Cb. divergens

Djamel Drider – Ph.D
Unité de Recherche Biotechnologie de la Reproduction
ONIRIS - Nantes
 02 51 78 55 42 ou 02 40 68 76 46
E-mail [email protected]
Quimper / 18 Novembre 2010
Cofinancé avec l’appui de
l’Union européenne FEDER
Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
La divercine V41
une bactériocine utilisable dans les domaines de
la sécurité alimentaire et de «l’antibiothérapie »
Les travaux présentés dans le cadre de cette présentation ont été
réalisées au laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de
l’ENITIAA de Nantes.
Grand Merci à tous les étudiants et collègues avec qui j’ai pu travailler sur
ce projet
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« Investir dans notre futur commun »
Problématique scientifique
Recrudescence de la multirésistance bactérienne
aux antibiotiques conventionnels
Sécurité microbiologique des aliments
Multiplication des infections bactériennes
- Campylobacter jejuni
- Listeria monocytogenes
- Salmonella enterica
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« Investir dans notre futur commun »
Augmentation de l’incidence des infections à bactéries
multirésistantes
Figure extraite de Quadri et al.
Infect Disord Drug Targets. 2007 Sep;7(3):230-237
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« Investir dans notre futur commun »
Diminution du nombre de nouvelles molécules antibiotiques
Figure extraite de Belguesmia-Naghmouchi-Chihib-Drider
In Drider and Rebuffat – Springer 2011
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« Investir dans notre futur commun »
Autorité européenne de sécurité des aliments
(European Fodd Safety Authorithy)
250000
En 2008
2006
2007
2008
200000
3500
150000
2006
2007
3000
2008
190566 cas
d’infections à
Campylobacter
100000
2500
50000
2000
2006
2007
131468 cas d’infections
à Salmonella
2008
1500
0
Cam pylobacter
Salm onella
Listeria
1000
1381 cas d’infections à
Listeria
500
0
Campylobacter
Campylobacter
Salmonella
Salmonella
Listeria
Listeria
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Définition des bactériocines
 Les bactériocines produites par les bactéries
lactiques sont:
– - synthétisées par voie ribosomique (RPS)
– - secrétées dans le milieu extracellulaire…
 L’activité bactéricide est dirigée contre des souches
taxonomiquement proches de l'organisme
producteur mais ….
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« Investir dans notre futur commun »
Principales classes des bactériocines
– Classe I / modifications post-traductionnelles
– Acides aminés inhabituels (Lanthionines et βmethyllanthionine)
– Lantibiotiques (Nisine) / additif alimentaire EC 234
Structure 3D de la nisine (Hsu et al., 2004)
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« Investir dans notre futur commun »
Principales classes des bactériocines
 Classe III / Bactériolysines
- - PM > 10kDa
- - Thermolabiles
- - Agissent sur la paroi bactérienne en hydrolysant le peptidoglycane
Helvéticine J
Lactobacillus helveticus
Zoocine A
Streptococcus zooepidermicus
Entérolysine A
Enterococcus faecalis
Milléricine B
Streptococcus milleri
Linocine M18
Brevibacterium linens
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Principales classes des bactériocines
 Classe II /
- - Peptides non lantibiotiques (pas d’acides aminés modifiés)
- - PM < 10kDa
- - Stables à la chaleur et aux pH extrêmes
Classe IIa
Pediocin-like
- Pédiocine PA-1
- Divercine V41
- Entérocine A
Classe IIb
Bactériocines à deux
composantes
- Entérocine
L50A/L50B
- Lactococcine G
- Lactococcine Q
Classe IIc
Bactériocines
circulaires
Classe IId
- Entérocine AS-48 - Lactoccine A
- Carnocycline A
- Lactocycline Q
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« Investir dans notre futur commun »
Structure secondaire des bactériocines de classe IIa
N
C
Feuillet β
Hélices α
YGNGV
Pédiocine box
KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC
Pédiocine PA-1
Henderson et al., 1992
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« Investir dans notre futur commun »
Structure 3D des bactériocines de classe IIa
-En région N-terminale : Structure en
coude β, portant le motif YGNGVxCx4C.
C
N
- En région C-terminale : Hélices α
hydrophobes qui interagissent avec la
membrane
YGNGV
Curvacine A
Haugen et al., 2005
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Mode d’action des bactériocines de classe IIa
Formation de pores
Récepteur membranaire
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« Investir dans notre futur commun »
Modèle de Wedge
Agrégation et formation du pore
Milieu
extracellulaire
+
+
-
Milieu
intracellulaire
Naghmouchi Drider and Fliss I.(2007)
J. Applied Microbiology. 102:1508-17.
-
K+, Acide aminés,
phosphate inorganique,
ATP
Mort cellulaire
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Récepteur membranaire
Héchard et al., 2001. Microbiology 147, 1575-80
Drider et al., 2006. Microbiol Mol Biol Rev. 70, 564-82.
