hémocultures
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Examen bactériologique des hémocultures CHARLOTTE GUYON ANNE LEGRAND DES BACTÉRIOLOGIE AVRIL 2011 Généralités Sang = milieu stérile Présence de Bactérie(s) = bactériémie Champignon(s) = fongémie Bactériémie/fongémie physiologique Digestion, brossage des dents (transitoire) Clinique : différents niveaux de gravité Rarement asymptomatique Associée à un Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique (SRIS) = sepsis Associée à un sepsis sévère Associée à un choc septique +/- sd de défaillance multi viscérale Généralités Critères cliniques de gravité Définitions des syndromes septiques selon la réunion d’experts de l’ACCP/SCCM [Bone RC et al. Chest 1992 ; 101 : 1644] Termes Critères de définition Infection Invasion par des micro-organismes d’un tissu normalement stérile Réponse Au moins 2 des 4 critères suivants : systémique - température > 38°C ou < 36°C inflammatoire - fréquence cardiaque > 90 batt/min - fréquence respiratoire > 20/min ou PaCO2 < 32 mmHg - leucocytes > 12 000/mm3 ou < 4 000/mm3 Sepsis Réponse systémique inflammatoire liée à une infection Sepsis sévère Sepsis associé : - à une hypotension (PA systolique < 90 mmHg ou < 40 mmHg à la PA habituelle) - ou à une hypoperfusion d’organes telle que : - PaO2/FiO2 < 280 - oligurie (< 0,5 ml/kg/h) - acidose lactique - altération des fonctions supérieures Choc septique Sepsis sévère associé à une hypotension persistante (> 1 h) malgré un remplissage vasculaire adéquat (> 500 ml) ou nécessitant l’administration de médicaments vasoactifs. Diagnostiquer une bactériémie Clinique Sd infectieux : fièvre, frissons, foyer infectieux spécifique Signes de sepsis sévère ou de choc septique Facteur favorisant ? Immunodépression Diabète Grossesse Porte d’entrée? Hépatopathie Toxicomanie IV, alcoolisme Matériel étranger et/ou prothétique Matériel étranger Existence d’un autre foyer infectieux Confirmation biologique : hémocultures Indications Toute fièvre d’origine indéterminée (>38,5°) Isolée (femme enceinte, immuno-déprimé) Associée à des signes cliniques évocateurs d’infection, de sepsis sévère ou de choc septique Associée à la présence d’un foyer infectieux spécifique : EI, pyélonéphrite, …. Objectifs Rechercher une cause bactérienne, responsable de la clinique Isoler et identifier dans le sang la bactérie responsable Antibiogramme si nécessaire Rechercher et préciser l’étiologie d’une endocardite infectieuse Orienter la indéterminé recherche d’un foyer infectieux Documenter l’implication d’un dispositif vasculaire dans un état septique intra Démarche diagnostique Prélèvement Transport Incubation Détection de la croissance Examen bactériologique Rendu des résultats Prélèvement : modalités Protocole validé par le CLIN : règles d’hygiène et antisepsie rigoureuses But = éviter la contamination du prélèvement, réduire les AES Conditions de prélèvement • Porte de chambre fermée • Port d’un masque chirurgical • Lavage/désinfection des mains du préleveur • Port de gants non stériles • Désinfection de l’opercule des flacons et du point de ponction avec un produit approprié • Ne plus palper la veine après cette étape • Prélever le sang en contrôlant le bon remplissage des flacons • Identifier correctement l’ensemble des flacons • Recommandé d’utiliser des antiseptiques alcooliques Sites de prélèvement Ponction veineuse Seule méthode valable pour prélever le sang en vue d’une culture bactériologique Prélèvement via dispositif intra-vasculaire (DIV) Présence fréquente de contaminants Seul intérêt = déterminer la responsabilité du DIV dans une bactériémie Prélèvement simultané d’hémocultures sur DIV et en périphérie = hémocultures appariées ou quantitatives Moment du prélèvement Au pic fébrile À distance de l’administration d’antibiotiques À