1.a. Le derme - Cicatrisation.info
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20/01/2017 Plan 2 a. b. c. 2. Institut de Recherche Biomédicale des Armées (IRBA) Unité de Thérapie Tissulaire de Traumatologie de guerre (UT3G) Antenne Centre de Transfusion Sanguine des Armées 1 rue du lieutenant Raoul Batany BP 410 92141 CLAMART cedex 3. b. 4. Généralités sur la peau Réparation cutanée La brûlure (Définition, physiopathologie, conséquences) Prise P i en charge h classique l i d’ d’une b brûlure ûl th thermique i Alternatives: Utilisation de substituts cutanés produits par ingénierie tissulaire a. 5. 19/01/2017 Introduction sur la brûlure 1. THÉRAPIE CELLULAIRE DES BRÛLURES CUTANÉES Les substituts épidermiques Les substituts de peau totale L’utilisation des CSM pour la réparation cutanée Utilisation de nouvelles technologies : 3D bioprinting Marina Trouillas, PhD, [email protected], 01.41.46.72.09 1.a. Introduction - la peau 1.a. Introduction – l’épiderme 3 Epiderme: Fonction de protection •Protection (couche cornée) •Cellules de Merkel (Sensibilité) •Mélanocytes (Photoprotection) •Cellules de Langerhans (immunoprotection) Derme: Tissu de soutien et Nourricier •Matrice extracellulaire : Propriétés mécaniques •Fibroblastes: synthèse et remodelage matriciel Croissance et différenciation des kératinocytes •Sensibilité •Vascularisation (apports de nutriments Coupe de peau Stade d de différenciation 4 Lavoie et al., 2009 Loricrine Filaggrine Involucrine K1, K10 Kératohyaline Loricrine P fil Profilaggrine i Involucrine K1, K10 Ki67, K5, K14, K19, K15 Intégrines Collagène IV et VII, Laminine 3-3-2, perlecan, etc.. Hypoderme : Propriétés mécaniques et thermiques d’après Géras, In Dermatology, 1990 1.a. Le derme Epiderme 1.a. La jonction dermo-épidermique Derme Nie 2012: “BM plays a substantial role in cellular ll l communications i ti and maintains the stem cell-like qualities of undifferentiated keratinocytes “ Sorrell & Caplan, 2004 1 20/01/2017 1.a. Homéostasie cutanée 1.b. Processus de cicatrisation Phase Inflammatoire Résultante d'interactions multiples cellule <-> cellule •Formation d’un caillot •Activation des plaquettes •Recrutement de Neutrophiles puis de Macrophages cellule <-> matrice Kératinocytes Phase de proliferation / Réepithélialisation Matrice Fibroblastes Phase de maturation / Remodelage •Formation F i d’ d’un tissu i d de granulation l i •Recrutement de fibroblastes et différenciation en myofibroblastes •Nouvelles matrices conjonctives •Vascularisation •Migration des keratinocytes à partir des berges de la plaie et différenciation •Fermeture de l’épiderme •Apoptose de myofibroblastes •Remodelage matriciel ( qualité/ structure) Gurtner et al, 2008 1b. Processus de cicatrisation 1.c. Introduction – La brûlure La brûlure peut avoir différentes origines… flamme contact électrique liquides chauds chimique par frottement radio-induite 80% des cas de brûlures (Rowan MP et al, 2015) Eming SA et al, 2009 1.c. Introduction – La brûlure 1.c. Introduction – La brûlure 11 12 Evaluation de la surface brûlée 11824 patients hospitalisés pour brûlures en 2011: 10% de séjours pour brûlure grave D é moyenne de Durée d séjour éj pour les l bûlures graves: 34 jours (Pasquereau A., Thélot B., InVs, 2014) Grand brûlé Face palmaire de la main = 1 % de la surface corporelle Règle des 9 de Wallace Excision des tissus brûlés Séquelles : problèmes fonctionnels, esthétiques, psychologiques et/ou relationnels (Echinard 2010) SITE % de la surface totale Tête et cou 1x9 % Membres supérieurs (chacun) 1x9 % Membres inférieurs (chacun) 2x9 % Tronc (faces ant. et post.) 4x9 % Périnée 1% Cicatrices suite à une brûlure 2 20/01/2017 1.c. Introduction – La brûlure 1.c. Introduction – La brûlure 13 14 Degrés de brûlure Peu ou pas de régénération possible Destruction traumatique de la peau Et quelquefois des tissus sous-jacents Evaluation: Profondeur Surface Rose et al, 2016 1.c. Cicatrisation des brûlures 1.c. Introduction – Physiopathologie de la brûlure 16 Brûlure du 1er degré Temps nécessaire Complications 4 à 5 jours après desquamation Aucune Brûlure du 2nd degré superficiel 10 à 14 jours Brûlure du 2nd degré profond (en l’absence d’infection) 21 à 35 jours Dans les cas les plus sévères: réponse inflammatoire systémique et défaillance multiorganes Dyschromie possible Brûlure du 3ème degré Relargage de médiateurs de l’inflammation, induit par la nécrose et la formation in situ de complexes lipido-protéiques toxiques (Allgöwer M et al, 2008) Evolution des brûlures sévères en trois phases: Phase précoce de choc: hyperinflammation, défaillance multi-organes et aggravation de la plaie Phase hypermétabolique: défaillance multiorganes maintenue par un état inflammatoire durable, immunodépression Phase locale de remodelage: induction d’une cicatrice fibrotique, hypertrophique ou rétractile (Leclerc T et al, 2011) Cicatrices majeures Guérison spontanée impossible traitement chirurgical nécessaire Rose et al, 2016 Cirodde A et al, 2015 2. Prise en charge d’un grand brûlé 17 2. Nécessité d’excision-greffe précoce 18 Réparation spontanée exclue chez un grand brûlé Besoin d’une prise en charge médicale spécifique: Excision précoce de la zone brûlée (toxicité du tissu brûlé) Nécessité d’une recouverture rapide du grand brûlé pour restaurer la barrière cutanée Restaurer le tissu lésé : apport nécessaire d’un support matriciel et de cellules progénitrices • • • Tissu nécrotique = toxique Brûlure plaie Brûlure B ûl profonde f d ett étendue : • excision • greffe 3 20/01/2017 2. Traitement chirurgical de la brûlure 2. Traitement chirurgical de la brûlure 19 20 Utilisation d’Autogreffes: « Gold Standard » Utilisation d’Allogreffes Prélèvement Donneur décédé Conservation FFraîches, î h cryo-préservées, Glycérol à 85% Excision précoce Prélèvement du site donneur 0.2 à 0.4 mm d’épaisseur Expansion de la surface prélevée filet (x 1.5 à 8) Greffe Utilisation Couverture temporaire Greffe composite en sandwich Préparation d’un socle aux cultures Rarement pour couverture définitive Inconvénients immédiats: Saignement Douleur Zone de prélèvement problématique pour un grand brûlé Inconvénients lointains Cicatrices en résilles sur la zone greffée Cicatrices de la zone prélevée 3. Alternatives: Utilisation de substituts cutanés produits par ingénierie tissulaire 21 3.a. Développement de substituts épidermiques 22 Collagène Fibrine Acide hyaluronique Gl Glycosamino i glycanes Matrices synthétiques Types cellulaires (Kératinocytes, fibroblastes, Cellules endothéliales, d héli l autres) Autologues vs allogéniques Cellules fraichement isolées ou cultivées in vitro Les substituts épidermiques actuels (Kamel et al., 2013) Feuillet de keratinocytes (auto vs allo) produit sur un support pp plastique p q Keratinocytes en suspension auto vs allo +/- dans matrice de fibrine Utilisation d’un support matriciel Fibrinogène purifié (Pellegrini et al., 1999; Ronfard et al., 2000) Matrices issues de