M1ParisV

IN VIVO STUDIES IN ANIMALS :
PRECLINICAL PHARMACOLOGY
An essential step between molecular and human studies for
understanding the pathophysiological mechanisms involved in human
diseases and the mechanisms of action of pharmacological agents.
DEVELOPMENT OF EXPERIMENTAL MODELS
OF CARDIAC AND RENAL DISEASES
•Post-Ischemic Heart Failure (Coronary ligation)
(Pons et al., Clin. Exp. Physiol. Pharmacol., 2003; J. Cardiovasc.
Pharmacol., 2003; Richer et al., Circulation, Abstract, 2003)
•Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury (reversible coronary oclusion)
(Richer et al., FASEB J, 2005)
•Renovascular Hypertension (clip on renal artery)
•Experimental Aldosterone-induced Cardiac Remodeling
•Insulinoprive Diabetes (Streptozotocin)
(Huang et al., PNAS, 2003)
ANIMAUX TRANSGENIQUES ET
MALADIES CARDIOVASCULAIRES
Ce sont des modèles avec une ou plusieurs modifications
ciblées d’une hormone ou d’un second messager impliqués
dans la régulation cardiovasculaire
GENETICALLY MODIFIED ANIMALS
Generation of genetically altered animals :
- Models of gene inactivation : Tissue Kallikrein, ApoE.
- Models of gene inactivation and duplication, genetic titration :
ACE, Angiotensinogen,Tissue Kallikrein.
Candidate genes : Vasoactive peptide systems, Ionic transporters.
Breeding of mutated strains :
- Importance of genetic backgrounds
(Trabold et al., Hypertension, 2OO2)
- Need of individual genotyping
- Use of control littermates
- Role of environmental factors : housing, diet.
Effets variables du traitement au L-NAME
selon les souches de rats
Survie des rats Brown Norway (BN) et
Fischer344 (F) après traitement au L-NAME.
BN
1
Survival rate (%)
Pression artérielle des deux souches
après traitement au L-NAME.
300
.8
250
.6
pression
artérielle
(mmHg)
F
.4
.2
200
150
100
50
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Time (days)
Souche Brown Norway résistante
Absence d’AVC
Souche Fischer 344 susceptible
Développement d’AVC
FT
FL
BNT
BNL
PA 15j
153
187
132
163
PA 30j
157
278
134
210
INVESTIGATED PARAMETERS
•PHYSIOLOGICAL ANALYSES
• Mortality
• Invasive or non Invasive Cardiovascular Explorations
Blood pressure (invasive and non invasive : telemetry)
Cardiac function (invasive : Millar microcatheter transducer
and non invasive : 2D Echography, Acuson Sequoia 512)
Cardiac output, Regional blood flows (fluosphere technique)
• Renal studies (metabolic cages)
• Biochemical and hormonal studies (micromethods)
• Morphological and morphometric studies
•PHARMACOLOGICAL APPROACH
• Agonists, Antagonists
• Mechanisms of Action of Pharmacological Agents
Insuffisance cardiaque
 Incapacité du cœur à adapter le débit sanguin aux besoins
métaboliques et fonctionnels des différents organes.
 Véritable problème de santé publique dont la prévalence augmente
régulièrement.
 Cause la plus fréquente : insuffisance coronarienne responsable
d’une dysfonction ventriculaire systolique.
 Mécanismes adpatatifs :
Précoces
- système adrénergique
- système rénine-angiotensine
- système kallicréine-kinines
- autres…
Retardés
- hypertrophie myocardique
- fibrose interstitielle
- dilatation des ventricules
ANGIOTENSINOGENE
Rénine
ANGIOTENSINE I (1-10)
ECA
CAGE,
Cathepsine
G, Chymase.
