MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques
SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE
Principe
Utilise la capacité d’absorption de lumière d’une longueur d’onde fine et définie des
substances dissoutes dans l’eau.
Loi de Beer-Lambert (en expression logarithmique) :
Log I0 /I = e . C .L = densité optique ou DO (directement proportionnelle à C)
I = énergie lumière transmise
I0 = énergie lumière incidente
C = concentration substance en mole/l dans le solvant
L = longueur du trajet optique (largeur de la cuve)
e = coefficient caractéristique de la longueur d’onde (coef. d’absorption moléculaire)
Si I=I0 -> le milieu est transparent, la transmission est de 100% et la DO = 0
Si I tend vers 0 , milieu opaque, la DO tend vers l’infini
Spectre d’absorption lumineuse :
représentation graphique des variations de densité optique de la lumière transmise
lors de modification de la longueur d’onde de la lumière incidente.
Spectres des substances : ultraviolet et visible.
Conditions définies : solvant, pH, O sinon variation de l’emplacement des longueurs
d’onde et de coefficient d’absorption
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques
SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE
Appareillage
Nature
spectrophotomètres : toutes les longueurs d’ondes sont disponibles
Photomètres : certaines longueurs d’ondes
Caractéristiques
Sources lumineuses
solides chauffés
(tungstène , visible-infrarouge)
(halogène, visible-UV)
décharges des gaz raréfiés (hydrogène ou deutérium( UV, continu)
(vapeur de mercure (UV, discontinu)
Fente d’entrée
forme rectangulaire
Mono chromateur
filtres colorés (verre ou gélatine)
Filtres interférentiels (verre + métal)
Prismes (dispersion de la lumière)
Réseaux (idem)
Fentes de sortie
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques
SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE
Appareillage
Caractéristiques
Cuves
verre -> visible
Quartz -> U.V.
polystyrène
Précautions d’utilisation (bulles, rayures,nettoyage)
Cellules photoélectriques -> transformation énergie lumineuse en énergie électrique
Tubes photomultiplicateurs
Lentilles, miroirs, fibres optiques
Amplificateurs
Galvanomètres (mesure le courant fourni par l’amplificateur)
Enregistreur
Appareils
photomètres : à filtres, peu coûteux
spectrophotomètres : à réseaux ou à prismes (intéressants pour les spectres)
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques
SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE
Applications
Détermination du spectre
Mesure de concentration
caractérisation substance
directe (Hb. Protéines)
Indirecte (urée diacetylmonoxime)
Réflectométrie
Mesure de l’absorption lumineuse au cours du passage d’une lumière
monochromatique à travers une phase solide sur support réfléchissant.
Applications
Lecture de plaques de chromatographie, de
bandelettes réactives
Analyse automatique
Luminométrie
Mesure de la lumière émise par réaction chimique (Chimioluminescence)
Applications
réactions impliquant la luciférase (ATP ou O2)
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques
PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES
Opacimétrie
mesure de la lumière émise dans le même sens que la lumière incidente
Néphélémétrie
mesure de la lumière à 90° par rapport à la direction de la lumière incidente
Turbidimétrie
concentration ou épaisseur d’un milieu troublant la visibilité nette d’un test optique placé
derrière ce milieu
FLUORIMETRIE
Principe : une molécule à l’état stable recevant une énergie sous forme de rayonnement
passe à l’état excité. Le retour à l’état fondamental se traduit par l’émission de lumière
mesurable.
CHEMILUMINESCENCE
Dans ce cas, l’énergie est d’origine chimique ou enzymatique
Spectres
d’émission
comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est
maximum
d’excitation
comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est
maximum
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques
SPECTROMETRIE D’ABSORPTION ATOMIQUE
Principe
Mesure de l’absorption de radiations photoniques spécifiques par des atomes en
phase vapeur
Loi de Kirchhoff : un élément métallique peut absorber les radiations qu’il est lui-même
susceptible d’émettre
Atome métallique + énergie lumineuse  état excité
Retour à l’état fondamental radiations caractéristiques (raie de résonance)
Inversement
Vapeur atomique (atomes état fondamental) + radiation  absorption de la radiation
Appareillage
Sources de radiation : lampe à cathode creuse ou lampes à excitation HF
Production de la vapeur atomique : source d’atomisation à flamme ou électrothermie
Systèmes de correction d’absorption non spécifique
Système de lecture : monochromateur puis photomultiplicateur
Applications
Dosage des métaux et alcalinoterreux (biologie clinique, toxicologie, pharmacologie)
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES
EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques
PHOTOMETRIE D’EMISSION ATOMIQUE
Principe
Mesure de l’intensité d’énergie lumineuse spécifique émise par un élément chauffé dans
une flamme (raie de résonance)
Appareillage
Nébuliseur – brûleur (solution à doser nébulisée dans une flamme (air-propane,acétylène)
Système de lecture : filtre interférentiel à bande étroite + dispositif photosensible
Applications
Dosage des alcalins Na, K, Li (biologie clinique)
Inconvénient
Manipulation des gaz
Avantages
Fiabilité, spécificité, linéarité, simplicité
Spectrophotomètres
Schéma
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
