Cinétique Enzymatique

Cinétique Enzymatique
1
BUT................................................................................................................................................. 2
2
INTRODUCTION ............................................................................................................................ 2
3
PARTIE EXPÉRIMENTALE ........................................................................................................... 4
4
MODE OPÉRATOIRE .................................................................................................................... 4
4.1
GRAPHIQUES............................................................................................................................ 6
4.1.1
4.1.2
5
Michaelis Menten .................................................................................. 6
Lineweaver Burk Plot ............................................................................ 7
CALCUL DES ERREURS EXPÉRIMENTALES............................................................................ 8
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
Papaine.doc
Page 1 sur 8
1 But
Etude de la cinétique d'un réaction catalysée par une enzyme contenue de manière
naturelle dans la papaie: la papaine
2 Introduction
Une réaction catalysée par une enzyme E suit le mécanisme réactionnel suivant pour
le substrat S :
K2
K1
S + E ⇐------------⇒ ES ------------⇒ E + P
K-1
La vitesse de formation du produit P est donnée par:
V0=dIPI = K2 • lESl
dt
(A)
L'hypothèse de l'état stationnaire pour ES conduit à dIESI = 0 et donc
dt
(B)
K1 • lEl • lSl= ( K-1 • K2) • IESI
En remplaçant B dans A :
V0 =
K1
K-1+K2
• K2 • IEI • lSl = K2 • lEI • lSI
Km
(C)
La constante de Michaelis-Menten vaut :
Km= K-1 + K2 et a pour unité : [M]
K1
Expérimentalement seule la concentration totale en enzyme peut être
Déterminée :
lEtotl=IEI + lESl
(D)
En introduisant C dans D :
l Etot l = l E l • (1+
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
K1
K-1+ K2
• ISI) = I E I • (1+ ISI )
Km
Papaine.doc
Page 2 sur 8
La fraction libre en enzyme IE I vaut donc
IE I = IEtotI •
Km
Km+ISI
(E)
La substitution de E dans C mène à l'équation:
V0 = d lPl =
K2
• l Etot l • ISI
Dt
Km+ISI
(A)
-La vitesse de formation du produit est proportionnelle à la concentration de l'enzyme
mais elle dépend de la concentration en substrat de façon plus complexe.
-Si Km<< I S I, V0= K2 • IEtotI = Vmax
La vitesse est d'ordre zéro en substrat et ne dépend plus de sa concentration. Elle
correspond à la vitesse maximale de la réaction enzymatique => Ce qui donne
l'équation de Michaelis-Menten :
V0=Vmax • I S I
Km+ISI
La représentation « Lineweaver-Burk plot »obtenue à partir de l'inverse de l'équation
précédente correspond à une linéarisation de la relation entre Km et Vmax.
1 =1/ ( Vmax • I S I ) = Km • 1 + 1
Km+ISI
Vmax ISI Vmax
V0
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
Papaine.doc
Page 3 sur 8
A propos de la papaine
C'est une protéase, une enzyme qui peut casser une liaison peptidique par
hydrolyse. Elle se trouve dans la papaye et est utilisée dans nombreuses
applications. (industrie de la bière, nettoyage des lentilles de contact)
3 Partie expérimentale
Le substrat est la Nα-benzyl-arginine-p-nitroanilide (BAPNA), une arginine
synthétique qui est une molécule plus simple qu'une protéine. Son hydrolyse va
casser sa liaison amide et générer un produit de couleur jaune intense : la pnitroaniline. Puisque le substrat et le deuxième produit sont incolores, l'évolution de
la réaction peut être étudiée grâce à l'absorption optique de la p-nitroaniline en
fonction du temps.
4 Mode opératoire
5 solutions de concentrations différentes en BAPNA sont réalisées afin de réaliser un
« Lineweaver-Burk plot ».
Ici la relation C1 • V1 = C2 • V2 est utilisée. C1 = 0.02M et V2 = 5 [ml]
Solution n° 5 [mI] (V2) de BAPNA
C2 en [M]
1
0.003
2
0.005
3
0.008
4
0.012
5
0.016
V1 en [ml] de solution mère BAPNA 0.02[M]
0.75
1.25
2
3
4
L’appareil est calibré avec un blanc contenant 2.5 [ml] de solution d’enzyme
tamponné à pH 6 qui permet de régler le zéro de l'absorbance à 400[nm]. La cuvette
suivante contient comme le blanc plus 0.5 [ml] de solution n°1 qui sont ajoutés juste
avant d'utiliser le spectromètre puisque la réaction commence dès la présence de
substrat. L'absorption à 400[nm] est suivie pendant 5 minutes. Le contenu des
éprouvettes est au préalable bien mélangé en les couvrant avec un parafilm de
manière a obtenir un mélange homogène. L'expérience est répétée pour les
solutions 2,3,4,5 ainsi que pour la solution mère de 0.02[M].
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
Papaine.doc
Page 4 sur 8
Résultats
-Le pH de la solution de l'enzyme est égal à 6.
-La température du laboratoire est de 22°C.
-Le coefficient d'extinction molaire de la p-nitroaniline à 400[nm] est trouvé égale à
Solution
n°
Conc.
Conc.
1/Conc.
