UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE
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UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE Les effets synergiques des cytokines pro-inflammatoires et des cytokines impliquées dans l’homéostasie sur les réponses des lymphocytes T CD8 aux antigènes Par Julien Gagnon Programme d’études supérieures en immunologie Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en immunologie Sherbrooke, Québec, Canada 15 avril 2016 Subburaj Ilangumaran, Ph.D. (directeur) Gilles Dupuis Ph.D . (co-directeur) Klaus Klarskov Ph.D. (co-directeur) Patrick McDonald Ph.D. (interne du programme d’immunologie) Guylain Boulay Ph.D. (externe du programme d’immunologie) Martin Guimond Ph.D. (examinateur externe) © [Julien Gagnon, 2016] [Dédicace] À tous ceux qui ont permis à cet ouvrage de naître… [Épigraphe] « Le secret de la guerre réside dans la communication » Napoléon Bonaparte I RÉSUMÉ Les effets synergiques des cytokines pro-inflammatoires et des cytokines impliquées dans l’homéostasie sur les réponses des lymphocytes T CD8 aux antigènes Par Julien Gagnon Programme d’études supérieures en immunologie Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.) en immunologie. Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 II L’IL-7 et l’IL-15 sont des cytokines impliquées dans l’homéostasie des lymphocytes T CD8 naïfs et mémoires respectivement. Lors d’une réponse immunitaire, certaines cytokines pro-inflammatoires, comme l’IL-6 et l’IL-21, sont produites par les cellules du système immunitaire inné. Nous avons observé que certaines cytokines de ces deux groupes (homéostasie et pro-inflammatoires), peuvent avoir un effet synergique sur la fonction des lymphocytes T CD8. Spécifiquement, l’incubation des lymphocytes T CD8 naïfs avec l’IL-6 ou l’IL-21, en présence d’IL-7 ou d’IL-15 cause une forte prolifération qui est indépendante de l’antigène. De plus, la combinaison d’IL-15 avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraîne une prolifération préférentielle des lymphocytes T mémoires, tandis que la combinaison avec l’IL-7 entraîne une prolifération des lymphocytes T naïfs. La stimulation des lymphocytes T CD8 avec l’IL-6 ou l’IL-21, en présence d’IL-7 ou d’IL-15, entraîne une augmentation de la phosphorylation en tyrosine de STAT5 ainsi qu’une augmentation de liaison à l’ADN. Nous avons étudié l’effet d’une pré-stimulation des cellules T CD8 naïves par les cytokines synergiques sur leur réponse subséquente à un antigène. Nous avons observé qu’une pré-stimulation avec l’IL-6 ou l’IL-21, en présence d’IL-7 ou d’IL-15, même pour une courte durée de 24 heures, augmente leur sensibilité aux antigènes, entraînant une robuste prolifération et une forte augmentation de cytotoxité spécifique à l’antigène gp33. Nous avons observé que les cytokines pro-inflammatoires en combinaison avec l’IL-7 induisent une augmentation accrue de la prolifération chez les lymphocytes T CD8 exprimant un TCR transgénique de forte affinité (P14), ainsi que les cellules exprimant un TCR de faible affinité (H-Y). De plus, la combinaison synergique de cytokines entraîne une forte expression du récepteur de l’IL-2R (CD132), ainsi qu’une augmentation de la production d’IL-2 après stimulation antigénique. Une forte augmentation de l’expression de CD8 et de CD45, ainsi qu’une diminution drastique de l’expression de CD5 peut expliquer l’augmentation de l’avidité fonctionnelle du TCR suite à une stimulation avec les combinaisons de cytokines synergiques. La stimulation des lymphocytes T CD8 avec les combinaisons de cytokines, induit une augmentation de la phosphorylation de LAT ainsi qu‘AKT. Cependant, la stimulation subséquente du CD3 n’entraîne pas d’augmentation de la phosphorylation de LAT ainsi qu’AKT chez les lymphocytes T CD8 pré-stimulés avec les combinaisons de cytokines. Nous avons aussi observé que les lymphocytes T CD8 stimulés avec les combinaisons de cytokines augmentent l’expression de CD62L, ce qui peut favoriser leur migration vers les ganglions lymphatiques. En conclusion, la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-15, IL-21) par les cellules du système immunitaire inné lors d’une infection ou d’une inflammation, ainsi que la présence constitutive d’IL-7, peuvent stimuler la prolifération et l’activation des lymphocytes T CD8 de façon non spécifique à l’antigène. Cette stimulation entraîne une augmentation de l’avidité fonctionnelle de leur TCR causant ainsi une forte prolifération ainsi que l’acquisition de fonctions effectrices spécifiques. Cette liaison entre le système immunitaire inné et adaptatif, médiée par les cytokines pro-inflammatoires et les cytokines homéostatiques joue un rôle très important dans l’élimination des pathogènes ainsi que dans le développement de maladies auto-immunitaires. Mots clés : CD8+ T lymphocytes, IL-7, IL-6, IL-15, IL-21, TCR avidité, CD5 III SUMMARY Increased antigen responsiveness of CD8 T cells after cytokine primings By Julien Gagnon Immunology program Thesis presented at the Faculty of medicine and health sciences for partial fulfillement of the Philosophiae Doctor (Ph.D.) degree in immunology, Faculty of medicine and health sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 IV Homeostasis of naive and memory CD8+ T lymphocytes is dependent on two cytokines IL-7 and IL-15, respectively. During an immune response to an infection, cells of the innate immune system produce several pro-inflammatory cytokines. We have observed that these two groups of cytokines, namely proinflammatory and homeostatic, can have a synergistic effect on CD8 T lymphocytes. Specifically, incubation of naive CD8 T cells with IL-6 or IL-21 in the presence of IL-7 or IL-15 induced strong proliferation in an antigen independent manner. While the combination of IL-6 or IL-21 with IL-15 induced strong proliferation of memory CD8 T cells, naïve CD8 T cells responded better to the combination with IL-7. These stimulatory cytokine combinations elicited strong STAT5 phosphorylation and it’s binding to DNA in CD8 T cells. We investigated the effect of priming CD8 T cells with the synergistic combination of IL-6 or IL-21 and IL-7 on their subsequent response to antigen. We observed that cytokine priming for only 24 hours enhanced their sensitivity to antigen, resulting in strong proliferation, effectors functions and cytotoxicity. These effects were observed with CD8 T cells expressing transgenic TCR with strong (P14) or weak (H-Y) affinity towards cognate peptide antigens. Priming CD8 T cells with the synergistic combination of cytokines increased the expression of IL-2 receptor gamma (CD132) and augmented the production of IL-2 when stimulated with antigen. These cells also expressed elevated levels of CD8 and CD45, as well as down modulate CD5, and these events may underlie the increased TCR avidity. Stimulation of CD8 T cells with the synergistic combination of cytokines induced phosphorylation of LAT and AKT. However, subsequent TCR stimulation did not further increase these phosphorylation events. We have observed that CD8 T cells primed with the synergistic combinations of cytokines up regulated CD62L, which could promote their migration through lymph nodes. In conclusion, inflammatory cytokines such as (IL-6, IL-15, IL-21) secreted by cells of the innate immune system during an infection or non-infectious inflammation, and basal levels of the homeostatic cytokine IL-7 can act in synergy with inflammatory cytokines to activate CD8 T lymphocytes in an antigen independent manner. This stimulation also results in an increase in the functional avidity of their TCR, as indicated by strong antigen responsiveness with increased proliferation