Rôle du Laboratoire de Bactériologie

Rôle du
Laboratoire
Cours de Bactériologie
Faculté de Médecine de Fès
Dr. Sylvestre Tigaud
Laboratoire de Bactériologie
Centre de Biologie Nord
Hôpital de la Croix-Rousse
CHU de LYON
Diaporama du Dr. Jacqueline GRANDO.
Rôle du
Laboratoire
Rôle du Laboratoire de
Bactériologie
Dr. Sylvestre Tigaud
[email protected]
Tel : +33 4 72 07 18 44
Fax : +33 4 72 07 18 42
Hôpital de la Croix-Rousse
Diaporama du Dr. Jacqueline GRANDO.
Rôle du laboratoire
Rôle du
Laboratoire
• Diagnostic bactériologique direct
But : isoler et identifier la bactérie responsable de
l'infection et déterminer sa sensibilité aux antibiotiques
• Diagnostic indirect
But : mettre en évidence une réponse immunitaire
spécifique
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Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• Précoce, avant les antibiotiques
• règles d'asepsie élémentaire
• étiquetage correct :
– identité – service, nature exacte, date (heure, n°)
• présence d'antibiotique ?
• transport rapide
• importance de la collaboration entre le clinicien et le
microbiologiste pour l'interprétation
•Diaporama
fiche
de
renseignements
(GBEA)
du Dr. Jacqueline GRANDO.
Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• Pus ou liquides d'épanchements
– foyers infectieux ouverts (contamination par la flore
commensale) ou infections fermées
– seringue stérile ou écouvillon (culturette)
– si recherche d'anaérobies  milieux de transport
(Portagerm ou hémoculture anaérobie)
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Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• Crachats
– le matin à jeun au réveil après une toilette buccodentaire
– effort de toux (les crachats salivaires sont à éliminer)
– LBA et brosse en réanimation ou pneumologie
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Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• Urines
– toilette soigneuse de la région vulvaire ou du gland
– recueil du 2ème jet dans un poudrier stérile (poche autocollante
chez le nourrisson)
– transport rapide ou stockage à 4°C ou milieu de transport avec
conservateur
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Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• Selles (coproculture)
– de préférence un fragment muqueux ou sanglant ou
écouvillonnage rectal si pas de selles.
– renseignements cliniques : âge, voyage, antibiotiques,
épidémie familiale,…
– Il faut bien distinguer :
• La coproculture standard, à la recherche de Salmonella, Shigella,
Yersinia,
• La coproculture à la recherche de Bactéries Multi-Résistantes
• La coproculture à la recherche de Clostridium difficile
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Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• Prélèvements génitaux
– avant toute thérapeutique locale (ovules, gels, crèmes) ou
toilette intime
– prélèvement à écouvillon guidé par les signes cliniques :
•
•
•
•
•
des ulcérations génitales
des sécrétions génitales ou leucorrhées au niveau :
du méat urétral,
de l'orifice des glandes de Bartholin en cas de réaction inflammatoire
du cul de sac vaginal ou de l'endocol utérin après mise en place du
spéculum
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Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• L.C.R. (Liquide Céphalo-Rachidien)
– C’est le prélèvement impératif en cas de méningite
bactérienne, qui est une urgence absolue.
– transport urgent ++++. Il faut s’assurer que le laboratoire
prenne le prélèvement en charge.
– froid interdit (car tue les Méningocoques).
• N.B. Classiquement, on enseigne de faire le Prélèvement avant
antibiotique…. Mais le prélèvement nécessite une Ponction Lombaire
ce qui entraîne des délais d’hospitalisation. Il peut être nécessaire de
commencer les Antibiotiques avant le transport à l’hôpital.
