Régulation - Site Maintenance in progress

Régulation
Nécessité et mécanismes
FLUX:
L’organisme se procure
quelques composés, en
synthétise la majorité… La
vitesse d’approvisionnement
(FLUX à travers la voie
métabolique) doit répondre à
ses besoins.
Pour y arriver, il va
CONTROLER L’ACTIVITE
des enzymes, et REGULER
LA CONCENTRATION des
métabolites intermédiaires.
Contrôle de l’activité enzymatique:
• Quantité: synthèse et dégradation
• Activité:
– Régulation covalente
– Régulation non covalente
Synthèse/dégradation
d[E]
d (t )
 k ' s k 'd [ E ]
d[E]
k 's k 'd [ E ]
 d (t )
ln( k ' s  k ' d [ E ])   k ' d t  c
En t  0, [ E ]  [ E 0 ]
ln( k ' s  k ' d [ E 0 ])   c
ln( k ' s  k ' d [ E ])   k ' d t  ln( k ' s  k ' d [ E 0 ])
k 's k 'd [ E ]
k ' s k ' d [ E0 ]
 e  k 'd t
Synthèse-dégradation: cinétique
 k 's
 k ' t


 1 e d

[ E 0 ] k ' d [ E 0 ]  k ' d [ E 0 ]

Augmentation de l’activité enzymatique
[E]
k 's
Tryptophane 2-3,
dioxygénase (t1/2 2.5h)
Pyruvate kinase (t1/2 24h)
Ornithine décarboxylase (t1/2 0.3h)
2.5
5
7.5
10
Temps (heures)
Demi vies dans le foie de rat:
Enzyme
t1/2
Ornithine décarboxylase
20 min
5-aminolevulinate synthase
(mitochindriale)
1.2h
RNA polymérase I
1.3 h
Tyrosine aminotransférase
1.5 h
Tryptophane 2,3
dioxygénase
(extrait de: Fundamentals of
Enzymology (3rded)
N.C. Price et L. Stevens
Oxford University Press)
Glucose-6-P déshydrogénase
24.0 h= 1.0 j
glucokinase
1.3 j
catalase
1.4 j
Acétyl co-A carboxylase
2.1 j
2.0 h
GAP déshydrogénase
3.1 j
Thymidine kinase
2.6 h
Pyruvate kinase
3.5 j
HMG Co-A réductase
4.0 h
Arginase
4.5 j
Sérine déshydratase
5.2 h
Fructose bisphosphate aldolase
4.9 j
PEP carboxykinase
8.0 h
Déhydro-orotase
12.0 h
Lactate déshydrogénase
6.0 j
RNA polymérase II
13.0 h
6-PFK
7.0 j
Mitochondrie
t1/2
(jours)
Membranes
microsomales
7.7
Cytochrome b5 (out)
0.4
Malate déshydrogénase 2.6
Cytochrome b5
reductase (out)
5.8
Glutamate
déshydrogénase
1;0
NADPH-cytochrome
reductase (out)
2.9
Carnitine acétyl
transférase
1.8
NDPase (in)
1.3
Ornithine amino
transférase
1.9
Carboxylestérase (in)
4.0
HMG CoA réductase
0.2
Amine oxidase
2.8
NAD+ nucléotidase
18.0
Cytochrome c oxidase
>8.0
Pyruvate
déshydrogénase
4.5 à
5.6
Carbamoyl Phosphate
synthétase
t1/2
(heures)
Recyclage individuel des
protéines!
Contrôle de la synthèse et de la
dégradation:
•
•
•
•
Transcription
Stabilité de l’ARNm (séquences « UA riche », etc)
Traduction
Dégradation de la protéine (séquences « PEST »,
ubiquitinylation, SUMOylation, mais aussi
protéolyse régulée de la HMG CoA réductase,
« down-regulation » des récepteurs, etc.)
Souvent: régulation coordonnée de toute la voie
Prokaryotes: opérons ( lac)
Fatty acid synthase
Eucaryotes: activité
multi enzymatique,
homologie promoteurs
Régulation covalente: autres
• Phosphorylation: Ser/Thr
– (glycogène phosphorylase, glycogène synthase, Ac
CoA carboxylase, F2,6 bis phosphatase/PFK2,
GPCRs, etc, etc)
• Phosphorylation: Tyr
– (voie de signalisation de l’insuline, de facteurs de
croissance)
• ADP-ribosylation
– (protéines G, glutamine synthétase, RNA polymérase, etc)
• Adenylylation, uridylylation, etc
– (glutamine synthétase E Coli, etc)
Régulation non covalente:
– Concentration adéquate de substrat, de cofacteur
– Accumulation du produit
– Inhibiteurs/activateurs allostériques
– Protéines inhibitrices (BPTI / trypsine,
protéine nucléaire / glycogène synthase,
glycogène phosphorylase a / glycogène synthase
phosphatase, etc)
Enzymes allostériques et enzymes
coopératives
• Enzymes allostériques:
– Enzymes régulées par des composés ne ressemblant ni au
substrat, ni au produit de la réaction
Exemples: inhibition de la phosphofructokinase par l’ATP, …
• Enzymes coopératives:
– Enzymes multimériques, cinétique de forme « sigmoïde »
{ v = fct( [S]n) }
Remarque: PAS SYNONYMES!
Même si la majorité des enzymes coopératives sont
également allostériques, et si beaucoup d’enzymes
allostériques sont également coopératives vis-à-vis d’au
moins un substrat.
Enzyme coopérative, ou “de type K”:
l’aspartate transcarbamoylase
Aspartate transcarbamoylase bactérienne:
enzyme coopérative et allostérique