and display of effectors functions. This connection between the innate and adaptive system mediated by inflammatory cytokines may play an important role in pathogen clearance and possibly in the development of autoimmune diseases. Keywords : CD8+ T lymphocytes, IL-7, IL-6, IL-15, IL-21, TCR avidity, CD5 V TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ .................................................................................................................................................I SUMMARY ......................................................................................................................................... III TABLE DES MATIÈRES.................................................................................................................... V LISTE DES FIGURES ...................................................................................................................... VII LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................... IX LISTE DES ABRÉVIATIONS UTILISÉES ...................................................................................... X CHAPITRE 1 - INTRODUCTION ...................................................................................................... 1 1. SYSTÈME IMMUNITAIRE ............................................................................................................... 1 1.1. Réponse immunitaire innée .................................................................................................. 1 1.2. Réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T....................................................... 2 2. GÉNÉRATION, MATURATION ET SÉLECTION DES LYMPHOCYTES T ............................................... 3 3. ACTIVATION DES LYMPHOCYTES T CD8 NAÏFS ............................................................................ 5 4. GÉNÉRATION DES LYMPHOCYTES T CD8 MÉMOIRES ................................................................... 7 5. RÔLES DES LYMPHOCYTES T CD4 DANS L’ACTIVATION ET LA TOLÉRANCE. ................................ 9 6. HOMÉOSTASIE DES LYMPHOCYTES T ......................................................................................... 11 7. 8. 9. 6.1. Lymphocytes T naïfs ........................................................................................................... 12 6.2. Lymphocytes T mémoires ................................................................................................... 14 6.3. Lymphopénie ...................................................................................................................... 14 6.4. Maladies auto-immunes induites par la lymphopénie ........................................................ 16 6.5. Cytokines impliquées dans la génération de maladies auto-immunes ................................ 18 CYTOKINES ET LEURS RÉCEPTEURS............................................................................................ 20 7.1. Famille des cytokines ......................................................................................................... 20 7.2. Rôles biologiques de l’IL-2, l’IL-4, l’IL-7, l’IL-9 et l’IL-15 ............................................... 23 7.3. Rôles biologiques de l’IL-21............................................................................................... 23 7.4. Rôles biologiques de l’IL-6 ................................................................................................ 28 7.5. Récepteurs des cytokines partageant la chaîne gamma commune (c) ............................... 28 7.6. Récepteur des cytokines partageant la chaîne commune gp130......................................... 32 SIGNALISATION DES RÉCEPTEURS DE CYTOKINES ...................................................................... 33 8.1. Signalisation des récepteurs de cytokines de la famille c ................................................. 35 8.2. Signalisation des récepteurs de cytokines de la famille gp130 ........................................... 39 INHIBITION DE LA VOIE DE SIGNALISATION DES CYTOKINES ...................................................... 41 9.1. Récepteurs de cytokines solubles ........................................................................................ 41 9.2. « Protein inhibitor of activated STAT » (PIAS) .................................................................. 42 VI 9.3. Phosphatases ...................................................................................................................... 42 9.4. « Suppressor of cytokines signaling » (SOCS) ................................................................... 43 10. SIGNALISATION DU TCR ....................................................................................................... 47 10.1. Caractéristiques du récepteur du TCR ............................................................................... 47 10.2. Affinité et avidité du TCR ................................................................................................... 47 10.3. Initiation de la signalisation par le complexe du TCR ....................................................... 48 10.4. Organisation spatio-temporelle du complexe du TCR........................................................ 52 10.5. Signalisation distale du TCR .............................................................................................. 53 CHAPITRE 2 - ARTICLE 1 ............................................................................................................... 56 RÉSUMÉ ............................................................................................................................................. 58 ABSTRACT ......................................................................................................................................... 60 INTRODUCTION .................................................................................................................................. 60 MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................... 62 RESULTS ............................................................................................................................................ 66 DISCUSSION ....................................................................................................................................... 84 ACKNOWLEDGMENTS ........................................................................................................................ 87 REFERENCES ...................................................................................................................................... 87 CHAPITRE 3 ARTICLE 2 ................................................................................................................. 94 RÉSUMÉ ............................................................................................................................................. 96 ABSTRACT ......................................................................................................................................... 98 INTRODUCTION .................................................................................................................................. 99 RESULTS .......................................................................................................................................... 101 DISCUSSION ..................................................................................................................................... 116 METHODS ........................................................................................................................................ 