisation • Pasteurisation du lait à 72°C/15 sec dans un bain marie. • Laisser les béchers à température ambiante pour quelques minutes 3- Emprésurage du lait • Remettre les béchers contenant le lait au bain marie à 30°C ; • Ajouter à chaque bécher 5ml des ECD 4-Coagulation • Laisser les béchers au bain marie à 42°C pendant 1h • Obtention de deux phases caillé et lactosérum 5- Egouttage • Versement du coagulum sur un tissu facilitant l'égouttage (compresses stériles) • laisser le caillé égoutter pendant une nuit 6- Récupération du lactosérum • Le lactosérum qui s'égoutte est recueilli en totalité Figure 6 : La coagulation du lait camelin par les ECD 23 Chapitre II Matériel et Méthodes II .2.2.2. Collecte de lactosérum bovin Le lactosérum bovin a été collecté à partir de la laiterie EL OUANI SAFI de Ghardaïa. Le lactosérum collecté est de type « lactosérum doux » issu de la fabrication de fromage frais " TAKMARITHE " à courte durée de consommation (2 à 3 jours) (voir annexe 4) II .2.2.3. Traitement de lactosérum camelin et bovin (déprotéinisation) Le lactosérum doux, provenant de la laiterie EL OUANI SAFI de Ghardaia et celui issu de la coagulation de lait camelin ont été subit une déprotéinisation par chauffage selon le protocole proposé par MOULIN et al (1976) : - Le pH de lactosérum est ajusté à une valeur de 4,6 et 4.3 respectivement pour lactosérum bovin et camelin (point isoélectrique de floculation des protéines bovines et camelines) par addition d'acide sulfurique (0,1N) ; - Chauffage dans un bain-marie réglé à une température de 102°C pendant 5 minutes. - Filtration du sérum après refroidissement, sur un filtre (type Wattman) l'opération est répété plusieurs fois jusqu'à l'obtention d'un sérum limpide ; - le filtrat recueilli est réajusté à pH=6.8 par une solution de NaOH (1N), puis stérilisé à 120°C pendant 20 minutes (Figure 7). 24 Chapitre II Matériel et Méthodes Lactosérum brute bovin et camelin Précipitation des protéines de lactosérum par ajout de l’acide sulfurique (0 .1N) à pH 4.6 pour LB et 4.3 pour LC Chauffage à une température de 102°C pendant 5 minutes. Précipitation des protéines de lactosérum Filtration et séparation des protéines de lactosérum sur un filtre (type Wattman) Les protéines Lactosérum déprotiéné Ajustement de pH du sérum déprotéiné à pH=7 NaOH (1N) Autoclavage à 120°C pendant 20 min Lactosérum déprotiéné Figure 7: Diagramme de déprotéinisation du lactosérum (Moulin et al, 1976) 25 Chapitre II Matériel et Méthodes II .2.2.4.Mise en culture II .2.2.4.1. Préparation de préculture On a prélevé quelques colonies de la culture sur gélose M17 inclinée, qui seront transférées dans un tube de 10 ml de milieu M17 liquide, puis incubées à 30°C pendant 24h . Lorsque la croissance bactérienne est suffisamment avancée, ce milieu va servir à inoculer le milieu de culture (voir annexe 5). II .2.2.4.2. Culture Deux cultures ont été réalisé l’un pour la mesure de la densité optique et l’autre culture pour l’estimation du poids sec final après 48h. Les cultures sont réalisées dans des Erlen mayers d'une capacité de 250ml, contenant : Ces • 100 ml de milieu M17 autoclavé ; • 100 ml de lactosérum doux d’origine bovin déprotéiné et autoclavé ; • 100 ml de lactosérum doux d’origine camelin déprotéiné et autoclavé. Erlen mayers sont ensemencés stérilement par 10 ml de préculture et incubés à 30°C sans agitation (voir annexe 5). II .2.2.5. Mesure de la croissance La croissance bactérienne est suivie par trois méthodes: • Mesure de PH • Mesure de densité optique • Estimation du poids sec final Des prélèvements sont effectués régulièrement chaque 1 heures à partir des 3 cultures expérimentaux réalisés. Les paramètres suivants sont mesurés : II .2.2.5.1. Mesure du pH La mesure de pH permet d’estimer le niveau de biomasse bactérienne (GUIRAUD, 1998). Le pH présent l’acidité à un moment donné on le mesure habituellement à l’aide d’un pH-mètre. Un volume de 5ml de chaque culture est mis dans un bécher, le bout de l’électrode du pH-mètre est immergé dans le milieu. La valeur du pH s’affiche instantanément sur l’écran II .2.2.5.2. Mesure la de densité optique Dans un milieu de culture limpide, la biomasse est quantifiable à l’aide d’une mesure de la turbidité. Des spectrophotomètres à transmission sont généralement utilisés. Elle peut être utilisée, soit directement comme indicateur de la croissance, soit pour calculer une concentration bactérienne, exprimée