ZOOM:
1
1
Controle
VITESSE
VITESSE
+ATP
0.5
+CTP
+ATP
0.5
Controle
+CTP
0
0
20
[SUBST RAT ] (mM)
40
0
0
5
[SUBST RAT ] (mM)
Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP;
Inhibé lorsque les purines sont disponibles;
activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles
10
Courbe sigmoïde: pourquoi?
1
v
i
t
e
s
s
e
1
v
i
t
e
s
s
e
R
R
0.5
T
0.5
0
T
0
0
2
4
6
Conformation R
Conformation T
Enzyme allostérique (2sites)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
[S]
8
10
[S]
L’enzyme coopérative existe en 2
conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine;
les courbes v et T sont confondues à très petit [S].
Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la
vitesse se rapproche de la courbe R
Monod, Jacob et Changeux:
R
T
S
S
S
S
Deux conformations préexistantes,
changement coordonné.
Chaque ligand (substrat, activateur,
inhibiteur) favorise une des deux conf.
S 
Si  
KR
c 
S 
KT
S
S
S
S
L
Y 
Tn 
 Rn 
(1   ) n 1  L (1  c ) n 1
(1   ) n  L (1  c ) n
Koshland, Néméthy et Filmer:
S
S
S
Deux conformations
possibles pour chaque sous
unité, chaque ligand peut
induire une des deux
conformations.
S
S
S
Les ligands n’affectent
que la sous unité qu’ils
occupent
La réalité: un mélange de ces deux modèles?
Monod-Wyman-Changeux
Koshland-Néméthy-Filmer
R4
R3T
R2T2
R2T2
RT3
T4
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Régulation d’une enzyme coopérative
par des régulateurs allostériques:
1
Activateur,
stabilisant R
0.5
Inhibiteur stabilisant T
0
0
2
4
6
Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100)
Enzyme allostérique activé (T/R = 10)
Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000)
8
10
Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparemment
pas grande différence au niveau des vitesses?
1
0.5
0
0
2
4
6
Enzyme "Michaelienne"
Enzyme allos térique (2 s ites )
8
10
Mais…pas du tout le même effet sur le
« Flux » à travers la voie métabolique:
{ Orifice étroit à la base,
s’élargit,
puis redevient très étroit }
{ orifice large à la base,
devient de plus en plus étroit }
Pourquoi? Zoom sur les petites
concentrations de Substrat:
0.3
Enzyme Michaelienne:
v varie moins que S
 Flux augmente,
mais moins que [S]
vitesse
0.2
0.1
0
0
0.1
0.2
[Substrat]
Enzyme "Michaelienne"
Enzyme allostérique (2 sites )
0.3
Enzyme coopérative
0.3
 Flux augmente,
plus que [S]
0.2
vitesse
Enzyme coopérative:
v varie plus que S
0.1
0
0
0.1
0.2
[Substrat]
Enzyme "Michaelienne"
Enzyme allostérique (2 sites )
0.3
Régulation d’une enzyme
coopérative et allostérique:
Inhibiteur, stabilisant la conformation « T »,
Activateur, stabilisant la conformation « R »
Régulation de voies
métaboliques:
Coordonnée, à plusieurs niveaux.
Pourquoi?
Régulation de la glycolyse et du cycle de Krebs:
Glucose
Synthèse et de la
dégradation du glycogène:
AMPc
Glucose P
Glycogène
Synthèse et de la
dégradation du glycogène :
glucose
(Glycogène +Pi)
 Glucose-P
UDP-glucose
 glycogène
Questions:
On observe en règle générale plusieurs
mécanismes de contrôle dans une voie
métabolique.
• Comment identifier l’enzyme qui contrôle
effectivement la voie?
• A quoi servent les autres contrôles?
• Pourquoi une telle multiplication des contrôles?
• Lorsqu’une même voie conduit à plusieurs
produits, comment l’organisme s’arrange-t-il
pour avoir en permanence une synthèse
adéquate de tous les produits?
• Une vitesse de réaction « Michaelienne » passe
de 10% à 90% du maximum lorsque la [S] passe
de 0.1 à 10 KM («la réponse se développe sur 2
logarithmes »).
– Comment obtenir une réponse « oui/non » (division
cellulaire, apoptose, …)
– au contraire, une réponse graduelle sur 7 à 8
logarithmes (vision)?
Flux, contrôle et régulation?
Le problème: comprendre comment
l’organisme s’arrange pour obtenir ce dont
il a besoin sans gaspillage:
Il doit pouvoir contrôler le Flux à travers
chaque voie de synthèse ou de
dégradation, tout en régulant la
concentration des métabolites
intermédiaires…
Flux, contrôle et régulation:
• « Flux » : vitesse de production (et d’utilisation) des différents
métabolites dont l’organisme a besoin.