METHODES ELECTROCHIMIQUES
Principe
Echange d’électrons entre électrode et substance électroactive
(électrode = cathode ou anode)
Méthodes
Méthodes en pleine expansion, souvent automatisables (biochimie analytique du GR ou
analyses de biologie délocalisée)
Les méthodes sont de 2 types selon l’importance de l’électrolyse :
 ampérométrique :
ampérométrie : microélectrolyse avec concentration relativement constante de
l’analyte. Potentiel constant, intensité courant proportionnelle à concentration
Analyte - Application : détermination de la PO2 ou étude post-chromatographique
haute pression.
potentiométrie : les électrodes sont spécifiques à membrane. Intensité courant
constante,analyse des variations de potentiel en fonction de la concentration analyte
 coulométrique : coulométrie
mesure la consommation complète du produit à analyser. Intensité ou potentiel
imposé. - Application : dosage du fer sérique par coulométrie à potentiel imposé.
 voltamétrie et polarographie. Application peu usuelle
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
RADIOANALYSE
Principe
La plupart des éléments naturels existent à l’état de mélange d’isotopes
Masse noyau  et Nombre électron =
propriétés chimiques identiques
Les radioisotopes sont instables.
Leur désintégration  libération e- ou rayon g
Il est possible de créer des réactifs marqués par radioisotopes pour l’usage biologique.
Méthodes
Les radioisotopes peuvent être détectés de diverses manières :
- compteur Geiger (ionisation d’un gaz)
- compteur à scintillation (éclair lumineux)
- autoradiographie (impression d’une plaque photographique)
Applications
- toute technique d’analyse biochimique (cf : reste du cours !)
- étude métaboliques : traçage des processus cellulaires :
précurseur radioactif , étape métabolique, mesure biochimique , autoradiographique,..
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
Enzyme
Définition catalyseur biologique de réaction biochimiques
Spécificité
vis à vis de la molécule sur laquelle il agit = substrat
Variable (notion d’affinité)
Structure
Préparation et purification
Protéines
Parfois fragilisées par les séparation des constituants cellulaires
Site actif = sites privilégiés de fixation du substrat
Proenzyme = forme inactive à transformer pour activation
Isoenzymes = différentes protéines à même spécificité enzymatique correspondent
souvent à des protéines formées de plusieurs chaînes
polypeptidiques à combinaisons variables entre elles (LDH)
Il existe des protéines à plusieurs fonctions enzymatiques
Enzyme et structure cellulaire
- enzymes impliquées dans une chaîne métabolique ont souvent la même localisation
cellulaire
parfois regroupements en complexes poly-enzymatiques difficilement dissociables
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
Enzyme
Régulation de l’activité enzymatique
Formes allostériques différences de forme spaciale
Certaines substances - ligands- modifient ces formes
Ce sont des effecteurs allostériques (parfois substrat ;dans ce cas la courbe de la
vitesse de réaction en fonction de la concentration prend la forme d’une sigmoîde)
Certaines substances de bas PM ont également des effets effecteurs ou inhibiteurs 
modification de l’affinité pour le substrat régulation métabolique
Cas de la régulation par le produit terminal de la chaîne métabolique = rétro inhibition
ou inhibition par feed-back
Enzyme à concentration faible par rapport aux autres enzymes de la chaîne
métabolique, enzyme régulateur de la chaîne  effet limitant
Classification internationale des enzymes => numérotation
1 = oxydoréductases : réactions d’oxyoréduction
2 = transférases : transfert de groupements fonctionnels
3 = hydrolases : réactions d’hydrolyse
4 = lyases : suppression ou fixation d’un groupement=>double liaison
5 = isomérases : réactions d’isomérisation
6 = ligases : liaison (c-o, c-n, c-c, c-s) avec coupure d’une molécule d’ATP
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
Dosage des enzymes
Moyens :méthodes immunochimiques (comme autres protéines, cf suite du cours)
méthodes de mesure de l’activité catalytique
Mesure quantitative (activité catalytique)
Mesurer la vitesse de réaction  apprécier la quantité d’enzyme
v = k{Enz]
v = molécules de substrat tranformées par minute
[Enz] concentration en enzyme
k = constante dépendant de la nature de l’enzyme
Paramètres
concentration en substrat
mesure, pour chaque concentration, de la vitesse initiale (tous paramètres stables)
aspect de la courbe dû au fait que, à concentration faible, toutes les molécules d’enzyme ne sont
pas saturées
pour une concentration en substrat la vitesse est donnée par :
équation de Michaelis-Menton : v = Vmax {S] / {S] + {KM]
KM : caractéristique de l’enzyme, exprimée en molécules.l-1
Souvent transformation pour obtenir une représentation graphique linéaire (équations de
Lineweaver-Burk, Eadie-Hoftee)
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
Dosage des enzymes
Paramètres
Température et pH résultante entre effets activateurs et inhibiteurs
Coenzymes
partie non protéique – souvent transformé lui-même
souvent transporteur de groupements fonctionnels
ATP, coenzymeA, biotine, pyrophosphate de thiamine
Activateurs autres : ions métalliques (Zn, Mg..), protéines inertes (albumine)
protecteurs des thiols
Inhibition
compétitive : analogue structural du substrat
modification par ajout de substrat
modification de la KM
non compétitive complexants,
inhibiteurs d’une fonction chimique
aucun effet d’ajout de substrat
pas de modification de la KM