en nombre de cellule, en nombre d’unité formant colonies ou en point sec bactérien par unité de volume (CORRIEU et LUQUET, 2008). Dans se présent travail la mesure de la densité optique est effectuée pour évaluer la 26 Chapitre II Matériel et Méthodes croissance bactérienne en déterminant Do de la culture bactérienne entre un temps T0 et un temps Tx > T0 (BOUGUESSA et al., 2010). La mesure de densité optique est effectuée à une longueur d’onde de 660nm (Do660) au spectrophotomètre de type SHIMADZU UV-1800. II .2.2.5.3. Estimation du poids sec final Le poids sec de la biomasse est déterminé à la fin de la croissance, après centrifugation et rinçage des trois cultures avec l’eau distillée. La biomasse est séchée dans une étuve réglée à 105°C jusqu’ au poids constant selon les étapes suivantes (GANA et TOUZI, 2001): - Prendre 100 ml de chaque culture (M17, LB et LC) cultivée pendant 48h à 30°C et centrifuger à 3200 tours/minutes pour faciliter la séparation de biomasse; - le surnageant est séparé du culot; - Le culot ainsi obtenu est lavé trois fois avec l'eau distillée stérile en ayant soin de centrifuger après chaque lavage; - un maximum de surnageant est éliminé, puis le culot est mis en suspension dans un minimum d'eau distillée; - les culots de trois cultures sont placés dans des capsules en acier inoxydable et séchés dans une étuve à 105°C pendant 24 heures; - le poid sec est déterminé par la formule suivante: P (g/l) = (m – mc)/0.01 Où m : masse de culot + la masse de la capsule (g) mc: masse de la capsule vide. (g) (voir annexe 5) II.2.2.6. Culture sur milieu à base de lactosérum gélosé Les lactosérums (bovin et camelin) sont utilisés pour préparer des milieux de culture gélosés par l’addition de l’agar (15g/L). Ces milieux sont stérilisés par autoclavage à 120°C pendant 20mn. La souche lactique isolée est ensemencée dans ces deux milieux et le milieu M17 gélosé utilisé comme témoin et sont ensuite cultivées à 30°C pendant 24h à 72h. 27 Chapitre III Résultat et discussion III.1. Isolement et identification phénotypique d’une souche Lactococcus lactis III.1.1. pH du lait camelin La valeur du pH du lait collecté de la région d’Ouargla est égale à 6.34. Le pH du lait compris entre 6.6 et 6.8. Selon DESMAZEAUD (1990), l’amplitude des variation de pH au cour du cycle de lactation et l’influence de l’alimentation, est relativement modeste (LUQUET et CORRIEU, 2008). La valeur du pH du lait camelin obtenue dans la présente étude est proche de pH signalé par certains auteurs : CHETHOUNA, (2011) (6.37) et SIBOUKEUR, 2007 (6.31). Des valeurs plus élevées ont été rapporté par d’autre auteurs, on peut citer, DEBOUZ ,2014 (6.51), BOUDJENAH, 2012 (6.53), MAHBOUB et al., 2010 à Ouargla (6.65). La teneur élevée en vitamine C dans le lait serait à l’origine du pH bas. Par ailleurs, le pH bas du lait camelin peut être attribué à la forte concentration en acide gras volatils (CHETHOUNA, 2011). VIGNOLA (2002) et CAROLE (2002) signalent que le pH du lait dépend principalement de la présence de caséines et des anions phosphorique et citrique. III.1.2. Isolement et purification de la souche lactique A partir d’un échantillon de lait cru de chamelle provenant d ’ Ouargla nous avons isolé deux souches lactiques (S1 et S2), la souche (S2) s’est révélée positive à la coloration de GRAM et catalase positive, donc éliminée, alors que la souche (S1) recherchée (GRAM+ et catalase -) a été purifiée par la méthode de stries sur milieu M17. III.1.3. Identification de la souche isolée : L’identification de la souche isolée est réalisée par des tests morphologiques, physiologiques et biochimiques (GUIRAUD, 2012).La souche étudiée est GRAM positif et catalase négatif. III.1.3.1. Critères morphologiques III.1.3.1.1. Examen macroscopique Les cultures obtenues sur les boites de pétris sont observées à l’œil nu pour caractériser la forme, la taille, l’aspect ainsi que la couleur des colonies (BADIS et al., 2006). Le repiquage successif sur milieu M17 solide a révélé des petites colonies rondes, blanchâtres, crémeuses de diamètre moyen de 0.5mm (Figure 08). III.1.3.1.2. Examen microscopique La caractérisation microscopique est basée sur la coloration de Gram. L’observation microscopique est effectué a grossissement (G : x 100) avec l’huile à immersion, nous avons observé que les bactéries étaient GRAM positif apparaissant sous différentes formes avec différents modes d’associations (Coques