(Par analogie: ventes et réapprovisionnement d’un supermarché)
• « Contrôle » : capacité du système à obtenir un flux adéquat
pour répondre à la demande.
(Par analogie: bouton de réglage de la température d’un frigo.)
• « Régulation » : capacité de l’organisme à maintenir la
concentration des métabolites intermédiaires à un niveau plus ou
moins constant.
(Par analogie: capacité du frigo à maintenir une température constante,
proche de la température demandée, quelque soit le nombre d’ouvertures
de la porte et la température demandée.)
Enzyme « rate limiting »???
Quelle est l’enzyme qui contrôle
la vitesse de la cascade de
réaction:
•La plus lente?
•La moins concentrée?
•Le lièvre, ou les tortues???
Quelle étape devrait on contrôler?
• A l’état stationnaire, toutes les réactions se
produisent à la même vitesse: c’est ce qu’on
appelle le « Flux » à travers la voie métabolique.
• Traditionnellement, on suppose que l’étape qui
contrôle le flux devrait être une réaction
irréversible, particulièrement lente.
• Mais: crédible?
Le « rate limiting step »: légende ou réalité?
A  B  C  D  E…
Supposons:
• Réaction B  C (par exemple) particulièrement lente
• A et B ↑, et C ↓
• Si C ↓  vitesse réaction C  D ralentie (loi d’action
des masses),
• Si A et B ↑ vitesse de transformation BC accélérée,
jusqu’à atteindre une vitesse équivalente à C  D
Rappel: comment visualiser le flux?
Diminution d’une activité
enzymatique  accumulation
des métabolites en amont,
déplétion des métabolites en
aval de.
Dangereux, voire même
toxique?
Risque d’emballement
d’autres voies?
Rappel: forme de « l’écluse » qui
relie les canaux ?
Vmax/KM ou KS
Cascade de réactions irréversibles:
Repas
Apport dans le premier
bassin ↑,
 niveau ( [S1] ) ↑
 vitesse ↑,
 le niveau ([S2]) ↑,
etc.
Difficulté : ↑ du flux
suffisante, sans (trop)
↑ [métabolites
intermédiaires]!
Glycémie (veine porte)
GLUT 4 /
Glucokinase/
phosphoglucomutase
Glucose 1P
UDP-glucose
pyrophosphorylase
UDP-Glucose
glycogène synthase
Rôle de la régulation:
• Régulation nécessaire pour maintenir
[métabolites] ≈ , quelle que soit la demande (par
exemple: régulation de la glycémie lors de
l’effort et du repos)
• Nécessité de contrôler le flux (vitesse de
production).
• Pour contrôler la vitesse de chaque réaction :
modifier KM, Vmax , [enzymes], proportion
d’enzyme en conformation active, etc…
Outils:
Effet d’une augmentation / diminution de la
quantité d ’enzyme ou de son activité (Vmax)?
vitesse
[S]
Effet d’une diminution de KM?
vitesse
[S]
Enzyme coopérative:
Ressemble à un tuyau: le
« bas » de l’écluse s’évase.
Idéal pour conserver une
concentration stable de
substrat !
Inhibition d’une enzyme coopérative et
allostérique (composé favorisant la conformation T)
Inhibiteur favorise T
Activateur favorise R
inhibition / activation
surtout aux faibles [S]
« Metabolic Control Analysis »:
Formalisme mathématique,
permet la description quantitative du
contrôle du flux à travers une voie
métabolique, et de sa régulation par les
différents mécanismes qui ont étés
identifiés par les biochimistes.
Intérêt:
• Permet de valider les « impressions » qualitatives sur
l’importance des différents mécanismes de contrôle
observés
• Permet (en théorie) de contrôler qu’on a bien identifié
tous les mécanismes de régulation, et d’en évaluer
l’importance relative
• Explique pourquoi on observe en général des
changements « coordonnés » de la concentration de
tous les enzymes impliqués dans une voie métabolique
Dans le but de quantifier l’effet de chaque mode de
régulation, Kacser et Burns puis Heinrich et
Rapoport ont défini trois fonctions:
• Elasticité, εsv : mesure la variation de la vitesse de
chaque réaction prise séparément.
• Coefficients de contrôle du flux, CEJ : mesure la
variation du flux (càd. à travers l’ensemble de la voie)
lorsque E change.
• Coefficients de contrôle de métabolite, CEM : mesure la
variation de chaque [métabolite] (à l’état stationnaire)
lorsque Ej change.
Élasticité:
De quel pourcentage varie la vitesse lorsque la concentration
de substrat augmente? se traduit en termes mathématiques par:
 SF 
 (v )
 ([ S ]
v
[S ]

