14/03/2016 PELLAT Andréanne L2 CR : Nyl CHEMLI AIH Pr

AIH – Infections à mycobactéries et infections à spirochètes
14/03/2016
PELLAT Andréanne L2
CR : Nyl CHEMLI
AIH
Pr. Drancourt
18 pages.
Infections à mycobactéries et infections à spirochètes
A. Infections à spirochètes
I. Les spirochètes
a. Caractéristiques
Les spirochètes sont des bactéries : c'est à dire des êtres vivants unicellulaires délimités par une membrane, à
l'intérieur de cette membrane se trouve le cytoplasme contenant le matériel nucléaire (diffusé ou sous forme de
noyau), dépourvus de mitochondries.
Les spirochètes sont des bactéries dites « gram zéro » car elles ne sont pas du tout colorées par la coloration de
gram.
La coloration de gram est utilisée pour colorer les bactéries et faciliter leur visualisation au microscope. Elle
permet de distinguer 2 catégories de bactéries :
–Les gram négatives : coloration en rouge du à une structure particulière de l'enveloppe : ces bactéries
comportent une première enveloppe qui limite le cytoplasme, puis un deuxième enveloppe et ensuite
une enveloppe externe.
–Les gram positives : coloration en bleu, ces bactéries ont une membrane cellulaire et une autre
relativement épaisse. Elles ne possèdent pas d'enveloppe externe.
–Les gram dites « zéro » : elles ne sont pas colorées, on ne les voit pas au microscope.
Ces bactéries sont extrêmement mobiles : elles possèdent à l'intérieur de leur cytoplasme une flagelle qui est à
l'origine de leur mobilité. Elles ressemblent à des petits serpents.
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Plan :
A. Infections à spirochètes
I. Les spirochètes
II. La syphilis
III. La leptospirose
IV. Le genre Borrélia
B. Infections à mycobactéries
I. La tuberculose
II. La lèpre
III. Les ulcères de Buruli

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Il y a 3 genre de spirochètes pathogènes pour l'homme :
–Treponema : responsable de la syphilis
–Leptospira :responsable de la leptospirose
–Borrelia : responsable de la maladie de Lyme et des fièvres récurrentes
Tout ces microbes possèdent les mêmes caractéristiques morphologiques.
Ils sont dits de fastidieux car ils sont très difficiles à isoler et à cultiver en laboratoire à partir d'un prélèvement
fait chez l'homme. Le diagnostic des maladies causées par ces microbes ne va pas reposer sur leur isolement et
leur culture.
ex : Triponema Pallidum responsable de la Syphilis chez l'Homme n'est toujours pas cultivé alors que la
syphilis est l'une des maladies les plus anciennement connue chez l'homme (XVème siècle). On sait
diagnostiquer cette maladie, on sait que c'est ce microbe qui est responsable mais on arrive toujours pas
à l'isoler et à le cultiver depuis le temps.
b. Morphologie
Cette structure est commune à tous les spirochètes :
Elle est proche de celle des gram négatives car elle possède 3 enveloppes.
–une membrane plasmique
–un cylindre protoplasmique
–une membrane externe
–le flagelle responsable de leur forte mobilité : câble tendu qui parcourt tout le corps de la bactérie qui
permet à le membrane de battre. CR : le flagelle est contenu à l'intérieur du corps de la bactérie.
c. Méthodes de diagnostic
Ce sont des bactéries dont on ne sait pas faire ou pas facilement leur isolement en laboratoire, elles vont être
essentiellement diagnostiquées à partir des prélèvement des patients, où on va chercher l'ADN de la bactérie
grâce au diagnostic moléculaire (PCR temps réel).
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Illustration 1: Morphologie des spirochètes

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1) Diagnostic moléculaire, la PCR temps réel
On va chercher à amplifier un petit fragment de chromosome de la bactérie (entre 200 et 300 bases à peu près
en sachant que le chromosome de ces bactéries mesure entre 1 et 2 millions de bases (petit)).
Les fragments sont mis dans un thermocycleur qui va permettre de les amplifier.
On dit « à temps réel » car à chacun de ces cycles d'amplification, la machine va essayer de coller sur cette
région de 200-300 bases, une sonde d'une 40aine de bases strictement spécifiques de la région étudiée. Cette
sonde sera marquée par une substance fluorescente.
La machine mesure l'accumulation de fluorescence dans le tube de réaction.
A partir d'un certain de seuil de fluorescence la machine détermine que la réaction est positive.
Intérêt : Elle est très rapide, en 1h elle nous permet de faire le diagnostic de la maladie.
C'est une méthode de diagnostic direct : car on va chercher directement le microbe responsable de la maladie
infectieuse dans le prélèvement du patient.
2) La sérologie
C'est la deuxième méthode de diagnostic.
C'est une méthode de diagnostic indirect des maladies infectieuses. On ne cherche pas le microbe directement
mais on cherche les anti-corps sécrétés par le patient contre le microbe.
Il existe plusieurs techniques :
–L'Immunofluorescence
Les étapes :
* On met sur la lame du microscope le spirochète, on applique alors le sérum du patient :
→ si le sérum du patient contient des anti-corps contre le spirochète présent sur la lame ils vont se fixer
sur les bactéries
* On lave pour chasser l'excès du sérum du patient.
* Enfin on met des anti-corps anti-anti-corps humain marqués pas un fluorochrome.
On observe donc 3 couches :
1) les bactéries,
2) les anti-corps du sérum du patient
3) les anti-corps anti-anti-corps humain marqués par un fluorochrome.
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Illustration 2: Sérologie par
immunofluorescence