119 ACKNOWLEDGMENTS ...................................................................................................................... 122 REFERENCES .................................................................................................................................... 122 CHAPITRE 4 ..................................................................................................................................... 126 INTRODUCTION ................................................................................................................................ 127 MATÉRIELS ET MÉTHODES ............................................................................................................... 128 RÉSULTATS ...................................................................................................................................... 130 CHAPITRE 5 - DISCUSSION ......................................................................................................... 141 CHAPITRE 6 - CONCLUSION ....................................................................................................... 155 REMERCIEMENTS ......................................................................................................................... 157 RÉFÉRENCES .................................................................................................................................. 158 VII LISTE DES FIGURES Figure 1 : Développement des lymphocytes T dans le thymus. .......................................................................... 4 Figure 2 : Trois signaux afin d’engendrer une réponse immunitaire optimale ................................................... 7 Figure 3 : Influence des cytokines pro-inflammatoires dans la génération des lymphocytes T CD8 mémoires. 8 Figure 4 : Polarisation des lymphocytes T CD4 dépendante des cytokines ...................................................... 11 Figure 5 : Effets de la lymphopénie sur la diversité de la population de lymphocytes T. ................................. 17 Figure 6 : Rôles biologiques de l’IL-21. (Leonard et al., 2008)........................................................................ 27 Figure 7 : Récepteurs de la famille de l’IL-2. ................................................................................................... 29 Figure 8 : Phénotypes et nombre relatif de lymphocytes T CD8 + avant, pendant l’activation et lors de la génération de lymphocytes T CD8+ mémoires. ................................................................................................ 31 Figure 9 : Signalisation des cytokines par la voie des JAK/STAT. .................................................................. 34 Figure 10 : Signalisation du récepteur de l’IL-21. ............................................................................................ 38 Figure 11 : Signalisation du récepteur de l’IL-6. .............................................................................................. 40 Figure 12 : Inhibition des voies de signalisation des récepteurs de cytokines .................................................. 46 Figure 13 : Initiation de la signalisation du TCR par agrégation. ..................................................................... 49 Figure 14 : Ségrégation du complexe du TCR. ................................................................................................. 51 Figure 1. IL-6 induces proliferation of CD8+ T cells in the presence of IL-7 or IL-15. ................................... 68 Figure 2 : Comparison of the synergistic effects of IL-6 and IL-21 in stimulating proliferation CD8+ T cells in the presence of IL-7 or IL-15. ........................................................................................................................... 70 Figure 3. IL-6 stimulates proliferation of naïve and memory CD8+ T cells in synergy with IL-7 or IL-15..... 73 Figure 4. Concomitant stimulation of CD8+ T lymphocytes by IL-6 or IL-21 augments STAT5 phosphorylation and its DNA-binding activity induced by IL-7 or IL-15. ....................................................... 77 Figure 5. Pre-stimulation of CD8+ T cells with IL-6 and IL-7 lowers the TCR signaling threshold. ............... 79 Figure 6. Cytokine-stimulated CD8+ T cells display increased cytolytic activity following Ag re-stimulation. .......................................................................................................................................................................... 81 Figure 7. Cytokine stimulation of P14 cells induces a distinct phenotypic differentiation program compared to stimulation via the TCR. ................................................................................................................................... 83 Figure 1. Brief exposure to IL-7 and IL-6 or IL-21 is sufficient to ‘prime’ naive CD8 T cells to proliferate robustly upon subsequent antigen stimulation. ............................................................................................... 103 Figure 2. Cytokine priming strongly enhances antigen-induced cytolytic activity in naive CD8 T cells. ...... 105 Figure 3. Cytokine priming of naive CD8 T cells rapidly enhances antigen-induced secretion of IFN and IL2. ..................................................................................................................................................................... 107 Figure 4. Increased proliferation of cytokine-primed P14 cells to antigen requires autocrine IL-2 stimulation. ........................................................................................................................................................................ 109 Figure 5. Cytokine priming augments TCR-stimulated proliferation independently of costimulation. .......... 112 Figure 6. Cytokine priming rapidly downmodulates CD5 via induction of its transcriptional repressor E47. 115 VIII Figure 1: L’affinité du TCR influence le phénotype des lymphocytes T CD8 après une stimulation de 2 jours avec les cytokines. .......................................................................................................................................... 132 Figure 2: La préstimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente la sensibilité du récepteur CD8 ................................................................................................................................................. 134 Figure 3: La préstimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente la sensibilité du récepteur CD8 ................................................................................................................................................. 136 Figure 4: La stimulation de lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraine une forte expression de CD45. ........................................................................................................................ 138 Figure 5: La stimulation avec l’IL-6 et l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 augmente la présence de GM1. 140 IX LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Implications de l’IL-21 et de la lymphopénie dans le développement de maladies auto-immunes. .......................................................................................................................................................................... 19 Tableau 2 : Implications de l’IL-6 et de la lymphopénie dans le développement de maladies auto-immunes . 19 Tableau 3 : Famille de récepteurs des cytokines de type I et de type II ............................................................ 