TD immuno techniques
publicité
Techniques immunologiques Les techniques immunologiques sont principalement basées sur une intéraction entre l’anticorps et l’antigène Techniques immunologiques • But : - Mise en évidence des antigènes - Mise en évidence des anticorps Techniques immunologiques Mise en évidence des anticorps (Ac) • Où ? : - essentiellement dans le serum - plus rarement dans les autres liquides biologiques (LCR, salive, urine…) • Comment ? : au moyen d’antigènes: - le germe lui-même - les antigènes Techniques immunologiques Mise en évidence des antigènes (Ag) • Où : - dans les cellules - dans les tissus - dans les liquides biologiques (sérum, LCR, urines…) • Comment : au moyen d ’anticorps - polyclonaux - monoclonaux Réaction Ag-Ac : complexe immun Interaction épitope-paratope Antigène soluble Antigène particulaire complexe Ag-Ac forme un précipité complexe Ag-Ac forme un agglutinat ATTENTION : un Ac peut lui aussi être un Ag, vis à vis d’un Ac anti-Ac. un couple Ac/Ac anti-Ac peut être utilisé pour la mise en évidence Ag ou Ac. Plusieurs découvertes majeures en sciences biomédicales n’auraient pas vu le jour sans l’utilisation d’anticorps Techniques immunologiques 1- Précipitation 2- Agglutination 3- Utilisant un marqueur: - Immunofluorescence - Immunoenzymatique Precipitation en milieu liquide • L'expérience consiste à répartir des quantités égales d'un solution d'un Ag multivalent avec des dilutions croissantes d'un sérum immun. Le test de l’anneau de précipitation est réalisé dans un tube Antigène (soluble) Zone d’équivalence : précipité visible Anticorps Précipitation sur gel • Gel d’agar ou d’agarose • Intérêt : Les méthodes de précipitation en milieu gélifié sont appliquées à l'analyse qualitative d'un mélange d'Ag dans une solution. 1/ Immunodiffusion double ou réaction d'Ouchterlony 2/Immunodiffusion radiale (technique de Mancini) Immunodiffusion double ou réaction d'Ouchterlony • Les solutions d'Ag et d'Ac sont déposées dans des puits percés à distance les uns des autres dans un gel d'agarose. Les molécules diffusent dans le gel en fonction de leur taille et forment des lignes de précipitation pour chaque système d'Ag et d'Ac. • Chaque ligne de précipitation correspond à la zone d'équivalence respective, c'est-à-dire à la formation d'un réseau Ag-Ac. Ouchterlony Cette méthode permet la comparaison directe de différents antigènes. Par exemple savoir si l’albumine de deux espèces proches possèdent les mêmes épitopes, des épitopes partiellement identiques ou des épitopes différents. Méthode d’Outcherlony Puits central : sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) Puits périphériques : 1 : sérum de chèvre 2 : sérum de porc 3 : sérum de lapin 4 : sérum de boeuf 5 : sérum de cheval 6 : BSA Réaction d'agglutination • La réaction d'agglutination met en présence des Ag sur un élément figuré (cellules, érythrocytes, particules, bactéries) et un antisérum contenant des Ac spécifiques agglutinants. • Réaction d‘hémagglutination Quand les Ac se fixent aux Ag à la surface des GR du sang, la réaction d’agrégation résultante s’appelle hémaglutination. Quel groupes sanguins? A B AB O Techniques d'immunomarquage Immunodetection anticorps/antigène IgA IgM Radioactif Enzyme chromogène Fluorescence Immunodetection anticorps/antigène Western blot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel (SDS PAGE) Détection par Ac primaire Détection de l’Ac primaire par un Ac secondaire couplé Western blot 1. Séparation des échantillons protéiques sur PAGE 6.Incuber la membrane avec le substrat chemiluminescent de l’HRP et exposition du film 2. Transfert électrophorètique Des Proteines du gel vers une membrane NC 5. Incuber la membrane avec AC secondair conjugué à HRP 3. Blockage de la membrane (lait ou BSA) 4. Incuber la membrane avec AC primair Western blot Exemple (clinique): détection d'Ac anti-HIV Protéines HIV Patient A: négatif Patient B: indéterminé Patient C: positif patients Immunodetection anticorps/antigène ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay -Sérum -Urine -Surnageant de culture Etc. ELISA ELISA indirect ELISA Sandwich Immunodetection anticorps/antigène ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV
