soutenance_GuillaumeLamour_2010 - TEL (thèses-en
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Soutenance de thèse Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12 Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010 Différenciation neuronale : processus suivant lequel une cellule acquiert un phénotype neuronal 2 Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? neurite cône de croissance noyau corps cellulaire (soma) 3 Le cône de croissance : structure et fonctions faisceau de filaments d’actine chimio-attraction chimio-répulsion filament d’actine microtubule filopode lamellipode axone cône de croissance 4 Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] Adhésion cellulaire et différenciation neuronale : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? Propriétés de surface des biomatériaux : La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Deux paramètres : Nanorugosité Gradients locaux FAdhésion? E1 DistributionΔE E2 de l’énergie E4 de surface E3 E5 surface 1 µm 1 µm 5 Partie I Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la neuritogénèse 6 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse Stratégies de modification des surfaces de verre Caractérisation de l’état de différenciation Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 » Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 7 Technique de modification du verre 8 Stratégies de modification du verre par diverses molécules PLL n EDA 9 Cellules PC12 : modèle d’étude pour la différenciation neuronale Les cellules PC12 : sont dérivées d’un phéochromocytome de rat. voient leur cycle cellulaire stoppé et se différencient sous traitement au NGF. CellulesPC12 PC12- -6àjours l’ensemencement Cellule Cellule PC12 NGF 6 jours 10 Neuritogénèse des cellules PC12 sous l’effet d’un traitement au NGF avec NGF sans NGF 6 jours 6 jours 11 Neuritogénèse induite par effet de surface Sur PLL : sans NGF Sur EDA : sans NGF verre/EDA 6 jours 6 jours 6 jours Gradients locaux dans les énergies d’adhésion 12 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse Stratégies de modification des surfaces de verre Caractérisation de l’état de différenciation Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 » Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 13 Expression du marqueur neuronal : MAP1B 14 Immunomarquage de MAP1B (après 6 jours de culture) sans NGF avec NGF témoin positif verre/PLL témoin négatif verre/PLL verre/EDA sans NGF 15 Expression du marqueur neuronal : Tau PEDA : 6 jours (sans NGF) sans NGF actine avec NGF Tau PEDA : 6 jours ADN 50 µm 25 µm 50 µm 16 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse Stratégies de modification des surfaces de verre Caractérisation de l’état de différenciation Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 » Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 17 Influence de la nature des terminaisons Biopolymères (acides aminés) Alkylsiloxanes NH2 NH3+ PLL EDA CH3 NH2 PLO HTMS peu ou pas de neuritogénèse neuritogénèse élevée 18 Microscopie interférentielle (RICM) temps accéléré (× 50) PLL EDA HTMS PLO 10 µm 19 Conclusions Neuritogénèse obtenue par effet de surface Reproduction de l’effet du NGF Expression de marqueurs neuronaux Influence de gradients locaux dans les énergies d’adhésion Limites Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Influence de facteurs externes Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques 20 Partie II Identification des paramètres de surfaces critiques à la réponse cellulaire 21 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse Stratégies de modification des surfaces de verre Caractérisation de l’état de différenciation Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 » Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 22 Modification du verre par auto-assemblage d’alkylsiloxanes très ordonnée conformation all-trans Classe 1 partiellement ordonnée perte des liaisons latérales Classe 2 très désordonnée hétérogénéité chimique accrue Classe 3 23 Techniques de caractérisation des surfaces modifiées Spectroscopie vibrationnelle : génération de fréquence somme (SFG) État virtuel ωVis substrat ωIR ωSFG État vibrationnel excité État fondamental Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : modèle Owens-Wendt énergie d’adhésion solide-liquide composantes dispersive/apolaire composantes non-dispersive/polaire 24 Comparaison IRTF / SFG sur le spectre vibrationnel d’une monocouche d’OTS (région C-H) 25 Spectres SFG des substrats dans la région C-H HTMSH (θ = 104°) OTS (θ = 110°) ODMS2 (θ = 96°) ODMS1 (θ = 77°) HTMSM (θ = 56°) OTS ; HTMSH : Formation d’une monocouche très ordonnée ODMS1 ; ODMS2 ; HTMSM : Formation d’une monocouche désordonnée Classe 1 Classe 2 & Classe 3 26 Techniques de caractérisation des surfaces modifiées Spectroscopie vibrationnelle : génération de fréquence somme (SFG) État virtuel ωVis substrat ωIR ωSFG État vibrationnel excité État fondamental Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : modèle Owens-Wendt énergie d’adhésion solide-liquide composantes dispersive/apolaire composantes non-dispersive/polaire 27 Estimation des énergies libres de surface Classe 1 (¤) : Classe 2 (▲) : Distribution homogène de l’énergie (s ≈ d ) présence de gradients locaux dans les Eadhésion Classe 3 (#) : hétérogénéités chimiques accrues 28 Adhésion et neuritogénèse des PC12 sur 3 classes de surfaces après 48h de culture sans NGF classe 1 classe 2 surface très ordonnée 200 µm classe 3 surface (dés)ordonnée surface très désordonnée 200 µm 200 µm pas d’adhésion adhésion limitée adhésion renforcée agrégats cellulaires flottant quelques neurites forte croissance neuritique Adhésion limitée sur le verre propre (les cellules tendent à se détacher) 29 Conclusions Identification du facteur critique : hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques Eadhésion (classe 3) > Eadhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γs ? 30 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse Stratégies de modification des surfaces de verre Caractérisation de l’état de différenciation Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 » Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 31 Modification du verre par des aminosilanes Monométhoxy-silane Triméthoxy-silanes DETA ADMS Classe 2 APTMS PEDA EDA Classe ??? État désordonné État ordonné 32 Analyses des surfaces NH2 : théorie de Zisman Liquides tests eda ADMS & peda : APTMS très hétérogènes (Classe 3) adms & aptms : plus homogènes (Classe 2) énergies critiques γc deta : EDA ??? PEDA ± 2 mN m-1 33 Analyses des surfaces NH2 : théorie de Owens – Wendt Liquides tests eda ADMS & peda : APTMS très hétérogènes (Classe 3) adms & aptms : plus homogènes (Classe 2) énergies critiques γc deta : ??? ± 2 mN m-1 34 Cellules en culture sur les surfaces NH2/OH après 24h de culture sans NGF cas particulier du deta classe 2 classe 2 classe 3 différenciation : + différenciation : ++++ 35 Conclusions La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH. L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique. Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, et la différenciation n’est pas stimulée. Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité, et la différenciation est fortement stimulée. 36 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse Stratégies de modification des surfaces de verre Caractérisation de l’état de différenciation Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 » Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 37 AFM : cellules PC12 sur verre/EDA. 38 Déstabilisation du cytosquelette d’actine par la cytochalasine-B. témoin [cytochalasine] = 5 µM 39 Conclusion générale. Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la différenciation neuronale Mise en évidence de l’impact de gradients locaux Redéfinition des monocouches auto-assemblées en qualité de substrat d’adhésion selon la distribution des énergies de surfaces qu’elles exposent Classe 1 : très ordonnée Classe 2 : relativement (dés)ordonnée Classe 3 : très désordonnée Nécessité de combiner SFG et Owens – Wendt Assignation des substrats élaborés aux classes définies Mise en évidence de l’influence des hétérogénéités chimiques locales du substrat dans les processus d’adhésion et de différenciation neuronale des cellules PC12 40 Perspectives Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? Investigation de la dynamique des filaments d’actine A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? Création de gradients contrôlés via des nanoplots Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+ 41 Conclusion générale. ? Distribution de l’énergie de surface 42