22 Tableau 4 : Phénotypes des souris déficientes en cytokines ou en leurs récepteurs de la famille IL-2............. 36 X LISTE DES ABRÉVIATIONS UTILISÉES ADN Ag AP1 CPA ARN Bad Bax CBM CCR CD CMH CRP CXCR DAG Dc DN DP EAE FACS FERM Foxp3 GAS GDP GEF Glut-1 GM-CSF Gp Grb2 GTP IFN Ig IRES Itk JAK Kd Lat Lck LIF LIP LPS M MAPK NF-AT Acide désoxyribonucléique Antigène Activator Protein-1 Cellule présentatrice d’antigène Acide Ribonucléique Bcl-2-associated death promoter Bcl-2–associated X Cytokine binding module C-C chemokine receptor Cluster of differentiation Complexe majeur d’histocompatibilité C rective protein C-X-C chemokine receptor Diacylglycérol Cellule dendritique Double négatif Double positif Experimental autoimmune encephalomyelitis Fluorescence-activated cell sorting F for 4.1 protein, E for ezrin, R for radixin and M for moesin forkhead box P3 IFN activation sequence Guanosine diphosphate Guanine nucleotide exchange factors Glucose transporter Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Glycosylated protein Growth factor receptor-bound protein 2 Guanosine-5'-triphosphate Interferons Immunoglobulin IFN-stimulated response elements IL2-inducible T-cell kinase Janus kinase dissociation constant Linker of Activated T cells Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase Leukemia inhibitory factor Lymphopenia-induced proliferation Lipopolysaccharides Molaire Mitogen-activated protein kinases Nuclear factor of activated T-cells XI NK PAMP PI3K PIAS PIP3 PLC PRR PTB PTP1B RET RFI SCF SH2 SOCS SP Tcm TCR Tem Tg Th Tfh TLR TNF Treg ZAP70 Natural killer Pathogen-associated molecular patterns Phosphoinositide 3-kinase Protein inhibitors of activated STAT Phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate (PtdIns(3,4,5)P3) Phospholipase C Patron de reconnaissance de pathogène Phosphotyrosine-binding domain Protéine-tyrosine phosphatase 1B Récemment émigrés du thymus Intensité de fluorescence relative Side Scatter Src Homology 2 Suppressor of cytokine signaling Simple positive Lymphocyte T mémoire central T cell receptor Lymphocyte T mémoire effecteur Transgénique Lymphocyte T helper Lymphocyte T helper folliculaire Toll-like receptors Tumor necrosis factors Lymphocyte T régulateur Zeta-chain-associated protein kinase 70 1 CHAPITRE 1 - INTRODUCTION Dans cette introduction, nous allons aborder l’importance des cytokines dans la génération, le maintien et le fonctionnement du système immunitaire. 1. Système immunitaire Le système immunitaire est composé d’un ensemble d’organes formés de tissus et de cellules dont l’objectif est de protéger l’organisme contre les pathogènes (virus, bactéries, parasites et champignons) et contre des cellules cancéreuses. Le système immunitaire comporte plusieurs organes lymphoïdes, dont la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, la rate et le thymus. Certaines cellules du système immunitaire patrouillent l’organisme grâce au réseau sanguin et lymphatique, tandis que d’autres cellules sont résidentes de tissus. Une réponse immune se déroule de façon ordonnée et comporte deux phases. La première qui débute par une reconnaissance spécifique à un type de pathogène (immunité innée) et qui évolue vers la deuxième phase, la réponse spécialisée (immunité acquise). La coordination de la réponse immunitaire est dirigée par des messagers solubles, appelés cytokines. 1.1. Réponse immunitaire innée Le système immunitaire se divise en deux sections : le système immun inné et le système immun adaptatif. La réponse immunitaire innée est la réponse initiale contre un pathogène et ne génère pas de mémoire immunitaire. À la suite de l’invasion d’un pathogène à travers la couche de cellules épithéliales, il sera phagocyté par les macrophages, les cellules dendritiques et les neutrophiles. Les cellules phagocytaires détectent et s’activent grâce aux récepteurs de patrons de reconnaissance de pathogène (PRRs) qui reconnaissent les motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) (Palm et al., 2009). Les PAMPs reconnus par les PRR doivent être uniquement exprimés par les pathogènes et doivent représenter une diversité de pathogènes. La réponse immunitaire innée résorbe l’infection en 2 induisant de l’inflammation, en phagocytant les pathogènes, en produisant des substances bactéricides et en recrutant d’autres cellules phagocytaires. Lors de la réponse initiale par les cellules du système immunitaire inné, il y a une production de cytokines pro-inflammatoires qui auront un effet subséquent sur le développement de la réponse immunitaire spécifique (Curtsinger et al., 1999). 1.2. Réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T Les cellules phagocytaires activées (macrophages et cellules dendritiques) migrent vers les ganglions lymphatiques afférents au site d’infection. Les cellules phagocytaires dégradent les pathogènes en petits peptides qui sont ensuite exprimés à la surface cellulaire grâce au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Il existe 2 types de CMH, le CMH de classe I, qui présente aux lymphocytes T CD8 des peptides provenant du cytosol de la cellule, ainsi que le CMH de classe II qui présente aux lymphocytes T CD4 des peptides provenant de particules phagocytées. Ces cellules présentatrices d’antigènes (CPA) activent le récepteur de lymphocyte T (TCR) d’un lymphocyte T CD4 qui reconnaît spécifiquement cet antigène présenté par un CMH de classe II. Une fois activés, les lymphocytes T CD4 produisent des cytokines permettant de diriger la réponse immunitaire vers une réponse humorale, en activant les lymphocytes B ou une réponse cellulaire en activant les lymphocytes T CD8 cytotoxiques. Les lymphocytes T CD8 quittent les ganglions lymphatiques et migrent vers le site d’infection. Les lymphocytes T activés reconnaissent spécifiquement, grâce à leur TCR, les antigènes présentés par un CMH de classe I exprimé par les cellules et les tuent grâce à leur action cytotoxique (Lefrancois et al., 2010). La réponse immunitaire adaptative a un inconvénient, elle nécessite plusieurs jours afin de générer une réponse immunitaire spécifique. Par contre, elle possède l’avantage de générer beaucoup de lymphocytes mémoires spécifiques aux pathogènes, ce qui permet d’écourter la durée d’une réinfection par le même pathogène. 3 2. Génération, maturation et sélection des lymphocytes T Les cellules du système immunitaire sont originaires de cellules souches hématopoïétiques provenant de la moelle osseuse. Les cellules lymphoïdes précurseures des lymphocytes T migrent de la moelle osseuse au thymus (Akashi et al., 2000). Lors de la première étape de la maturation, les cellules lymphoïdes n’expriment pas le TCR, ni les marqueurs de surface CD4 ou CD8, ils sont nommés double négatif (DN) (Takahama, 2006). L’IL-7 et le SCF sont deux cytokines essentielles à la maturation des lymphocytes T. En absence de ces cytokines, il a une diminution importante de génération de lymphocytes T (Akashi et al., 2000). Le récepteur des lymphocytes T (TCR) est formé d’une chaîne bêta et alpha qui est exprimée après recombinaison. Durant la phase DN3 les thymocytes expriment la chaîne bêta, par la suite ces thymocytes vont exprimer le CD4 et le CD8 à leur surface, ces cellules sont nommées double positif (DP) (Hayday et al., 2006). À cette étape, le TCR alpha est exprimé après recombinaison des gènes. La formation de dimère des chaînes TCR alpha et bêta va générer une très grande diversité de récepteurs (1x1013) (Nikolich-Zugich et al., 2004). Cette diversité va ensuite être modelée par la sélection thymique afin d’éliminer les lymphocytes T exprimant un TCR autoréactif ou les TCR qui ne reconnaissent aucun antigène. La première étape est la sélection positive. Les lymphocytes T expriment à leur surface une seule recombinaison du TCR. Lors de la sélection positive, les lymphocytes T dont le TCR reconnaît un peptide du soi présenté par une molécule du CMH (classe I ou II) vont survivre, tandis que les lymphocytes T dont le TCR ne reconnaît rien meurt par négligence (~98 %). Par la suite, la sélection négative entraîne l’élimination par apoptose des lymphocytes T reconnaissent trop fortement les peptides du soi (~1 %) (Sprent et al., 2008). Les lymphocytes T expriment à leur surface le CD4 ou le CD8 selon leur interaction avec le CMH-II ou le CMH-I respectivement (Hayday et al., 2007) (Figure 1). Seulement 1 à 2 % des thymocytes survivent à la sélection thymique (Bevan, 1997). Cependant, la sélection n’est pas parfaite, une proportion de lymphocytes T autoréactifs échappent à la sélection thymique et se retrouvent en périphérie (Parish et al., 2008). Ces lymphocytes T autoréactifs sont contrôlés par la tolérance immune. 