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Sélection du Top
Spermatozoïde
Université de Liège
CPMA
CHR de la Citadelle
S. Perrier d’Hauterive,MD, PhD,
M. Dubois, O. Gaspard, F. Thonon, C. Jouan, S. Ravet,
P. Ruggeri, V. Gridelet and J-M Foidart
XIIèmes Journées Liégeoises de Gynécologie-Obstétrique
24-25 septembre 2009
Reproduction: histoire de rencontres
• Fécondation: rencontre des gamètes
– Spermatozoïde normal: le top spermatozoïde
– Ovule mature: le top ovocyte
 embryon compétent
• Implantation: rencontre embryon et
endomètre
– Embryon
• Développement embryonnaire précoce
– Endomètre maternel
• fenêtre de réceptivité
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Dr S. Perrier d’Hauterive
Sperme
• Fonctions:
1. Donner une population de
spermatozoïdes aptes à féconder
l’ovule
 spermogramme
2. Aptitude pour le gamète de
permettre le développement d’une
embryon normal et sain apte à
s’implanter
 dégats ADN, MSOME
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Evaluation du sperme
• Progrès en andrologie: focus quasi
exclusif sur le fécondation de l’ovule:
– ICSI (1992): Perte de la sélection
naturelle: injection de spermato
immatures, immobiles, morpho
pathologique ou ADN très fragmenté
avec certain succès (Ogura et al. 2005):
!!tolérance de la fécondation!!
– conséquences de la fécondation des
ovocytes avec des spermatozoïdes à
l’ADN endommagé ne sont pas connues
avec certitude
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Dégats de l’ADN: fragmentation/décondensation
Infections
Exposition
chaleur
Age, erreurs de
réplication
(De Iuliis et al., 2009)
Stress oxydatif
Exposition aux
xénobiotiques:
thérapeutique,
occupationnel ou mode de
vie (pesticides, tabac, styrène,
Irradiations
électromagnétiques:
téléphones mobiles!!
Clivage lié endonucléase
Erreurs d’imprinting
Spermato défecteux:
- protamination défectueuse:
décondensation ADN
- Apoptose défecteuse (↑ROS)
Dégâts ADN
-résidus cytoplasmiques (↑ROS)
hydrocarbures, polluants, …)
Développement aN
Echec implantation
Embryon normal
Réparation ADN
FC
aN chez la descendance
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Dégats de l’ADN
• Description d’association de dégats de
l’ADN avec:
– Réduction taux de G en fécondation in
vitro (34%vs19%), altération
développement embryonnaire, ↑FC,
faible fertilité en fertilité naturelle ou
assistée (Sakkas 1998, Aitken 2001, Duran 2002, Morris
2002, Benchaib 2003, Loft 2003, Virro 2004, Kruger 2004,
Tesarik 2006, Libman 2006, )
– Incidence élevée de pathologies dans
la descendance: infertilité, cancer,
maladie génétique (S Apert) mais R faible
pour G1…Conséquences sur les générations
futures??
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Dégats de l’ADN spermatique
• Physiologiquement et dans certaines limites:
mécanismes de réparation de l’ADN
endommagé par l’ovocyte (Shimura 2002), mais
parfois défectueux:
– Dégats étendus, déficits ovocytaires (âge,
culture IV, …) (Zheng 2005)
– Réparation aberrante (Aitken 1999)
•
Frydman et al. 2008: bonne réserve
ovocytaire ne prévient pas la réduction
des TG associée au sperme à fragmentation
élevée.
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Fragmentation de l’ADN
• Définition:
cassures de l’ADN double brin: particulièrement
fréquentes dans la population masculine subfertile
(Irvine et al. 2000)
• Ne constitue pas une mutation
mais est un changement pro-mutagène qui peut
générer des mutations chez la descendance suite à
une réparation inadéquate ou défectueuse
• Impact:
principalement sur les grossesses et fausses couches,
peu au niveau du développement embryonnaire
précoce, y compris la fécondation
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Fragmentation de l’ADN
• Comparaison hommes fertiles (HF) et infertiles (HI):
pas de frag dans sperme à morpho normale chez
HF, mais bien chez HI ! (Avendano et al. 2008)
• Corrélation entre réduction de la numération,
motilité et de la morphologie avec le niveau élevé
de fragmentation MAIS…même avec un
spermocytogramme normal, un index de Frag >2030% peut être observé (Erenpreiss et al. 2008, Moskovtsev et
al., 2009, Varghese et al., 2009)
• Frag >30%: IIU inutiles  faire ICSI d’emblée?:
capacitation en F in vivo ou FIV class: ↑ROS et
aggravation frag/ICSI: accès direct à la réparation
ovocytaire mais FIV: cumulus= meilleure sélection!