et Bâtonnets). Nous n’avons gardé que les bactéries 28 Chapitre III Résultat et discussion à GRAM positives et en forme de coque. Les coques sont disposées en paires (diplocoques) ou en courtes chaînettes (Figure 0 9 ). La souche S1 isolée en forme de Cocci, Gram positif et catalase négative est conservée pour les études ultérieures. Les résultats de l’observation macroscopique et microscopique sont résumés dans le (tableau 09). Tableau09: Résumé de l’observation macroscopique et microscopique de la souche isolée Examen réalisé Examen macroscopique Examen microscopique Forme Couleur Aspect Taille Milieu Forme Arrangement Gram Régulier blanches lisse Petites (0.5mm) M17 Cocci Paires, chaînettes Positive S1 Figure 8: Observation macroscopique de la souche isolée cultivée sur milieu M17 III.1.3.2. Critères physiologiques et biochimiques Figure 9:Observation microscopique de la souche isolée après coloration de GRAM (G : 10x100). En plus de ces tests basés sur la morphologie des bactéries nous avons utilisé des tests physiologiques et biochimiques pour déterminer le genre et l’espèce de la souche lactique isolée (S1). III. 1.3.2.1. Test de catalase La recherche de la catalase se fait par la mise en contact des colonies avec quelques gouttes d’eau oxygénée à 10V. Le dégagement gazeux traduit l’activité positive de cette enzyme. Lors de cette étude nous avons isolé à partir du lait camelin deux souches lactiques (S1 et S2), la souche S2 s’est révélée catalase positive, donc éliminée, alors que la souche 29 Chapitre III Résultat et discussion S1 recherchée (Catalase -) a été purifiée et gardée pour la suite de l’étude III. 1.3.2.2. Tests physiologiques Les résultats des tests suivant : Croissance à 45°C, croissance à pH 9.6, croissance à 4%, 6.5% de NaCl et la résistance à la température de 60°C pendant 30mn sont résumé dans le tableau 10. Tableau 10 : Résultats des tests physiologiques. S1 Température (°C) 10 45 + - pH 9,6 - NaCl (%) 4 6,5 - Croissance à 63,5° C/30min - Les expériences effectuées ont montré que la souche isolée est incapable de se croitre sur le bouillon M17 avec une concentration de NaCl de 4%, et 6,5% et à pH 9,6. Se multipliée à 10°C, mais non à 45 º C et ne résiste pas à température de 60.5°C pendant 30mn (Figure10) (Figure 11). T 10°C (+) Figure 10: Croissance de la souche isolée à 10°C. T:tube témoin (+) : Croissance T 45°C (-) 63°C (-) 4% (-) 6.5% (-) 9.6% (-) Figure 11: Résultats des tests physiologiques (-) : Absence de la croissance III.1.3.2.3. Type fermentaire Dans des tubes à essais, menus de cloches de Durham et contenant le milieu M17 à pH 7 on a ensemencé les souches à tester. Les souches hétérofermentaires vont produire, en plus de l’acide lactique, l’acide acétique et le CO2. Ce gaz libéré va être mis en évidence par la poussée de la cloche de Durham vers le haut. Nous avons remarqué que la souche étudiée est homofermentaire où il n’y a pas un dégagement de gaz (Figure 12). III .1.3.2.4. Croissance sur lait bleu de Sherman La souche isolée (S1) a donné une réaction positive avec le bleu de méthylène 1% et 3% (Figure 13).Selon CHAMPAGNE et al., 1994) Lc. lactis subsp.cremoris réduit le bleu 30 Chapitre III Résultat et discussion de méthylène à 1% et 3% T (-) (-) (+) (-) (+) Figure 13 : Résultat du test de réduction de bleu de méthylène de la souche examinée sur le milieu lait Sherman (0.1%) et (0.3%). T : Témoin (+) : Réduction de bleu de méthylène III.1.3.2.5. Recherche de l’Arginine dihydrolase Figure 12 : Résultat obtenu pour le type fermentaire de la souche examinée. T : tube témoin non ensemencé (-) : Absence de gaz La production de l’acide lactique acidifie le milieu de culture, qui contient un 1% indicateur de pH le bleu de bromothymol, et la couleur de ce dernier va virer vers le jaune. Les bactéries possédant l’ADH vont réalcalinisé le milieu et sa couleur reviendra vert, les souches qui ne possèdent pas cette enzyme leur milieu va rester jaune. Après incubation à 30°C, nous avons remarqué que la souche étudiée est dénuée d’une arginine déshydrogénase (ADH négative) (Figure 14). Figure 14 : Aspect de la souche ADH négative sur milieu Möeller à l’arginine. La couleur jaune de milieu indique l’absence de l’enzyme de l’ADH 31 Chapitre III Résultat et discussion III.1.3.2.6. Test de fermentation des sucres L’identification de l’espèce est complétée avec l’étude de la fermentation des hydrates de carbones par la souche isolée (GUIRAUD, 2012). La fermentation des sucres entraine une acidification se traduisant par un virage de l’indicateur coloré dû à l’acidification du milieu par la souche en utilisant les sucres fermentescibles (Figure15). Les sucres utilisés sont : Glucose, Galactose, Saccharose, Sorbitol, Sucrose, Mannose, Mannitol, Raffinose, Rhamnose, Arabinose, Fructose, Lactose, Xylose et Tylose. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 11. Tableau 11 : Résultat de la fermentation des hydrates de carbones Sucres utilisé Glucose Galactose Saccharose Sorbitol Sucrose Maltose Mannitol Raffinose Rhamnose Arabinose Fructose Lactose Thylose Xylose Abréviation (Glc) (Gal) (Sac) (Sor) (Suc) (Mal) (Man) (Raf) (Rha) (Ara) (Fru) (Lac) (Thy) Xyl Résultat obtenu + + + +/+ + + + (+) : Fermentation du sucre utilisé (-) : Résultat négative T Man Raf Sor Sac MalGlu Thy Gal Ara Xyl Suc Glc Fru Lac Figure 15: Résultat de la fermentation des hydrates de carbones de la souche (S1) isolée T : Témoin, Glc : Glucose, Gal : Galactose, Sac : Sacharose, Sor : Sorbitol, Suc : Sucrose, Man : Mannitol,Raf : Raffinose, Rha : Rhamnose, Ara :Arabinose, Fru : Fructose, Lac : Lactose, Xyl : Xylose. Thy : Thylose Les résultats des tests morphologiques, physiologiques et biochimiques sont résumés dans le (tableau 12). 32 Chapitre III Résultat et discussion L’identification phénotypique du genre est d’abord orientée par la morphologie, puis par le type fermentaire (production de CO2 à partir du glucose) et par la suite par les résultats des tests physiologiques de la souche isolée (GUIRAUD, 2012). L’étude macroscopique réalisée sur milieu solide M17 nous a permis d’observer de petites colonies blanchâtres, à contour régulier , lisses et légèrement bombées. L’examen microscopique a révélé que la souche isolée est Gram positif, de forme cocci sphérique, disposée en diplocoques ou en chaînettes. Le résultat de type fermentaire montre que cette souche est effectivement homofermentaire (PRESCOTT et al., 2013). Pour différencier les entérocoques, des lactocoques nous nous somme basés sur les testes de croissance en présence de 6,5% de NaCl et à pH 9,6, la croissance à 45°C et le test de thermorésistance. La souche isolée est capable de croitre à 10 et non pas à 45°C et ne se développe pas dans un bouillon à pH 9,6 .Cette souche ne pousse pas en présence de 4 % de NaCl et non pas à 6,5%, elle ne survive pas après leur exposition à 60°C pendant 30 min et ne produise pas du l’ammoniac à partir de l’arginine (Tableau 12). Selon (GUIRAUD, 2012; LARPENT et al., 1997) les lactocoques ne poussent pas dans les conditions hostiles, en présence de 6.5% de NaCl, à pH 9,6 et à température 45°C. A partir des résultats obtenus et qui sont conformes à ceux rapportés par LARPENT (2000), GUIRAUD (2012) et (PRESCOTT et al., 2013) nous pouvons conclure que la souche bactérienne isolée correspond probablement au genre Lactococcus. En présence de différentes sources hydrocarbonés, cette souche utilise le lactose et le galactose, le fructose et le sucrose, tandis qu’elle est incapable d’utiliser les autres sucres testés tel que le maltose, mannitol, sorbitol (Tableau 12). Les résultats de fermentation des sucres semblent similaires à celles décrit par LARPENT (2000) et CHAMPAGNE et al ., (1994) pour Lc. lactis subsp.cremoris. La même souche a été isolée par KACEM et al., 2002 dans le lait de vache, de brebis et de chèvres de l’Ouest Algérien. Cependant, cette souche incapable de résister à 6.5% de NaCl est différente de celle isolée par KARAM N.E. et ZADI-KARAM H (2006) qui ont isolé à partir du lait de chamelle des souches Lactococcus lactis subsp. Cremoris ayant la capacité inattendue de résister à une concentration de 6,5% de NaCl, ce qui les distingue des espèces habituellement décrites dans la littérature pour Lactococcus lactis (incapable de résister à 6.5% de NaCl). 33 Chapitre III Résultat et discussion Tableau 12: Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche (S1) isolée Profil fermentaire Gram Catalase Forme des colonies Couleur des colonies Aspect des colonies Morphologie Type fermentaire Croissance à : 4% de NaCl 6.5 de NaCl Criossance à : 10°C 45°C Test de thermorésistance (survie à 60°C/30mn) Croissance à PH 9.6 Hydrolyse de l’arginine Test de Sherman Glucose Galactose Sacharose Sorbitol Sucrose Maltose Mannitol Raffinose Rhamnose Arabinose Fructose Lactose Xylose Thylose + + ronde blanchâtre Muqueux Cocci Homofermentaire + + + + + +/+ + + + La souche isolée (S1) est pré-identifiée comme étant Lactococcus lactis subsp cremoris. 