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Diagnostic bactériologique direct
1 – Les prélèvements
Rôle du
Laboratoire
• Hémocultures
– permet le diagnostic des bactériémies (passage transitoire) et
des septicémies (passages répétés accompagnés de syndrome
infectieux grave)
– indications :
• toutes les formes de fièvre, et aussi les hypothermies
• sensation de refroidissement ou frissons, prostration, hypotension
– prélèvements précoces avant les antibiotiques de 4 à 6
hémocultures en 48h
– ponction veineuse de 20 ml après asepsie rigoureuse
– une hémoculture = un flacon aérobie + un flacon anaérobie
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Diagnostic bactériologique direct
Rôle du 2 – L’examen macroscopique
Laboratoire
•
•
•
•
•
exemples :
urines troubles
selles liquides
crachat salivaire
L.C.R. limpide, hémorragique ou purulent (eau de riz).
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Diagnostic bactériologique direct
3 – L’examen microscopique
Rôle du
(ou examen direct)
Laboratoire
• examen à l'état frais :
– mobilité des germes
• coloration après avoir fixé le frottis
– bleu de méthylène
– Gram
– Ziehl
• examen par immunofluorescence
– utilisation d'anticorps (Ac) spécifiques marqués par une
substance fluorescente
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Diagnostic bactériologique direct
4 – La mise en culture
Rôle du
Laboratoire
• Milieu solide (gélose en boîte de Pétri) et/ou liquide
(bouillon dans des tubes)
• Le choix des milieux est dicté par la nature des
prélèvements, les renseignements cliniques et les
données de l'examen direct
• Mise à l'étuve 24 à 48 h ou + dans certains cas
(anaérobies, mycobactéries…)
• Culture positive
– le bouillon se trouble et chaque bactérie donne naissance à
une colonie sur la gélose
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Diagnostic bactériologique direct
Rôle du 5 – Identification des bactéries
Laboratoire
• On connaît déjà :
– Les caractères morphologiques : formes, groupement,
mobilité, coloration (donnés par l'E.D.)
– Les caractères culturaux : rapport avec O2, aspect des
colonies, pigmentation, odeur, …
• On va définir :
– Les propriétés biochimiques : galeries (ex : entérobactéries)
– Les constituants antigéniques : anticorps spécifiques
(agglutination) (ex : S. aureus, Streptococcus, …)
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Diagnostic bactériologique direct
Rôle du 5 – Identification des bactéries
Laboratoire
• Part croissante des techniques de Biologie Moléculaire
– Hybridation avec une sonde d'ADN marquée spécifique d'un
gène bactérien, soit directement soit après amplification de
l'ADN bactérien par PCR (Polymerase Chain Réaction)
– De plus en plus souvent, on utilise le séquençage moléculaire
d’une « horloge moléculaire » puis on recherche cette
séquence dans une base de donnée.
– L’horloge moléculaire la plus utilisée est le gène codant
l’ARNr16S
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Diagnostic bactériologique direct
Rôle du 6 – Sensibilité aux antibiotiques
Laboratoire
• Base théorique :
– Détermination de la CMI : Concentration Minima Inhibitrice ;
c'est la plus faible concentration capable d'inhiber toute
culture visible de la souche.
– La CMI est comparée aux deux « concentrations critiques c et
C » qui correspondent aux concentrations obtenues chez
l’homme.
