Mécanismes de résistance du Pseudomonas Aéruginosa

DESC Réanimation Médicale
Inter-Régions Rhône-Alpes et Sud-Est
Mardi 9 juin 2009
Mécanismes de résistance aux
antibiotiques de
Pseudomonas aeruginosa
Gérald AUBERT
CHU Saint-Etienne
Pseudomonas aeruginosa
1 – Mécanismes de résistance aux antibiotiques
Rappels et nouveautés
2 – Activité des antibiotiques sur P. aeruginosa
Etude des phénotypes
3 – Cas particulier de la Mucoviscidose
Production de biofilm
4 - Impact d’un schéma thérapeutique
Sélection de souches résistantes
5 – Comment éviter la sélection de mutants résistants
Notion de PK/PD
2
1 – Résistance aux antibiotiques
Origine :
naturelle et/ou acquise
3
1 - 1 - Origine naturelle
Constitutive - intrinsèque : résistance commune à
toutes les souches d’une même espèce →
Phénotype sauvage
ex: Membrane externe des bacilles Gram négatif (LPS)
empêche la pénétration des antibiotiques lipophiles
(acide fusidique) et des antibiotiques de masse
moléculaire élevée ne pouvant emprunter la voie des
porines (pénicilline G, V et M - glycopeptides)
La perméabilité membranaire de P. aeruginosa est de 10
à 100 fois inférieure à celle d’E. coli
4
1 - 2 - Origine acquise
Résistance propre à certaines souches ayant par
rapport à l’espèce à laquelle elle appartient un
comportement différent vis à vis des antibiotiques.
C’est le résultat de modifications génétiques :
* Mutations affectant des gènes naturellement
présents sur le chromosome bactérien
* Acquisition de gènes “ étrangers ” provenant
d’autres espèces ou portés par des éléments mobiles
(plasmides ou transposons)
5
Gènes « sauteurs »
Transposon présent soit
sur le chromosome, soit
sur un plasmide
Transfert
RS vertical
Chromosome
(AmpC)
Plasmide
Transfert RS
horizontal
(BLSE)
Bactérie
6
1 - 3 – Mécanismes de résistance
Bactéries à Gram
positif
Bactéries à Gram
négatif
Inactivation de
l’antibiotique +
Inactivation de
l’antibiotique +++
Modification de la
cible ++
Modification de la
cible +
Efflux +
Efflux +
Imperméabilité ++
7
Mécanismes de résistance
- Inactivation de l’antibiotique
C’est un mécanisme fréquent. Il s’agit d’une destruction
de l’antibiotique.
Ex : Hydrolyse des ß-lactamines par les ß-lactamases
- Modification de la cible
Généralement on observe soit une modification partielle
de la cible, soit une modification du nombre de PLP
Ex : modification des PLP chez le pneumocoque
induisant une résistance aux ß-lactamines
8
- Diminution de la perméabilité
La baisse de perméabilité entraîne une diminution de la
quantité d’antibiotique atteignant la cible.
* Protection de la cible
Augmentation de l’épaisseur de la paroi (remodelage du
peptidoglycane)
Ex : Staphylococcus aureus de type GISA (résistance
partielle aux glycopeptides)
* Fermeture des porines
Concerne surtout les bactéries à Gram négatif
Ex : résistance à l’imipénème par fermeture de la porine
D2 chez Pseudomonas aeruginosa
9
Exemple de modification de la perméabilité
Porine
Porine D2 (OprD): seule voie de
pénétration de l’imipénème chez
P. aeruginosa
Gram Négatif
10
- Efflux actif
Les systèmes d’efflux sont constitués de protéines
particulières permettant l’expulsion de molécules
(nocives) dont les antibiotiques dès qu’ils entrent dans la
cellule bactérienne.
Activation de l’efflux : diminution de la quantité
d’antibiotique atteignant la cible.
Les modifications de la perméabilité membranaire et
l’efflux actif peuvent concerner des antibiotiques très
variés (quinolones, tétracyclines, ß-lactamines...) et sont
souvent impliqués dans la multirésistance.
Chez P. aeruginosa : 12 systèmes d’efflux actifs dont 2
impliqués dans la résistance naturelle (MexAB-OprM ou
11
MexXY-OprM).
