Utilisation et besoins en phylogénie en microbiologie - T

Utilisation et besoins en phylogénie
en microbiologie clinique
Pierre-Edouard Fournier
Unité des Rickettsies
CNRS UMR6020
Faculté de Médecine - Marseille
Phylogénie en microbiologie clinique
pourquoi?
• Nécessaire pour la taxonomie et l’identification
• Mise au point de méthodes de détection
• Genomique: origine des genes (LGT)
• Traitement: prédiction de la sensibilité aux anti-microbiens
Phylogénie phénotypique
Limites = peu discriminant, convergences
Phylogénie moléculaire
• Zuckerland and Pauling. Molecules as documents
of evolutionary history. J Theor Biol. 1965;8:35766.
• Fox et al. The phylogeny of prokaryotes. Science.
1980;209:457-63.
Renouveau de la phylogénie des Bacteria
Découverte des Archae
Plus discriminant
Plus fiable
Familles
Tribus
Rickettsiaceae Rickettsieae
Genres
Espèces
Protéobactéries
Rickettsia
tsutsugamushi
Orientia tsutsugamushi
prowazekii
Rickettsia prowazekii
rickettsii
Rickettsia rickettsii
Rochalimaea quintana
Ehrlichia sennetsu
Coxiella
Neorickettsia helminthoeca
burnetii
1
Wolbachia pipientis
Ehrlichia
Ehrlichieae
Cowdria
sennetsu
Anaplasma phagocytophilum
canis
Anaplasma marginale
phagocytophila
Ehrlichia chaffeensis
ruminantium
Ehrlichia canis
Neorickettsia helminthoeca
Cowdria ruminantium
Bartonella quintana
Wolbachieae
Bartonellaceae
Wolbachia
Bartonella
pipientis
Bartonella bacilliformis
persica
Brucella melitensis
bacilliformis
Coxiella burnetii
Wolbachia persica
Anaplasma
Anaplasmataceae
marginale
Legionella pneumophila
Haemobartonella sp.
Eperythrozoon sp.
Bacilles à gram positif à
G+C% faible
2

Cibles moléculaires
• ARNr 16S
• gltA, rpoB, …
• Core genes
Les outils
•
•
•
•
•
Alignement
ClustalW, T-Coffee
Distance matrix DNADIST, PROTDIST
NJ tree
NEIGHBOR, ClustalW
MP tree
DNAPARS, PROTPARS
ML tree
DNAML, PROTML,
fastDNAml
• Bootstraping
SEQBOOT, CONSENSE
• Software packages: MEGA, PHYLIP, PAUP...
Quand croire les arbres?
• > 2 méthodes congruentes: distance + MP +
ML
• Valeurs de bootstrap élévées
• Comparaison du ratio de noeuds validés par
des bootstraps > 90%
• Comparaison des phylogénies obtenues à
partir de plusieurs gènes
• Concaténation de gènes
Utilisation en microbiologie clinique
• Description de nouveaux taxons
(organisation, distance phylogénique)
• Nouvelles espèces, nouveaux genres
R. conorii (AF123721)
79
79
R. rickettsii (X16353)
60
R. honei (AF123724)
R. africae (AF123706)
50
87
R. parkeri (AF123717)
80
95
R. sibirica (AF123722)
R. slovaca (AF123723)
99
R. japonica (AF123713)
R. aeschlimannii (AF123705)
100
79
R. massiliae (AF123714)
100
R. rhipicephali (AF123719)
100
R. montanensis (AF123716)
93
R. helvetica (AF123725)
100
Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)
Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)
R. felis (AF210695)
100
100
R. australis (AF123709)
R. akari (AF123707)
100
R. typhi (L04661)
R. prowazekii (AF123718)
Description
de nouvelles
bactéries
Bactéries isolées
et/ou caractérisées
dans l’UMR6020 et maladies découvertes
ABC
AB
AB
Utilisation en microbiologie clinique
• Mise au point de nouveaux outils
diagnostiques
• Amorces spécifiques de clusters de
bactéries
R. conorii (AF123721)
79
R. rickettsii (X16353)
79
R. honei (AF123724)
60
R. africae (AF123706)
50
87
R. parkeri (AF123717)
80
95
R. sibirica (AF123722)
R. slovaca (AF123723)
99
R. japonica (AF123713)
R. aeschlimannii (AF123705)
100
79
R. massiliae (AF123714)
100
R. rhipicephali (AF123719)
100
R. montanensis (AF123716)
93
R. helvetica (AF123725)
100
Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)
Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)
R. felis (AF210695)
100
100
R. australis (AF123709)
R. akari (AF123707)
100
R. typhi (L04661)
R. prowazekii (AF123718)
Utilisation en microbiologie clinique
• Genomique: origine des genes
Arsenic resistance operon
1_837
3’’ partial
ATPase
1_780
tnpM
1-703
1_17
1_16
tniA
1_819
1_817
Transposition trkA
trxB
helper
putative thioredoxin
monooxygenase reductase
1_779
1_73
intI
integrase
dfrI
1_163
1_699
IS1999
intI
integrase
1_821
blaVEB-1
1_78
1_165
aadB
arsH
1_88
1_81
qacE1
sulI
cmlA
1_166
1_173
arr-2
1_816
cmlA5
1_814
arsB
arsC
1_103
1_748
tetA
tetR
1_176
1_179
blaOXA-10
aadA1
1_813
1_812
arsR
1_107
lysR
1_183
qacE1
1_808
1_811
arsC
1_732
1_196
1_59
1_62
strA
strB
truncated
truncatedTn5393
-like
transposon
1-710
recG Transposase
aac6’
Transposase dfrX
ORF513
sulI
1_718
1_126
Transposase- GroEL-integrase
like protein fusion protein
1_194
1_52
1_44
lspA
pbrR Heavy metal
Transposase
detoxificationprotein
ISPpu12 – like transposon
uspA
1_724
1_187
1_43
1_199
qacE1
1_203
1_207
1_633
sulI
orf5
IS6100
Mercury resistance operon
1_213
1_627
1_624
1_622
1_621
1_615
TnpA
urf2y
merE
merD
merA
merC
1_609
1_612
merP
merT
1_244
merR
1_598
1_562
1_555
InsB (Tn1)
IS15
IS26
1_314
1_318
1_528
Transposase Résolvase
IS15
tetA
tetR
1_588
1_275
pecM
TnpA
1_277
1_319
1_522
1_326
1_516
IS26
aphA1
IS26
tnpM
1_513
1_569
ybjA
cat
1_285
InsA (Tn1)
IS1 - like transposon
truncatedTn1721 - like transposon
truncated
Tn21 - like transposon
1_287
1_258
1_339
1_341
1_343
1_344
1_348
1_352
intI
aac3
intégrase
orfX
orfX
orfX’
aadDA1
qacE1
1_356
1_360
sulI
orf5
1_365
Pseudomonassp.