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–Cette méthode de diagnostic est extrêmement intéressante : On va utiliser le sérum du patient que l'on va
diluer en cascade (par exemple de 2 en 2), puis on passe chacune de ces dilutions dans notre réaction
d'immunofluorescence et on va regarder à partir de quelle dilution notre réaction devient négative.
A force de diluer il y a un moment où il n'y a plus assez d'anti-corps pour activer notre réaction
d'immunofluorescence indirecte.
La dernière dilution du sérum qui est encore positive s'appelle le titre de sérum.
Le titre correspond à ce qui va être marqué dans le compte rendu de sérologie
ex : la syphilis est positive jusqu'au 64ème, ce la signifie que lorsque l'on dilue le sérum du patient
64 fois, la réaction est encore positive mais que à la 128ème on obtient une réaction négative, 64 est
donc le titre du sérum.
Avoir un titre du sérum est intéressant car
- il nous indique la quantité d'anti-corps présents dans le sérum du patient
- il nous permet de comparer des titres de deux sérum que l'on a prélevé à quelques jours d'intervalles
chez le patient afin de savoir si il y a une modification au cours du temps ou non.
C'est une méthode très laborieuse et longue.
Cependant c'est une sérologie très intéressant nécessitant beaucoup de travail.
On a le résultat dans la journée.
–L'ELISA
Au départ c'est pareil que en immunofluorescence, nos deux premières couches sont identiques :
1) les bactéries
2) les anti-corps du sérum du patient
C'est la 3ème couche qui est différente : ce sont toujours des anti-corps anti-anti-corps humain mais au
lieu d'être marqués par un fluorochrome, ils sont liés à un enzyme qui va convertir un substrat incolore
en réaction colorée.
On va donc avoir des puits transparents si la réaction est négative et des puits plus ou moins
jaune/orange en fonction de la densité de la réaction.
L'avantage de cette méthode ELISA c'est qu'elle est automatisée.
Ce sont des machines qui prennent le sérum jusqu'à la lecture de la densité.
On utilise un densitomètre pour déterminer la densité optique de chaque puits.
C'est une méthode plus rapide.
L'inconvénient est que le résultat obtenu est rendu en densité optique, or la densité optique n'est pas
proportionnelle à la quantité d'anti-corps contenus dans le sérum, on ne pourra donc pas comparer deux
sérums entre eux.
–La Western Blot
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Illustration 3: Exemple de Western Blot

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C'est une méthode particulièrement utilisée en sérologie.
Elle est également utilisée dans le diagnostic du VIH ainsi que dans le diagnostic d'un certain nombre
de spyrochètes.
La méthode :
* On prends les bactéries, à partir des bactéries on fait une extraction de toutes les protéines de la
bactérie
* On fait migrer ces protéines dans un gel d'électrophorèse grâce à un courant électrique en fonction de
leur taille et de leur poids moléculaire. Les plus grosses vont rester au niveau du dépôt et les plus petites
vont migrer plus loin.
Pour l'instant on ne voit rien du tout sur le gel d'électrophorèse, ce gel est constitué de manière
générale de poly-acrylamides qui est une matière synthétique. C'est un gel transparent, très difficile
à manipuler car il est très cassant, cancérogène.
Ce gel est difficile à manipuler en laboratoire, on va alors le transférer sur une membrane plus facile
à manipuler et non dangereuse (feuille de nylon).
* On met le gel de poly-acrylamide sur une feuille de nylon, on refait passer un courant électrique dans
le sens opposé à la première fois, et les protéines qui ont été séparées lors de la première étape vont
passer sur la feuille de nylon. On obtient alors quelques chose de très facile à manipuler.
To blot = transférer
* Pour rendre visible les protéines on va utiliser différents colorants (le Bleu de Coomassi qui se fixe
sur toutes les protéines, non dangereux et très facile à utiliser)
* On voit alors apparaître différentes bandes chacune correspondante à une protéine qui a migré de haut
en bat en fonction de son poids moléculaire sur la feuille de nylon :
- les plus lourdes migrent en haut
- les plus légères migrent en bas
Pour obtenir la sérologie :
* On met le sérum du patient sur la feuille du patient, si il y a des anti-corps dans le sérum du patient
contre la bactérie ils vont aller accrocher les protéines séparées.
Intérêt : chaque anti-corps contre une protéine va aller reconnaître sa protéine.
*On lave.
* On révèle si il y a une réaction ou pas selon le même principe que pour l'ELISA, on met des anti-corps
anti-anti-corps humain liés à un enzyme, on va rajouter la substance incolore qui sous l'action de
l'enzyme va devenir colorée se présentant sous la forme de bande.
Chaque trait marron observé sur la feuille de nylon signifie que l'ensemble de la réaction s'est réalisée
sur cette protéine là.
–
A la fin, sérum par sérum on décrit le profil protéique allumé par le sérum du patient, tout les patients
n'allume pas de la même façon par rapport à une même bactérie.
C'est une technique longue et laborieuse qui dure une semaine.
Intérêt : on peut faire une comparaison de deux sérum d'un même patient et voir si il y a une évolution
du profil sérologique du patient.
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