4 Figure 1 : Développement des lymphocytes T dans le thymus. Inspiré de (Fridkis-Hareli et al., 2004). 5 3. Activation des lymphocytes T CD8 naïfs Après leur développement, les lymphocytes T CD8+ naïfs émigrent hors du thymus et colonisent les organes lymphoïdes périphériques. Les lymphocytes T CD8 + sont impliqués dans la reconnaissance et la destruction de cellules infectées par des pathogènes ainsi que des cellules tumorales. La réponse des lymphocytes T CD8+ passe par quatre phases : l’activation, l’expansion clonale, la contraction et la génération de lymphocytes T CD8+ mémoires. Les lymphocytes T CD8 nécessitent 3 signaux pour atteindre leur activité maximale. Le premier signal provient du TCR qui reconnaît un peptide présenté par une molécule de CMH de classe I. Le TCR des lymphocytes T CD8 reconnaît des peptides (9-11 acides aminés de long) présentés par un CMH-I. Le CMH-I est exprimé de façon ubiquitaire par presque toutes les cellules nucléées de l’organisme. Le CMH-I présente à sa surface membranaire des peptides qui ont été synthétisés à l’intérieur de la cellule (peptide du soi, peptides viraux ou de pathogènes intracellulaires) (Bonilla et al., 2010). Les CPA peuvent aussi faire de la présentation croisée, c’est-à-dire qu’un pathogène extracellulaire qui a été phagocyté peut-être présenté par le CMH-I (Heath et al., 2001). Dans la plupart des cas, les lymphocytes T CD8 naïfs sont activés dans les ganglions lymphatiques (Huber et al., 2009) par présentation croisée avec les cellules dendritiques. Le résultat de cette rencontre va dépendre du stade de maturation des cellules dendritiques. La présentation d’un Ag par une cellule dendritique immature va entraîner la tolérance (ignorance, délétion, anergie) tandis que la présentation d’un Ag par une cellule dendritique mature entraîne l’activation des lymphocytes T CD8 (Steinman et al., 2003). Les cellules dendritiques matures expriment des molécules de co-stimulation qui sont nécessaires pour l’activation des lymphocytes T CD8. Le récepteur CD28 des lymphocytes T CD8 interagit avec les molécules CD80 et le CD86 exprimé par les CPA matures. Les CPA peuvent murir de deux façons, la stimulation des récepteurs de motifs de reconnaissance de pathogènes (PRR) comme les TLR, ainsi que par l’interaction avec un lymphocyte T CD4 activé exprimant le CD40 ligand (Bennett et al., 1998). La combinaison de la signalisation du TCR et de la stimulation des molécules de co-stimulation entraînent l’activation des lymphocytes T CD8. 6 Cependant, il a été rapporté dans la littérature que même si les DC expriment fortement les molécules de co-stimulation, certains Ag induisent peu ou pas l’activation des lymphocytes T CD8 (Fujii et al., 2004). Afin d’obtenir une activation maximale, un troisième signal est nécessaire. Le troisième signal est fourni par les interférons de type I (IFN et ), l’IFN, et l’IL-12. Ces cytokines pro-inflammatoires sont produites par les cellules du système immunitaire inné comme les CPA activées. Il a été montré qu’en absence d’IL-12 ou d’IFN les lymphocytes T CD8 naïfs purifiés proliféraient peu in vitro lorsqu’ils étaient exposés à un Ag présenté par une CPA artificielle exprimant des molécules de costimulation. Cependant, la prolifération des lymphocytes mémoires est indépendante des cytokines pro-inflammatoires (Curtsinger et al., 1999). Il a été aussi montré que la présence d’IL-12 augmentait la production de lymphocytes T effecteurs (Gately et al., 1991) et que les IFN/ augmentaient leur survie (Marrack et al., 1999) et la production d’IFN(Nguyen et al., 2002). Les lymphocytes T CD8+ activés produisent de l’IL-2 qui agit de manière autocrine et stimule l’expansion clonale et la différenciation en cellules effectrices. L’expansion clonale des lymphocytes T effecteurs est indépendante du TCR, mais est soutenue par des cytokines IL-2, IL-7 et IL-15 (Mercado et al., 2000 ; Badovinac et al., 2002). Les lymphocytes T effecteurs sont cytotoxiques et peuvent engendrer l’apoptose spécifique des cellules infectées par la libération de granules (granzyme B et perforines) ou par l’activation de la voie de Fas/FasL des cellules cibles (Harty et al., 2002). Les lymphocytes T CD8+ effecteurs ont une expression plus importante de certains marqueurs de surface, dont le CD69, IL-2R (CD25), IL-2R (CD122) c (CD132), CD44, et à la baisse de CD62L. En conclusion, la réponse optimale des lymphocytes T CD8 nécessite 3 signaux (figure 2). Le premier signal se fait par la signalisation du TCR à la suite de la rencontre d’un Ag présenté par un CMH-I exprimé sur une CPA mature. La CPA mature exprime des ligands de co-stimulation qui va induire le signal numéro deux en stimulant le CD28 exprimé chez les lymphocytes T CD8. Le troisième signal est induit par les cytokines pro-inflammatoires comme IL-12, IFN et IFN produit par les CPA matures. 7 Figure 2 : Trois signaux afin d’engendrer une réponse immunitaire optimale Inspiré de l’article (Gutcher et al., 2007) 4. Génération des lymphocytes T CD8 mémoires Les lymphocytes T mémoires sont issus de l’activation de lymphocytes T naïfs suite à la rencontre avec un antigène présenté par un CMH et reconnu spécifiquement par le TCR de ces lymphocytes. À la suite de l’activation, il y a une expansion clonale et l’acquisition de capacités effectrices et finalement l’élimination des pathogènes. Lorsque l’infection est résolue, 95 % des lymphocytes effecteurs entrent en apoptose et seulement 5 % se transforment en lymphocytes T mémoires (Stemberger et al., 2009). La contraction de la réponse immunitaire des cellules T CD8 est causée par l’absence de stimulation antigénique, l’épuisement des ressources en cytokines et à l’induction de l’AICD par IL-2 (Refaeli et al., 1998 ; Marrack et al., 2000). Les processus et les facteurs qui déterminent la sélection d’un lymphocyte T CD8 activé pour une différenciation en cellule mémoire ne sont pas encore bien connus. Les lymphocytes T mémoires se caractérisent par une augmentation de la rapidité, de la magnitude et de la sensibilité à la réponse à un antigène (Jameson et al., 2009). Les lymphocytes T mémoires ont des phénotypes variés, mais peuvent se classer en deux catégories : les lymphocytes T mémoires centraux et effecteurs. Les 8 lymphocytes T mémoires centraux (Tcm) expriment fortement le CD62L et le CCR7 leur permettant de migrer vers les ganglions lymphatiques et la rate (Sallusto et al., 2004). Tandis que les lymphocytes mémoires effecteurs (Tem) expriment faiblement ces molécules de surface cellulaire et se retrouvent dans les organes non lymphoïdes (poumon, foie et intestin) possiblement à l’endroit d’inflammation où ils ont le plus de possibilités de rencontrer leur antigène (Refaeli et al., 1998 ; Masopust et al., 2001). Les cellules Tem ont une capacité de réponse immédiate à un pathogène . Certaines cytokines pro-inflammatoires peuvent influencer la génération de lymphocytes T mémoires (figure 3). Une inflammation importante et des cytokines pro- inflammatoires comme l’IL-2 et l’IL-12 entraînent une augmentation du nombre de lymphocytes T effecteurs de courte durée de vie tandis que le déclin de l’inflammation va engendrer des lymphocytes T mémoires centraux (D’cruz et al., 2009). De plus, il a été montré que la surexpression de l’IL-21 entraîne une augmentation du nombre de lymphocytes T CD8 mémoires (Allard et al., 2007). Figure 3 : Influence des cytokines pro-inflammatoires dans la génération des lymphocytes T CD8 mémoires. Inspiré de l’article de (Cox et al., 2011). 