plasma (Llames et al, 2004) Kamel RA et al, 2013 3.a. Alternatives pour le traitement des grands brûlés 3.a. Les substituts épidermiques Kamel RA et al, 2013 23 24 Nom Descriptif du substitut Références Epicel (Genzyme Biosurgery ) Feuillet de kératinocytes autologues sur une gaze vaseliné Rheinwald and Green et al, 1975, Gallico 1984 Cell Spray (ClinicPerthal Cell Culture ) MySkin (CellTran Ltd) Laserskin or Vivoderm (Fidia Advanced Biopolymers) Bioseed-S (BioTissue Technologies GmbH) JACE (Japan Tissue engineering Co) Suspension cellulaire de keratinocytes Gravante et al 2007 and d Shukla Sh kl ett all 2010 autologues cultivés ou non Keratinocytes quasiconfluents sur une couche de silicone Moustafa et al, 2004 Keratinocytes autologues dans une matrice d’acide hyaluronique Keratinocytes autologues en suspension dans une matrice de fibrine Feuillet de kératinocytes autologues sur une gaze vaseliné Lam PK et al, 1999 Alternative de traitement pour les grands brûlés sur plus de 60% de leur surface corporelle (Cirrode et al., 2011): Diversité de techniques suivant les centres G ff d Greffes de substituts b i cutanés é complets l ou greffe ff en deux d temps d’une partie dermique puis d’une partie épidermique Techniques utilisées au CTB de Percy: Johnsen S et al, 1994 Technique de Cuono (Cuono et al., 1986) Technique combinée (Braye et al, 2000) Culture d’épiderme autologue Matsumura H et al, 2013 4 20/01/2017 3.a. Technique de Cuono et utilisation de culture d’épiderme autologue (CEA) 25 3.a. Les Cultures d’Epidermes Autologues (CEA) 26 Préparation du socle dermique : technique de « Cuono » Récupération des kératinocytes et culture sur cellules nourricières Biopsie Culture Culture de greffons épidermiques autologues Ecision des tissus brûlés et biopsie de peau saine Abrasion de l’épiderme de la greffe Couverture temporaire par allogreffe ou xenogreffe •Evite la réaction inflammatoire de rejet de l’épiderme de l’allogreffe ou la xenogreffe Vascularisation du derme Pose de greffon épidermique autologue sur un derme régénéré Préparation du socle dermique Préparation en parallèle de feuillets épidermiques autologues 3.a. Rétrospective de la recherche sur les kératinocytes (Ghadially 2012) 3.a. Rétrospective de la recherche sur les kératinocytes (Fuchs 2009) 27 28 Epidermal Proliferation Unit (EPU) EPU (Mackenzie) Stem cells = Label retaining cells 1969 1969 1981 In vivo study in mice Tritiated thymidine and BrdU Les kératinocytes forment des colonnes avec des cellules basales clonogéniques (Mackenzie 1969, 1970) Keratinocyte souche = •Cellules quiescentes à faible activité mitotique (Conservation de l’analogues de base sur le long terme) •Démonstration de l’ ’existence de kératinocytes souches inter-folliculaires et les kératinocytes souches localisés dans le renflement des follicules pileux et de la glande sébacée Human skin showing columnal organization (MacKenzie 1975) Bickenbach 1981, Morris 1985, Potten and Morris 1988 3.a. Rétrospective de la recherche sur les kératinocytes 3.a. Rétrospective de la recherche sur les kératinocytes 29 30 EPU (Mackenzie) 1969 Label retaining cells (Bickenbach, Potten, Morris) 1981 Barrandon Green 1987 Clonal Analysis hierarchy prolif kera EPU (Mackenzie) 1987 Holoclones, Label retaining cells (Bickenbach, Potten, Morris) Clonal Analysis (Barrandon Green) 1981 1987 1969 Meroclones, Start of epidermal stem cells marker 1993 Paraclones Jones and watt 1993 : les Integrines Beta1 ont un plus fort