 (v ) [ S ]
?
 ([ S ]) v
 SF
S F
F S
?
avec
F
  N 
  
D   D  

S 
N  S 




D  N S ND S 

S 



N D
D2 
 N S D S 

 S



 N
D 
N
D
Réaction à l ' équilibre :
S  E  ES / EP  E  P
K SS [ S ]  K SP [ P ]
v
1  [ S ] S  [ P] P  [ I ] I
Ki
KM
KM
alors


K SS

   [S ] S
  K S [ S ]  K SP [ P ] 


v
S


1

K SP [ S ] 
K MS

  [S ]
1 P
  [S ]
[I ]  
[ P]
K S [ S ]  1 
I 
P 
S 
K
K
K
i
M
M



1
Mesure le déséquilibre
substrats / produits
 
v
S
K eq


K eq   1      

1
1 

K eq

1    
Fraction de E occupé par S
Elasticité: % de variation de la vitesse par % d’augmentation de [M]:
 v 
 
1

 v   v 

S
 S 
1 
1  
 
K eq
 S 
propriété « locale » de l’enzyme 
- mesure in vitro
- peu d’infos sur le flux (voie
métabolique)
Habituellement: ε >0 si métabolite = substrat, ε <0 si le métabolite =
produit de la réaction.
│ ε │ ↑ lorsque l’équilibre produit/substrat est presque atteint (Γ/K
≈1): le flux à travers l’enzyme est très faible (la réaction est en
fait aussi rapide dans les deux directions).
ε ↓ lorsque occupation par le métabolite élevée: lorsque l’enzyme
est déjà saturé, augmenter la concentration du métabolite n’a pas
d’effet…
De même, on peut définir
 Pv

  K eq
1   K eq


1  
(normalement négative, sauf si activation
par produit ; augmente en valeur absolue près de l' équilibre)
 Ev  
0 si E ne catalyse pas la réaction
1 si E catalyse la réaction
 Iv  

1  
(toujours négative pour les inhibiteur s
non réactifs)
Elasticités des enzymes « Michaeliennes »
catalysant des réactions irréversibles:
• Si réaction irréversible, si
[S]/KM est très petit: vitesse
de la réaction ↑ avec [S]:
Elasticité d'une réaction
Michaelienne irréversible:
1.2
ε ≈ 1.
1
 Elasticité maximale ( ≈ 1)
en [S]/KM petit,  0 en
[S]/KM grand…
0.8
Elasticité
• [S] saturant: v ≈ Vmax, donc
(en valeur relative), d(v)/v
tend vers 0.
0.6
0.4
0.2
0
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
101
[S]
Elasticités des enzymes « Michaeliennes »
catalysant des réactions réversibles:
Elasticité d'une réaction
Michaelienne réversible:
• Réaction réversible: vitesse
résiduelle (v(SP) - v(PS)) ≈0.
Equilibre
20
10
Elasticité
Près de l’équilibre :
faible modification de [S] ou
[P]  forte modification de la
vitesse résiduelle :
30
0
1
-10
en valeur absolue,
-20
│ε │ ∞ en v  0.
-30
11
21
31
41
51
61
71
81
91
101
[S]
Cœfficients de contrôle:
C EJ i 
J
E i
J
mesure la capacité de l' enzyme catalysant
Ei
la réaction " i" à controler le flux " J" ;
 [S j ]
Sj
C Ei

[S j ]
E i
mesure la capacité de l' enzyme catalysant
Ei
la réaction " i" à contrôler la concentration du substrat S j ;
Beaucoup plus difficiles à évaluer mathématiquement que les élasticités:
chaque cœfficient de contrôle dépend des autres enzymes!
Signification:
• Les cœfficients de contrôle de flux : effet de ↑ [enzyme]
sur le « flux », à l’état stationnaire, à travers la voie
métabolique dans son ensemble;
• Les cœfficients de contrôle de concentration effet de ↑
[enzyme] sur la [métabolites], à l’état stationnaire,
lorsque la voie enzymatique complète est considérée;
• Les élasticités mesurent l’effet de chaque métabolite sur
la vitesse de chaque réaction enzymatique (régulations
allostériques, rapport [S]/KM, etc)
Évaluation des cœfficients de
contrôle?
• Mathématique:
– Relations entre élasticités et cœfficients de contrôle…
• Expérimentale:
– Ajoute d’une enzyme? (système acellulaire)
– Augmentation / diminution d’expression d’une enzyme (mutation
du promoteur, transfection stable ou transitoire, siRNA, cellules
polynuclées, etc.)?
– Augmentation / diminution d’activité d’une enzyme: effet
d’inhibiteurs? D’activateurs? De mutations?
– « Top down » analysis: analyse de groupes de réaction
Expérimentalement:
Hexokinase
Glycolyze:
ajoute
d’enzyme
PFKase
Respiration mito.
Respiration
mitochondriale:
inhibiteur
Compl.I
V
Hétérokaryons:
Neurospora (synthèse Arg)
J
CE
Remarque: le contrôle du flux (pente de la tangente à
la courbe) diminue lorsque la [Enzyme] augmente!
Approche « top down »:
Diviser la voie en un nombre limité de « blocs » et en étudier le contrôle:
Glucose


Glucose

Glucose
0.15 0.30




  