9 5. Rôles des lymphocytes T CD4 dans l’activation et la tolérance. Les lymphocytes T CD4 ont un rôle primordial dans l’orchestration de la réponse immune adaptative en sécrétant des cytokines impliquées dans l’activation de la réponse humorale ou cellulaire. Les lymphocytes T CD4 ont aussi un rôle important dans la maturation des CPA. Le TCR des lymphocytes T CD4 reconnaît des peptides présentés par une CMH-II. Contrairement au CMH-I qui est exprimé par la majorité des cellules, le CMH-II est exprimé seulement par les cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Afin d’activer un lymphocyte T CD4, il faut qu’il y ait reconnaissance par le TCR d’un Ag présenté par un CMH-II ainsi que l’interaction de molécules de co-stimulation (CD40L/CD40) (Ridge et al., 1998). Le lymphocyte CD4 activé produira de l’IL-12 (Cella et al., 1996). Cette activation favorise la transprésentation d’un Ag phagocyté par le CMH-I. La présence d’IL-12 peut favoriser le rejet de greffe et l’élimination de tumeurs solides (Curtsinger et al., 2007). Les lymphocytes T CD4 ont un rôle fondamental dans l’activation des lymphocytes T CD8 (figure 4). Les lymphocytes T CD4 peuvent être polarisés vers plusieurs phénotypes (Th1, Th2, Th17, Tfh, Treg) qui auront un impact important sur l’orientation de la réponse immune. Le micro-environnement de cytokines joue un rôle primordial dans la polarisation des lymphocytes T CD4. Les lymphocytes T CD4 de type Th1 ont besoin d’une stimulation avec de l’IL-12 pour produire de l’IFN, du TNF, de l’IL-2, et induire une défense contre des pathogènes intracellulaires (virus, bactéries) ou contre des cellules cancéreuses. Les lymphocytes Th2 nécessitent une stimulation avec de l’IL-4 afin de produire de l’IL-4, l’IL-5, l’IL-13 afin d’induire une réponse humorale contre des pathogènes extracellulaires. (Moss et al., 2004 ; Coffman, 2006 ; Rochman et al., 2009). La génération des Th17 nécessite la présence d’IL-6 ou d’IL-21 en combinaison avec du TGF ainsi que l’activation du facteur de transcription RORt (Korn et al., 2007). L’IL-21 est aussi impliqué dans la prolifération et l’expansion de lymphocytes Th17. Les Th17 sont l’une des sources importantes d’IL-21. L’IL-23 est important pour stabiliser le phénotype Th17. Certaines cytokines du micro-environnement peuvent antagoniser la différenciation des autres sous-types de lymphocytes T CD4. Il a été récemment montré que l’IL-21 et IL-6 bloquent la différenciation des lymphocytes T régulateurs inductibles (iTreg) 10 favorisant ainsi une polarisation vers les Th17 et une réponse inflammatoire impliquée dans certaines pathologies (Monteleone et al., 2008). De plus, l’IL-21 semble renverser l’effet inhibiteur des lymphocytes régulateurs iTreg (Li et al., 2008). La polarisation des lymphocytes T CD4 vers un sous-type est importante pour une réponse immunitaire adéquate envers un type de pathogène en particulier. Une réponse de type Th1 est impliquée dans l’élimination des pathogènes intracellulaires, tandis qu’une réponse de type Th2 est impliquée dans l’élimination des pathogènes extracellulaires. Cependant, l’expansion non contrôlée des lymphocytes Th1 peut entraîner des maladies auto-immunes et inflammatoires tandis qu’une dérégulation de la réponse Th2 peut entraîner des maladies atypiques telles que les allergies et l’asthme. Les lymphocytes Th17 semblent aussi impliqués dans la réponse contre certains types de pathogènes, mais pourraient être aussi impliqués dans des pathologies auto-immunes et inflammatoires (Bettelli et al., 2007). Les lymphocytes T CD4 folliculaires (Tfh) sont impliqués dans l’activation des lymphocytes B dans les centres germinaux des organes lymphoïdes secondaires induisant ainsi la permutation somatique, la commutation isotypique et la sélection des lymphocytes B de forte affinité. Les Tfh et les lymphocytes B matures expriment le CXCR5 qui leur permet de migrer vers les centres germinaux. Le développement de Tfh est dépendant de l’IL-6, l’IL-21 ainsi que de l’activation de STAT3 et Bcl-6 (Nurieva et al., 2008a ; Nurieva et al., 2009). Les souris déficientes en IL-21 n’ont pas de Tfh, de centre germinatif et les lymphocytes B ne peuvent pas faire la commutation isotypique (Nurieva et al., 2008a). Les lymphocytes T CD4 régulateurs (Treg) ont un rôle important dans le contrôle de l’auto-immunité. Les lymphocytes T régulateurs sont caractérisés par une expression constitutive du récepteur CD25 et aussi par l’expression du facteur de transcription Foxp3. Les souris mutantes pour Foxp3 ou pour l’IL-2 développent des maladies auto-immunes (Fontenot et al., 2003 ; Sakaguchi, 2004). 11 Pathogènes intracellulaire Pathogènes extracellulaire Tolérance Inflammation Formation du centre germinatif des follicules Figure 4 : Polarisation des lymphocytes T CD4 dépendante des cytokines Inspiré de l’article (King et al., 2008) 6. Homéostasie des lymphocytes T Le nombre de lymphocytes T dans l’organisme reste relativement constant au cours de la vie même après une réponse immune, une lymphopénie et l’involution du thymus à l’âge adulte. La quantité constante de lymphocytes T dans l’organisme permet de déduire que des mécanismes de contrôle sont présents permettant de réguler la survie, la prolifération et l’apoptose. Il existe plusieurs mécanismes afin d’assurer le maintien du nombre de lymphocytes en périphérie, ces mécanismes varient selon l’état (naïfs ou mémoire) et selon le contexte de prolifération (normal ou lymphopénique) des lymphocytes T. 12 6.1. Lymphocytes T naïfs Les lymphocytes T naïfs sont des cellules dont le TCR exprimé à leur surface n’a pas encore été exposé ou n’a pas encore reconnu un antigène spécifique. Ces lymphocytes T peuvent être différentiés des lymphocytes T effecteurs ou mémoires par une faible expression du CD44 à leur surface cellulaire, l’expression de la molécule de CD44 à la surface des lymphocytes T indique qu’ils sont activés ou qu’ils sont des lymphocytes T mémoires. Ces lymphocytes T naïfs ont la caractéristique de se diviser que très rarement en condition normale (Sprent et al., 2008). La prolifération basale des lymphocytes T naïfs n’entraîne pas de modification de leur phénotype (Rocha et al., 1989). Dans la périphérie, les lymphocytes T naïfs doivent recevoir deux signaux pour survivre, une stimulation par l’IL-7 et une faible stimulation du TCR par un peptide du soi présenté par une molécule de CMH (Sprent et al., 2003b ; Boyman et al., 2007). L’IL-7 est une cytokine essentielle afin de maintenir les lymphocytes T naïfs en périphérie. L’IL-7 est produite de façon constitutive par les cellules stromales et épithéliales de plusieurs organes, dont le thymus, la moelle osseuse, les intestins, la rate et les ganglions périphériques (Lee et al., 2005). Le nombre de lymphocytes T reste constant dans l’organisme dû à la quantité restreinte d’IL-7. La déplétion d’IL-7 par des anticorps anti-IL-7, la déficience en IL-7 ou de l’une des chaînes du récepteur engendre une