potentiel prolifératif in vitro Stem cells Transit amplifying stem cells 5 20/01/2017 3.a. Rétrospective de la recherche sur les kératinocytes 3.a. Rétrospective de la recherche sur les kératinocytes 31 32 EPU (Mackenzie) Label retaining cells (Bickenbach, Potten, Morris) Clonal Analysis (Barrandon Green) Start of epidermal stem cells marker (Jones) 1969 1981 1987 1993 Les cellules souches inter-folliculaires peuvent maintenir l’homéostasie de l’épiderme sans cellules souches issus de follicules pileux Ghazizadeh Taichman 2001, Braun 2003, Ito 2005, Levy 2005, Langton 2008… IF stem cells independant from HF EPU (Mackenzie) Label retaining cells (Bickenbach, Potten, Morris) Clonal Analysis (Barrandon Green) 1969 1981 1987 2001 Start of epidermal stem cells marker (Jones) 1993 IF stem cells independa nt from HF Single epidermal progenitor vs a hierarchy 2001 Suivi des cellules souches épidermiques interfolliculaires et leurs progéniteurs au cours de la cicatrisation Blanpain et al 2014 Réparation épidermique essentiellement due aux cellules souches interfolliculaires, Plus faible contribution des progéniteurs (Mascré et al, 2012) Ghazizadeh & Taichman 2001, Bgal EPU 3.a. Rétrospective des avancées thérapeutiques M3 sur les CEAs 3.a. Timing du traitement 34 33 EPU (Mackenzi e) 1969 Label retaining cells (Bickenbach, Potten, Morris) Clonal Analysis (Barrandon Green) 1981 1987 Les fibroblastes murins 3T3 permettent la culture in vitro de keratinocyte (Rheinwald & Green 1975) Start of epidermal stem cells marker (Jones) Première utilisation alloderme + CEA (Cuono 1986) Première greffe de CEA au Peter Bent Brigham Hospital Boston (O’Connor & Mulliken 1979) Début de la production d’Epicel par Genzyme 1986 1993 IF stem cells independa nt from HF Single epidermal progenitor vs a hierarchy Cultures 1aires J8-10 2001 Test clinique d’un substitut de peau totale pour le traitement du grand brûlé (Boyce ST et al, 1999) Biopsie J0 Cultures 2aires J16-24 Test clinique de CEA sur fibrine de fibrinogène purifié (Ronfard 2000) Test clinique de CEA sur fibrine de plasma coagulé (Llames 2004, 2006) Préparation Pose 3.a. La pose des CEA Transport 3.a. Take-down : pose + 7 jours 35 36 Pose Pansement 1aire 2aire Dermabrasion J 20 à J 24 % d’épidermisation 6 Diapositive 33 M3 Est-ce que j'ajoute peaux totales et peau autologues/allologues de O.Damour ? Maïa; 08/03/2013 20/01/2017 3.a. À Percy, de 1991 à 2011… 3.a. Traitement d’enfants 37 38 De 1991 to 2007 : Biopsies : 63 patients ( 4 morts avant la fin du processus de culture) 59 patients traités par cultures 40 % venant d’un autre centre 2005-2011: 10 patients Cirodde A et al , 2011 116 feuillets CEA 3.a. Traitement d’adultes 3.a. Avantages des CEA 39 40 Obtention de nombreux feuillets épidermiques à partir d’une biopsie de faible surface Remplacement permanent de la peau Augmentation du taux de survie Peau humaine saine 482 feuillets CEA en 2 applications Epiderme de culture (1,5 mois après la greffe) (Ronfard V et al, 2000) 3.a. Les limites des CEA 3.a. Données cliniques sur les CEA 42 Insuffisances fonctionnelles Données cliniques : Immaturité variabilité de prise de greffe (15 à 85% de prise (Atiyeh 2007), 10 à 90% (Llames 2006), 46 à 92% (Carsin 2000), 0 à 100% (Braye 2001), 45 à 84% (Cirrode 2011)) Néoformation Techniques Cicatrices Grande (bulles, rétraction, taches, hyperkératoses) Fragilité de la peau reconstruite (pas de fibres élastiques avant 2 ans) de la jonction dermo-épidermique