la vallée Fenêtre thérapeutique de 48-72h Endocardite infectieuse Prélèvement de 3 hémocultures espacées d’1 heure minimum avant toute prise d’ATB Volumes prélevés Importance +++ car corrélée au rendement de la technique, donc à la sensibilité Adulte Densité bactérienne # 1 UFC/ mL sang Paires d’hémocultures : flacon aérobie + anaérobie Volume optimal = 40 à 60 mL soit 2 à 3 paires d’hémocultures par 24 h (volume minimal = 20 mL) Enfant Concentration bactérienne plus élevée, diminuant avec l’âge 1 seul flacon pédiatrique Volume à adapter en fonction du poids Facteur de dilution But = diluer les substances inhibitrices présentes dans le sang (complément, lysozyme, cellules phagocytaires, antibiotiques) Ratio sang/bouillon Systèmes manuels : 1/5 à 1/10 (vol/vol) Systèmes automatisés : 1/2,5 à 1/5 Intérêt des flacons pédiatriques (ratio sang-bouillon adapté au volume de sang prélevé) non démontré Nombre de prélèvements Intervalle entre 2 prélèvements Nul ou intervalle de quelques heures, à chaque pic fébrile Pas d’influence sur les performances diagnostiques Prélèvements multiples vs prélèvement unique Même sensibilité Comparaison des protocoles de prélèvement d’hémocultures Prélèvements multiples 2 à 3 prélèvements de 2 flacons Prélèvement unique 1 seul prélèvement de 4 à 6 flacons Nb de prélèvements 2à3 1 Nb total de flacons mis en culture 4à6 4 à6 Sensibilité Sensibilité équivalente Détection équivalente des bactériémies lorsque les prélèvements sont espacés dans le temps ou réalisés simultanément Taux de contamination Modéré Faible (divisé par 2 à 3) Interprétation du résultat (reconnaissance des contaminants) Interprétation sur la base de l’espèce isolée et du nb de prélèvements positifs Confrontation clinicobiologique Interprétation inutile pour la plupart des contextes cliniques Remarques Malgré des règles d’interprétation, conclusion délicate en cas de bactériémie liées à un dispositif intra-vasculaire Non conseillé pour les endocardites infectieuses et pour les infections liées à un dispositif intra-vasculaire Avantages Plus simple (un seul prélèvement) Antibiothérapie instaurée plus rapidement Choix des conditions de culture Richesse du milieu liquide : Trypticase-soja, bouillon cœur-cervelle, peptones, supplémentés en nutriments et facteurs de croissance, milieux spécifiques levures Atmosphère aérobie (O2 et CO2) et anaérobie (CO2 et H2 ou N2) fréquence d’isolement des bactéries anaérobies strictes Remise en cause du flacon anaérobie MAIS : facilite la croissance de certains germes (streptocoques, entérocoques,…) Important dans les infections gynécologiques et digestives Choix des conditions de culture • Anticoagulant : polyéthanol sulfonate de Na (SPS) 0 0 0 Inhibe l’activité bactéricide du sérum, la phagocytose cellulaire, l’activité du complément et du lysozyme Inhibe l’activité de certains antibiotiques MAIS risque d’inhibition de certaines souches de Neisseria, Peptostreptococcus anaerobius, Capnocytophaga, Gardnerella… • Produits adsorbants 0 0 0 0 Résine adsorbante de cations ou charbon activé Propriétés mal connues : effet neutralisant des antibiotiques et des substances toxiques ++ pour la détection de S. aureus et des Entérobactéries MAIS pas pour les bactéries non fermentantes ni les levures Types de flacons disponibles Flacons pour systèmes manuels avec ou sans indicateur de croissance (mise en évidence d’une surpression) Systèmes biphasiques : milieu liquide + gélose : observation d’un trouble ou de colonies sur la gélose Système Isolator® : bactéries intracellulaires et mycobactéries, levures et filamenteux lyse des cellules sanguines (saponine), inhibition phagocytose et activité bactéricide du Se, centrifugation, mise en culture du culot Intérêt : - concentration des bactéries dans le lysat, - performant MAIS: Risque de