BAPNA
BAPNA
BAPNA
initiale M cuvette M cuvette M-1
1
2
3
4
5
Mère
0.003
0.005
0.008
0.012
0.016
0.02
5.00E-04
8.33E-04
1.33E-03
2.00E-03
2.67E-03
3.33E-03
2000
1200
750
500
375
300
Pente
[A/min]
0.0102
0.0196
0.0314
0.0462
0.0577
0.0697
V0 [M/min]
1/V0
[min/M]
1/Conc.
BAPNA
cuvette M
1.020E-06
1.960E-06
3.140E-06
4.620E-06
5.770E-06
6.970E-06
9.804E+05
5.102E+05
3.185E+05
2.165E+05
1.733E+05
1.435E+05
2000
1200
750
500
375
300
- I BAPNA Icuvette=Vpris = 0.25 • l BAPNAIinitiale
Vtotal
exemple de calcul IBAPNAIcuvette pour la solution 1 :
IBAPNAIcuvette= 0.5[ml] • 0.003 M = 5 • 10-4 M
3[ml]
Pour chaque mesure de l'absorption en fonction du temps, la détermination de
la pente permet de trouver la vitesse initiale V0 selon :
pente dA => V0 = dA • 1 = pente
dt
dt
εI
εI
A= ε • I • c
l= 1 cm
ε= 104AM-1cm-1
exemple de calcul pour la solution 1 :
V0 = 0.0102 [Amin-1] / (104[AM-1cm-1] • 1[cm]) = 1.02 • 10-6 [M/min]
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
Papaine.doc
Page 5 sur 8
4.1
Graphiques
4.1.1 Michaelis Menten
Le graphique ci-dessous exprime la vitesse de réaction V0 en fonction de la
concentration de substrat.
Série1
Polynomial (Série1)
Cinétique de Michaelis Menten
8.00E-06
y = -0.2078x2 + 0.0029x - 3E-07
R2 = 0.9995
7.00E-06
6.00E-06
V0
5.00E-06
4.00E-06
3.00E-06
2.00E-06
1.00E-06
0.00E+00
4.00E04
9.00E04
1.40E- 1.90E- 2.40E03
03
03
[BAPNA]cuvette
2.90E03
3.40E03
On devrait observer une forme plus marquée de 2ème degré ce qui n’est pas le cas
dans ces concentrations.
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
Papaine.doc
Page 6 sur 8
L'équation du graphe ci-dessous est :
1 = Km
1
+
1
V0 Vmax IBAPNAIcuvette
Vmax
Les points qui coupent les axes permettent de trouver les constantes de
Michaelis-Menten :
4.1.2 Lineweaver Burk Plot
Lineweaver Burk Plot
Série1
Linéaire (Série1)
2000
y = 0.002x + 61.463
2
R = 0.9909
1/Vo
1500
1000
500
0
0.E+00
2.E+05
4.E+05
6.E+05
8.E+05
1.E+06
1.E+06
1/[BAPNA]
y = 0.002x + 61.463 =0 ⇨ x=- 30269
-1/Km = -30269 ⇨ Km = 3.3 • 10-5
1/Vmax = 61.463 ⇨ Vmax = 1.63 10-2
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
Papaine.doc
Page 7 sur 8
5
Calcul des erreurs expérimentales
L'erreur sur les concentrations dans les cuvettes provient de l'erreur commise sur la
préparation des solutions initiales qui se calcule selon
IBAPNA I initiale = Cmère • Vi
Vf
=>∆ IBAPNAI initiale = ∆ Cmère Vi + ∆ Vi Cmère + Cmère Vi (∆Vf = ∆ Vi+ ∆ Vrajouté )
Vf
Vf
Vf2
ou en sachant que Ln IBAPNAI initiale = Ln C mère + LnVi- LnVf
⇒% d' erreur = ∆ IBAPNAI initiale =∆C mère + ∆Vi + ∆ Vi +∆ Vrajouté
IBAPNAI initiale
C mère
Vi
Vf
Ces deux démarches mathématiques donnent les mêmes valeurs pour ∆ IBAPNAI
Tableau des résultats selon calcul ci-dessus :
Cinitial
Solution
n°
"+/-"
Vi
∆Vi
∆ Vrajouté
Vrajouté
%
en M
en M
1
0.003
9.80E-05
2
0.005
0.008
0.012
0.016
2.10E-04
1.28E-04
1.52E-04
3.20E-04
3
4
5
[ml]
0.75
[ml]
0.02
[ml]
0.01
[ml]
4.25
1.25
0.04
0.01
3.75
2
3
4
0.02
0.02
0.04
0.01
0.01
0.01
3
2
1
d’erreur
⇨
Conc.
BAPNA
cuvette M
1.267%
2.000%
5.00E-04
8.33E-04
1.33E-03
2.00E-03
0.00267
∆A = 9.8 * 10-5/(0.003)2 = 10.9
"+/-"
M
9.80E-05
2.10E-04
1.28E-04
1.52E-04
3.20E-04
Aguilar Augusto
Perrotti Luc
∆S
S2
∆S/S2
9.80E-05
2.10E-04
1.28E-04
1.52E-04
3.20E-04
2.50E-07
6.94E-07
1.78E-06
4.00E-06
7.11E-06
392.0
302.4
72.0
38.0
45.0
Papaine.doc
4.200%
1.600%
Calcul d’erreur sur 1/[BAPNA] :
∆A = ∆S/S2
3.267%
Page 8 sur 8