difficile (papilles 6 mois) Coût de production très élevé (15€/cm², 100000€/patient) Thérapie assimilée à une xénotransplantation différentes différentes (degré de brûlure, ulcères) Variabilité donneurs Kératinocytes auto- vs allologues Etat métabolique du patient Utilisations Plaie suite au frottement d’un jean sur une peau traitée par épiderme de culture 7 20/01/2017 3.a. Développement de substituts épidermiques: Protocole de culture 43 3.a. Développement de substituts épidermiques: 44 Le choix du substitut (en fonction des exigences liées à l’application clinique): Substitut épidermique immature Utilisation d’une matrice pour la culture des kératinocytes: plasma frais congelé Keratinocytes Patient P0 Biopsie de peau Cell Bank Cellules nourricières irradiées humaines Amplification in vitro (6 à10 jours) P1 Greffe sur patient Blood Transfusion Bank PlasmaBased Matrix Culture d’hPBES 14 jours Gold standard Epicel ® n=4 n=4 human Plasma-Based Matrix : « hPBM » Analyse de la régénération épidermique sur un modèle animal human Plasma-Based Epidermal Substitute : « hPBES » Intérêt pour la manipulation du feuillet Facteurs de cicatrisation Préservation de la jonction dermo-épidermique 3.a. Développement de substituts épidermiques: Preuve de concept, Analyse in vivo 3.a. Développement de substituts épidermiques: Preuve de concept, Analyse in vivo 45 46 hPBES, J21 post greffe Greffe J0 • Greffe d’hPBES • Plaie vive (1cm²) • Souris NODSCID J11 post greffe J21 post greffe •Bonne réepidermisation i Bonne prise de greffe et régénération d’un épiderme humain au bout de 21 jours post-greffe •Maintien de la greffe Integrin β1 Keratin 19 Ki67 Collagen IV Laminin 332 Perlecan Keratin 10 Involucrin Filaggrin Alexaline M. et al, Stem cell translational medecine, 2015 47 Présence de protéines de la jonction dermoépidermique Différenciation terminale Alexaline M. et al, Stem cell translational medecine, 2015 Scale bars 100µm 3.a. Voies de recherche sur les substituts épidermiques Couche basale contenant des keratinocytes souches et en prolifération 3.b. Les substituts de peau totale 48 Amélioration des milieux de culture Nom Descriptif du substitut Références Fibroblastes et kératinocytes allogéniques ensemencés dans du collagène, épiderme stratifié Kirsner RS et al 1998 Enrichissement en kératinocytes souches Apligraft (Organogenesis) Amélioration des propriétés mécaniques de la matrice Orcell (Ortec International) Fibroblastes et kératinocytes allogéniques ensemencés dans du collagène, épiderme stratifié Still J et al 2003 Permaderm (regenecin) Fibroblastes et kératinocytes autologues ensemencés dans du collagène+GAG, épiderme stratifié Boyce ST et al, 2006 Polyactive Fibroblastes et kératinocytes autologues ensemencés dans une matrice synthétique El-Ghalbzouri A et al, 2004 Laserskin and hyalograft Fibroblastes et kératinocytes autologues ensemencés dans une matrice d’acide hyaluronique Uccioli L et al, 2003 Apports d’autres types cellulaires: mélanocytes, cellules dendritiques, cellules de Langerhans, mécanorecepteur Amélioration de la prise de greffe en associant les épidermes de culture à l’injection de cellules stromales mésenchymateuses (Cf paragraphe 5) Autologous Fibroblastes et kératinocytes autologues ensemencés Plasma-Based dans une matrice de plasma coagulé Bioengineered Skin Llames et al, 2004 et 2006 8 20/01/2017 3.b. Les substituts de peau totale 3.b. Les substituts de peau totale 49 50 Patient brulé sur 90% de sa surface