nécessité de standardisation, de contrôles interne, externes
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
Dosage des enzymes
conditions classiques
large excès de substrat
température = 37° ou 30°
pH = pH optimal
protecteurs enzymatiques
dilutions ( !)
Expression des résultats
v de la réaction / ml ou mg de protéines
v = mmoles de substrat / mn à 30°  UI
Katal = 1 mole/seconde
1 UI = 16 nkatal
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
Dosage des enzymes
Techniques de mesure
2 possibilités : disparition du substrat ou apparition du produit
méthodologies de mesure
photométrie
coloration du produit , différence d’absorption
fluorimétrie
technique plus sensible,
soit fluorescence spontanée, soit transformation par
modification pH, ajout réactif, transformation structure
causes d’erreurs (fluorescence propre , impuretés
témoin
« blanc réaction »)
radioisotopie
substrat radioactif  séparation
sensible, peu d’interférences
impossibilité d’automatisation
prix élevé, difficultés de fabrication
Immunochimie
Anticorps-anti-enzyme pour séparer différentes
activités
Spécificité pour une isoforme
Etude des modifications génétiques
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
Dosage des substrats
Dosages en point final
Excès d’enzyme
Possibilité d’utiliser une deuxième réaction de révélation
Mesure en fin de réaction par photométrie ou radioenzymologie
Dosages par méthode cinétique
Enzyme à Km élevée (éventuellement inhibiteur compétitif)
Mesure de la vitesse de réaction à 2 temps rapprochés et comparaison avec la
courbe établie à partir de quantités connues de substrat
La plupart du temps ; méthodes des analyseurs multiparamétriques
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie
Principe
utilise la spécificité remarquable de la liaison antigène – anticorps due à la
complémentation stéréochimique qui la caractérise
Nature des réactifs
Anticorpsprotéine particulière synthétisée par les lymphocytes B
Architecture de base à 2 chaînes lourdes et légères
Polymorphisme très élevé
Site Ac toujours situé en extrémité N terminale
Liaison Ag-Ac par site antigénique et site anticorps
Chaque anticorps possède une afffinité particulière à
l’égard de l’épitope qui lui correspond
Antigène
Nombre d’épitopes variable de 1 pour les molécules
hapténiques à plusieurs centaines pour certains virus
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie
Préparation des réactifs immunochimiques
Immunisation expérimentale d’animaux la plupart du temps
Préparation des antigènes
Grosses molécules spontanément immunogènes injection directe
Haptènes = molécules PM <5000  couplage avec grosses molécules (albumine,
adjuvant de Freund)
Préparation des anticorps
Anticorps polyclonaux
Mélange d’anticorps issus de nombreuses cellules lymphoïdes  Ac reconnaissant
des épitopes différents ou des aspects variés du même épitope ou un même épitope
avec une affinité variable = immunsérums, excellents réactifs
Nécessité de purifier l’immunsérum
de le concentrer en anticorps (précipitation Ig)
Anticorps monoclonaux
Proviennent de l’hybridation d’une cellule lymphocytaire avec une cellule tumorale
(plasmocytome) =>cellule hybride immortelle
=>clone à fabrication indéfinie et stabilisée d’1 anticorps
avantages :
production industrielle
préparation à partir d’antigènes inconnus
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie
Etalonnage
Réaction Ag-Ac sensible à l’environnement  étalonnage et dosage mêmes conditions
(y compris nature du prélèvement)
En général, il est en fait techniquement impossible de connaître la quantité exacte
d’antigène dans le milieu d’étalonnage
=> expertises et définitions d’unités internationales
distribution de solutions d’étalonnage sous les auspices de l’OMS
Méthodes
Nombre et variété impressionnants
Classification possible selon le phénomène observé et mesuré
Observation directe du complexe Ag-Ac : précipitation, agglutination
Observation indirecte par l’intermédiaire d’une marque attachée soit à l’antigène, soit à
l’anticorps. Marque = molécule détectable par un appareil ou les sens.
Observation par intermédiaire d’un phénomène biologique
Applicables à la quantification des antigènes et des anticorps
mais
dosage possible des antigènes (cf : remarques)
Seulement estimation des anticorps (variabilité)
Appréciation de la quantité des immuncomplexes
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie
Standardisation et contrôles de qualité en immunochimie
Valeurs des méthodes inégales :
Reproductibilité
seuil de détection
Spécificité
sensibilité aux interférences
Commodité
capacité à être automatisée
coût
Donc :
évaluations, comparaisons
généralement du mélange : « principe méthodologique, appareillage, réactifs »
standardisation en fait impossible
 définition de valeurs de consensus
 mise au point de matériel réactif de référence
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques – observation microscopique
Principe
Utilisation d’amplification du signal par lentilles optiques pour détecter des objets de
taille inférieure à celle décelable à l’observation à l’œil nu.
Méthodes
On distingue :