0.15-0.30
NADH

0.85 0.70




0.29
0.00 0.14
  H 

0.22
 
 ( fuite)
 0.49
  ( ATP )
NADH   
   H 
0.22
 
 ( fuite)
 0.49
  ( ATP )
Mathématique:
Nombre d’inconnues?
E3
En
E1
E2
E4
A 
 S1 
 S 2 
 S 3 
 S 4  ... S ( n 1) 
 P
« n » enzymes et « (n-1) » métabolites intermédiaires, donc:
J
– « n » coéfficients de contrôle de Flux C E
i
(1 par enzyme Ei)
– « n (n-1) » coéfficients de contrôle de [Sj] par Ei, C S j
E
i
(1 par enzyme et par métabolite),
Soit: n + n (n-1) = (n + n2 – n) = n2 inconnues
Il faut donc trouver (n)2 équations
pour déterminer les n2 coéfficients
de contrôle inconnus à partir des
élasticités, « connues »…
Théorème des sommes
Théorèmes de connectivité
1. Théorèmes des sommes:
Supposons
1.
que nous augmentons « un tout petit peu » la concentration de tous les
enzymes de la voie,
2.
que la vitesse de chaque réaction est proportionnelle à la concentration de
l’enzyme qui la catalyse.
L’effet total sur le flux va correspondre à la somme des effets de chacune des
augmentations sur le flux:
d(J ) 
 (J )
 ( E1)
d ( E1) 
 (J )
 ( E 2)
d ( E 2) 
 (J )
 ( E 3)
d ( E 3)  ....
d(J ) 
 (J )
 ( E1)
d ( E1) 
 (J )
 ( E 2)
 (J )
d ( E 2) 
 ( E 3)
d ( E 3)  ....
Diviser les deux termes par J; multiplier chaque terme
à droite par " E i / E i ".
On obtient
d(J )
J
d(J )
J

 ( J ) / J d ( E 1)
 ( E 1) / E 1 E 1
 C EJ1
d ( E 1)
E1
 C EJ 2

 (J ) / J
d ( E 2)
 ( E 2) / E 2
E2
d ( E 2)
E2
 C EJ 3
d ( E 3)
E3

 ( J ) / J d ( E 3)
 ( E 3) / E 3 E 3
 ...
 ...
Supposons que toutes les concentrations d’enzymes augmentent
du même facteur d(E)/E = α. Cela revient au même que de changer
d’échelle de temps : le flux (nombre de moles formées par unité de
temps) va augmenter d’un facteur d(J)/J = α.
d(J )
 C EJ1
d ( E 1)
J
E1
devient donc :
 C EJ 2
d ( E 2)
E2
 C EJ 3
d ( E 3)
 ...
E3
  C EJ1   C EJ 2   C EJ 3   ...
1  C EJ1  C EJ 2  C EJ 3  ...
 i C EJ i
1
Le contrôle du flux est
« partagé » par tous les enzymes
qui constituent la voie
métabolique.
Conséquences:
• On ne peut que très rarement
identifier « UNE » enzyme
limitante, en règle générale le
contrôle est partagé;
• Lorsqu’on augmente l’activité
d’une des enzymes limitantes,
son coéfficient de contrôle
diminue;
• Pour augmenter la production
d’un composé intéressant, il
faudra augmenter la
concentration de toutes les
enzymes de la voie!
Lactate 
glucose:
Coéff. contrôle flux
Basale
+ glucagon
Transport
pyruvate
0.00
0.01
Pyruvate
carboxylase
0.51
0.83
Transport
OAA
0.02
0.04
PEP-CK
(induite)
0.05
0.08
Pyr Kinase
(« fuite »)
-0.17
0.00
Enolase +
PGK
0.29
0.00
TIM+FbPase
0.27
0.03
PGI+G6Pase
0.02
0.00
On peut faire le même raisonnement pour les coéfficients de
contrôle de concentration:
A l’état stationnaire, changer d’échelle de temps n’affecte
pas les concentrations des différents métabolites (niveau
dans les bassins intermédiaires), donc
 i C ESji  0
Conclusion: si on augmente la concentration de TOUS les
enzymes d’une voie métabolique, la concentration des
métabolites intermédiaires ne variera pas.
 « Méthode Universelle » de Kacser…
Augmentation de la synthèse du Trp?
Gène surexprimé
<Augmentation>
Augmentation
TRP2 TRP4 TRP1 TRP3 TRP5
de [E]
du flux, J
1
58
35
34
30
19
23
1.0
2.0
2.4
1.2
2.1
8.2
8.8
+
µ
µ
+
µ
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
µ : surexpression d’un allèle muté, résistant à la rétroinhibition par le Trp
Niederberger et al., Biochem. J. 287:473-9, 1992
2. Théorèmes de connectivité:
Imaginons qu’on modifie simultanément la concentration d’une
enzyme quelconque « Ei » ET celle du substrat « Sj », de telle
façon que la vitesse de la réaction catalysée par Ei ne change
pas:
d ( vi )

d ( Ei )
vi
Ei
d ( Ei )
 Svij
Ei

  Svij
d (S j )
Sj
d (S j )
Sj
Si la vitesse de chaque réaction ne
change pas, le flux ne change pas:
0
d(J )