34 Chapitre III Résultat et discussion III .2 Mise en culture de la souche lactique isolée dans un milieu de culture à base de lactosérum déprotiéné (camelin et bovin). III.2.1. Traitement de lactosérum camelin et bovin (déprotéinisation) Après coagulation du lait camelin par l’extrait coagulant adulte (ECD) nous avons recueilli deux litre de lactosérum camelin. Parallèlement deux litres de lactosérum bovin ont été collectés de la laiterie SAFI de Ghardaïa. L'aspect du lactosérum provenant du lait camelin est de couleur blanche très marquée contrairement au sérum de lait de vache qui possède un aspect jaune verdâtre (Figure 16). Ceci est attribué à la concentration accrue des petites particules de caséines et des globules gras dans le lactosérum du lait de chamelle (AL HAJ et Al KANHAL, 2010). Selon WEBB et al.,( 1974) la teneur en riboflavine, qui est responsable de la couleur verte caractéristique du lactosérum, et qui est plus faiblement représentée dans le lait de dromadaire que dans le lait de vache, intervienne de manière déterminante. Les lactosérums obtenus (bovin et camelin) ont été déprotéiné selon le protocole de MOULIN et al., (1976) par chauffage à pH 4.6 (lactosérum bovin) et à pH 4.3 (lactosérum camelin) , ce qui a permet d’obtenir un lactosérum limpide déprotéiné (Figure 17). Selon CORRIEU et LUQUET, (2008) le principal inconvénient, lors de l’utilisation du lactosérum, est lié à la présence des protéines sériques qui précipitent lors de traitement thermique, nécessitant ainsi une étape de séparation. Selon LINDEN et LORIENT(1994) la déprotéinisation par chauffage du lactosérum est partielle car le lactosérum possède des protéines fragiles les albumines, les globulines, immunoglobulines, les protéoses-peptones et les protéines mineur, ont un pHi (point isoélectrique) varie de 4,6 à 5,2 et n'ont pas un pHi fixe égal 4.6. A ce pH, ils précipitent certaines fractions protéiques tandis que les autres restent solubles dans le sérum. Après traitement du lactosérum par chauffage et filtration le lactosérum déprotéiné a été subit un traitement thermique pendant 20 mn à 120°C avant son utilisation comme milieu de culture. Selon DRIDER.D et PREVOST, (2009) le traitement thermique sert d’une part, à détruire la majeure partie de la flore contaminante et d’autre part, dénature des substances antimicrobiennes naturellement présentes dans le lactosérum tel que le lysozyme, la lactoferrine, les immunoglobulines et lactoperoxydase. 35 Chapitre III Résultat et discussion LC LB LB Figure 16: Aspect de lactosérum brute LB : Lactosérum bovin de couleur jaune verdâtre LC : Lactosérum camelin de couleur blanche LC Figure 17: Aspect de lactosérum déprotiéiné LB : Lactosérum bovin déprotéiné LC : Lactosérum camelin déprotéiné III.2.2. Mesure de la croissance La croissance de la souche lactique isolée a été testée sur des milieux de culture à base des lactosérums déprotéinés (camelin et bovin) en utilisant un milieu de culture M17 comme témoin. Pour suivre l’évolution des cultures, des mesures de pH et de la DO ont été réalisé chaque 1h pendant 48h. L’estimation du poids sec final de cette souche dans les trois cultures a été effectuée après 48h. III.2.2.1. Mesure du pH La mesure du pH permet d’estimer le niveau de biomasse bactérienne (GUIRAUD, 1998). La figure 18 montre l’évolution du pH au cours de la croissance de la souche lactique testée dans les trois cultures M17, LB et LC. Les résultats montrent que le pH diminue progressivement dans le lactosérum bovin et camelin comparativement avec le milieu M17 témoin. Cette diminution du pH est due à la production de l’acide lactique dans le milieu de culture après fermentation de lactose. Selon AMRANE et PRIGENT, (1998), la diminution du pH, lors de la culture libre se combine à l'accumulation de l'acide lactique dans le milieu. Les valeurs du pH mesurés après 48h dans les milieux de culture M17 témoin, LB, et LC sont de l’ordre de 4.5, 4.2 et 3.97 respectivement. La valeur du pH enregistrée dans le milieu M17 témoin et proche de celle rapportée par ELMOUALDI et al., (2008) avec 4.32 pour la croissance de Lactococcus lactis subsp cremoris. 