la microscopie photonique qui, comme son nom l’indique, utilise des lampes à
émission de photons (longueurs d’ondes UV visibles).
Préparation spéciale :coloration sélective (entraîne la nécessité d’augmenter la
sensibilité par activité enzymatique ou par fluorescence)
 le microscope à fluorescence permet la détection de protéines ou d’autres substances.
Il est possible d’utiliser des anticorps marqués (fluorescents ou révélés par activité
enzymatique). Ces anticorps se lient à la surface des molécules de la cellule vivante
ou à l’intérieur de la cellule fixée perméabilisée. Il y a possibilité de détection de
variation de concentration et localisation de molécules à l’intérieur de la cellule.
 la microscopie par diffraction des rayons X : révèle un arrangement tridimensionnel
moléculaire.
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques – observation microscopique
Méthodes

la microscopie électronique qui utilise un faisceau d’électrons.
Contraintes spécifiques :
la fixation est nécessaire (elle utilise en général des produits identiques à ceux
décrits pour la déprotéinisation)
coupe en tranches fines (souvent inclusion dans résine ou cire)
les mêmes préparations avec révélation (enzyme, peroxydase ou or colloïdal) utilisées
pour la microscopie optique peuvent être utilisées en microscopie électronique
La microscopie électronique par cryofracture (cassure des structures internes de la
cellule par le froid intense) localise la distribution de proteines intra-cellulaires.
La technique de coloration négative : entraîne la révélation d’agrégats
macromoléculaires ou l’agencement des sous-unités protéiniques.
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques – observation microscopique
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques – observation microscopique
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs
Mesure d’un paramètre biologique chez un individu