J
C EJ1
d ( E1 )

E1
C EJ 2
d ( E2 )

E2
C EJ 3
d ( E3 )
 ...  0
E3
devient :
d(J )

J

C EJ1  Sv1j
d (S j )
 C EJ1  Sv1j
d (S j )
Sj

Sj
Comme

C EJ 2  Sv2j
d(S j )
Sj
0:
C EJ 2  Sv2j
d (S j )
Sj
d (S j )

Sj

C EJ 3  Sv3j
C EJ 3  Sv3j
d (S j )
d (S j )
 ...  0
Sj
J vi
C
i Ei  S j  0
Sj
 ...  0
La concentration du substrat « j » a changé: donc
d (S j )
Sj
S
 C E1j
d ( E1 )
E1
S
 C E 2j
d ( E2 )
E2
S
 C E3j
d ( E3 )
 ...
E3
devient :
d (S j )
Sj
donc

S j v1
 C E1  S j
d (S j )
Sj
vi
j
C

i Ei S j  1
S

S j v2
C E2  S j
d (S j )
Sj

S j v3
C E3  S j
d (S j )
Sj
 ...
La concentration des autres substrats n’ a pas changé:
d ( Sk )
0
Sk
C ES1k
d ( E1 )
E1

C ES 2k
d ( E2 )

E2
C ES3k
d ( E3 )
 ...
E3
devient :
d ( Sk )
Sk
donc

 C ES1k  Sv1j
d (S j )
Sj
S k vi
C
i Ei  S j  0

C ES 2k  Sv2j
d (S j )
si k  j
Sj

C ES3k  Sv3j
d (S j )
Sj
 ...
Au total = n2 équations?
•
1 somme de coéfficients de contrôle du flux par Ei:
J
C
 Ei  1
i
• (n-1) sommes de coéfficients de contrôle des substrats par Ei (1 par
j
métabolite):  C E  0
i
S
i
•
(n-1) équations de connectivité entre le contrôle du flux par chaque enzyme et
l’élasticité de chaque vitesse en réponse aux (n-1) métabolites;
J vi
C
 Ei  S j  0
i
•
(n-1)2 équations de connectivité entre le contrôle de la concentration de
chaque (n-1) métabolite par chaque enzyme et l’élasticité de chaque vitesse
en réponse aux (n-1) métabolites:
•

i
C ESik  Svij
 1 pour k  j


0 pour k  j
Soit: 1 + (n-1) + (n-1) + (n-1)2 = 1 + 2n – 2 + (n2 -2n +1) = n2 équations
Intérêt de ces relations?
• n2 équations à n2 inconnues…
Il « suffit » d’évaluer tous les coéfficients d’élasticité in vitro, aux
conc. physiologiques de substrat, pour calculer les coéfficients de
contrôle de concentration et de flux;
• Permettent de répondre aux questions
– « quelles conditions faut-il remplir pour que l’enzyme contrôle
efficacement le flux? »
– « quelles conditions faut-il remplir pour maintenir les
concentrations des métabolites à peu près constantes? »
Quelles conditions faut-il remplir pour que
l’enzyme contrôle efficacement le flux?

J
C Ei
1
i
La somme des coéfficients de contrôle de flux = 1:
le contrôle est partagé par tous les enzymes de la voie
Cascade de réactions irréversibles:
A
Enzyme 1
Pour accélérer le
flux à travers toute
la cascade: l’idéal:
augmenter
simultanément
toutes les activités
enzymatiques!
B
Enzyme 2
C
Enzyme 3
Voie comportant deux enzymes:
Quelles conditions faut-il remplir pour que la
demande (E2) contrôle efficacement le flux?
Valeurs des coéfficients de contrôle?
Eoffre
 
 M   

4 inconnues
( CJfourniture et CJdemande,
CMfourniture et CMdemande )
donc: 4 équations?
2 équations de sommes
(ΣCJ et Σ CM) et deux
équations de connectivité
(Σ CJεM et Σ CM εM)
E demande
offre
J
J
Coffre
M
 C demande
 Mdemande  0 (1)
J
J
Coffre
 Cdemande
1
(2)
M
M
Coffre
 C demande
0
(3)
offre
M
M
Coffre
M
 C demande
 Mdemande  1 (4)
(1)
offre
J
J
Coffre
M
 C demande
 Mdemande  0
(2)
J
J
Coffre
 C demande
1

J
J

Coffre
 1  C demande
offre
J
J
dem ande
1  C dem



C

0
ande M
dem ande M
offre
J
dem ande

 0
 Moffre  C dem



ande M
M
offre
J
dem ande


 Moffre  C dem



ande M
M
J
C dem
ande 
 Moffre
 Moffre   Mdem ande
Le contrôle exclusivement par un des deux blocs
est-il possible?
J
C dem
ande 
 Moffre  Mdem ande
 Moffre
 Mdem ande  1
1
offre
dem ande
si  M
  M
De même :
J
C offre

