ACTIVITE 2-A : la recherche d`immunité

ACTIVITE 2-­‐A : La recherche d’immunité
En se fixant sur ces éléments indésirables, les anticorps vont les immobiliser, permettant l'organisation de la défense de l'organisme : activation d’une réaction immunitaire spécifique, et recrutement des cellules qui vont lutter contre le développement de ces indésirables. Au cours de cette activité, vous allez tenter de comprendre la structure et la fonction des anticorps. Exercice 1 : Recherche d’anticorps pour un test de séropositivité au VIH
Un anticorps est une protéine de l’immunité adaptative. Il en existe plusieurs milliards dans le corps humain et ils sont capables de reconnaître des substances étrangères à l'organisme en se fixant sur elles. Ainsi, les bactéries, les virus, les champignons, les venins ou les cellules cancéreuses peuvent être identifiés comme des éléments indésirables de la circulation sanguine. Un patient est qualifié de séropositif pour le VIH lorsqu’on détecte dans son sérum la présence d'anticorps reconnaissant certaines protéines du virus, les antigènes viraux (par exemple la protéine virale p24). La reconnaissance est la liaison spécifique d’un anticorps avec une petite région de la protéine appelée déterminant antigénique. La protéine p24 du virus comporte plusieurs déterminants antigéniques, dont l’un, appelé 5.3, est utilisé dans le test de séropositivité. L’objectif de cet exercice est de chercher à déterminer, parmi deux anticorps proposés, lequel est spécifique du déterminant antigénique 5.3.
8 Utilisation des logiciels ANAGENE et RASTOP 1.
Ouvrir dans ANAGENE le fichier « sida03.edi ». A l’aide du logiciel, mettre en évidence la région de la protéine p24 qui correspond au déterminant antigénique 5.3. Noter sur la fiche réponse, les numéros des acides aminés de la protéine p24 correspondant à 5.3. 2.
Ouvrir avec RASTOP le fichier « p24.pdb » correspondant à un modèle de la protéine. Dans la fiche réponse, expliquez l’intérêt de l’étape 1 pour retrouver le déterminant antigénique dans ce modèle de la p24 (chaîne :P) présent à l’écran. 3.
Mettre en évidence le déterminant antigénique 5.3 à l’aide du logiciel RASTOP 4.
Ouvrir les fichiers «p24+Ac1.pdb» (p24 liée à un fragment de l’anticorps Ac1) et «p24+Ac2.pdb» (p24 liée à un fragment de l’anticorps Ac2). A l’aide des fonctionnalités du logiciel RASTOP, mettre en évidence pour chaque complexe moléculaire : a. la chaîne :H et la chaîne :L de l’anticorps b. la protéine p24 (chaîne p) c. le déterminant antigénique 5.3 de p24 5.
Modifier judicieusement la couleur de fond pour la lisibilité à l’impression 6.
Identifiez l’anticorps recherché. Justifiez votre choix. þ Résultats •
Présenter des images des modèles moléculaires traités au point 4 de manière judicieuse pour répondre au problème posé : exportez vos captures d’image dans votre fiche réponse. •
Enregistrer votre fichier, et imprimez-­‐en un exemplaire.