diminution ou l’absence lymphocytes T naïfs (Kondrack et al., 2003). Contrairement à ce qui a été observé chez les souris mutantes, les souris transgéniques pour l’IL-7 ont une augmentation marquée de lymphocytes T naïfs (Mertsching et al., 1995 ; Kieper et al., 2002). En raison de la quantité restreinte d’IL-7 produite par l’organisme, les cytokines telles que l’IL-2, l’IL-4, l’IL-6 et l’IL-15 permettent la survie des lymphocytes T CD8+ et l’internalisation du récepteur de l’IL-7 (Park et al., 2004). Les lymphocytes T ayant survécu à la sélection thymique sont ceux pouvant reconnaître faiblement des antigènes du soi présentés par un CMH de classe I pour les lymphocytes T CD8 et les CMH de classe II pour les CD4. Lorsque ces lymphocytes T émigrent en périphérie, ils dépendent aussi d’une stimulation faible de leur TCR. L’importance de la signalisation du TCR dans la survie des lymphocytes T 13 en périphérie a été montrée par le transfert de lymphocytes T chez des souris déficientes en CMH ainsi que chez des souris dont on pouvait induire la perte d’expression du TCR (Brocker, 1997 ; Tanchot et al., 1997 ; Polic et al., 2001). De plus, les lymphocytes T entrent en compétition entre eux pour les peptides du soi afin de recevoir leurs signaux de survie (Hayday et al., 2007). Les lymphocytes T CD8 ayant une plus forte affinité pour un antigène du soi vont proliférer davantage. L’affinité des TCR pour leur Ag corrèle avec l’expression de CD5 à la surface cellulaire. Les lymphocytes T CD8 qui expriment un haut niveau de CD5 prolifèrent davantage, indiquant un TCR de plus forte affinité contre un antigène du soi (Azzam et al., 2001 ; Kieper et al., 2004). L’avidité du TCR des lymphocytes T CD4 semble être contrôlée de façon similaire (Kassiotis et al., 2003). Cette concurrence pour les peptides du soi permet de favoriser une diversité des TCR puisque des TCR ayant la même affinité pour un antigène du soi doivent entrer en compétition afin d’obtenir un signal de survie (Moses et al., 2003). Pour survivre, les lymphocytes doivent migrer vers les ganglions lymphatiques afin de recevoir leurs signaux de survie. Les lymphocytes T naïfs expriment fortement le CD62L (L-sélectine) et le CCR7 leur permettant de migrer vers les ganglions. Les cellules réticulaires fibroblastiques de la zone T des ganglions lymphatiques sont les principales sources d’IL-7 et de CCL19 le ligand du CCR7 (Link et al., 2007 ; Surh et al., 2008). Afin de favoriser les lymphocytes T récemment émigrés du thymus (RET) qui exprime une nouvelle diversité de TCR, les RET expriment plus fortement l’IL-7R (CD127), leur permettant d’avoir un avantage sur les lymphocytes déjà résidents de la périphérie (Hassan et al., 2001). Le nombre de lymphocytes T naïfs versus mémoires est relativement stable, mais tend à favoriser les lymphocytes T mémoires avec l’âge, dû à l’involution du thymus et la génération de lymphocytes T mémoires induite par la rencontre de pathogènes au cours de la vie (Surh et al., 2005). 14 6.2. Lymphocytes T mémoires Pour survivre dans l’organisme, les lymphocytes T mémoires ont besoin principalement d’IL-15 pour leur prolifération, mais aussi de l’IL-7 pour leur survie (Sprent et al., 2003b ; Boyman et al., 2007 ; Surh et al., 2008). Chez les souris IL-15 transgéniques (IL-15tg), la population de lymphocytes T mémoires est beaucoup plus élevée (Fehniger et al., 2001). Au contraire, chez les souris déficientes en IL-15 ou en IL-15R il y a une diminution importante de lymphocytes T mémoires (Zhang et al., 1998). Les lymphocytes T mémoires n’ont pas besoin d’une stimulation de leur TCR pour leur survie en périphérie (Tough et al., 1994). De plus, ils expriment fortement le CD127 (IL-7R) du récepteur de l’IL-7 et le CD122 (IL-2/15R) du récepteur de l’IL15 (Boyman et al., 2007). Contrairement aux lymphocytes T naïfs, les lymphocytes T mémoires se divisent une fois aux deux à trois semaines afin de compenser la disparition de lymphocytes morts par l’apoptose (Tough et al., 1994). La limitation de la taille de la population de lymphocytes T mémoires est contrôlée par la quantité limitante d’IL-15 produite principalement par les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DC) après activation (Dubois et al., 2002 ; Schluns et al., 2004). 6.3. Lymphopénie La lymphopénie est caractérisée par une perte de l’homéostasie, c’est-à-dire, par une diminution drastique de la quantité de lymphocytes T due principalement à une infection virale, à la chimiothérapie ou à une irradiation (Surh et al., 2005). La prolifération induite par la lymphopénie (LIP) est un processus impliqué dans la division des lymphocytes restant afin d’atteindre le nombre normal de lymphocytes T dans l’organisme (Ge et al., 2002) (figure 5). La prolifération LIP survient aussi lors de la génération du compartiment du système immunitaire en périphérie chez les souris néonatales (Min et al., 2003). L’apport massif de lymphocytes T émigrant du thymus (RET) chez les souris néonatales assure une diversité des TCR ce qui n’est pas le cas chez les individus adultes. Lors d’une lymphopénie, il y a une augmentation de la quantité d’IL-7 circulante due à l’absence de l’utilisation par les lymphocytes T (Bolotin et al., 1999) L’augmentation de la concentration d’IL-7 et la diminution de la 15 concurrence pour les peptides du soi entraînent la prolifération des lymphocytes T CD8 naïfs. De plus, il a été montré qu’il y avait une synergie entre la signalisation du TCR et celle du récepteur de l’IL-7 augmentant ainsi leur prolifération (Seddon et al., 2002). La prolifération LIP induit une perte du phénotype naïf et une acquisition du phénotype ressemblant aux lymphocytes mémoires effecteurs (CD44 Hi) (Goldrath et al., 2000). La transformation du phénotype des lymphocytes T naïfs en phénotype mémoire effecteur leur permet de répondre plus efficacement à une stimulation antigénique permettant une certaine protection immunitaire lors d’une lymphopénie (Khoruts et al., 2005). Chez la souris, les lymphocytes T se divisent de 1 à 5 fois durant 2 à 3 semaines. La prolifération des lymphocytes T CD8 est plus prononcée que celle des lymphocytes T CD4. Lorsque le nombre normal de lymphocytes T est atteint, le phénotype ressemblant au mémoire et les capacités effectrices sont perdus. Contrairement à une réponse immunitaire qui engendre l’expansion d’un clone spécifique, LIP induit la prolifération de tous les lymphocytes envers des peptides du soi présentés par le CMH des cellules dendritiques (DC) conservant ainsi la diversité restante des TCR (Sprent et al., 2008). Les lymphocytes T CD8 mémoires nécessitent seulement l’IL-7 ou l’IL-15 pour leur prolifération LIP et se divisent de façon beaucoup plus intense que les lymphocytes T naïfs lors d’une lymphopénie (Cheung et al., 2009). La prolifération préférentielle des lymphocytes T mémoires possèdent l’avantage de favoriser les lymphocytes possédant des TCR qui sont reconnus pour réagir contre un pathogène. Lors d’une lymphopénie causée par une infection virale, des cytokines proinflammatoires telles que l’IL-12, l’IL-18, l’IFN-type I, l’IFN sont produites. Ces cytokines vont augmenter la prolifération des lymphocytes T mémoires en induisant la production IL-15 (Tough et al., 2001). 