Résistance par diminution de l’accumulation
intrabactérienne
-
Rejet à l’extérieur des antibiotiques : système de pompe
mexA mexB
oprM
mexR
OprM
M. externe
MexA
M. plasmique
Protéine assurant la liaison
entre les 2 membranes
Canal protéique
Pompe à efflux
MexB
H+
Résistance:
surexpression MexAB-OprM ou MexXY-OprM
production MexEF-OprN ou MexCD-OprJ
Mex : Multiple Efflux
Energie : hydrolyse
de l’ATP, gradient
électrochimique de
membrane 12
Conséquences de la surexpression des
pompes à efflux chez P. aerugionsa
ß-lactamines céfépime, FQ Tétracyclines Aminosides
cefpirome
Ticarcilline
Aztréonam
MexA-BOprM
Constitutif
MexX-YOprM
Constitutif
MexC-DOprJ
MexE-FOprN
13
2 – Activité des antibiotiques sur
Pseudomoas aeruginosa
Etude des phénotypes de résistance
Technique de l’antibiogramme (S/I/R)
et/ou
de la CMI (mg/L)
14
Antibiogramme
Diffusion en
gélose
Technique
Vitek 2
bioMérieux
15
Pseudomonas aeruginosa
Résistance naturelle aux antibiotiques
(imperméabilité membranaire)
• Pénicilline G et amoxicilline
• Amoxicilline + acide clavulanique
• C1G et C2G (Cefalotine, Cefoxitine, ….)
• Cefotaxime, ceftriaxone
• Tétracycline
• Quinolone 1ère génération
• Triméthoprime
Nouveaux ATB inactifs :
Tigécycline
Ertapénème
Moxifloxacine
Daptomycine, Linézolide, …
Nouvel ATB actif : doripéneme
16
Pseudomonas aeruginosa
Mécanismes de résistance aux ß-lactamines
Résistance naturelle :
• une céphalosporinase chromosomique ampC
non inhibée par l’acide clavulanique
• une perméabilité limitée en raison du faible nombre
de porines : vitesse de pénétration diminuée par
rapport aux entérobactéries (10 à 100 fois moins)
• des systèmes d’efflux de bas niveau (MexAB-OprM et
MexXY-OprM)
17
Antibiogramme de P. aeruginosa : phénotype de base
Ticarcilline :
Pipéracilline :
Ticar + Ac clav :
Pipé + tazo :
Aztréonam :
Ceftazidime :
Céfépime :
Imipénème :
Méropénème :
Doripénème :
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Tobramycine :
Amikacine :
Ciprofloxacine :
Colistine
S
S
S
S
18
Phénotypes de Pseudomonas aeruginosa
Phénotype
sauvage
Phénotype 2007 (CHU St-Etienne)
Ticarcilline
Ticarcilline + ac. Clav.
Pipéracilline + tazo.
Ceftazidime
S
S
S
S
I/R
I/R
I/R
I/R
39 %
39 %
19 %
18 %
Pénicillinases +
céphalosporinase
haut niveau (ampC)
Imipénème
S
R
9%
imperméabilité (oprD)
Amikacine
Tobramycine
S
S
R
R
20 %
11 %
enzymes : AAC, APH …
Ciprofloxacine
S
R
20 %
mutation gyr A, parC, …
Colistine
S
R
0%
19
Pseudomonas aeruginosa
Mécanismes de résistance aux ß-lactamines
Résistance acquise :
- enzymatique:
- céphalosporinase hyperproduite (AmpC)
- ß-lactamases à spectre étroit : pénicillinase
(PSE/CARB, TEM-1 et TEM-2), oxacillinases ;
- ß-lactamases à spectre étendu (BLSE) :
- classe A : VEB-1, PER-1, GES-1,
TEM-4 …, SHV-5 …
- classe B : imipénémase
* (metallo ß-lactamases) : IMP, VIM …
* (sérine ß-lactamases) : KPC
- classe D : OXA
20
Pseudomonas aeruginosa
Mécanismes de résistance aux ß-lactamines
Résistance acquise :
- non enzymatique :
- imperméabilité : porines Oprf et OprD2
- surexpression de l’efflux membranaire :
MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN et MexXY-OprM
- modification PLP
21
Antibiogramme de P. aeruginosa : phénotype
résistant aux carbapénèmes
Ticarcilline :
Pipéracilline :
Ticar + ac. clav :
Pipé + tazo :
Aztréonam :
Ceftazidime :
Céfépime :
Imipénème :
Méropénème :
S
S
S
S
S
S
S
R
I/R
Tobramycine :
Amikacine :
Ciprofloxacine :
Colistine
S
S
S
S
Imperméabilité (perte porine OprD2) et surexpression
efflux MexEF-OprN ou MexAB-OprM (méropénème)
L’imipénème n’est pas soumis au système d’efflux.