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Différences entre bactériocines et antibiotiques !
 Voie de synthèse
 Spectre d’action
 Concentration requise pour l’activité
Ingolf Nes in Drider and Rebuffat. (2011)
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« Investir dans notre futur commun »
Divercine V41 / modèle d’investigation
 Bactériocine de classe IIa
 Carnobacterium divergens V41 (bactérie lactique isolée de viscères
de poisson)
 La divercine V41 possède:
- une activité anti-Listeria très élevée
- deux ponts disulfure importants pour l’activité
antibactérienne
- des acides aminés essentiels : tyrosine (Y) et tryptophane (W)
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Etude structure fonction
C-term hydrophobe
N-term hydrophile
Pas d’activité anti-Listeria
Activité anti-Listeria
Clivage par une endoprotéase Asp-N
Réduction chimique des ponts disulfures  perte de l’activité anti-Listeria
Rôle important des acides aminés aromatiques
1 Trp
3 Tyr
 une perte totale de l’activité
Bhugaloo-Vial et al., 1999 (Appl. Environ. Microbiol.)
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« Investir dans notre futur commun »
Synthèse des variants structuraux de DvnRV41
1
10
20
30
40
DvnRV41
W19F
Q21S
A22G
S23Y
V30F
L35F
A38V
P40V
AMDPTKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVD F GQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGSASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQGSGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQAYGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTFVGGWLGGAIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWFGGAIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGVIPGKC
TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIVGKC
Aa / Divercine V41
Aa / bactériocines de classe IIa
Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D. (2009)
Appl Environ Microbiol.75:1811-1819
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« Investir dans notre futur commun »
DvnRV41 et variants structuraux / CMIs (µg/ml) de
Peptides
Acide aminé
Changé
L. monocytogenes EGDe
DvnRV41
None
0.1 ± 0.01
variant 1
W19F
21.1 ± 0.9
variant 2
Q21S
18.3 ± 0.9
variant 3
A22G
8.6 ± 0.01
variant 4
S23Y
0.1 ± 0.01
variant 5
V30F
1.3 ± 0.4
variant 6
L35F
0.7 ± 0.2
variant 7
A38V
1.5 ± 0.4
variant 8
P40V
2.5 ± 0.9
Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D. (2009)
Appl Environ Microbiol.75:1811-1819
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« Investir dans notre futur commun »
Consommation de saumon
 Produit de consommation quotidienne !
 En France la consommation [20,000,000 kgs/an]
(augmentation de la consommation nationale d’un facteur de 6 depuis 1980
 Production UE est leader dans le monde [80%]
 Production Française (40 entreprises / 300,000,000 €)
Sources bibliographiques variées et à actualiser
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« Investir dans notre futur commun »
Contamination des aliments et infection
L. monocytogenes
100 bactéries
Gramme d’aliment
Tirer
Production de
DvnV41
Risque
Infection
Listérioses
Traitement
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« Investir dans notre futur commun »
Cb. divergens V41
La microbiologie du saumon
Microflore
du saumon fumé
A la sortie de l’usine / La contamination des produits peut atteindre
102 à 106 UFC/g (Unités formant colonies)
Les Bactéries à Gram Négatif
Les Bactéries à Gram Positif
Sources bibliographiques variées et à actualiser
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« Investir dans notre futur commun »
Les bactéries à Gram Négatif
Après le fumage et au moment du conditionnement
 Les bactéries à Gram Négatif
 Photobacterium phosphoreum
 Shewanella putrefaciens
 Vibrio spp.
 Serratia liquefaciens
 Acetinobacter spp.
 Hafnia alvi
 Enterobacter agglomerans
 Proteus mirabilis Proteus vulgaris
 Pseudomonas spp.
 Moraxella spp.
 Aeromonas spp
Sources bibliographiques variées et à actualiser
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« Investir dans notre futur commun »
Impact de la Flore à Gram Négatif
 Shewanella putrefaciens
-Altération des qualités organoleptiques du poisson
Poissons frais: Le Cabillaud, Lee Hareng, Le Bar
Poissons fumés: Le Saumon
-Production de TMA (Triméthylamine)
-Production d’H2S et odeurs putrides dans le saumon fumé
Photobacterium phosphoreum
-Altération des qualités organoleptiques du poisson*
Emballé sous atmosphère modifiée et calamar
-Production de TMA (Triméthylamine)
-Production d’amines biogènes (histamine)
Sources bibliographiques variées et à actualiser
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« Investir dans notre futur commun »
Les Bactéries à Gram Positif
 Les bactéries lactiques
 Carnobacterium piscicola
 Carnobacterium divergens
 Lactobacillus alimentarius
 Lactobacillus bavaricus
 Lactobacillus curvatus
 Lactobacillus homohiochii
 Lactobacillus casei subsp. tolerans
 Lactobacillus coryneformis
 Lactobacillus farciminis
 Lactobacillus plantarum
 Lactobacillus sakei
 Lactococcus sp.