Valeur
à situer par rapport aux valeurs possibles
donc nécessite que soient connues :

Les valeurs représentatives de la population générale

Les valeurs de référence



Individus en bonne santé
Conditions définies (exclusion des facteurs de variation)
Les valeurs usuelles


Population hétérogène (existent des facteurs incontrôlés)
Population pathologique à risque (obèses…)
Valeurs usuelles deviennent valeurs de référence
si définition de la population et contrôle des facteurs d’interférence
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs – listes des facteurs de variations biologiques
Le choix des individus de la population de référence impose de connaître
les facteurs de variations biologiques
Etablissement de la liste = constitution de banques de données



Répertorier
 Littérature
 Facteurs physiologiques
 Facteurs pharmacologiques
Quantifier
 Centres d’examens de santé
 Variations tissulaires physiologiques
 Variations pharmacologiques et pathologiques
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs – listes des facteurs de variations biologiques
Types de facteurs de variations biologiques
Plusieurs propositions de classifications
•
Variations génétiques ou acquises
•
Variations dues à l’environnement
•
Variations dues à des facteurs exogènes ou endogènes
•
Variations dues à des facteurs physiologiques
•
•
Facteurs de masse (graisse, muscle, foie  enzymes)
Facteurs métaboliques
•
•
•
Très régulés
Produits de catabolisme
Produits impliqués dans les mécanismes de synthèse à partir du plasma (glucose,
cholestérol…)
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs - sélection de la population de référence
La sélection de la population de référence utilise 2 types de critères
Les critères de stratification ou facteurs de variation maîtrisables

création de sous ensembles homogènes
personnalité des groupes
environnement
histoire
En général : âge, sexe, masse corporelle, origine ethnique
Les critères d’exclusion ou facteurs de variation non maîtrisables
pathologies
prise de médicaments
état physiologique
sujets à risque
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs – le concept de valeur de référence
Filiation entre les différents termes
Individus de référence
Constituent la
Population de référence
À partir de laquelle est sélectionné un
Échantillon de référence
Valeur
observée
chez un individu
Pouvant
être
comparée
aux
Sur lequel on détermine des
Valeur de référence
Sur lesquelles on observe une
Distribution de référence
À partir de laquelle est déterminée une
Limite de référence
Qui sert à définir l’
Intervalle de référence
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs – le concept de valeur de référence
Études bibliographiques
et expérimentales
Liste des facteurs de variations
biologiques et pathologiques
à posteriori
Préparation des sujets
Sélection des sujets
= population de référence
à priori
Critères de stratification, d’exclusion
questionnaire
Préparation des sujets
Prélèvement
Traitement du spécimen
analyse
Prélèvement
Traitement du spécimen
analyse
Sélection de l’échantillon de référence
Critères de stratification, d’exclusion
Traitement statistique
Vérification de la représentativité
Valeurs de référence
Traitements statistiques
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - publication
ELEMENTS D'UN ARTICLE SCIENTIFIQUE
journal
Date de parution
titre
Auteurs + adresses
Mots clefs
résumé
introduction
Exposé du problème à résoudre
Etat des connaissances
Plan du travail
Matériels (techniques et biologiques) et méthodes
Résultats + commentaires (Tableaux – Figures)
Discussion (Tableaux – Figures)
conclusion
remerciements
bibliographie
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis)
MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
 biopsie cutanée  fibroblastes cultivés
 sang
 leucocytes isolés
METHODES UTILISEES
culture cellulaire
sédimentation en polyvinylpyrolidone
centrifugation
lyse cellulaire (ultrasons)
mesure activité enzymatique :
 radiochimie
 blanc réactif + blanc réaction
 double essai