Pseudomonas
sp.
1_366
Résolvase
1_467
trbI
1_465
1_376
1_377
lspA
pbrR Heavymetal
detoxificationprotein
1_386
Transposase
ISPpu12-like
-like transposon
1_442
sulI
1_434
5’-partial
’-partial
ATPase
Best Blast match with
Salmonella sp.
sp.
E. coli
Other bacteria
Utilisation en microbiologie clinique
• Prédiction de la sensibilité aux
antibiotiques
R. conorii (AF123721)
79
79
R. rickettsii (X16353)
60
R. honei (AF123724)
R. africae (AF123706)
50
87
R. parkeri (AF123717)
80
95
R. sibirica (AF123722)
R. slovaca (AF123723)
99
R. japonica (AF123713)
R. aeschlimannii (AF123705)
100
79
R. massiliae (AF123714)
100
R. rhipicephali (AF123719)
100
Résistance
À la rifampicine
R. montanensis (AF123716)
93
R. helvetica (AF123725)
100
Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)
Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)
R. felis (AF210695)
100
100
R. australis (AF123709)
R. akari (AF123707)
100
R. typhi (L04661)
R. prowazekii (AF123718)
Sensibilité
aux macrolides
Limites - Problèmes
• Pas d`outil integre
• Difficultés d’alignement, surtout en cas de
séquences répétées => vérification manuelle
• Difficulté de réaliser des analyses phylogéniques
sur de grands nombres de séquences et/ou des
séquences de grande taille, surtout si
bootstraping
Besoins en phylogénie
• Ideal = outil omnipotent
• Alignement fiable => analyses multiples
=> arbre
Besoins en phylogénie
• Outils d’alignement performants
• Serveurs pouvant analyser rapidement
des nombres élévés de séquences (> 100)
de grande taille (> 4000 bp), notamment
en ML
Besoins en phylogénie
• Outils permettant d’identifier dans un
alignement à partir d’un arbre des
séquences spécifiques d’un taxon ou d’un
cluster
A
F
B
H
I
G
C
D
E
90 Shigella
99
Escherichia
Salmonella
75
Klebsiella
100
Number of genomes
Number of species
Serratia
88
84
Yersinia
100
 Proteobacteria
60
44
 Proteobacteria
18
16
 Proteobacteria
30
25
 Proteobacteria
5
5
 Proteobacteria
6
4
Chlorobi
1
1
Chlamydiae
10
6
Spirochaetes
6
5
Cyanobacteria
11
8
Deferribacteres
0
0
Fibrobacteres
0
0
Chloroflexi
2
2
Bacteroidetes
4
3
Fusobacteria
1
1
Firmicutes
67
45
Actinobacteria
19
16
Nitrospira
Nitrospirae
0
0
Acidobacter
Acidobacteria
0
0
Verrucomicrobia
0
0
Planctomycetes
1
1
Dictyoglomi
0
0
Deinococcus-Thermus
2
1
Aquificae
1
1
Thermotoga
1
1
Vibrio
Haemophilus
87
Acinetobacter
Pseudomonas
64
100
Legionella
54
Stenotrophomonas
100
Minibacterium
Neisseria
71
82
Bordetella
100
Burkholderia
58
Ralstonia
81
Rickettsia
86
7
Ehrlichia
Brucella
99
Sphingomonas
94
Desulfovibrio
13
Campylobacter
26
Helicobacter
100
Wolinella
100
4
Et la
phylogénomique ?
Chlorobium
 Proteobacteria
Pelobacter
21
Chlamydia
100
Parachlamydia
Leptospira
22
Borrelia
66
Treponema
100
16
Anabaena
99
100
Prochlorococcus
39
Deferribacterales
Fibrobacter
9
Dehalococcoides
Bacteroides
22
Porphyromonas
100
9
Fusobacterium
Mycoplasma
39
100
51
63
Streptococcus
Enterococcus
Lactobacillus
Listeria
100
Bacillus
94
87
Staphylococcus
Tropheryma
Propionibacterium
100
Corynebacterium
42
Nocardia
99
87
43
Mycobacterium
Verrucomicrobium
63
18
Rhodopirulella
Dictyoglomus
29
Thermus
99
Aquifex
63
91
0.05
Thermotoga