Les enzymes de restriction
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Les sillons de l ’ADN L’ ADN sous forme B Observer la différence entre le grand sillon le petit sillon Intéressant pour la reconnaissance des protéines Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Les sillons de l ’ARN L’ ARN sous forme A le petit sillon le grand sillon Large et peu profond Étroit et profond donc propriétés de reconnaissance complètement différentes de celles de l’ADN. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Caractéristiques des formes canoniques A et B des AN Forme B 3,4Å 34Å Forme B A Nombre de paires de bases par tour 10 (10,4) 11 Angle de torsion par paire de base 36° 32,7° Pas de l'hélice 34 Å 29 Å Distance axiale entre les paires de bases 3,4 Å 2,6 Å voisin de 0 à peu près 20 Grand 11,4 Å 2,4 Å Petit 6,0 Å 11,0 Å 9,3 Å 9,5 Å Angle de basculement Largeur des sillons Distance du phosphore à l'axe de l'hélice Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Plan du cours : première partie A : rappels sur le génome Les acides nucléiques Le DNA circulaire La chromatine B: Les outils de la biologie moléculaire Enzymes qui coupent les acides nucléiques Enzymes qui changent les contraintes des AN Enzymes qui travaillent sur les phosphates Enzymes qui recopient les acides nucléiques C: Les techniques de la biologie moléculaire Purification des acides nucléiques Electrophorèse sur gel Méthode de transfert d’après Southern Technique de l’amplification génique Le séquençage de l’ADN Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 L’ADN Circulaire Une forme particulière de l’ADN l’ADN circulaire Définition Sens des super enroulements Notion de topoisomères Importance des ADN circulaires Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Molécule d’ADN circulaire La chaine d’ADN peut ce circulariser et chaque brin se refermer sur lui même par des liaisons phosphodiester 3’ 5’ 5’ 3’ Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LE SUPERENROULEMENT POSITIF Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LE SUPERENROULEMENT NÉGATIF Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LE SUPERENROULEMENT POSITIF Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LE SUPERENROULEMENT NÉGATIF Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 ADN circulaire : topoisomères Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Topoisomères de l’ADN circulaire Relaxée Torsadée Super torsadée Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La Chromatine La structure de l’ADN dans la cellule la chromatine Pourquoi compacter l’ADN dans la cellule ? La machinerie de compaction Les histones Le nucléosome Les superstructures de l’ADN Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Compaction de l’ADN Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Modèle de compaction de l’ADN Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Compactions de l ’ADN Double hélice d’ADN + histones Double hélice d ’ADN Chromatide Chromosome Fibre de chromatine Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LE NUCLÉOSOME - Comprend de l'ADN (environ 200 pb) -Des protéines : -des histones sous forme d'octamères: 2 x H2A, 2 x H2B, 2 x H3 et 2 x H4 et des protéines non histones. - La protéine histone H1 est extérieure à la partie principale du nucléosome. Elle est sous forme d'une protéine unique. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Le nucléosome Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LE NUCLÉOSOME Histone H1 200 pb d'ADN Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4 Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Empaquetage de l’ADN Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Chromosomes humains Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Les outils de la biologie moléculaire • Enzymes qui coupent les acides nucléiques • Enzymes qui changent les contraintes des AN • Enzymes qui travaillent sur les phosphates • Enzymes qui recopient les acides nucléiques Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Polarité de la chaîne d’ADN C A 3’ P 3’ P 5’ G 3’ P 5’ Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 P 5’ Les nucléases Les enzymes de restriction La DNase I La nucléase S1 Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Les enzymes de restriction Définition Le palindrome Symétrie de la coupure Coupure à bouts collants Coupure à bouts francs Restriction et méthylation de l’ADN Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Les enzymes de restriction Les enzymes de restriction sont des outils utilisés pour couper l’ADN. La coupure de l’ADN se fait en un site particulier reconnu par l’enzyme. Chaque enzyme reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique. Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases c’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique 3’ 5’ 3’ 5’ Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’). 