corporelle 73 J 337 J Substitut de peau totale: matrice de collagène/glycosaminoglycanes colonisée par des fibroblastes et kératinocytes autologues Boyce ST et al, 2002 28 J 479 J Boyce ST et al, 2006 3.b. vascularisation des substituts de peau totale 3.b. Les substituts de peau totale 51 Autogreffe Substitut de peau totale Avant greffe 5 mois 25 mois Avantages: •Autologues, •Durée de vie permanente •Diminution du nombre de prélèvement Inconvénients: •Prise de greffe un peu moins bonne •Manque de vascularisation de la greffe Klar AS et al 2014, Biomaterials Boyce ST et al, 2006 4. L’utilisation de Cellules Souches/Stromales Mesenchymateuses (CSMs)pour la réparation cutanée 3.b. Conclusions 53 SVF ensemencée dans une matrice de fibrine, puis culture des kératinocyte Implantation des substituts sur un modèle d’excision chez le rat nude 54 D’immenses progrès ont été réalisés qui permettent de traiter des malades autrefois condamnés La cicatrice obtenue n’est pas satisfaisante Mauvaise vascularisation, vascularisation absence d’annexes épidermiques et mauvaises innervation Intérêt des Cellules Souches Mésenchymateuses comme cellules « médicament »: effets antiinflammatoires derme muscle cartilage gencive moelle graisse placenta cordon thymus osseuse ombilical From Kuhn & Tuan, 2009 E t d Ectoderme neurone épithélium cutané CELLULES STROMALES MESENCHYMATEUSES CD90 CD105 Mesoderm e chondrocyte CD73 Endoderme adipocyte Autorenouvellement osteocyte muscle épithélium intestinal 9 20/01/2017 4. Les facteurs paracrines des CSMs favorisent la cicatrisation 4. Critères de définition des CSMs 55 56 Le Blanc K, 2011 (Chen et al., PLoS One 2008) Population hétérogène retrouvée dans le compartiment stromal des tissus isolement par adhérence et passages consécutifs Administration of conditioned medium (CM) from cultured MSC in Hypoxia condition Critères minimum proposés par l’International Society for Cellular Therapy (ISCT) pour définir ce type de cellules: basés sur leur capacité d’adhérence, leur potentiel de différenciation et leur profil phénotypique Forte production de cytokines dans un milieu conditionné de CSMs Hypothèses: amélioration de la cicatrisation par les cytokines produites par les CSM via le recrutement notamment de macrophages et de cellules endothéliales plutôt que grâce aux CSMs elle-mêmes. 4. L’environnement a un rôle primordial sur le profil sécrétoire des CSM 4. Mode d’action des CSMs 5 7 Adapted from Lane SW et al. Nature Biotech, 2014 4. Les CSM produisent des facteurs de croissance et des cytokines qui améliorent la cicatrisation cutanée 4. voie de recherches pour l’utilisation des CSMs dans le traitement de la brûlure thermique 60 Effet des CSM dans les différentes phases de la réparation cutané Phase inflammatoire Phase de prolifération Phase de remodelage Réduction de l’inflammation par la sécrétion de cytokines antiinflammatoire Amélioration de la néo angiogénèse et augmentation de la reépithélialisation et la fermeture de la plaie Régulation de la déposition du dépôt de collagène et atténuation de la formation de cicatrices In vitro, seul ou en combinaison avec les cellules nourricières murines pour la culture des kératinocytes (technique de Green) Adapté de Ceiqueira et al, 2016 Effet chimiotactique des CSMS sur les kératinocytes, amélioration de la stratification de l’épiderme en utilisant un faible % de CSMs (Laco F et al, 2009) Impact sur la clonogénicité P0 CFE i3T3 100% de fibroblastes 90% fibroblastes