Carbapénémase = métallo-enzyme IMP, VIM-1, VIM-2
22
Antibiogramme de P. aeruginosa : résistance par
phénomène d’efflux membranaire
Ticarcilline :
Pipéracilline :
Ticar + ac. clav :
Pipé + tazo :
Aztréonam :
Ceftazidime :
Céfépime :
Imipénème :
I
S
I
S
I
S
S
S
Tobramycine :
Amikacine :
Ciprofloxacine :
Colistine
S
S/I
I/R
S
Surexpression pompes à efflux : MexAB-OprM,
MexCD-OprJ, MexEF-OprN et MexXY-OprM
23
Antibiogramme de P. aeruginosa : résistance de
type céphalosporinase + …..
Ticarcilline :
Pipéracilline :
Ticar + ac. clav :
Pipé + tazo :
Aztréonam :
Ceftazidime :
Céfépime :
Imipénème :
R
R
R
I
R
I/R
I
S
Tobramycine :
Amikacine :
Ciprofloxacine :
Colistine
S
S
S
S
Hyperproduction de la céphalosporinase AmpC et éventuellement
surexpression des pompe à efflux et/ou BLSE : VEB-1, PER, GES-1,
24
TEM, SHV, OXA …
Pseudomonas aeruginosa
Mécanismes de résistance aux ß-lactamines
Mécanisme
de résistance
Tic
Pip
Caz
Fep
Atm
IMI
Absence
S
S
S
S
S
S
Pénicillinase
R
R/I
S
I/S
I/S
S
Efflux
I/R
S/I
S/I
I
I
S
Céphalospori
nase hyper
R/I
R/I
I/R
I/R
I/R
S
Déficit en
porine D2
S
S
S
S
S
R
BLSE
R
I/R
R
R
I/R
S
Imipénémase
R
I
R
R
I
I/R
Tic : ticarcillline, Pip : pipéracilline, Caz : ceftazidime,
Fep : céfépime, Atm : aztréonam, IMI : imipénème
25
Pseudomonas aeruginosa
Mécanismes de résistance aux aminosides
Deux mécanismes de résistance acquise (plasmide) :
- enzymes inactivant les aminosides
(nucléotidylation, phosphorylation ou acétylation).
Résistance haut niveau.
- diminution de l’accumulation de l’antibiotique
dans la cellule par mutation du système de transport
des aminosides. Résistance de bas niveau.
Antibiotiques les plus actifs : amikacine et tobramycine
26
3 – Cas particulier de la mucoviscidose
Infection
pulmonaire :
cause de
mortalité de la
mucoviscidose
Le gène responsable de la maladie est
localisé sur le chromosome 7au niveau
du locus « CFTR ». Une mutation du
gène provoque un mauvais
fonctionnement de la protéine CFTR
(Cystic Fibrosis Transmembrane
Conductance Regulator). Ce
disfonctionnement affecte l'ensemble
des glandes exocrines de l'organisme
ainsi que des fonctions d'excrétion d'eau
dans les épithéliums spécialisés..
Présence de sécrétions
visqueuses et peu hydratées.