36 Chapitre III Résultat et discussion Selon CORRIEU G et LUQUET M-F, (2008) l’acidité maximale des lactocoques, correspond à un pH de 4,3 à 4,5 et l’espèce Lactococcus lactis n’acidifie pas très rapidement mais peut abaisser le pH du milieu jusqu'à 4.2. Et la sous espèce Lactococcus lactis subsp.cremoris se distingue essentiellement par sa capacité acidifiante. Le pH enregistré dans le lactosérum camelin (3.97) serait légèrement plus acide que le lactosérum bovin (4.2). Par ailleurs, le pH bas de lactosérum camelin peut être attribué à la forte concentration en acide lactique produit dans ce milieu par la souche isolée comparativement au lactosérum bovin. Ces résultats montrent que la souche isolée du lait camelin semble très adaptée à la croissance et la conversion de lactose (principale source de carbone dans le lactosérum) en acide lactique dans le lactosérum camelin qui est légèrement riche en lactose par rapport au lactosérum bovin .Selon FARAH (1996) ; FARAH (2004) et FARAH (2011) la teneur en lactose dans le lait de chamelle varie de 2,40 à 5,85 % et est légèrement plus élevée que la teneur en lactose du lait de vache. Le lactose est le principal constituant du lactosérum de fromagerie, ce sucre représente une principale source de carbone pour les microorganismes (LUQUET et FRANCOIS ,1990). Les résultats de BOUDJEMA (2009) ont montré que le lactose représente 70 à 72 % de l'extrait sec de lactosérum. 8 PH M17 PH PH LB PH LC 6 4 2 Temps (heures) 0 0 10 20 30 40 50 60 Figure 18: Evolution de pH en fonction de temps dans les trois milieux de culture M17, LB et LC LB : Lactosérum bovin LC : Lactosérum camelin III.2.2.2. Mesure de la densité optique et l’estimation du poid sec final La figure 19 représente les mesures de l’absorbance instantané dans les trois milieux de culture M17, LB et LC à une longueur d’onde de 660 nm (DO660). La densité optique est utilisée directement comme indicateur de la croissance, elle permet un suivi direct de l’évolution de la biomasse au cours de culture. Les résultats enregistrés montrent que la Do augmente progressivement avec le temps dans les lactosérums camelin et bovin ensemencés par cette souche comparativement à la Do 37 Chapitre III Résultat et discussion dans le milieu M17 témoin, milieu commercial destiné à la culture des lactocoques. Par ailleurs, l’absorbance dans le lactosérum camelin après 48h est meilleur (1.27) par rapport à celle obtenue dans le lactosérum bovin (1.10). Cela peut être attribué à la différance de concertation en biomasse dans les deux milieux. Selon la loi de Beer Lamber lorsqu’une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau lumineux monochromatique,elle absorbe une quantité de lumière qui est proportionnelle à sa concentration cellulaire (BOURGEOIS et LEVEAU, 1991). En outre, la biomasse finale obtenu dans le lactosérum camelin après 48h est égale à 1.50 g/l cette valeur et proche de celle enregistré dans le milieu M17 témoin (1.60g/l), et supérieure à celle du lactosérum bovin qui est de l’ordre de 1g/l. Les valeurs obtenues se situent dans la fourchette des valeurs rapportés par CORRIEU et LUQUET, (2008) pour les concentrations bactériennes atteintes en fin de culture pour les lactocoques. Ainsi, les biomasses finales sont généralement comprise entre 1 à 2g/l à pH libre et entre 5 à 12g/l à pH contrôlé. A la lumière de ces résultats, on a constaté que les lactosérums (camelin et bovin) peuvent être des milieux de culture adéquat pour la croissance de la souche lactique isolée et, que cette souche semble bien adaptée à se développer sur le lactosérum camelin, comparativement au lactosérum bovin. Cela peut être attribué à la différence de composition de ces deux milieux de culture. Selon NOVAK L (1998) la croissance de Lactococcus lactis est dépendante de la composition du milieu de culture, tant en terme d'efficacité que de vitesse. Le rendement en biomasse formée par rapport au substrat catabolique, augmente avec la richesse du milieu. La DO 660nm 1,5 1 abs M17 abs LB 0,5 abs LC 0 Temps(heur) 0 10 20 30 40 50 60 Figure 19 : Evolution de la DO en fonction de temps dans les trois milieux de culture M17, LB et LC LB : Lactosérum bovin LC : Lactosérum camelin DO: Densité optique 38 Chapitre III Résultat et discussion poids sec final 2 1,5 Poids sec final 1 0,5 0 M17 LB LC Figure 20: Estimation du poids sec final dans les trois milieux de culture M17, LB et LC après 48h. III.2.2.3. Culture sur milieu à base de lactosérum gélosé Les milieux de culture gélosés à base des lactosérums déprotéinés bovin et camelin et le milieu M17 