 Leuconostoc carnosum
 Leuconostoc mesenteroides
 Brochotrix thermosphacta
Sources bibliographiques variées et à actualiser
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« Investir dans notre futur commun »
La listériose
• Maladie à déclaration obligatoire depuis 1998
• 17 décès au Canada (Eté 2008)
• Taux de mortalité avoisinant les 30 % chez la femme
enceinte
• 220 cas sporadiques de listériose recensés par an en
France.
Informations génériques disponibles en ligne
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« Investir dans notre futur commun »
Systématique et bactériologie
Colonies typiques sur gélose sélective
http://en.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogenes
Listeria monocytogenes
 Bactérie à Gram positif, distribution ubiquitaire
 Températures de développement 4 à 45°C.
 Concentrations en NaCl tolérées 10 à 20%.
Cette bactérie à des capacités d’adaptation extraordinaires
Gandhi M, Chikindas ML.
Int J Food Microbiol. 2007 Jan 1;113(1):1-15. Epub 2006 Sep 28. Review.
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« Investir dans notre futur commun »
Relation listériose et consommation de saumon ou de truite fumés
Suède 9 personnes touchées dont 2 décès
Finlande: 23 cas de listériose ont été recensés en Finlande entre juin 1999
et Février 2000, probablement liés à l’ingestion de poisson fumé ou salé à
froid.
 Normes !
Pas d’accord international sur le niveau acceptable de L. monocytogenes
Remarque / En France et dans d’autres pays Européens, la législation tolère
jusqu’à 100 UFC/g dans le saumon fumé à la DLC à condition que les
entreprises ait effectué des études vieillissement de leurs produits prouvant
que le seuil de 100 UFC/g n’est jamais dépassé à la DLC. (AFSSA, 2000;
DGAL N98/N°8088, 1998).
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« Investir dans notre futur commun »
log 10 (UFC/ g saumon)
Inhibition de L. monocytogenes dans le saumon
fumé
1 UFC/g
6
5
4
3
2
1
L. monocytogenes
Cb. divergens V41
0
0
7
14
Temps (jours)
(BRILLET et al, 2004. JAM. 97: 1029-1037)
21
28
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« Investir dans notre futur commun »
Origine de cette inhibition ?
 Action inhibitrice de DvnV41 (in situ)?
 Compétition nutritionnelle entre L. monocytogenes et Cb. divergens
V41 ?
Isolement et caractérisation d’une souche mutante déficiente dans
la production de la divercine V41
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Antagonisme microbien par production de peptide
Test de diffusion sur boite
Souche cible = Listeria
monocytogenes
1
Souche 1
Cb. divergens NCDO2763
(contrôle)
2
Souche 2
Cb. divergens V41
(souche sauvage)
3
Souche 3
Cb. divergens V41C9
(souche mutante)
Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003
Lett Appl Microbiol. 36:288-292.
Cofinancé avec l’appui de
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
2,5
DO 405 nm
2
1,5
1
0,5
0
1
Souche 1
Cb. divergens NCDO2763
(contrôle)
2
Souche 2
Cb. divergens V41
(souche sauvage)
3
Souche 3
Cb. divergens V41C9
(souche mutante)
Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003
Lett Appl Microbiol. 36:288-292.
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Approche moléculaire
(Amplification et séquençage du gène dvnV41
1
2
3
400 pb
300 pb
200 pb
Souche 1
Cb. divergens NCDO2763
(contrôle)
Souche 2
Cb. divergens V41
(souche sauvage)
Souche 3
Cb. divergens V41C9
(souche mutante)
Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003
Lett Appl Microbiol. 36:288-292.
