IN VIVO STUDIES IN ANIMALS : PRECLINICAL PHARMACOLOGY An essential step between molecular and human studies for understanding the pathophysiological mechanisms involved in human diseases and the mechanisms of action of pharmacological agents. DEVELOPMENT OF EXPERIMENTAL MODELS OF CARDIAC AND RENAL DISEASES •Post-Ischemic Heart Failure (Coronary ligation) (Pons et al., Clin. Exp. Physiol. Pharmacol., 2003; J. Cardiovasc. Pharmacol., 2003; Richer et al., Circulation, Abstract, 2003) •Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury (reversible coronary oclusion) (Richer et al., FASEB J, 2005) •Renovascular Hypertension (clip on renal artery) •Experimental Aldosterone-induced Cardiac Remodeling •Insulinoprive Diabetes (Streptozotocin) (Huang et al., PNAS, 2003) ANIMAUX TRANSGENIQUES ET MALADIES CARDIOVASCULAIRES Ce sont des modèles avec une ou plusieurs modifications ciblées d’une hormone ou d’un second messager impliqués dans la régulation cardiovasculaire GENETICALLY MODIFIED ANIMALS Generation of genetically altered animals : - Models of gene inactivation : Tissue Kallikrein, ApoE. - Models of gene inactivation and duplication, genetic titration : ACE, Angiotensinogen,Tissue Kallikrein. Candidate genes : Vasoactive peptide systems, Ionic transporters. Breeding of mutated strains : - Importance of genetic backgrounds (Trabold et al., Hypertension, 2OO2) - Need of individual genotyping - Use of control littermates - Role of environmental factors : housing, diet. Effets variables du traitement au L-NAME selon les souches de rats Survie des rats Brown Norway (BN) et Fischer344 (F) après traitement au L-NAME. BN 1 Survival rate (%) Pression artérielle des deux souches après traitement au L-NAME. 300 .8 250 .6 pression artérielle (mmHg) F .4 .2 200 150 100 50 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Time (days) Souche Brown Norway résistante Absence d’AVC Souche Fischer 344 susceptible Développement d’AVC FT FL BNT BNL PA 15j 153 187 132 163 PA 30j 157 278 134 210 INVESTIGATED PARAMETERS •PHYSIOLOGICAL ANALYSES • Mortality • Invasive or non Invasive Cardiovascular Explorations Blood pressure (invasive and non invasive : telemetry) Cardiac function (invasive : Millar microcatheter transducer and non invasive : 2D Echography, Acuson Sequoia 512) Cardiac output, Regional blood flows (fluosphere technique) • Renal studies (metabolic cages) • Biochemical and hormonal studies (micromethods) • Morphological and morphometric studies •PHARMACOLOGICAL APPROACH • Agonists, Antagonists • Mechanisms of Action of Pharmacological Agents Insuffisance cardiaque Incapacité du cœur à adapter le débit sanguin aux besoins métaboliques et fonctionnels des différents organes. Véritable problème de santé publique dont la prévalence augmente régulièrement. Cause la plus fréquente : insuffisance coronarienne responsable d’une dysfonction ventriculaire systolique. Mécanismes adpatatifs : Précoces - système adrénergique - système rénine-angiotensine - système kallicréine-kinines - autres… Retardés - hypertrophie myocardique - fibrose interstitielle - dilatation des ventricules ANGIOTENSINOGENE Rénine ANGIOTENSINE I (1-10) ECA CAGE, Cathepsine G, Chymase. ANGIOTENSINE II (1-8) Prolylcarboxypeptidase Aminopeptidase A ECA2 ANGIOTENSINE (1-7) ANGIOTENSINE III (2-8) Aminopeptidase M ANGIOTENSINE IV (3-8) ECA ANGIOTENSINE (1-9) ECA ANGIOTENSINE (1-5) Voies de synthèse et de dégradation de l’AII. CAGE : chymostatin-sensitive angiotensin II generating enzyme ; ECA : enzyme de conversion de l’angiotensine ; tPA : tissue plasminogen activator. Méthodes (4) Paramètres mesurés : - Survie - Hémodynamique : PAM, FC, PTDVG, débit cardiaque, débit rénal - Fonction cardiaque : FE (échocardiographie