ANGIOTENSINE II (1-8)
Prolylcarboxypeptidase
Aminopeptidase A
ECA2
ANGIOTENSINE (1-7)
ANGIOTENSINE III (2-8)
Aminopeptidase M
ANGIOTENSINE IV (3-8)
ECA
ANGIOTENSINE (1-9)
ECA
ANGIOTENSINE (1-5)
Voies de synthèse et de dégradation de l’AII.
CAGE : chymostatin-sensitive angiotensin II generating enzyme ; ECA : enzyme de
conversion de l’angiotensine ; tPA : tissue plasminogen activator.
Méthodes (4)
Paramètres mesurés :
-
Survie
-
Hémodynamique : PAM, FC, PTDVG, débit cardiaque, débit rénal
-
Fonction cardiaque :
 FE (échocardiographie bi-dimensionnelle,
« surface-longueur » monoplan)
 dP/dtmax
-
Morphologie ventriculaire gauche :
 Taille d’infarctus
 Poids VG/poids total, poids VD/poids total
 Périmètre interne VG
 Masse VG/poids total
 Volume fin de diastole VG
-
GMPc urinaire
méthode
Analyse d’image
Echocardiographie
bi-dimensionnelle
Ejection fraction (%)
Shortening fraction (%)
Comparisons of Invasive and
non Invasive (echocardiography) Cardiac Explorations
60
50
40
30
20
10
0
r = 0.54
p < 0.05
80
60
40
20
0
3000 4000 5000 6000 7000 8000
r = 0.56
p < 0.05
25
30
35
40
45
50
Infarct size (%)
dP/dtmax (mmHg/s)
SHAM
MI
Pons et al., Clin. Exp. Physiol. Pharmacol., 2003.
300 r = 0.90
250 p < 0.001
200
150
100
50
0
4 6 8 10 12 14 16 18
LV perimeter (mm)
LV Diastolic Volume (mm3)
Correlations between Cardiac Morphological and
Echocardiographic Parameters
20
16
r = 0.75
p < 0.001
12
8
4
LV perimeter (mm)
25 30 35 40 45 50
Infarct size (%)
SHAM
MI
Irbesartan and survival in CHF in rats
P<0.01
100
P<0.001
80
%
60
40
Sham
MI-Control
20
MI-Irbesartan, 50 mg/kg/d
0
0
4
8
12
16
20
Weeks
24
28
32
36
Irbesartan and survival in CHF in rats
100
P=0.11
%
60
Sham
MI-Control
MI-Irbesartan, 5 mg/kg/d
MI-Irbesartan, 50 mg/kg/d
40
20
0
0
4
8
12
16
20
Weeks
24
28
32
36
P<0.001
P<0.05
80
1. Up-regulation of the renin - angiotensin system (RAS)
is a primary feature associated with chronic heart
failure (CHF) in animal models and in humans.
2. Angiotensin I - converting enzyme inhibitors (ACEIs)
prolong survival and prevent cardiac remodeling
in the rat model of post- ischemic
- heart failure
(Pfeffer et al., 1985).
ACEIs reduce morbidity and mortality and improve
quality of life in patients with CHF and in patients
who have had a myocardial infarction (Consensus,
Solvd, Save, Aire, Trace, etc...).
3. Angiotensin II AT 1 receptor blockers (ARBs) also
prolong survival and prevent cardiac remodeling
in the rat model of post- -ischemic heart failure.
In patients with CHF, Losartan was effective at
reducing mortality and morbidity but its efficacy
was not greater than that of Captopril (Elite II).
.
RATIONALE FOR ACEIs -ARBs
COMBINATION IN CHF
1. ACEIs alone do not completely and permanently
suppress Ang II production (reactive rise in renin,
chymase). Addition of ARBs should result in a
more complete inhibition of the RAS.
2. In hypertensi on, ACEIs and ARBs prove to be
synergistic and , the greater the RAS blockade
achieved, the greater the antihypertensive effect.