27
Infection à P. aeruginosa
dans le cas de la MUCUVISCIDOSE :
formation du biofilm
Le biofilm se définit
comme une
population
bactérienne qui
adhère à une surface
et s’enrobe d’une
matrice
d’exopolysaccharide
(Alginate)
Schémas et photos (prises en microscopie électronique) des
différentes étapes de la formation du biofilm – Camille Mace
28
Cette photo prise au microscope électronique
montre des bactéries regroupées (en biofilm)
sur de la laine de verre. – Sébatien Vilain
29
Comportement de P. aeruginosa
dans le cas de la MUCUVISCIDOSE
Apparition de résistances et de facteurs de
virulence lors de situations particulières in
vivo :
- présence de biofilm
(exopolysacharide fabriqué lors de condition
d’anaérobiose qui apparaît dans le la couche
profonde du mucus)
- hyper –expression des systèmes
d’efflux
- activation du quorum-sensing en
phase stationnaire et en phase d’anaérobie
Jeune biofilm de
Pseudomonoas
aeuginosa prise
au microscope
électronique à
balayage
© CNRS, Unité
"Polymères,
biopolymères,
membranes"
30
Procédures d’adaptation chez P. aeruginosa
Mucoviscidose et …
Régulation par Quorum Sensing (QS) : processus de
communication intercellulaire basé sur de petites
molécules signal (langage) qui permet aux bactéries de
répondre aux changements de l’environnement (phase
stationnaire et anaérobiose) et de synchroniser de
manière collective l’expression globale de multiples
gènes (las et rhl).
Le QS contrôle la synthèse de facteurs de virulence :
- interviennent dans l’attachement bactérien et la colonisation
(paroi): pili de type IV, flagelle …
- sécrétés hors de la bactéries et provoquant des lésions cellulaires:
exotoxine A, élastase, exoenzyme S, pyocyanine, pyocheline … 31
On estime que 6 à 10 % du génome de P. aeruginosa
est régulé par le QS
Les modèles expérimentaux (souris) et des souches
mutantes confirment le rôle des facteurs de virulence et
du QS dans la pathogénicité
Les macrolides modulent la production
d’exopolysacharides et de l’activité du QS
Avenir thérapeutique : inhibition du QS pour diminuer
la pathogénicité de P. aeruginosa
S. Bleves et A. Lazdunski – Communication intercellulaire chez les bactéries –
Qorum sensing. Bull. Soc. Microbiol., 2007, 22 : 227-233.
Le Berre et al. Quorum sensing : une nouvelle cible thérapeutiquye pour
Pseudomonas aeruginosa. Med Mal Infect. 2006, 36 : 349 – 357.
32
Traitement des infections à P. aeruginosa
MUCUVISCIDOSE
En anaérobiose : diminution de l’activité de tous
les ATB
En présence de biofilm + anaérobiose : aérosol
Colistine - tobramycine
Méropénème + tobra ou ciproflo
Hill D., Rose B., Pajkos A. et coll. – Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas
aerugionsa isolates …… J. Clin. Microbiol., 2005, 43 : 5085 – 5090.
33
Pseudomonas aeruginosa
Multi - résistance aux antibiotiques
(totorésistance)
Ticarcilline :
Pipéracilline :
Ticar + ac. clav :
Pipé + tazo :
Aztréonam :
Ceftazidime :
Céfépime :
Imipénème :
Méropénème
R
R
R
R
R
R
R
R
R
Tobramycine :
Amikacine :
Ciprofloxacine :
Colistine
Faire des CMI pour définir les niveaux de résistance …
Etudier la rifampicine, la fosfomycine, …
R
R
R
S/I
34
4 - Impact d’un schéma thérapeutique
L’exposition à l’imipénème (ou méropénème) et aux
fluoroquinolones (ciprofloxacine) constitue un
risque significatif pour l’émergence de souches
résistantes (mutations ponctuelles).