Exercice 2 : Test d’immunodiffusion ou test d’Ouchterlony
Pour créer des anticorps en laboratoire ou bien à des fins expérimentales, il est possible d’injecter un antigène à des lapins. Ils produisent alors des anticorps spécifiques, qui circulent dans leur sérum, et les lapins sont alors immunisés contre cet antigène. La présence d’anticorps spécifiques peut être mise en évidence par la méthode d’Ouchterlony. Un chercheur étourdi a injecté des antigènes à un lapin, mais a oublié de noter lesquels ! L’objectif de cet exercice est de retrouver le ou les antigènes qui ont été injectés à ce lapin de laboratoire. !Principe de la méthode Vous disposez pour ce test d’un échantillon du sérum du lapin immunisé (tube S). Afin de retrouver l'antigène pour lequel ce lapin a été immunisé, on a mis à votre disposition un tube témoin et plusieurs antigènes dont dispose le labo du chercheur maladroit. Il s’agit d’antigènes peptidiques extraits à partir du sérum sanguin de quelques animaux : Antigène Bo : extrait de sérum de bœuf Antigène Po : extrait de sérum de porc Antigène Ch : extrait de sérum de chèvre Antigène Cl : extrait de sérum de cheval Antigène La : extrait de sérum de lapin Témoin E : eau distillée Principe de la méthode d’Ouchterlony C’est une méthode d’immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu’elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s’il n’y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l’œil nu. Celui-­‐ci est dû à l’interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation de complexes immuns. Le temps de réaction est de l’ordre de 24h*. * Pour des raisons de délai, ce TP utilise des produits de substitution, qui simulent une immunodiffusion en 40 minutes seulement. Repère sur la
boite
Doc. 1 : Description du principe de l’immunodiffusion. Doc. 2 : Disposition des puits dans la gélose
(l’emplacement du repère sert à l’orientation de la boîte
de Pétri)
Doc. 3 : Aspect d’un arc de précipitation observé
24h après diffusion
QUESTIONS
1-­‐ Sachant que les solutions d’antigène et la solution de sérum diffusent toutes à la même vitesse, choisir la disposition des produits dans la boîte de Pétri. Justifiez votre choix. 2-­‐ Complétez le Document 2, en notant avec des lettres la disposition des produits à déposer dans les puits. !Réalisation du test En cas d’erreur de manipulation, vous pouvez demander une boîte de secours, pour reprendre votre manipulation là ou vous avez fait l’erreur. Faites attention, vous ne disposerez que d’une seule boîte de secours ! ü Préparation d’un gel d’Agar à couler dans une boîte de Pétri pour test d’Ouchterlony a.
Organiser votre plan de travail pour manipuler proprement en suivant les consignes de sécurité. b.
Peser dans la coupelle 0,2g d’Agar prélevés à l’aide de la spatule. c.
Verser 14 mL d’eau distillée puis l’Agar dans le Bécher et dissoudre soigneusement l’Agar avec la spatule. d.
Chauffer le mélange à 900 °C en remuant à la spatule jusqu’à ce que le mélange devienne limpide et arrêter au tout début de l’ébullition. e.
Retirer à l’aide de la pince en bois, attendre quelques secondes que le Bécher refroidisse afin de pouvoir saisir le flacon sans se brûler. f.
Verser environ la moitié du bécher de gel d’Agar chaud et fluide dans une boîte de Pétri g.
Egaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles. h.
Laisser la boîte refroidir sans mettre le couvercle. i.
Ne pas remuer les boîtes avant prise du gel d’Agar : environ 5 mn. ü Préparation du test a.
Utiliser le gabarit de perçage qui vous est fourni pour creuser les puits nécessaires dans le gel d’Agar, à l’aide du tube emporte-­‐pièce. b.
Veiller à marquer la boite sur le socle (pas sur le couvercle), pour orienter la boîte de Pétri. c.
Eliminer les disques de gélose avec un cure-­‐dent si nécessaire. ü Réalisation des dépôts a.
A l’aide de la micro-­‐pipette, remplir les différents puits avec 20 µL de chaque produit. Chaque dépôt devra être prélevé avec un cône propre, puis être déposé dans les puits sans débordement ni bulles et sans endommager le gel d’agar. b. Fermer la boîte, et laisser diffuser 40 minutes. þ Résultats •
Observer les résultats sur fond noir et en éclairage rasant. •
Schématisez les résultats du test, en reproduisant le Document 2 que vous compléterez pour indiquer l’emplacement du (des) arc(s) de précipitation. QUESTIONS
1-­‐ Dans chaque cas (formation de l’arc de précipitation, ou absence d’arc), réaliser un schéma d’interprétation à l’échelle moléculaire, en utilisant la symbolisation conventionnelle pour les immunoglobulines. 2-­‐ A partir des résultats fournis, déterminer quel est l’antigène injecté au lapin. Justifier votre réponse.