contamination +++ et couteux Types de flacons disponibles Flacons pour systèmes automatisés Mise en évidence de la croissance bactérienne grâce à un indicateur coloré Flacons Bact Alert® Flacons Bactec® Transport Acheminement le plus rapidement possible au laboratoire En cas de délai Incubation manuelle: à l’étuve à 35°C le plus rapidement possible Incubation dans un automate: maintien à T° ambiante avant l’introduction dans l’automate Eviter le risque de faux négatifs ou une augmentation du délai de positivité Incubation Incubation à l’étuve/dans un automate Durée d’incubation 7 jours à l’étuve ou 5 jours avec les systèmes automatisés Bactéries détectées au-delà = souvent contaminants Délai prolongé pour les microorganismes à croissance lente (HACCEK, Brucella spp, champignons…) n’est pas nécessaire avec les automates Incubation à 35°C Détection de la croissance bactérienne Systèmes manuels Flacons inspectés quotidiennement 0 0 Recherche d’un trouble provoqué par la croissance bactérienne, de la production de gaz, d’un coagulum… Bactéries troublant peu le milieu le bouillon de culture Brucella spp, Haemophilus campylobacter spp spp, Neisseria spp, Détection de la croissance bactérienne Systèmes automatisés à détection continue Amélioration de la détection de la croissance bactérienne : plus sensible et plus rapide (agitation) lecture toutes les 10 min Principe = détecteur de CO2 au fond du flacon contenant un indicateur de pH, séparé du bouillon par une membrane ½ perméable au CO2 0 CO2 = pH (indicateur coloré) mesurée par réflectométrie (BacT ALERT) ou fluorimétrie (Bactec) Flacons déclarés positifs selon un algorithme de mesure: - concentration initiale en CO2 - de la vitesse de production de CO2 - de l’ de la vitesse de production de CO2 Détection de la croissance bactérienne Bactec® BacT ALERT ® Examen bactériologique : Recommandations REMIC ED : lame-lamelle + Gram Bactériémie: diagnostic d’urgence Appel des résultats des ED Milieux ensemencés au minimum: Milieux supplémentés en sang Atmosphères aérobie, anaérobie et sous CO2 Adaptation selon le résultat de l’ED et le contexte clinique Recherches spécifiques Mycobactéries Micro-organismes non cultivables en (Bartonella, Leptospira, Legionella, Coxiella) Levures et moisissures flacon d’hémoculture Levures et moisissures Hémoculture = examen clé dans le diagnostic des mycoses invasives Responsabilités dans les infections nosocomiales et communautaires de + en + démontrée Candida++ Facteurs de risques : ID, utilisation d’AB à large spectre, cathéter Les automates et l’optimisation des milieux de cultures (flacon aérobie) ont amélioré la rapidité d’isolement des champignon Flacons négatifs dans 50% des infections fongiques disséminées Utilisation de flacon spécifique intéressante • Paramètres : • • • T° optimale de culture : 37°C (levures) 27-30°C (ch.filamenteux), Privilégier l’aérobiose Incubation 5-7jrs (levures), 3 à 6 semaines (ch. dimorphiques) Interprétation Éléments pris en compte Critères de pathogénicité Nombre d’hémocultures positives Différentes situations en faveur d’une étiologie bactérienne Plusieurs hémocultures positives avec un même germe Plusieurs hémocultures positives avec germes différents sur terrains particuliers : cirrhose hépatique, dysimmunité, foyer digestif ou cutané Dès la première hémoculture si bactérie pathogène spécifique : S. aureus, S. pneumoniae, entérobactéries, P. aeruginosa, Haemophilus meningitidis, Listeria, Campylobacter spp, HACCEK, levure, … spp, N. Contamination probable si une seule hémoculture avec bactérie de la flore cutanéo-muqueuse acnes) (SCN, Corynebacterium spp, Bacillus spp, P. Fréquence des espèces bactériennes et signification clinique Espèces les plus fréquemment isolées SCN (majo = contaminants, 10-30% ont une signification clinique) Staphylococcus