dermiques dermiques + 10% BM-MSC 10 20/01/2017 4. Voie de recherches pour l’utilisation des CSMs dans le traitement de la brûlure thermique 4. Voie de recherches pour l’utilisation des CSMs dans le traitement de la brûlure thermique 61 62 Modèle de brûlure sévère chez le rat avec une injection de CSMs en intraveineux En présence de CSMs: Accélération de la cicatrisation Diminution de cellules et cytokines inflammatoires dans la plaie Augmentation de la néovascularisation et des taux de VEGF In vivo, pour améliorer directement la cicatrisation des zones brûlées In vivo, pour améliorer directement la cicatrisation des zones brûlées Liu L et al, 2014 Modèle de brûlure du second degré chez le rat avec une injection de CSMs ou exosomes en sous-cutanée In vivo: o 4. Voie de recherches pour l’utilisation des CSMs dans le traitement de la brûlure thermique Accélération de la cicatrisation en présence d’exosome de CSM ou de CSM In vitro après un choc thermique: o Zhang B et al, 2014 Augmentation de la prolifération et inhibition de l’apoptose en présence d’exosome de CSM Effet in vitro et in vivo du à la présence de Wnt4 dans les exosomes via l’activation de la voie AKT 4. Voie de recherches pour l’utilisation des CSMs dans le traitement de la brûlure thermique 64 Zhang B et al; 2015, Stem Cells Transl Med Modèle de brûlure du second degré chez le rat avec une injection de CSMs ou exosomes en souscutanée In vivo, en association avec un substitut dermique ou un CEA pour augmenter la prise de greffe Modèle de plaie vive chez le rat et évaluation de l’injection locale de CSMs sur la prise d’une matrice dermique Neovascularisation ADM: Matrice dermique acellulaire TPN: thérapie par pression négative In vitro et In vivo: o In vivo, pour améliorer directement la cicatrisation des zones brûlées Accélération de l’angiogenése en présence d’exosome de CSM o Activation induite par les exosomes de la b-catenin via la voie Wnt dans les cellules endothéliales Augmentation de la vascularisation et de la prise de greffe en présence des CSM Sahin I et al, 2014 4. Effet des CSMs in vivo pour l’amélioration de la prise de greffe des feuillets épidermiques ADM TPN ADM + MSCs ADM + MSCs + TPN 4. Nouvelles approches de thérapie cellulaire 66 Brûlure 4x4 cm 1) Avulsion des tissus brûlés et 2) greffe de la peau humaine cryoconservéé 6 jours 1) Abrasion de ll’épiderme épiderme 2) greffe du substitut épidermique 3 semaines Analyse de la cicatrisation 4 semaines Production in vitro des substituts épidermiques Injection en sous cutanée de CSM humaine Peu de solutions efficaces pour le traitement des brûlures cutanées radio-induites. Nouvelles approches: utilisation des CSMs 11 20/01/2017 Résultats précliniques (souris) 4. Etude préclinique de radiation cutanée chez la souris NOD/SCID 67 30 Gy 30 Gy + MSC OU Mesure de la taille de la plaie + 24h PI hMSC injection veine de la queue • L’irradiation totale augmente la prise de greffe des CSM • Les CSM sont retrouvées préférentiellement dans les zones ayant reçu les plus fortes doses d’irradiation (Francois S et al, Annals Hemat., 2007) 4. Etudes précliniques chez le minipig 4. Etudes précliniques chez le minipig 69 70 (Forcheron F et al, 2012) PBS treated group Contrôle de l’inflammation systémique Diminution in situ de cytokines inflammatoires et du recrutement de macrophages Diminution de la fibrose ASC grafted group ASC favorisent la cicatrisation après une irradiation locale: • Greffe des ASCs dans la