3’ 5’ 3’ 5’ Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Enzymes de restriction Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Palindrome LAVAL Les séquences de nucléotides Reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont des séquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’3’ (gauche - droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite - gauche pour le second brin (sens 5’3’). Ces séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4 ou 6 paires de bases. Mot palindromique 5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’ Séquence palindromique Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Sites de restriction Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Symétrie des enzymes de restriction Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LES COUPURES À BOUTS COLLANTS Enzyme Eco RI : 5' - G AAT T 3' - C 5’ – G – 3’OH 3’ – CTAAG – 5’P C- 3' T TAA G - 5' 5’P – AATTC – 3’ 3’OH – G – 5’ Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LES COUPURES À BOUTS FRANCS Enzyme Hae III : 5' - GGCC - 3' 3' - CCGG - 5‘ 5’ – GG – 3’OH 3’ – CC – 5’P 5’P – CC – 3’ 3’OH – GG – 3’ Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 MÉTHYLATION DES CYTOSINES Enzyme Msp I : Coupure 5' - C C* G 3' - G G G- 3' C* C - 5' Enzyme Hpa II : Pas de coupure 5' - C C* 3' - G G G Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 G - 3' C* C- 5' MÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTION Enzyme Hind III : coupure par l'enzyme. 5' AA G C T T - 3' - T T C G A A - 3' 5‘ Enzyme Hind III (avec hémi-méthylation sur l'adénine en N6) : Absence de coupure par Hind III. 5' - A* AGCTT - 3' 3' - T T C GAA - 5' Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LA DNase I 5' 3' 3' 5' C'est une endonucléase Ses coupures se font au hasard Elle coupe l'ADN (simple ou double brin) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La DNase La DNase 1 est une endonucléase qui dégrade l’ADN double brin ou simple brin. Les coupures (« nicks ») sont complètement aléatoires sans spécificité de site. Les produits de la réaction sont des oligonucléotides qui possèdent un groupement phosphate en 5’. L’activité dépend des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+) P P P P P 3’ P P OH P P 5’ P Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La Nucléase S1 La nucléase S1 dégrade l’ADN simple brin. Nettoie les extrémités simples brins. Coupe un misappariement Sans activité sur le double brin « parfait » Sans activité sur les hybrides ADN/ARN S1 5’ 3’ 3’ 5’ Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Enzymes des phosphates Les phosphatases Les kinases Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Phosphatases et Kinases Les phosphatases sont des enzymes qui enlèvent les groupements phosphates situés en 5’ d’une chaîne d’ADN. Phosphatase alcaline est active à pH basique. Les kinases, à l’inverse des phosphatases, sont des enzymes qui ajoutent un groupement phosphate à l’extrèmité 5’ d’un ADN , en présence d’ATP. γ β α A C’est le phosphate en γ de l’ATP qui est transféré. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Enzymes recopiant les acides nucléiques Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN DNA polymérase DNA dépendante DNA polymérase RNA dépendante RNA polymérase DNA dépendante RNA polymérase RNA dépendante Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’ La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle. L’enzyme fonctionne en présence de nucléosides triphosphates (XTP) ou de désoxynucléosides (dXTP) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Les DNA polymérases Propriétés DNA polymérase DNA dépendante DNA polymérase I : Activités exonucléasiques Fragment de Klenow Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LES ADN POLYMÉRASES - Un brin d'ADN matrice - Une amorce oligonucléotidique - Une synthèse du brin nouveau 5' 3' 3'(OH) 5' 5' 3' Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 DNA polymérase DNA dépendante Ces enzymes recopient l’ADN en ADN. Elles nécessitent une amorce d’acide nucléique. La réaction catalysée est: (dXMP)n + dXTP (dNMP)n+1 + PPi Amorce avec une extrémité 3’-OH libre La nouvelle chaîne est synthétisée dans le sens 5’ 3’ Règle de complémentarité et de polarité inverse Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La DNA polymérase 1 Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Fragment de KLENOW Le fragment de Klenow est préparé à partir de la DNA polymérse 1 d’E.coli. Ce fragment ne possède plus d’activité exonucléasique 5’ 3’ mais garde l’activité polymérasique et l’activité exonucléasique 3’ 5’. Cette enzyme est utilisée au laboratoire car elle permet de contrôler si la base qui vient d’être ajoutée obéit à la règle de complémentarité. (fonction d’édition) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LES ARN POLYMÉRASES - Synthèse d'ARN sans amorce préalable. - Présence de nucléotides : NTPs et d'ions magnésium (Mg2+). Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 - Une synthèse du brin nouveau dans le sens 5' 3'. - Absence de fonction d'édition. - Nécessité de reconnaître le promoteur spécifique correspondant. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01