(Bungum et al. 2007)
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Dégats de l’ADN spermatique
• Corrélation avec anomalies chromosomiques
(aneuploïdies) et fragmentation de l’ADN
spermatique dans les cas de tératospermie
sévère (Tang et al., 2009)
• Fragmentation:
corrélation avec l’âge paternel…
(Belloc et al., 2008, Quant et al., 2009)
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TUNEL assay
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated
deoxyuridine triphosphate (dUTP)-fluorescein NickEnd Labelling assay
1.
Incorporation de nucléotides biotinylés à l’aide de la terminal deoxynucleotidyl
transferase au niveau des cassures de l’AND
2. Ajout d’un anticorps anti-biotine couplé à FITC
Evaluation de la proportion de spermatozoïdes fluorescents (microscope fluo x100 sous
huile ou FACS)
2.
3.
•
•
•
Dapi (bleu) pour coloration noyaux cellulaires et FITC
(vert) pour fragmentation
Résultats:
• < 20%: normal
• 21-30% fragmentation augmentée: sans incidence
• 31-40% fragmentation augmentée: à surveiller!!!
• 40% fragmentation très augmentée: TT
! Exclure inflammation ou infection: ↑ROS et ↑Frag
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Décondensation ADN
• Cellule somatique : histones 
Spermatozoïdes : protamines
–
–
–
Condensation plus importante de l’ADN
Protection de l’ADN contre diverses agression, dont
certaines responsables de la fragmentation
Ce n’est pas la décondensation en elle-même qui
diminue la fertilité (ROSI)
• L’ouverture des ponts disulfures interbrins
des protamines (P2), conduit à
décondensation de l’ADN:
–
–
–
Impact sur le développement embryonnaire précoce
Si > 28%: pas de grossesse
Pas de résolution du problème via l’ICSI (><
fragmentation: ICSI peut parfois améliorer le
développement embryonnaire
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Décondensation ADN
• Etude de la dispersion de l’ADN
effectuée par la technique de la
coloration à la chromomycine et
lecture in situ
Rouge: normal
– Chromomycine A3 est fluorescente et
entre en compétition avec la protamine
au niveau des sites de fixation sur l’ADN
– Un décondensation >30% est un
marqueur de mauvaise qualité de
l’intégrité de la double hélice de l’ADN:
peut expliquer échecs de fécondation
et/ou développement E précoce= CI TT
Jaune: décondensé anti-oxydant!
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Stratégie thérapeutique
Les deux tests: cassures de l’ADN et qualité de la condensation doivent être
réalisés avant tout traitement anti-oxydant
•
Fragmentation isolée > 30% : antioxydants
Vit C (400 mg), vit E (400 mg), bétacarotène (18mg), Zinc
(500 µmol), Sélénium (1µmol)
•
Décondensation isolée >30% :
Traitement par Zinc et vitamines B6, B9, B12
•
Fragmentation et décondensation entre 20 et 30%:
Zn, vit B et tocophérol
•
Si les deux valeurs sont élevées (contre indication traitement
antioxydants si décondensation élevée) : privilégier le TT de la
décondensation: Zn et vit B (et prévoir ICSI)
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Analyse fine de la morphologie
• Microscopie électronique:
- 20 000à180000X
- fixation!
- purement D
- coût!!!!
• MSOME:
- 6600 à 10 000X
- pas de fixation!
- diagnostique et
thérapeutique!!
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MSOME
• Analyse fine de la tête spermatique
(Bartoov, 2002)
– Forme:
• Ovale, lisse, symétrique
– Taille évaluée sur 100 spz normaux:
• 4,75 + 0,28µm sur 3,28 + 0,20 µm
– Chromatine:
• Normale si 0 ou 1 petite vacuole
• Anormale: si 1 ou plusieurs vacuoles
occupent plus de 4% de l’aire nucléaire
• Corrélation positive avec critères
strictes de Kruger : (Oliveira, 2009)
–
mais % formes normales Kruger (9%)>
MSOME (3;3%)
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Noyau spermatique
Bedford et al,1973
(x 46000)
Vacuoles:petites lacunes
claires.
-La structure et/ou la
composition de la chromatine
des noyaux des spermatozoïdes
humains est très variable .
vacuoles
-La chromatine granuleuse peu
condensée traduit une
immaturité nucléaire
-des vacuoles nucléaires de taille
et de localisation variables sont
régulièrement observées en MET
Bisson et
David, 1975
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Noyau spermatique
• Signification des larges vacuoles nucléaires des
spermatozoïdes?