témoin sont stérilisés et ensemencés avec la souche isolée, ensuite cultivées à 30°C pendant 24h à 72h. Les résultats obtenus ont révélé une croissance importante de la souche testée (figure 21).Ces résultats confirment bien les résultats obtenus dans le milieu de culture à base des lactosérums (camelin et bovin). En outre ces résultats montrent la possibilité d’utiliser des milieux de cultures à base des lactosérums (bovin et camelin) pas seulement pour des fins analytiques (croissance sur milieu liquide) mais aussi pour l’identification. A B C Figure 21 : Croissance de Lc. lactis subsp cremoris (pré-identifiée) sur milieu M17 témoin (A), lactosérum bovin (B) et lactosérum camelin (C). 39 Conclusion Conclusion Le rejet dans la nature des quantités importantes du lactosérum représente d'une part une perte très importante en éléments nutritifs du lait et d'autre part une pollution redoutable pour l’environnement. Pour remédier à ces problèmes, la valorisation de ce sous produit est plus que nécessaire. Dans le présent travail, nous avons étudié l’aptitude d’une souche lactique à croitre dans un milieu de culture à base de lactosérum camelin et bovin. Le milieu M17 a été utilisé comme témoin. Dans un premier temps, notre travail a débuté par : - L’isolement et la purification d’une souche lactique à partir d’un échantillon du lait camelin ; - L’identification phénotypique de cette souche par une étude macroscopique et microscopique, complétée par une étude physiologique et biochimique sur un milieu M17. Les résultats obtenus nous a permet de caractérisée la souche isolée comme étant Lc.lactis subsp. cremoris. La deuxième étape de notre travail a porté sur l’étude de l’aptitude de cette souche isolée à croitre sur un milieu de culture à base de s lactosérums (bovin et camelin). La croissance de cette souche à été évalué par la mesure de pH et de la densité optique. Les résultats obtenus ont révélé que le lactosérum déprotéiné peut être considéré comme un milieu de culture adéquat à la croissance de la souche lactique testée, avec une différence remarquable de la croissance dans le lactosérum camelin par rapport au lactosérum bovin . En effet, à pH non contrôlé (pH libre) et sous les conditions optimales de température (30°C) et de pH (6.8), la production d’acide lactique par cette souche lactique dans le lactosérum camelin (pH 3.97) est beaucoup plus important que dans le lactosérum bovin (pH 4.20). Parallèlement La production de la biomasse est plus considérable dans le lactosérum camelin (1.5g/l) que dans le lactosérum bovin (1g/l). Une culture sur un milieu à base des lactosérums camelin et bovin gélosés a révélé une croissance importante de la souche testée. Ces résultats rehaussent la possibilité d’utiliser ces milieux non seulement pour des fins analytiques (croissance sur milieu liquide) mais aussi pour l’identification. Cependant l’utilisation de lactosérum seul comme milieu de culture reste limitée par plusieurs facteurs auxquels il faut remédier : - Le lactosérum n’a pas un pouvoir tampon très élevé, les effets positifs sur la croissance seront limités si aucun contrôle de pH n’est effectué. Il faut que la fermentation 40 Conclusion se déroule en contenu avec un contrôle externe de pH (CEpH) en utilisant comme agents de neutralisation, hydroxyde de calcium, hydroxyde de sodium…ect. - Le traitement thermique provoque la précipitation d’une partie des protéines de lactosérum. Cette insolubilisassions est doublement pénalisante car, d’une part, elle diminue la quantité d’azote disponible dans le milieu et, d’autre part, elle induit la formation d’un précipité qui pourra contaminer les souches inoculées et modifier leur résistance à la stabilisation. Pour compenser ces inconvénients: • Il est possible de réaliser une hydrolyse enzymatique de la fraction protéique avant le traitement thermique (par la trypsine, la protéase..). • L’élimination de précipité en le séparant par filtration avant la fermentation 41 Référence Bibliographiques • ADRIAN J., LEGRAND G., FRANGNE R.(1991). Dictionaries de biochimie alimentaire et de nutrition. Tec. et doc. Lavoisier. 3ème édition : P 116. • AGNES N. ( 1986).Production des protéines à partir de lactosérum brut. Thèse de 3eme cycle, université de Lyon, France. • ALHAJ OMAR A.,HAMAD A. et AL KANHAL A. (2010).Compositional, technological and nutritional aspects of dromedary camel milk : review. International Dairy Journal, 20, 811-821. • AL HAJ O.A., AL KANHAL H.A. (2010).Compositional, technological and nutritional • aspects of dromedary camel milk – review. International Dairy Journal xxx. P. 1-11. • A M R A N E A and PRIGENT Y (1998). 