plaie irradiée • Reepithélilisation et stimulation de la vascularisation cutanée • Infiltration lymphocytaire dans le derme Linard C et al, et al 2013 4. Production de grade clinique de CSMs autologues 71 Evaluation de l’administration répétée de CSMs sur un modèle d’irradiation du rectum chez le minipigs: minipigs 4. Traitement compassionnel des brûlures cutanées radio-induites 72 Culture en système clos en salle blanche 1) Prélèvement de moelle osseuse Injection de CSMs combinée à une autogreffe de peau et de muscle 3) CSMs de grade clinique 2) Amplification et production de CSMs Unité de théparie cellulaire (CTSA- Hopital Percy) 5) Administration locale de CSMs 20 jours PI Brûlure par irradiation accidentelle (Equateur, 2009) 4) Contrôle qualité (Stérilité, Phénotype, CFU-F, Numération, caryotype) 12 20/01/2017 4. Traitement compassionnel des brûlures cutanées radio-induites 73 4. Succès clinique sur plus d’une dizaine de patients 74 Pas d’inflammation 80 jours j PI 80 jours PI 300 joursPI Effet anti-inflamatoire et antalgique Voie d’amélioration: -Utilisation de milieu conditionné ou de microvésicules - Combinaison des CMS à d’autres types cellulaires (ex: cellules endothéliales) - Utilisation de source de CSM alternatives comme le tissue adipeux ou les tissus périnataux 5. Nouvelles technologies : Bioprinting 4. Points critiques 75 Sécurité: Remplacer le Sérum de Veau Fœtal Système clos de culture Qualité des Cellules: Evaluation in vitro de l’efficacité des cellules Variabilité inter-donneur Absence de marqueurs de tumorigénicité Amélioration des doses, du timing de l’administration, une ou plusieurs injections? Utilisation de CSMs Autologues vs allogéniques Seol YJ et al, European J Journal l off CardioC di Thoracic Surgery 2014 Utilisation de CSMs fraiches vs décongelées (pourrait permettre de réagir plus vite et plus facilement en cas d’un nombre important de patients) 5. Peau reconstruite par bioprinting 5. Peau reconstruite par bioprinting a) Fibroblastes humains b) Plasma humain c) CaCl2 d) Keratinocytes humains Lee V et al, Tissue Eng Part C 2014 Cubo N. et al, 2016 • Possibilité de fabriquer 100 cm² en 35 min • Peau imprimé similaire in vitro à une méthode manuel • Bonne régénération d’un épiderme sain in vivo 13 20/01/2017 5. Bioprinting in situ Les équipes et collaborations 80 Skardal A et al, Stem cells Trans Med 2012 TCRT IRBA Réparation cutanée: Unité de thérapies cellulaire / CSM M. Alexaline, C. Thépenier, M. Nivet, M. Trouillas, Pr. Lataillade M. Nivet, Boutin L., Tissedre F, Pr Lataillade Hôpital Percy Modèle de plaie chez la souris nude Evaluation de la cicatrisation après bioprinting En présence de CSMs issue de fluide amniotique: Accélération de la fermeture de la plaie et la reepithelialization et augmentation de la vascularisation Centre de traitement des Brûlés Pr. Bargues, Dr. Leclerc… Département de chirurgie plastique Pr. Bey, Pr. Duhamel… Département d’anatomie pathologique Pr. Saint-Blancard… Celogos Dr. A. Ullman CEA EEvry CEA, M. Martin, N. Fortunel ISTEM, Evry Equipe C. Baldeschi, G. Lemaitre Hopital Paul Bousse /INSERM U972 G. Uzan, I. Casal(Animalerie) THÉRAPIE CELLULAIRE DES BRÛLURES CUTANÉES Institut de Recherche Biomédicale des Armées (IRBA) Unité de Thérapie Tissulaire de Traumatologie de guerre (UT3G) Antenne Centre de Transfusion Sanguine des Armées 1 rue du lieutenant Raoul Batany BP 410 92141 CLAMART cedex 14/12/2016 Marina Trouillas, PhD, [email protected], 01.41.46.72.09 14