mesure
par
fluorimétrie
(méthylumbelliférone)
en
substrat
artificiel
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis)
RESULTATS
blanc réactif (conditions d'incubation)
conditions de réaction
STS
 comparaison de tampon Tris et phosphate
 sensibilité dans les leucocytes
incubation

activité spécifique substrat
concentration en protéines
de l'échantillon
ARS-C
 tampon phosphate à pH 8,5
détermination des valeurs de référence
 des valeurs des patients
des valeurs des porteurs
CONCLUSION
intérêt du dosage de la STS
intérêt de la mesure dans plusieurs types cellulaires pour le dépistage
des porteurs
temps


MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques – publication (purification
microfibrilles
MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
Ligaments de la nuque de fœtus de boeuf
METHODES UTILISEES
Préparation de microfibrilles natives intactes ( )
Centrifugation en gradient de densité
 directement ou après traitement avec hyaluronidase toute la nuit
 en gradient de C3CL (densité initiale 1,35 g/ml)
soit
 72 H, 36 000 rpm
 15 fractions de 0,8 ml
soit
 congélation4 H à -80°C, 18 H centrifugation, 36 000 rmp
 15 fractions de 0,8 ml
Analyse biochimique
 dialyse contre tampon 50 mM Tris/HCL, pH 7,4, contenant 0,2 M NaCl
 mesure densité optique à 280 nm par analyse spectrophotométrique
SDS PAGE
 dialyse contre eau distillée (aliquot 0,5 ml)
 congélation
 SDS PAGE à 6 % de SDS en condition réductrice (dithiothreitol)
 coloration des protéines ou bleu de Coomassie
Immunobuvardage (ou "blotting")
 sur membrane de cellulose (aliquot 50 µl)
 anticorps : anticollagène VI, antifibrilline, anti MAGP-1, anti LTBP-1,
anti LTBP-2, antifibronectine
 révélation par chemiluminescence
Microscopie électronique à ombrage rotatif
 observation du mélange initial riche en microfibrilles et des fractions de
centrifugation en gradient
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques – publication (purification
microfibrilles)
RESULTATS
Centrifugation en gradient de densité
 gradients de 1,28 à 1,43 g/ml (72H ou 18H après congélation)
 mesure de la densité optique à 280 nm  protéines à densité 1,30,
1,33 et 1,41 g/ml
après traitement par hyaluronidase, pic protéines 1,33 et 1,37 g/l
SDS PAGE et Immunobuvardage
 fractions 6 et 7  collagène VI chaîne 1 et 2 et chaîne 3
 fractions11 et 12 protéine de 330 kDa  fibrilline avec
colocalisation MAGP-1
 sommet du gradient fractions 1 et 2  LTBP-1 et LTBP-2
Microscopie à ombrage rotatif
- préparation non traitée à la hyaluronidase
 fractions 6 et 7
 collagène VI en aggregats
+ quelques fibres de fibrilline
 fractions 11
 µfibrilles de fibrilline
- préparation traitée à la hyaluronidase
 fractions 6 et 7
 µfibrilles de collagène VI
 fractions 11
 µfibrilles de fibrilline
DISCUSSION (CONCLUSION)
La méthode proposée permet une analyse structurale fine et précise des µfibrilles.