– Les limites c et C sont fixées par le Comité Français de
l'Antiiiogramme ou le NCCLS
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Diagnostic bactériologique direct
Rôle du 6 – Sensibilité aux antibiotiques
Laboratoire
• Bactérie résistante  CMI > C
CMI plus élevée que les concentrations d'antibiotiques obtenues in
vivo ; le traitement ne sera pas efficace
• Bactérie sensible CMI < c
CMI nettement inférieure aux concentrations obtenues in vivo ; le
traitement peut être efficace
• Bactérie intermédiaire c<CMI<C
zone d'incertitude ; la bactérie peut être atteinte en augmentant la
posologie
– Quotient inhibiteur : rapport entre concentration in vivo et CMI ; plus il
est élevé, plus le traitement sera efficace (QI > 8)
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Diagnostic bactériologique direct
Rôle du 6 – Sensibilité aux antibiotiques
Laboratoire
• Antibiogramme (en pratique la mesure des CMI est
réservée à des cas particuliers)
• Diffusion en milieu solide : méthode des disques (la
mesure du diamètre d'inhibition reflète la valeur de la
CMI)
lecture automatisée désormais possible
• Dilution en milieu liquide : systèmes automatisés ; la
lecture est automatisée et informatisée
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Laboratoire
Exemple d’un
antibiogramme
sur
Acinetobacter
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Diagnostic bactériologique direct
6 – Sensibilité aux antibiotiques
Rôle du
Bactériostase et CMI
Laboratoire
• La bactériostase est l'arrêt de la multiplication du
germe, qui reste vivant, et donc susceptible de reprendre sa multiplication si les conditions se
modifient.
• La CMI, concentration minimale bactériostatique,
est la plus faible concentration d'un antibiotique
donné qui inhibe toute croissance visible en 24
heures.
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Diagnostic bactériologique direct
6 – Sensibilité aux antibiotiques
Rôle du
Bactéricidie et CMB
Laboratoire
• La bactéricidie est la mort du germe, définitivement
incapable
de
reprendre
sa
multiplication.
• La CMB, concentration minimale bactéricide, est la
plus faible concentration d'un antibiotique donné qui
ne laisse survivre que 1/10000 après 24 heures de
contact.
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Diagnostic bactériologique direct
6 – Sensibilité aux antibiotiques
Rôle du
Laboratoire Bacteriostase et Bactéricidie
14
12
Pas d’AB
10
Témoin
1/2 CMI
CMI
CMB
2 X CMB
Bacteriostase
8
6
4
Bactericidie
2
0
0'
15'
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30'
1h
2h
3h
18h
Diagnostic bactériologique direct
7 - Techniques sans culture
Rôle du
Laboratoire
• La bactériologie traditionnelle est en défaut chaque fois que :
– La culture est impossible (Treponema pallidum, Mycobacterium
leprae…. Traitement aux antibiotiques préalable)
– La culture est trop complexe (Chlamydia trachomatis)
– La culture est trop lente par rapport à l’urgence (Mycobacterium
tuberculosis, mais aussi Neisseria meningitidis)
• On utilise alors des techniques immunologiques (Recherche
d’antigènes solubles dans le sang, l’urine ou le LCR)
• Mais la vraie solution est représentée par l’Amplification
génique par PCR.
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Diagnostic bactériologique direct
7 - Techniques sans culture
Rôle du
Laboratoire
• L’Amplification génique par PCR permet de multiplier un
gène bactérien un grand nombre de fois (jusqu’à 240). Ce
gène devient facile à détecter et à étudier.
• On peut soit utiliser l’amplification d’un gène très spécifique
d’une espèce (par exemple Nuclease du Staphylococcus
aureus),
• Soit utiliser l’amplification d’une « Horloge Moléculaire » de
type ARNr16S qu’il faut ensuite séquencer : c’est le principe
de la « PCR universelle »
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Diagnostic bactériologique direct
7 - Techniques sans culture
Rôle du
Laboratoire
• L’avenir ?
• Probablement l’utisation de « DNA-chips » c’est à dire de
dispositifs permettant de reconnaître en une fois de
nombreuses séquences génétiques, à la fois d’identification
bactérienne et virale, et de sensibilité aux antimicrobiens.
• Ce sera la responsabilité de votre génération que
d’apprendre à utiliser ces outils !!!
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Rôle du
Laboratoire
Diagnostic bactériologique
indirect
• Les bactéries expriment des antigènes (Ag)
• Les Ag induisent une réponse immunitaire spécifique
– Réponse humorale : apparition d'anticorps spécifiques
sérodiagnostic
– Réponse cellulaire : apparition d'une hypersensibilité de type
retardé
hypersensibilité retardée
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