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Annexe Milieux de culture • Milieu de culture M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) Tableau 1 : Composition de milieu de culture M17 en g/l (Terzaghi et Sandine, 1975) Milieu M17 Milieu de base Solution de lactose Composition Quantité - Peptone trypsique de caséine 2,50 g - Peptone pepsine de viande 2,50 g - Peptone papainique de soja 5,00 g - Extrait de levure 2,50 g - Extrait de viande 5,00 g - Glycérophosphate de sodium 19 g - Sulfate de magnésium 0,25g - Acide ascobique 0,50 g - Eau distillée qsp 950 ml - Peptone trypsique de caséine 2,50 g - Peptone pepsine de viande 2,50 g - Peptone papainique de soja 5,00 g - Extrait de levure 2,50 g Lactose Eau distillée Stérilisation à 120 pendant 20mn 5g 50 ml Annexe • Milieu MRS-BCP (KIHEL, 1996) Tableau 2 : Composition de milieu MRS-BCP en g/l (KIHEL, 1996) Milieu MRS-BCP PH 6 .9 • Composition Quantité Protéose peptone 10 g Extrait de levure 5g Tween 1mg Citrate de sodium 2g Acétate de sodium 1g Sulfate de manganèse 0.05 g Phosphate potassique 2g Eau distillée 1000 ml bleu de bromothymol 0,05g/l Stérilisation à 120 pendant 20mn Milieu M16-BCP (Thomas, 1973) : Tableau 3: Composition de milieu M16-BCP en g/l (Thomas,1973) Milieu M16-BCP Composition Quantité Extrait de viande 5g Extrait de levure 2,5g Peptone papainique de soja 5g Biopolypeptone 5g Lactose 2g Tweene 80 1g Acide ascorbique 0,5g Bleu de bromothymol 0,05g L-arginine Eau distillée Agar-Agar PH 6,8 Stérilisé à 110 °C pendant 10 min. 4g 1000ml 15g Annexe Milieu de Möeller à l’arginine (Möeller, 1955 Tableau 4 : Composition de milieu Möeller à l’arginine en g/l (Möeller, 1955) Milieu Möeller Composition Quantité Extrait de levure 3g L-arginine 5g glucose 1g chlorure de sodium 5g indicateur de pH le pourpre de bromocrésol 0,16 mg pH 6.8 Stérilisé à 110 °C pendant 10 min. • Milieu de dilution Tableau 5 : Composition de milieu de dilution (g/l) Milieu Milieu de dilution • Composition Nacl Quantité 5g Eau distillée 1000ml Milieu lait écrémé Tableau 6: Composition de milieu lait écrémé (g/l) Milieu Lait écrémé pH 6 .8 Composition Quantité Lait écrémé 10 g Extrait de levure 0.5 g Eau distillée 1000 Autoclavage 120°C pendant 20min Annexe • Préparation de la dilution (DELARRAS, 2007). -A l’aide de la pipette de 10ml, prélever et introduire 9ml de diluant dans chacun de 4 tubes. - Homogénéiser convenablement le produit a examiné (lait) puis, à l’aide d’une pipette de 1ml stérile, prélever 1ml de lait ; - Introduit aseptiquement le volume prélevé dans un tube contenant 9ml de diluant. Ainsi s’obtient une dilution de 10-1 ; - Rejeter la pipette dans un récipient contenant de l’eau javellisée ; - Prélever 1ml de la dilution au 10-1 ; - L’introduire dans un deuxième tube contenant 9ml de diluant, ainsi s’obtient une dilution de 10-2- rejeter la pipette ; - Une troisième, quatrième opérations s’effectuant de la même manière afin d’obtenir une dilution, au 10-3 et 10-4. • Protocole de préparation de boites de pétri dans la zone stérile (DELARRAS, 2007) Verser d’abord le contenu du flacon dans une boite de pétri vide et stérile, en respectant les précautions suivantes : - Essuyer avec soin le flacon à la sortie du bain marie ; - Enlever le bouchon dans la zone stérile du bec de gaz Bunsen et flamber l’ouverture du tube pour stériliser; - Ouvrir la boite de pétri du côté de la flamme du bec de gaz, verser le milieu de culture et refermer rapidement le couvercle ; - Répartir la gélose dans la boite en agitant doucement ; - Laisser la boite de pétri, sur la paillasse jusqu’à solidification du milieu de culture. • Conservation de la souche purifiée Tubes de conservation à courte durée (Milieu M17) Fabrication de fromage frais au niveau de la laiterie SAFI Ghardaïa Caillé et lactosérum Moulage Egouttage et récupération de lactosérum Fromage frais conditionné ″ TAKMARITHE ″ Lactosérum bovin (brute) collecté Souche lactique conservée dans le milieu M17 incliné Tube de 10ml de milieu M17 ensemencé avec la souche isolée Culture de la souche lactique isolée dans LB, LC et M17 témoin M17 Préculture (10ml) LB LC Capsules du poids sec final de la souche isolée dans le LB, LC et le milieu M17 témoin