 Moffre
1
 Mdem ande  1
 1
offre
dem ande
si  M
  M
Pour que le flux soit contrôlé « uniquement » par la demande,
il faudrait que son élasticité, |εM|, soit nulle et l’élasticité de
l’offre, « infinie »: c’est l’enzyme ou le bloc d’enzymes qui a la
plus petite élasticité qui contrôle le flux.
Pourquoi?
L’élasticité mesure l’effet de [M] sur la vitesse des 2 réactions (offre et
demande). Imaginons que l’augmentation de M inhibe énormément l’offre
(grande élasticité de l’offre):
•
Si on augmente la concentration des enzymes qui synthétisent M (offre):
dès que M augmente il va inhiber les enzymes qui le produisent: la vitesse
ne changera pas…
•
Imaginons au contraire qu’on augmente la concentration des enzymes qui
utilisent M (demande): dès que M diminue, son inhibition sur les enzymes
de synthèse sera levée, et la vitesse de production de M augmentera.
•
Le flux est donc bien contrôlé par la demande si l’élasticité de l’offre, en
valeur absolue, est très grande et l’élasticité de la demande, très petite!
Rappel: élasticités des enzymes « Michaeliennes »
catalysant des réactions irréversibles:
• L’élasticité est donc grande
pour [S]/KM petit, faible pour
[S]/KM grand…
Elasticité d'une réaction
Michaelienne irréversible:
1.2
1
0.8
Elasticité
• Si la réaction est irréversible,
la vitesse de la réaction
augmente avec la
concentration de substrat tant
que [S]/KM est petit.
Dès que le substrat devient
saturant, v≈Vmax, et (valeur
relative, d(v)/v tend vers 0.
0.6
0.4
0.2
0
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
101
[S]
Elasticités des enzymes « Michaeliennes »
catalysant des réactions réversibles:
•
Attention: le produit aura
également une très grande
élasticité (inverse) près de
l’équilibre!
Elasticité d'une réaction
Michaelienne réversible:
30
20
Equilibre
Si au contraire la réaction est
réversible, la vitesse résiduelle
s’annule à l’approche de
l’équilibre;
une faible modification de [S] ou
[P] entraînera une grande
modification de la vitesse
résiduelle;
10
Elasticité
•
0
1
-10
-20
-30
11
21
31
41
51
61
71
81
91
101
[S]
Elasticité d’enzymes coopératives:
Dans le cas d’enzymes
coopératives, la vitesse de
la réaction augmente plus
vite que [S] aux faibles [S];
l’élasticité est alors >1.
Elle diminue lorsque
l’enzyme approche de la
saturation.
offre
demande

 M 


J
Coffre
J
C dem
ande

 Mdem ande
offre
M
Pour que l’activité (la concentration) d’une enzyme contrôle
le Flux, il faudrait que son élasticité soit la plus faible
possible en valeur absolue:
• De préférence: réaction loin de l’équilibre, voire
même irréversible; enzyme saturée
• De préférence PAS: enzyme réversible près de
l’équilibre, ou enzyme coopérative!
Fonction des enzymes coopératives, allostériques
dans le contrôle des voies métaboliques?
Les enzymes coopératives ont une grande
élasticité, ce qui n’est pas idéal pour que
leur concentration puisse contrôler le flux.
(Si on augmente la [Enzyme coopérative],
[S] va chuter, et la vitesse de la réaction à
l’état stationnaire variera peu).
Conclusion: il est inutile d’augmenter la [ ]
de ces enzymes pour augmenter le flux!
Voie comportant deux enzymes:
Quelles conditions faut-il remplir pour que la
concentration des métabolites soit à peu
près constante? (homéostasie)
Dans quelles conditions la concentration du métabolite
intermédiaire (M) restera-t-elle constante?
(3)
M
M
Coffre
 C demande
0
(4)
offre
M
M
Coffre
M
 C demande
 Mdemande  1
M
M
Coffre
 C demande
offre
M
M
Coffre
M
 Coffre
 Mdemande  1
M
 Moffre   Mdemande  1
Coffre
M
C offre