– Fragmentation dans spermatozoïdes à larges vacuoles (30%) >
spermato Nx (16%) (Franco et al., 2008)
– Décondensation plus élevée dans spermatozoïdes vacuolés
(Cohen-Bacrie, 2008)
– Spermatozoïdes de morphologie normale: meilleures fonctions
mitochondriales, structure de la chromatine, et moins
d’aneuploïdes… D’autant plus si pas de vacuoles (Foresta et al.,
2008)
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L’ICSI
• ICSI:
– Injection intra-cytoplasmique
du spermatozoïde
– 2 étapes:
• Éliminer les cellules de
granulosa
• injection de l’entièreté du
spermatozoïde dans le
cytoplasme de l’ovocyte
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ICSI et morphologie:
•
Anomalies de la majorité des têtes spermatiques: ne donnent pas
•
Pas de relation entre le % de formes atypiques et les résultats de
l’ICSI( car choix du spermatozoïde le plus normal possible )
Le taux de succès de l’ICSI semble néanmoins dépendre de
l’aspect morphologique du spermatozoïde
injecté
•
•
ou peu de grossesses :macrocéphalie, globozoospermie, 0% de têtes
normales
De Vos et al., 2003:
– morphologie du spermatozoïde injecté en ICSI:
influence sur le taux de fécondation,
la morphologie embryonnaire(sur 662 cycles)
et les taux de grossesses(sur 1667 cycles).
Présélection du spz=étape cruciale pour le succès de l’ICSI= IMSI
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L’IMSI
• Microscope inversé avec
condensateur de
Normaski
• Micromanipulateur
automatisé
• Objectif 100X en
immersion sous huile
• Boîtes en fond de verre
• Camera
• Grossissement total =
gross. du microscope
(150x) x gross.du coupleur
vidéo (0,99x)
x gross. de la vidéo
(44,45x) = 6600x
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IMSI
• La microinjection de spermatozoïdes
avec une forme normale mais avec
de larges vacuoles affecte les TG en
ICSI et augmente les FC (Berkovitz, 2006,
Antinori, 2008, Junca et al., 2009)
• Impact de ces vacuoles sur le
développement embryonnaire?
– J3: Non observable: peu de relation avec
observation morphologique de l’embryon
(Berkovitz et al., 2006)
– J5: Si 1 grosse vacuole ou plus de deux
petites vacuoles: ↓ blastulation
(Vanderzwalmen et al. 2008)
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IMSI
1
Intra-cytoplasmic of morphologically
selected sperm injection
1
2
X 300
2
X 6600
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IMSI: chromatine normale
Pas de vacuole
Une petite vacuole
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IMSI
Têtes spermatiques avec vacuoles de tailles différentes
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IMSI: chromatine anormale
X 300
X 6600
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Indications: Frag/décondensation/IMSI
•
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•
•
Echecs d’IIU: décision FIV ou ICSI?
Infertilités idiopathiques
Échecs d’implantation en FIV/ICSI
Tératos sévères < 1-6% (David)
Fragmentations élevées (>30%)
Fausses-couches itératives
Pas encore vraiment codifiées
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Conclusions
• Succès de l’implantation
embryonnaire: conditionné par
l’interaction de gamètes au top:
– Qualité et intégrité du spermatozoïde
– Qualité de l’ovocyte…qui sera ou
non capable de pallier les déficits
éventuels, d’assurer le succès du
développement embryonnaire
précoce
• Embryon compétent…pour
dialoguer avec un endomètre qui
doit être réceptif
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Merci…
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Morphologie
Spermogramme
Sperme
Le sperme- le spermatozoïde
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•
Spermatozoïdes: 5% du volume du sperme
Vésicules séminales: plasma séminal (40-60% du vol spermatique-alcalin)
Prostate: sécrétion constitue 10-30% du volume spermatique: protection et
amélioration des fonctions spermatiques (Zinc, phosphatases acides, PSA qui
liquéfie l’éjaculat) (acide)
Glandes de Cowper: contribuent à 2-5% du volume:
neutralisation acidité urine et lubrification urètre.
Aspect : opalescent ± opaque; Viscosité: < 2 cm
Volume : 2 à 7 ml ; pH: 7,2 et 8 (<7,2 = atteinte vésicule séminale; >8 = atteinte de la
prostate)
Numération: 20-200 106/ml (oligozoospermie <20 106/ml)
Mobilité (OMS): Critère de type de mouvement : a, b, c ou d. N: a>25%, A+B: 50%
Vitalité: >60 % (coloration vitale éosine / nigrosine des SPZ morts
(>50%:Nécrozoospermie)
OMS: analyse sur 200 spermatozoïdes après fixation et coloration
(papanicolaou)
Plusieurs critères: David (N >30%) ou Kruger (critères stricts) N>14%
Analyse de la morphologie des spermatozoïdes: anomalies de tête,
de pièce intermédiaire, de flagelle, gouttelettes cytoplasmiques
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ICSI et morphologie:
•
De Vos et al., 2003:
L’injection de spermatozoïdes anormaux s’accompagne:
– D’une baisse du taux de fécondation:60,7% versus 71,7%
– D’aucune différence dans la morphologie des embryons
observés à J2 ou J3
– D’une baisse du taux de grossesse:20,2% versus 36,7%
– D’une baisse du taux d’implantation :9,6% versus 18,7%
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Fragmentation: indications
• Pas encore codifiées…
– Echec d’ICSI: échec implantation
chez femme jeune
– FC/échecs implantation itératifs
– Infertilité idiopathique: avant PMA:
choix IIU vs FIV/ICSI?
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