Situation : inoculum important 1010 UFC/mL
Mais aussi : tazocilline et ceftazidime pour la
résistance aux ß-lactamines
K. Jennot et P. Plésiat – Implications thérapeutiques de la résistance aux antibiotiques
chez Pseudomonas aerugionsa. La Lettre de l’Infectiologue. 2005, XX, n°6, 227-237
C. Pena et col – Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa: factors influencing
multi-resistant acquisition in non-critically ill patients. Eur J Clin Microbiol Infect35Dis,
2009, 28:519-522
CMI : 105 UFC/mL
CPM = CMI : 1011 CFU/mL
CMI de la FQ pour le mutant de
premier niveau
CMI de la FQ pour la
population
CMI = 0,023 mg/L
Ex : E. coli
Mutant
chromosomique
résistant de
premier niveau
(gyrA)
CMI = 0,25 mg/L
36
CMI : 105 UFC/mL
CPM = CMI : 1011 CFU/mL
CMI de la FQ pour la
population
CMI de la FQ pour le mutant de
deuxième niveau
CMI = 0,25 mg/L
Ex : E. coli
Mutant
chromosomique
résistant de
deuxième niveau
(gyrA + parC) CMI = 1,5 mg/L
37
Quelques principes thérapeutiques …
Eviter les antibiotiques peu actifs : céfotaxime,
ceftriaxone, gentamicine, netilmicine, ofloxacine …
Ne jamais prescrire en monothérapie : fosfomycine,
fluoroquinolones, carbapénème …
Faire une vraie antibiothérapie au niveau du site
infectieux :
- ß-lactamine + aminoside
- ß-lactamine + ciprofloxacine
Tenir compte du PK/PD des antibiotiques
38
5 – Comment éviter en clinique la
sélection de mutants résistants
Notion de PK/PD
39
Paramètres de pharmacodynamie
Concentration
d'antibiotique
Concentration
d'antibiotique
Cmax
Q.I.= C max
CMI
Cmax
CMI
Temps
Temps
Temps au dessus de la CMI
ATB dose dépendant :
aminosides - fluoroquinolones
ATB temps dépendant :
ß-lactamines
40
Notion de PK/PD
Fluoroquinolones et aminosides (ATB
dose dépendant) : Cmax/CMI = QI > 8
ß-lactamines (ATB temps dépendant) : T > CMI
(50 % du temps entre 2 injections 4 à 5 CMI)
Glyopeptides (ATB dose et temps dépendant) :
C/CMI = 8 et AUC/CMI ≥ 400
A. P. MacGowan. Clinical implications of antimicrobial resistance for
therapy. J. Antimicrob. Chemother. 2008, 62, Sup 2, ii105 – ii114.
41
Variation du PK/PD
Paramètres : dose de l’ATB, volume de
distribution (VD), clearence (Cl), liaison
aux protéines, la variation de
l’absorption, la valeur de la CMI.
 VD
Cl
CMI
Risque d’échec
42
Une souche bactérienne est considérée comme
sensible à un antibiotique - Quelle CMI est à prendre
en compte ?
- CMI approchée de l’antibiotique
Technique de l’antibiogramme - Référence : la
concentration critique basse
- CMI réelle de l’antibiotique
Technique E-Test (105 UFC/mL)
Une souche de P. aerugionosa est sensible à la ceftazidime pour
une CMI de 0,5 à 8 mg/L
- CMI de l’antibiotique pour le mutant de premier niveau
(FQ) présent dans l’inoculum (CPM)
Technique avec 1011UFC/mL
Une souche d’ E. coli sensible à la ciprofloxacine avec CMI = 0,75
mg/L a un CPM = 6 mg/L
43
MPC results
12
Log CFU/m L
10
8
6
4
2
4
Ciprofloxacin (m g/L)
Ex : E. coli
6
8
8
3
4
2
2
1
1
0
0
3
0
Strain 6
MIC = 0.5
MPC = 6
Strain 7
MIC = 0.5
MPC = 3
Strain 8
MIC = 0.75
MPC = 6
Strain 9
MIC = 1.5
MPC = 6
Strain 10
CMI = 1.5
MPC = 4
Strain 11
MIC = 1.5
MPC = 8
44
CPM de la rifampicine et de la ciprofloxacine
pour S. aureus
Concentration
sérique de la
rifampicine
Concentration
sérique de la
ciprofloxacine
(mg/L)
(mg/L)
480
CPM
9,5
Fenêtre de sélection
des mutants
6
A
B
CPM
4
Fenêtre de sélection
des mutants
CMI
0,003
CMI
0,3
Temps
Temps
RIFAMPICINE
CIPROFLOXACINE
45
Zhao X. and Drlica K. - J.I.D. 2002, 185 : 561-565
CONCLUSION
Pseudomonas aeruginosa
Espèce peu sensible aux antibiotiques
Fréquence importante de mutants résistants (10-7)
Transfert conjugatif important des gènes
et intégration sur le chromosome
Attention :
- aux inoculums importants (présence de mutants R)
- aux posologies basses (sélection de mutants R)
- bithérapies (volumes de distribution des antibiotiques)
46