Cofinancé avec l’appui de
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
L. monocytogenes
9
9
L. 8monocytogenes + C.b divergens V41C9
8
log (UFC/g salmon)
7
6
5
4
3
6
5
4
3
2
2
1
1
0
Souche mutante
0
0
5
10
15
20
25
30
35
0
5
10
15
Time (days)
20
25
30
35
Time (days)
9
L. monocytogenes + Cb. divergens V41
8
7
log (UFC/g salmon)
Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H,
Drider D. 2003
Lett Appl Microbiol. 36:288-292.
log (UFC/g salmon)
7
6
5
Souche sauvage
4
3
2
Cofinancé avec l’appui de
l’Union européenne FEDER
Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
1
0
0
5
10
15
20
Time (days)
25
30
35
Suivi de l’implantation de C. divergens V41, parmi la flore
lactique du saumon fumé inoculé, par la technique de
PCR-Multiplex
Sur colonies
de la flore lactique
100
90
80
70
60
% 50
40
30
20
10
0
C. divergens V41
autres Carnobacterium ssp
J0
J13
J20
J27
Connil N, Prévost H, Dousset X. 2002. J Appl Microbiol.92:611-617.
Cofinancé avec l’appui de
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Activité In-vivo de la divercine recombinante
Expériences sur les animaux (souris, Balb/c) ont été réalisées dans le
respect des principes éthiques fondamentaux.
Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010
Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.
Cofinancé avec l’appui de
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Stratégie expérimentale sur modèle murin « in vivo »
 Utilisation DvnRV41 et peptides altérés (W19, Q21, A22, P40)
 Protocole expérimental (Ingham et al. 2003; modifié)
Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010
Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.
Cofinancé avec l’appui de
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Groupes 1 à 5 / (Post challenge test)
T= 0: Injection iv. de L. monocytogenes EGDe 1,5 x 103 UFC/ml
T= 30 min : Injection iv de peptides (2 µg/50 µl)
Peptides injectés (DvnRV41; W19F; Q21S, A22G, P40V)
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Groupes 6 – 10 / (Pré challenge test)
T= - 15 min: Injection iv de peptides (2 µg/50 µl)
T= 0 min : Injection iv de L. monocytogenes 1,5 x 103 UFC/ml
Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010
Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.
Cofinancé avec l’appui de
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
OBSERVATION des souris pendant 72 heures
- Diarrhée
- Vomissement
- Dépression
Euthanasie par dislocation cervicale
- Extraction organe (rate)
- Isolement et dénombrement de L. monocytogenes
Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010
Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.
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« Investir dans notre futur commun »
Résultats Groupes 1-5 / (Post- challenge test)
Groupe
Peptide
Nombre
de souris
infectées
EGDe introduite
Quantité de
peptide
µg /temps (min)
Nombre des souris
avec la culture
négative /
totale ; exprimé
en (%)
Quantité de L.
monocytogenes
nombre UFC
(Log10)/rate)
1
DvnRV41
5
1.5 x 103
2 / (30)
4/5 (80)
0.97±2.17
2
W19F
5
1.5 x 103
2 / (30)
1/5 (20)
4.41 ± 2.46
3
Q21S
5
1.5 x 103
2 / (30)
2/5 (40)
3.10 ± 2.93
4
A22G
5
1.5 x 103
2 / (30)
2/5 (40)
3.14 ± 2.93
5
P40V
5
1.5 x 103
2 / (30)
1/5 (20)
3.23 ±1.88
11
NC
5
1.5 x 103
0/5 (0)
6.25 ± 0.19
NC = contrôle négatif
Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010
Cofinancé avec l’appui de
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Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »
Résultats Groupes 6-10 / (Pré challenge test)
Groupe
Peptide
Nombre
de
souris
infectée
s
Quantité de L.
monocytogenes
EGDe introduite
Quantité de
peptide
µg /temps (min)
Nombre des
souris avec la
culture négative
/
totale ; exprimé
en (%)
nombre CFU
(Log10)/rate)
6
DvnR
V41
5
1.5 x 103
2/ (15)
2/5 (40)
3.13 ±2.86
7
W19F
5
1.5 x 103
2 / (15)
1/5 (20)
3.92 ± 2.32
8
Q21S
5
1.5 x 103
2 / (15)
2/5 (40)
2.83 ± 2.75
9
A22G
5
1.5 x 103
2 / (15)
1/5 (20)
4.43 ± 2.50
10
P40V
5
1.5 x 103
2/ (15)
1/5 (20)
4.25 ±2.38
11
CN
5
1.5 x 103
0/5 (0)
6.25 ± 0.19
CN = contrôle négatif
Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010
Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.
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Publicité et bonnes œuvres
 Société Française des Peptides Antimicrobiens
[email protected] ou [email protected]
 Third International Symposium on Food, Veterinary
and Medical Applications (Lille 2012)
[email protected] ou [email protected]
 Procaryotic antimicrobial peptides: from genes to
biotechnologies. Edited by D. Drider and S. Rebuffat.
(Springer, NY-USA. 2011)
Cofinancé avec l’appui de
l’Union européenne FEDER
Programme Espace Atlantique
« Investir dans notre futur commun »