M1MHM 2012 partie 1 N etB [Mode de

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Apports de la Biologie Moléculaire à
l’étude des Maladies Héréditaires du
Métabolisme
Dr Cécile Acquaviva
[e-mail]
Dr Roseline Froissart
[email protected]r
Service des Maladies Héréditaires du Métabolisme et Dépistage néonatal
CBPE – Groupement Hospitalier Est - HCL
4 mai 2012
•Développement du concept de Maladies Héréditaires
du Métabolisme (MHM)
•Génétique classique et génétique inverse
•Apports de la biologie moléculaire à l’étude des MHM
Apports de la Biologie Moléculaire à l’étude des
Maladies Héréditaires du Métabolisme
DEVELOPPEMENT DU CONCEPT DE
M.H.M.
Le concept d'Erreurs Innées
1908 : Sir Archibald Garrod
Alcaptonurie
forte excrétion urinaire d'acide homogentisique (N=0)
caractère familial et forte consanguinité fréquente
en accord avec une transmission AR
Hypothèse : une enzyme responsable du métabolisme de
l’acide homogentisique est déficitaire chez les malades
Preuve →
→→
→La Du et al 1958
déficit hépatique en oxydase de l ’acide homogentisique
Le concept 1 gène – 1 enzyme
travaux de Beadle et Tatum (1941 – 59)
sur Drosophile et Neurospora Crassa
Tatum (Science, 1959) →
Tous les processus biochimiques dans tous les organismes sont sous contrôle
génétique
Ces processus biochimiques peuvent être résolus en une série de réactions
biochimiques
Chaque réaction biochimique est sous le contrôle d'un gène différent
La mutation d'un gène unique entraîne l'incapacité de la cellule à réaliser
cette réaction biochimique
Extension du concept 1 gène – 1 enzyme
1 gène peut coder
1 enzyme avec 1 fonction
1 enzyme avec plusieurs fonctions
plusieurs enzymes
1 chaîne polypeptidique d’une enzyme hétéromérique
1 déficit enzymatique peut →des déficits IIaires multiples
1 protéine non enzymatique
La notion 1 gène →1 enzyme a été étendue
à des protéines non enzymatiques
aux réactions post-transcriptionnelles et post-traductionnelles.

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Le concept de Maladie Moléculaire
Pauling 1949
Mutation →altération structure primaire de la protéine.
MHM sont dues à des gènes mutants qui produisent des
protéines anormales dont les activités fonctionnelles sont
altérées.
Les maladies héréditaires du métabolisme
Déficit enzymatique dans une voie métabolique
GENES
ENZYMES
METABOLITES A B C
G1G2G3
E1E3
E2
D
M
X
Accumulation Déficit
MHM : maladies rares “orphelines”
Rares individuellement : 1/10.000 à < 1/1.000.000
En tant que groupe : > 1/2000 naissances
Plus de 500 connues
Potentiellement plus nombreuses : 5 à 10.000 gènes seraient
consacrés au codage de protéines enzymatiques ou de transport.
Les MHM : maladies systémiques
Même si l’atteinte d’un organe est prédominante ou quasi
exclusive, elles affectent des systèmes biologiques
communs à de nombreuses ou à toutes les cellules
systèmes de production ou consommation d'énergie
systèmes de synthèse ou dégradation des constituants
cellulaires
systèmes de stockage et/ou d'élimination des déchets
systèmes d'adressage et de trafic dans et hors de la cellule
systèmes de régulation et d'information
Classification physiopathologique
Maladies qui agissent par "intoxication" (alimentation ou
catabolisme endogène protéique) →aminoacidopathies,
aciduries organiques, cycle urée, galactosémie,..
Maladies par déficit énergétique →GSD (GSDI), β-ox
mitochondriale des acides gras, déficits de la chaîne respiratoire
Maladies par déficit de synthèse ou de catabolisme de molécules
complexes (lysosomes, peroxysomes, CDG, …) Golgi
Lysosome
Mitochondrie
Peroxysome

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Maladies par "intoxication" endogène
Les signes sont liés à l'accumulation progressive d'un ou
plusieurs composés (aa, ac. orga., NH3…) d'origine alimentaire ou
produit(s) par le catabolisme protéique →
→→
→Traitements diététiques
Aminoacidopathies (PKU, leucinose,…) chromato. aa. sang et urines
Aciduries organiques (MMA, Ac. propionique,…) chromato. ac.
organiques urinaires
Déficits héréditaires du cycle de l'urée (déficit en OCT…)
Galactosémie dosage galactose, galactitol, gal-1-P
Maladies du métabolisme du cuivre et du fer (Wilson, hémochromatose),
porphyries héréditaires…
Maladies par déficit énergétique
Les symptômes sont dus en totalité ou en partie à un défaut
de production ou d'utilisation de l'énergie
Glycogénoses hépatiques et musculaires
Déficits héréditaires de l'oxydation mitochondriale
des acides gras
Déficits de la chaîne respiratoire mitochondriale
Maladies par déficit de synthèse ou de
catabolisme de molécules complexes
•Maladies peroxysomales
• Maladies lysosomales
•Anomalies du trafic intracellulaire de certaines molécules,
maladies dont le mécanisme causal n'est pas toujours
encore identifié
• Déficits de glycosylation des protéines (CDG)
MHM : transmission génétique
Maladies génétiques multifactorielles : diabète de type I …
Maladies monogéniques
génome nucléaire→transmission AD, AR, XR, XD
A.D. (hypercholestérolémie familiale...)
A.R. (PKU…)
liée à l'X – dominante (rachitisme hypophosphatémique …)
récessive liée à l'X (maladie de Hunter…)
génome mitochondrial
ADN nucléaire ou mitochondrial (transmission maternelle)
notion d’hétéroplasmie, de seuil
Maladies Héréditaires du Métabolisme
●Maladies pour lesquelles l’anomalie métabolique primitive est connue
– Diagnostic biochimique souvent possible par l’étude du produit du gène ou de sa fonction
– Approche thérapeutique de substitution ou d’éviction parfois possible
●Maladies pour lesquelles on dispose d’un marqueur biochimique fiable mais se situant
à un niveau inconnu par rapport au déficit primitif
– Diagnostic biochimique possible mais lésion primitive précise ???
●Maladies pour lesquelles on ne dispose d’ aucun marqueur biochimique
– diagnostic biochimique impossible
– pathogénie ???
Méthodes d’investigation des MHM
Dosage et/ou étude des substances circulantes
Métabolites : aa, acides organiques, acylcarnitines, MPS, protéines
circulantes,...
Milieux d'étude : urines, plasma, LCR, …
→
→→
→le plus svtdiagnostic d’orientation
Mesures d'activité enzymatique ou étude protéine :
Cellules sanguines ou cultivées ou tissus
→
→→
→diagnostic de «certitude»
Méthodes non invasives :
IRM spectroscopique, imagerie fonctionnelle,…
→
→→
→accès in vivo au métabolisme régional d'un organe