Valsartan - Benazeprilat combination in SHRs
Absolute variations in MAP
10
80
Pressor responses
to Ang I (100 ng/kg)
0
60
-20
mmHg
mmHg
-10
-30
-40
40
20
-50
-60
0
5
10
15
20
*
*
*#
0
vehicle
valsartan 1 mg/kg/d
benazeprilat 1 mg/kg/d
benazeprilat 1 mg/kg/d
+ valsartan 1 mg/kg/d
*P <0.05 vs vehicle
#
P <0.05 vs benazeprilat
Webb et al., 1998
Losartan - Enalapril combination in hypertensive patients
Absolute variations in
sitting DBP
0
L
E
Absolute variations in
active renin
L+E
*
50
40
pg/ml
mmHg
-5
*
30
NS
20
-10
10
0
-15
NS
*
*
L
E
L+E
Azizi et al., 2000
RESULTS (1) : Survival
100
43±1
43±1
0
0
4
8
12
16
20
Weeks
24
28
32
36
40
P=0.006
20
MI-E
MI-V+E
%
40
SHAM
MI-C
MI-V
IS (%)
44±1
44±1
P=0.03
60
P=0.06
80
RESULTS (2) : Cardiovascular parameters
SAP
mmHg
150
*
*
*
*
100
mmHg/s
0
*
*
20
0
15000
dP/dt
10000
*
0
*
10
50
5000
LVEDP
30
mmHg
200
*
*
*
SHAM
MI-C
MI-V
MI-E
MI-V+E
*P <0.05 vs SHAM
RESULTS (3) : Cardiac remodeling
mg/g
3
*
*
RVW/BW
1.0
2
*# *
*
*# *#
mg/g
4
HW/BW
*
0.5
1
0.0
0
5
4
%
3
2
1
0
Subendocardial collagen
*
*
* *
SHAM
MI-C
MI-V
MI-E
MI-V+E
*P <0.05 vs SHAM
#
P <0.05 vs MI-V
SUMMARY
In the rat model of post-ischemic heart failure :
- Valsartan like other ARBs, reduces mortality,
and limits cardiac remodeling
- Valsartan, Enalapril and their combination
reduced mortality at 9 months by 39, 21 and 33%,
respectively (NS),
- Valsartan, but not Enalapril and the combination,
limited the rise in LVEDP,
- Valsartan, but not Enalapril and the combination,
limited cardiac hypertrophy and fibrosis
development.
- AT1 receptor blockade and ACE inhibition
when combined do not exert synergistic effects
KININOGÈNE
BPM
KININOGÈNE
HPM
KALLICRÉINE
PLASMATIQUE
KALLICRÉINE
TISSULAIRE
Fragments
inactifs
ECA
KALLIDINE
Aminopeptidase N
(Lys-BK)
BRADYKININE
ECA
Fragments
inactifs
(BK)
Carboxypeptidases
Carboxypeptidases
Lys-des-Arg9-BK
des-Arg9-BK
ECA2
RÉCEPTEUR B1
inductible
RÉCEPTEUR B2
Constitutif
RÉCEPTEUR B1
inductible
Fragments
inactifs
Insuffisance cardiaque
Kininogènes
Angiotensinogène
Rénine
Kallicréine
Angiotensine I
ECA IEC
IEC ECA
Kinines
Angiotensine II
AT1Récepteur AT1
IP3, DAG, JAK,
FAK, PI3K, MAPK
Vasoconstriction,
Effets trophiques,
prolifératifs
Fragments
inactifs
Récepteur AT2
Récepteur B2
NO, PGI2,
EDHF
Vasodilatation,
Effets anti-trophiques,
anti-prolifératifs
Récepteur B1
Angiotensine II
- Vasoconstriction
-
Pro-arythmisante
Hypertrophie myocardique
Fibrose interstitielle
 stress oxydatif
Pro-inflammatoire
Pro-coagulante
Bradykinine
- Vasodilatation
- Anti-arythmique
- Anti-hypertrophique
- Antifibrotique
- Anti-coagulante
Le modèle d’insuffisance cardiaque post-ischémique peut être
appliqué à des souris génétiquement modifiées pour étudier :
• l’implication d’un ou plusieurs gènes dans le développement de
la maladie,
• le rôle de certains peptides dans le mécanisme d’action d’agents
pharmacogiques utilisés dans le traitement de cette maladie.