1
 Moffre   Mdem ande
M
C dem
ande 
1
 Moffre   Mdem ande
Coéfficient de co-réponse:
OiJ , M 
C iJ
C iM
J
C dem
ande 
M
C dem
ande 
L’idéal: coéfficient de co-réponse le plus grand
possible (variation du flux, pas du métabolite)
 Moffre
 Moffre   Mdem ande
1
 Moffre   Mdem ande
J ,M
O dem
ande 
J
C dem
ande
M
C dem
ande
offre
  M
Fonction des enzymes coopératives,
allostériques: homéostasie!
Pour que le flux soit contrôlé par la demande
(c’est-à-dire par les besoins de l’organisme), il
faut que l’élasticité de l’offre vis-à-vis des
métabolites intermédiaires soit la plus grande
possible.
D’où l’intérêt en début de voie d’enzymes
coopératives et régulées allostériquement par le
produit final de la voie!
Exemple d’enzyme coopérative : Aspartate
transcarbamoylase bactérienne
ZOOM:
1
1
Controle
VITESSE
VITESSE
+ATP
0.5
+CTP
+ATP
0.5
Controle
+CTP
0
0
20
[SUBST RAT ] (mM)
40
0
0
5
[SUBST RAT ] (mM)
10
Élasticité et contrôle du flux:
Si l’élasticité de l’offre est grande (réactions
réversible, enzymes allostériques,…) la voie est
contrôlée par la demande. Donc, pour
augmenter le flux, il est inutile de surexprimer
les premières enzymes de la voie (surtout pas
les enzymes allostériques).
Il vaut mieux surexprimer les derniers enzymes
d’une voie très contrôlée, pour augmenter la
demande…
Augmentation de la synthèse du Trp?
Gène surexprimé
<Augmentation>
Augmentation
TRP2 TRP4 TRP1 TRP3 TRP5
de [E]
du flux, J
1
58
35
34
30
19
23
1.0
2.0
2.4
1.2
2.1
8.2
8.8
+
µ
µ
+
µ
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
µ : surexpression d’un allèle muté, résistant à la rétroinhibition par le Trp
Niederberger et al., Biochem. J. 287:473-9, 1992
Ultrasensibilité:
• En pratique, l’élasticité d’enzymes coopératives est
rarement supérieure à 2.0  comment parvenir à
obtenir un coéfficient de covariance de 50 , 100 dans
certaines conditions?
• Comment diminuer la sensibilité de la réponse à de très
faibles signaux pour éviter les « faux départs »?
• Comment obtenir une réponse « tout ou rien »
(apoptose, division cellulaire) à un stimulus?
Trends in Biochem. Sci. 21:460-466, 1996
Zone tampon
REPONSE
« Ultrasensibilité »:
Réponse « tout
ou rien »
STIMULUS
Comment l’obtenir?
• Enzyme coopérative
• Phosphorylations multiples
• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible
concentration)
• Cycle futile kinase - phosphatase: à
certaines conditions seulement!
– inhibition de la phosphatase et activation
simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Comment l’obtenir?
• Enzyme coopérative
• Phosphorylations multiples
• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible
concentration)
• Cycle futile kinase - phosphatase: à
certaines conditions seulement!
– inhibition de la phosphatase et activation
simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Phoshorylations multiples?
• MAPK et MAPKK requièrent une double
phosphorylation pour être activées:
2
Comment l’obtenir?
• Enzyme coopérative
• Phosphorylations multiples
• Inhibiteur “stoechiométrique”
(très haute affinité, faible concentration)
• Cycle futile kinase – phosphatase
(à certaines conditions seulement!)
– inhibition de la phosphatase et activation
simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Ultrasensibilité due à un inhibiteur à très haute
affinité:
En présence d’un inhibiteur
à très haute affinité pour
l’enzyme activée: il faut
que la [Ea] dépasse la
[Inhibiteur] avant de voir
apparaître l’enzyme
active…
• Exemples: cdk,
P phosphatase I
(glycogène synthase et
phosphorylase), …
Comment l’obtenir?
• Enzyme coopérative
• Phosphorylations multiples
• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible
concentration)
• Cycle futile kinase – phosphatase
à certaines conditions seulement!
– inhibition de la phosphatase et activation
simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Imaginons 2 réactions irréversibles
indépendantes et opposées:
• Phosphatase en concentration constante (pointillés): v ÷ [S-P]
• Kinase en concentration (ou activité) variable (traits pleins): v ÷ [S]
L’intersection des deux courbes donne le % (S-P) à l’état stationnaire…
« Ultrasensibilité d’ordre zéro »?
• Si deux enzymes concurrentes catalysant des réactions
irréversibles sont toutes les deux à très bas KM ou
associées à leur substrat (donc saturées) : l’intersection
des deux courbes lorsque l’activité de l’une d’elles est
augmentée donne une courbe sigmoïde, très raide…
Comment l’obtenir?
• Enzyme coopérative
• Phosphorylations multiples
• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible
concentration)
• Cycle futile kinase – phosphatase
à certaines conditions seulement!
– inhibition de la phosphatase et activation
simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Ultrasensibilité de la réponse à
l’AMP:
adénylate kinase
2 ADP 

 ATP  AMP
K eq
 ATP  AMP 

1
2
 ADP 
 ADP 2
 AMP  
 ATP 
Amplification de la sensibilité:
AMP
AMPKK
AMP
AMPK
Cibles ~PO4
AMPK~PO4
PP2C
AMP
Cibles
Ultra- et sub-sensibilité de voies
« bifurquées »
Régulée
v total
 dir 
v dir
v total
S
Non
Régulée
 ind 
Si une des voies est saturée par S, sa
vitesse est proportionnelle à [E] mais
indépendante de celle de l’autre voie,
qui ne peut utiliser que le substrat
« résiduel »…
v ind
v total
Exemple de bifurcation : synthèse cholestérol…
« Statines »
AcAcCo-A +AcCoA
HMG-CoA
Mévalonate
IPPDMAPP
Protéines géranylées,
Protéines farnésylées,
Coenzyme Q,
Dolichol PP,
Vitamine K,
Chlorophyle,
Carotènoïdes,
terpenes
etc.
Géranyl PP
Farnésyl PP
Squalène
Cholestérol