bi-dimensionnelle, « surface-longueur » monoplan) dP/dtmax - Morphologie ventriculaire gauche : Taille d’infarctus Poids VG/poids total, poids VD/poids total Périmètre interne VG Masse VG/poids total Volume fin de diastole VG - GMPc urinaire méthode Analyse d’image Echocardiographie bi-dimensionnelle Ejection fraction (%) Shortening fraction (%) Comparisons of Invasive and non Invasive (echocardiography) Cardiac Explorations 60 50 40 30 20 10 0 r = 0.54 p < 0.05 80 60 40 20 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 r = 0.56 p < 0.05 25 30 35 40 45 50 Infarct size (%) dP/dtmax (mmHg/s) SHAM MI Pons et al., Clin. Exp. Physiol. Pharmacol., 2003. 300 r = 0.90 250 p < 0.001 200 150 100 50 0 4 6 8 10 12 14 16 18 LV perimeter (mm) LV Diastolic Volume (mm3) Correlations between Cardiac Morphological and Echocardiographic Parameters 20 16 r = 0.75 p < 0.001 12 8 4 LV perimeter (mm) 25 30 35 40 45 50 Infarct size (%) SHAM MI Irbesartan and survival in CHF in rats P<0.01 100 P<0.001 80 % 60 40 Sham MI-Control 20 MI-Irbesartan, 50 mg/kg/d 0 0 4 8 12 16 20 Weeks 24 28 32 36 Irbesartan and survival in CHF in rats 100 P=0.11 % 60 Sham MI-Control MI-Irbesartan, 5 mg/kg/d MI-Irbesartan, 50 mg/kg/d 40 20 0 0 4 8 12 16 20 Weeks 24 28 32 36 P<0.001 P<0.05 80 1. Up-regulation of the renin - angiotensin system (RAS) is a primary feature associated with chronic heart failure (CHF) in animal models and in humans. 2. Angiotensin I - converting enzyme inhibitors (ACEIs) prolong survival and prevent cardiac remodeling in the rat model of post- ischemic - heart failure (Pfeffer et al., 1985). ACEIs reduce morbidity and mortality and improve quality of life in patients with CHF and in patients who have had a myocardial infarction (Consensus, Solvd, Save, Aire, Trace, etc...). 3. Angiotensin II AT 1 receptor blockers (ARBs) also prolong survival and prevent cardiac remodeling in the rat model of post- -ischemic heart failure. In patients with CHF, Losartan was effective at reducing mortality and morbidity but its efficacy was not greater than that of Captopril (Elite II). . RATIONALE FOR ACEIs -ARBs COMBINATION IN CHF 1. ACEIs alone do not completely and permanently suppress Ang II production (reactive rise in renin, chymase). Addition of ARBs should result in a more complete inhibition of the RAS. 2. In hypertensi on, ACEIs and ARBs prove to be synergistic and , the greater the RAS blockade achieved, the greater the antihypertensive effect. Valsartan - Benazeprilat combination in SHRs Absolute variations in MAP 10 80 Pressor responses to Ang I (100 ng/kg) 0 60 -20 mmHg mmHg -10 -30 -40 40 20 -50 -60 0 5 10 15 20 * * *# 0 vehicle valsartan 1 mg/kg/d benazeprilat 1 mg/kg/d benazeprilat 1 mg/kg/d + valsartan 1 mg/kg/d *P <0.05 vs vehicle # P <0.05 vs benazeprilat Webb et al., 1998 Losartan - Enalapril combination in hypertensive patients Absolute variations in sitting DBP 0 L E Absolute variations in active renin L+E * 50 40 pg/ml mmHg -5 * 30 NS 20 -10 10 0 -15 NS * * L E L+E Azizi et al., 2000 RESULTS (1) : Survival 100 43±1 43±1 0 0 4 8 12 16 20 Weeks 24 28 32 36 40 P=0.006 20 MI-E MI-V+E % 40 SHAM MI-C MI-V IS (%) 44±1 44±1 P=0.03 60 P=0.06 80 RESULTS (2) : Cardiovascular parameters SAP mmHg 150 * * * * 100 mmHg/s 0 * * 20 0 15000 dP/dt 10000 * 0 * 10 50 5000 LVEDP 30 mmHg 200 * * * SHAM MI-C MI-V MI-E MI-V+E *P <0.05 vs SHAM RESULTS (3) : Cardiac remodeling mg/g 3 * * RVW/BW 1.0 2 *# * * *# *# mg/g 4 HW/BW * 0.5 1 0.0 0 5 4 % 3 2 1 0 Subendocardial collagen * * * * SHAM MI-C MI-V MI-E MI-V+E *P <0.05 vs SHAM # P <0.05 vs MI-V SUMMARY In the rat model of post-ischemic heart failure : - Valsartan like other ARBs, reduces mortality, and limits cardiac remodeling - Valsartan, Enalapril and their combination reduced mortality at 9 months by 39, 21 and 33%, respectively (NS), - Valsartan, but not Enalapril and the combination, limited the rise in LVEDP, - Valsartan, but not Enalapril and the combination, limited cardiac hypertrophy and fibrosis development. - AT1 receptor blockade and ACE inhibition when combined do not exert synergistic effects KININOGÈNE BPM KININOGÈNE HPM KALLICRÉINE PLASMATIQUE KALLICRÉINE TISSULAIRE Fragments inactifs ECA KALLIDINE Aminopeptidase N (Lys-BK) BRADYKININE ECA Fragments inactifs (BK) Carboxypeptidases Carboxypeptidases Lys-des-Arg9-BK des-Arg9-BK ECA2 RÉCEPTEUR B1 inductible RÉCEPTEUR B2 Constitutif RÉCEPTEUR B1 inductible Fragments inactifs Insuffisance cardiaque Kininogènes Angiotensinogène Rénine Kallicréine Angiotensine I ECA IEC IEC ECA Kinines Angiotensine II AT1Récepteur AT1 IP3, DAG, JAK, FAK, PI3K, MAPK Vasoconstriction, Effets trophiques, prolifératifs Fragments inactifs Récepteur AT2 Récepteur B2 NO, PGI2, EDHF Vasodilatation, Effets anti-trophiques, anti-prolifératifs Récepteur B1 Angiotensine II - Vasoconstriction - Pro-arythmisante Hypertrophie myocardique Fibrose interstitielle stress oxydatif Pro-inflammatoire Pro-coagulante Bradykinine - Vasodilatation - Anti-arythmique - Anti-hypertrophique - Antifibrotique - Anti-coagulante Le modèle d’insuffisance cardiaque post-ischémique peut être appliqué à des souris génétiquement modifiées pour étudier : • l’implication d’un ou plusieurs gènes dans le développement de la maladie, • le rôle de certains peptides dans le mécanisme d’action d’agents pharmacogiques utilisés dans le traitement de cette maladie. ACTIVITÉ DE LA KALLICRÉINE TISSULAIRE Circulation coronaire chez la souris: Oreillette droite Oreillette gauche 10 mm 5 mm Ligature Michael et al., 1995;269:H2150. Ligature Zone non infarcie Zone anévrismal Fonction cardiaque 7000 80 6000 70 * 5000 * 50 4000 3000 2000 FE 60 (%) (mmHg/s) dP/dtmax 40 * * 30 20 1000 10 0 0 3 mois Sham 6 mois IM-Témoin 12 mois 6 mois * p<0.05 vs valeur sham correspondante 12 mois Hypertrophie myocardique Poids VG/Poids total Poids VD/Poids total 6 6 * 4 † 3 5 * * (mg/g) (mg/g) 5 4 3 2 2 1 1 0 0 3 mois 6 mois 12 mois * * † 3 mois 6 mois Sham * p<0.05 vs valeur sham correspondante IM-Témoin † p<0.05 vs valeur 3 mois correspondante 12 mois Dilatation ventriculaire gauche Périmètre interne VG GMPc urinaire 14 12 * 3.0 * * (nmol/µmol créat) (mm) 10 2.5 8 6 4 1.5 1.0 2 0.5 0 0.0 3 mois Sham IM-Témoin 6 mois 12 mois * 2.0 6 mois * p<0.05 vs valeur sham correspondante Survival 100 p<0.02 80 p<0.05 p<0.02 (%) 60 40 20 Sham-TK+/+ (n=18) Infarct size (%) MI-TK+/+ (n=25) MI-TK+/+: 35±2 Sham-TK-/- (n=19) MI-TK-/- (n=28) MI-TK-/-: 34±2 10 20 30 40 WEEKS 50 60 70 Pons et al., Circulation, 2003,108: IV 152, Abstract LV function 80 80 60 60 40 * * EF (%) EF (%) MI-TK-/- vs MI-TK+/+ 40 20 20 0 0 42 w Sham-TK+/+ MI-TK+/+ 4w Sham-TK-/MI-TK-/- * p<0.05 vs corresponding Sham 12 w 42 w Cardiac remodeling: LV hypertrophy MI-TK-/- vs MI-TK+/+ † *† LVM/BW (mg/g) 6 5 * 4 3 2 LVM/BW (mg/g) 6.0 5.5 5.0 4.5 1 0 4.0 42 w Sham-TK+/+ MI-TK+/+ 4w Sham-TK-/MI-TK-/- 12 w * p<0.05 vs corresponding Sham † p<0.05 vs corresponding TK+/+ 42 w Cardiac remodeling: LV dilatation MI-TK-/- vs MI-TK+/+ † 240 200 160 *† * 120 80 40 LV diastolic volume (mm3) LV diastolic volume (mm3) 220 0 200 180 160 140 120 100 42 w Sham-TK+/+ MI-TK+/+ 4w Sham-TK-/MI-TK-/- 12 w 42 w * p<0.05 vs corresponding Sham † p<0.05 vs corresponding TK+/+ PHENOTYPING, EXPERIMENTAL PATHOLOGY, PHARMACOLOGY • Generation of pathogenic hypotheses, • Establishment of causality links between genes and diseases, • Development of therapeutic strategies Coupling between animal and human studies