ACTIVITÉ DE LA KALLICRÉINE TISSULAIRE
Circulation coronaire chez la souris:
Oreillette droite
Oreillette gauche
10 mm
5 mm
Ligature
Michael et al., 1995;269:H2150.
Ligature
Zone non infarcie
Zone anévrismal
Fonction cardiaque
7000
80
6000
70
*
5000
*
50
4000
3000
2000
FE
60
(%)
(mmHg/s)
dP/dtmax
40
*
*
30
20
1000
10
0
0
3 mois
Sham
6 mois
IM-Témoin
12 mois
6 mois
* p<0.05 vs valeur sham correspondante
12 mois
Hypertrophie myocardique
Poids VG/Poids total
Poids VD/Poids total
6
6
*
4
†
3
5
*
*
(mg/g)
(mg/g)
5
4
3
2
2
1
1
0
0
3 mois
6 mois
12 mois
*
*
†
3 mois
6 mois
Sham
* p<0.05 vs valeur sham correspondante
IM-Témoin
† p<0.05 vs valeur 3 mois correspondante
12 mois
Dilatation ventriculaire gauche
Périmètre interne VG
GMPc urinaire
14
12
*
3.0
*
*
(nmol/µmol créat)
(mm)
10
2.5
8
6
4
1.5
1.0
2
0.5
0
0.0
3 mois
Sham
IM-Témoin
6 mois
12 mois
*
2.0
6 mois
* p<0.05 vs valeur sham correspondante
Survival
100
p<0.02
80
p<0.05
p<0.02
(%)
60
40
20
Sham-TK+/+ (n=18)
Infarct size (%)
MI-TK+/+ (n=25)
MI-TK+/+: 35±2
Sham-TK-/- (n=19)
MI-TK-/- (n=28)
MI-TK-/-: 34±2
10
20
30
40
WEEKS
50
60
70
Pons et al., Circulation, 2003,108: IV 152, Abstract
LV function
80
80
60
60
40
*
*
EF (%)
EF (%)
MI-TK-/- vs MI-TK+/+
40
20
20
0
0
42 w
Sham-TK+/+
MI-TK+/+
4w
Sham-TK-/MI-TK-/-
* p<0.05 vs corresponding Sham
12 w
42 w
Cardiac remodeling: LV hypertrophy
MI-TK-/- vs MI-TK+/+
†
*†
LVM/BW (mg/g)
6
5
*
4
3
2
LVM/BW (mg/g)
6.0
5.5
5.0
4.5
1
0
4.0
42 w
Sham-TK+/+
MI-TK+/+
4w
Sham-TK-/MI-TK-/-
12 w
* p<0.05 vs corresponding Sham
† p<0.05 vs corresponding TK+/+
42 w
Cardiac remodeling: LV dilatation
MI-TK-/- vs MI-TK+/+
†
240
200
160
*†
*
120
80
40
LV diastolic volume (mm3)
LV diastolic volume (mm3)
220
0
200
180
160
140
120
100
42 w
Sham-TK+/+
MI-TK+/+
4w
Sham-TK-/MI-TK-/-
12 w
42 w
* p<0.05 vs corresponding Sham
† p<0.05 vs corresponding TK+/+
PHENOTYPING, EXPERIMENTAL PATHOLOGY, PHARMACOLOGY
• Generation of pathogenic hypotheses,
• Establishment of causality links between genes and diseases,
• Development of therapeutic strategies
Coupling between animal and human studies