aureus Escherichia coli Espèces en augmentation Enterococcus spp Levures Espèces anaérobies: très faible (<3%) Nature des bactéries identifiées et signification clinique Germes quasiment tjs pathogènes S. aureus, E. coli, Entérobactéries, P. aeruginosa, C. albicans Germes fréquemment contaminants Bacillus spp, Corynebacterium spp, Propionibacterium spp Interprétation difficile S. viridans, Enterococcus spp, SCN Isolement d’une de ces espèces → rechercher l’absence de DIV compatible avec une endocardite infectieuse avant de conclure à un contaminant Signification de positivité d’un ou plusieurs flacons Nature du µNb de flacons organisme isolé positifs ou identifié SCN 1 ou 2 d’une même paire P. acnes, S. « viridans » Bacillus spp 2 ou 3 de deux paires différentes Nb total d’hémoc réalisées ≥2 Renseignements cliniques Conduite à tenir Pas d’orientation clinique Conta probable Service d’oncohémato, Ident + ATB avec réa, cathéter central, la mention « à infection associée aux interpréter en soins fonction de la clinique et du prélèvement 1 Quel que soit le contexte Ident + ATB avec la mention « à interpréter en fonction de la clinique et du prélèvement ≥2 Quel que soit le contexte Ident + ATB sans restriction Signification de positivité d’un ou plusieurs flacons Nature du µorganisme isolé ou identifié Nb de flacons positifs Nb total d’hémoc réalisées Renseignements cliniques Conduite à tenir S. aureus S.pneumoniae Strepto βhémolytique Enterococcus spp Entérobactéries P. aeruginosa C.albicans Anaérobies N.meningitidis Haemophilus spp HACCEK Brucella spp Pasteurella spp Campylobacter spp ≥1 Quel que soit le nombre total Quel que soit le contexte Ident + ATB sans restriction Cas particuliers Hémocultures polymicrobiennes 10% des hémocultures pédiatriques 30% des hémoc chez immuno-déprimés Interprétation: toutes les espèces ont le même potentiel infectieux Faux positifs Grande quantité de leucocytes Flacons trop remplis Flacons oxygénés Faux négatifs Délai avant l’introduction dans le Bact-Alert Interprétation des hémocultures appariées Concept : concentration bactérienne dans sang prélevé sur DIV > concentration bactérienne dans sang prélevé en périphérie Signe la responsabilité du DIV dans la bactériémie 2 approches Qualitative : délai différentiel de pousse (>2h) Quantitative Hémocultures appariées quantitatives Modalités Prélèvement sur 2 tubes Isolator® pédiatrique de 1,5mL de sang Kit de prélèvement CHLS Ensemencement immédiat : GS pur et GS après dilution au 1/10 en bouillon Hémocultures appariées quantitatives Interprétation : lecture à 24, 48 et 72h Objectifs : comparer les dénombrements des µ-org isolés dans les tubes « cathéter » et « veineux » Si plusieurs espèces bactériennes : dénombrement, identification et ATB pour chaque espèce Détermination d’une différence significative Abaque si <55 UFC/mL Si > 55UFC/mL : différence significative si le nb d’UFC/mL d’un des tubes est > à 3 fois celui de l’autre Hémocultures appariées quantitatives • Réponses : Nb UFC/mL « cathéter » > nb UFC/mL « veineux » = cathéter sans doute à l’origine de la bactériémie Nb UFC/mL « veineux » > nb UFC/mL « cathéter » = cathéter à priori non responsable de la bactériémie Nb UFC/mL « cathéter » > nb UFC/mL « veineux » stérile = cathéter colonisé Comparaison inter-sites Comparaison intersites Types de flacons utilisés CBS CBN CBPE Flacons aérobies TS TS + CC + charbon activé TS Flacons anaérobies TS TS TS + CC + charbon activé Flacons pédiatriques / Flacons particuliers Isolator® + flacons mycobactéries Justification du choix TS + CC + charbon TS + CC + charbon activé, aé activé, aé TS = trypticase-soja, CC = cœur-cervelle CBPE : Fl aé sans charbon pour pouvoir voir les levures à l’ED CBN : Fl anaé sans charbon pour bien voir les germes d’identification