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Limites des méthodes d’investigation biochimique
●Étude des métabolites :
l’accumulation d’un même composé peut correspondre à plusieurs déficits
●Étude de la protéine déficitaire parfois difficile
– Techniquement : protéines non enzymatiques, protéines enzymatiques
d’activité = mais de localisation ≠,…
– Exprimée dans des tissus nécessitant un prélèvement invasif : foie,
cerveau, rein,… (DPN)
– Pseudodéficits (variants non patholologiques)
●Pronostic : ≠ in vivo/in vitro, polymorphismes associés,…
●Diagnostic des hétérozygotes
CLINIQUE
FONCTION GENE
THERAPEUTIQUE
Génétique classique et génétique inverse
Génétique classique et génétique inverse
2 démarches opposées
Maladie
Gène
Fonction
perturbée
Protéine
Localisation
génomique
Séquence / mutations
chez les malades
Génétique
classique
Génétique
inverse
Génétique classique
• Protéine connue purifiée →clivage en peptides
• Peptides →séquences d’acides aminés→séquences
nucléotidiques →criblage de banques d’ADNc →ADNc
→gène
• Recherche de mutations chez les malades pour valider
Génétique Inverse (1)
– Etudes de liaison génétique permettant une localisation
chromosomique
• Familles multiplex, homozygosity mapping
– Poursuite pour minimiser l’intervalle
• Plus de marqueurs et plus de familles si possible
– Recherche d’une hétérogénéité génétique : un ou
plusieurs loci
I - Le clonage positionnel

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Du locus au gène
•Repérer le gène
– repérage des exons (exon trapping...)
– mise en évidence des séquences exprimées
•Approche ciblée (clonage fonctionnel, gène candidat)
•Obtenir et séquencer un cDNA complet, puis l’ADN
•S’assurer que c’est le bon gène
– trouver des mutations chez les malades
– s’il existe une anomalie métabolique connue dans les cellules mutantes,
vérifier l’effet correcteur après transfection du cDNA isolé
Génétique Inverse (2) Génétique Inverse (3)
• Analyse de la séquence codante et reconstitution de la séquence polypeptidique
Recherche de “domaines” fonctionnels (homologies avec autres gènes/ protéines), sites
potentiels de glycosylation, motifs particuliers : ciblage ...
• Structure du gène et régulation de son expression
(y compris variations tissulaires)
• Pathologie moléculaire du gène
Mutations, corrélations génotype/phénotype
• Préparation d’anticorps afin d’étudier la protéine, de l’isoler et de définir sa
localisation, puis sa fonction
II - L’après gène
Elle constitue la seule possibilité en cas de protéines difficiles ou impossibles à
purifier (protéines membranaires,…). Ex : GSD I
Elle constitue la seule possibilité si la protéine et sa fonction ne sont pas
connues. ex : NPC
Néanmoins la disposition de marqueurs biochimiques reflétant le déficit primitif
(GSDI) ou une de ses conséquences : marqueur biochimique secondaire (NPC)
facilite l’obtention de groupes homogènes de malades
L’obtention de groupes homogènes de malades est plus difficile en l’absence de
marqueurs biochimiques (CLN4 : gène toujours pas connu, 1 ou plusieurs
gènes?)
Génétique Inverse (4)
Apports de la biologie moléculaire
aux MHM
Apports de la biologie moléculaire aux MHM
1 – Démembrement des cadres cliniques
2 – Compréhension du mécanisme biochimique ou moléculaire
3 - Apport au diagnostic et au pronostic
4 - Modèles animaux et Thérapeutique
1 - Démembrement de cadres cliniques
- Cliniques différentes et gène identique (ex MPS I/H, I/S)
- Clinique identique et gènes différents (ex MPS III, NPC 1 et 2)
- Protéine(s) inconnue(s) « génétique inverse » (ex NPC 1 et 2)
2 - Compréhension du mécanisme biochimique ou moléculaire
3 - Apport au diagnostic et au pronostic
4 - Modèles animaux – Physiopathologie – Thérapeutique
Apports de la biologie moléculaire aux MHM