difficile Comparaison intersites Incubateurs automatiques : Bactalert® Comparaison des durées d’incubation CBS Cas standard Cas particulier 5j Mycobactéries : 42 j CBN 7j Brucella, Listeria, Levures, HACCEK, EI : 10 j Hémoculture détectée positive Lame-lamelle : mobilité Gram CBPE Remic 6j 5 j automate 7 j étuve EI : 10 j Incubation prolongée: plus d’intérêt avec les automates Milieux ensemencés ED CBS CBN CBPE négatif GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 GS µaé GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 GS, aérobie Choc+PVX, CO2 B Schaedler + vit K3 C+ amas GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 GS, aérobie TS inclinée BCC→coagulase C+ chaînette GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 GS + opto GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 GS + opto GS + optochine, aé COS, CO2 Gél Choc+PVX, CO2 BCC C- GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 GS aérobie Gél Choc+PVX, CO2 BCC Remic Milieux supplémentés en sg, aérobie, anaérobie, sous CO2, adaptés selon la morphologie de la bactérie et le contexte clinique Milieux ensemencés ED CBS CBN CBPE B- type EB ou Pseudomonas Mobilité? Gaz? GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 URI4 GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 GS, aérobiose Gél ID polyvalente = uri4 BCC B- petits, fins polymorphes type anaé, HACCEK, Brucella Mobilité? GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 URI4 Sauf si Bincurvé à l’ED : GS µaé GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 GS aérobiose Gél Choc+PVX, CO2 Schaedler anaérobie B Schaedler + vit K3 Si suspicion Campylo à l’ED : COS µaé Si suspicion Campylo : Karmali µaé Remic Milieux supplémentés en sg, aérobie, anaérobie, sous CO2, adaptés selon la morphologie de la bactérie et le contexte clinique Milieux ensemencés ED CBS CBN B+ Clostridium, Bacillus Lacto, Leptotrichia Propioni, Coryne Listeria GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 Esculine GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 Esculine Levures, éléments mycéliens GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 Chromogène levure Gél Sabouraud GS aé GS anaé si fl anaé Gél Choc + PVX CO2 Gél Sabouraud CBPE Remic GS aérobie Gél Choc+PVX CO2 Schaedler, anaérobie Milieux supplémentés BCC en sg, aérobie, Bouillon Schaedler anaérobie, sous CO2, BCP (Bacillus) adaptés selon la BCC + esculine morphologie de la (Listeria) bactérie et le contexte clinique GS aérobie Chromogène levure Sabouraud pente Conditions d’incubation CBS CBN CBPE Standard : 35° Standard : 37° 35° Températures particulières Levures : 30° BGN non fermentants et Levures : 30° Ø Durée standard 48h 48h 48h Durées particulières Levures : 5j Campylo : 5j Levures : 5j Température standard Remic Aucune indication Levures : 3-5j Identification - Antibiogramme Identification CBS CBN CBPE Toute hémoc+ sauf SCN et BGP (≥ 2 hémocs+) Toute hémoc+ sauf SCN (≥ 2 hémocs+) Toute hémoc+ sauf SCN (≥ 2 hémocs+) Systématique Antibiogramme Remic si pathogène reconnu ≥ 2 hémocs+ si contaminant potentiel : SCN, Neisseria (sauf meningo et gono), BGP (sauf Listeria) Systématique si pathogène reconnu ≥ 2 hémocs+ si contaminants : SCN Systématique si pathogène reconnu sauf Neisseria (CNR) ≥ 2 hémocs+ si contaminants : SCN Cf tableau Conclusion Adéquation avec les recommandations du Remic Oui pour les milieux de culture Variable pour les atmosphères d’incubation CBS : incubation sous CO2 et anaérobie CBN : incubation anaérobie fonction du type de flacon CBPE : incubation sous CO2 et anaérobie fonction du résultat de l’ED Conduite de l’examen bactériologique différente CBPE : place importante de l’ED CBS et CBN : procédure d’ensemencement systématique, complétée selon l’ED Identification et antibiogramme : attitude similaire