16 6.4. Maladies auto-immunes induites par la lymphopénie À l’âge adulte, la lymphopénie engendre une perte de la diversité des TCR puisque les lymphocytes T générés sont des clones des lymphocytes T restant dans l’organisme (figure 5). De plus, l’involution du thymus à l’âge adulte réduit grandement l’apport de lymphocytes T exprimant, de nouveaux TCR (Khoruts et al., 2005). La prolifération engendrée par une lymphopénie nécessite la stimulation du TCR par un peptide du soi, la prolifération de certains lymphocytes T autoréactifs peut être favorisée (Figure 5). Durant une période de lymphopénie, les lymphocytes T ayant une plus forte avidité pour un peptide du soi, présentés par un CMH, ont un potentiel prolifératif plus important (Kassiotis et al., 2003a ; Ge et al., 2004). Les lymphocytes T peuvent être activés en l’absence de molécules de co-stimulation (Prlic et al., 2001) et migrer dans le tissu périphérique (Hagen et al., 2004). La concentration d’IL-7 et d’IL-15 est augmentée lors d’une lymphopénie et ces cytokines sont aussi impliquées dans le développement d’une réponse auto-immune. Il a été montré que ces cytokines renversaient l’anergie des lymphocytes T (Teague et al., 2006). La prolifération et l’activation de lymphocytes T autoréactifs combinées à la perte de la tolérance par les T régulateurs entraînent le développement de l’autoimmunité. L’incidence faible de maladies auto-immunes suggère que des mécanismes sont présents pour contrôler les lymphocytes T autoréactifs. La lymphopénie seule n’est pas suffisante pour induire des maladies auto-immunitaires suggérant que des facteurs environnementaux (virus, cytokines pro-inflammatoires), des prédispositions génétiques (CMH, cytokines pro-inflammatoires) et bris de l’un ou des mécanismes de tolérance (déplétion des Treg) sont nécessaires afin d’induire le développement de maladies auto-immunes. 17 Figure 5 : Effets de la lymphopénie sur la diversité de la population de lymphocytes T. Inspiré de l’article de (Khoruts et al., 2005). 18 6.5. Cytokines impliquées dans la génération de maladies auto-immunes Des études ont démontré que plusieurs maladies auto-immunes se développent après une lymphopénie et sont aussi intimement associées à certaines cytokines proinflammatoires comme l’IL-6 et l’IL-21 (Datta et al., 2008 ; Tajima et al., 2008) (Tableau 1 et 2). Le diabète de type I, l’arthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux, la maladie cœliaque et la maladie de Crohn sont tous associés à une diminution de la fonction splénique et à une atrophie des organes lymphoïdes secondaires. De plus, des infections par le virus de l’influenza, de la varicelle, de la rubéole, du virus du Nil sont associées à des lymphopénies transitoires. Le virus d’immunodéficience humaine VIH entraîne une lymphopénie sévère des lymphocytes T CD4. Les traitements antiviraux qui favorisent la reconstitution lymphocytaire favorisent aussi le développement de maladies auto-immunes plus fréquentes et plus sévères (Khoruts et al., 2005). 19 Tableau 1 : Implications de l’IL-21 et de la lymphopénie dans le développement de maladies auto-immunes. Maladies Causes Diabète type 1* Arthrite rhumatoïde* La déficience en IL-21 ou IL-21R protège contre la Sclérose en maladie plaques (EAE)* IL-21 augmente la pathologie Maladies Maladie auto-immunes Susceptibilité génétique cœliaque* Inhibe la formation des T régulateurs Maladie de Génération Th17 Crohn* Lupus érythémateux* (Bubier et al., 2007 ; Andersson et al., 2008 ; Fina et al., 2008 ; Garrote et al., 2008 ; Liu et al., 2008 ; Spolski et al., 2008 ; Datta et al., 2009) * Implication de la lymphopénie Tableau 2 : Implications de l’IL-6 et de la lymphopénie dans le développement de maladies auto-immunes Maladies Diabète type 1 Causes Maladies autoimmunes Arthrite rhumatoïde Sclérose en plaques (EAE) Lupus érythémateux (Campbell et al., 1991 ; Begum-Haque et 2008) Effet +/- selon les études Augmentation du diabète chez les souris transgéniques produisant de l’IL-6 dans les îlots de Langerhans Réduction d’incidence IL-6 KO ou anticorps inhibiteurs Haute concentration d’IL-6 dans le liquide synovial des patients arthritiques Anticorps neutralisant, récepteur soluble, IL-6 KO, agent pharmacologique réduisent l’incidence de la maladie Anticorps neutralisant, récepteur soluble, IL-6 KO, agents pharmacologiques réduisent l’incidence de la maladie Haute concentration d’IL-6 Polymorphisme gène d’IL-6 Anticorps neutralisant réduisent l’incidence de la maladie al., 2008 ; Emery et al., 2008 ; Wozniacka et al., 20 7. Cytokines et leurs récepteurs Les cytokines et leurs récepteurs ont des fonctions cruciales dans la génération, l’homéostasie et les capacités effectrices des lymphocytes T. Dans cette section, il sera question de la classification des cytokines et de leurs récepteurs, leurs rôles biologiques et de leurs principales voies de signalisation. 7.1. Famille des cytokines Les cytokines sont classifiées selon l’homologie des chaînes de leurs récepteurs qui se divisent en deux types. L’ectodomaine des récepteurs de type I possède un CBM (cytokine binding module) formé de deux domaines fibronectines de type III. On retrouve dans ce CBM un motif de résidus cystéines et prolines bien conservé (WSXWS) permettant de lier une vaste gamme de cytokines ayant une structure protéique tridimensionnelle formée de 4 hélices alpha (hormones, interleukines, colony-stimulating factors) (Nicola et al., 1998 ; Wang et al., 2009). Les récepteurs de type I ont une grande divergence en raison de la partie cytoplasmique de leur récepteur, mais possèdent un motif semblable à tous les récepteurs de type I (Box 1 et 2) formé d’une hélice alpha hydrophobe riche résidus proline qui est impliquée dans la liaison de la tyrosine kinase Janus-Kinases (Jaks). Les récepteurs de cytokines n’ont pas d’activité kinase intrinsèque, ils doivent s’associer à des protéines kinases afin de pouvoir induire une signalisation. Les récepteurs de cytokines de type I dépendent principalement de la voie de JAKs/STAT afin de transmettre un signal du récepteur membranaire au noyau (voir section signalisation). Le développement de la génomique a permis de découvrir une grande variété de cytokines en identifiant des motifs conservés par les cytokines et leurs récepteurs (Foster et al., 2004). Cependant, ce type d’approche ne permettait pas d’associer les cytokines et les récepteurs nouvellement découverts créant ainsi des cytokines et des récepteurs orphelins. Certaines cytokines utilisent des complexes de récepteurs formés de deux ou trois chaînes. Les récepteurs de type I se sous-divisent en trois classes qui se caractérisent par le partage d’une chaîne commune (c, c, gp130) (Tableau 3). 21 (Gadina et al., 2001). La combinaison de la chaîne commune et une chaîne alpha ou bêta spécifique à la cytokine forment le récepteur de forte affinité. Les récepteurs de type II se caractérisent aussi par un motif CBM formé de deux domaines fibronectines de type III. Cependant, le motif WSXWS n’est pas présent dans le domaine fibronectine II, mais est remplacé par un nombre variable de résidus cystéines et de prolines. Les récepteurs de cytokines de type II se divisent en deux familles : ceux de la famille de l’interféron (IFN), ceux de la famille de l’IL-10 (IL10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28A, IL-28B et IL-29) (Tableau 3). Les récepteurs de type II utilisent aussi la voie des JAK/STAT afin d’engendrer leur signalisation. Dans les prochaines sections, nous allons nous concentrer sur les cytokines et les récepteurs de type I, plus principalement la famille c et la famille gp130. 22 Tableau 3 : Famille de récepteurs des cytokines de type I et de type II Famille de récepteurs de cytokines Chaîne partagée Cytokines IL-2, IL-7, IL-9, IL-15 c Type I IL-21 JAK1, STAT3, JAK3 STAT1 IL-4 c gp130 GM-CSF, IL-3, IL-5 IL-6, IL-11, CNTF, LIF, OSM IFN, IFN, Type II IFN/IL-10 Molécules de signalisation JAK STAT STAT5 IFN IL-10 *Inspiré de l’article de (Gadina et al., 2001) STAT6 JAK2 JAK1, JAK2, Tyk2 STAT5 STAT3 STAT1 JAK1, STAT1, Tyk2 STAT2 JAK1, JAK2 JAK1, Tyk2 STAT1 STAT3 23 7.2. Rôles biologiques de l’IL-2, l’IL-4, l’IL-7, l’IL-9 et l’IL-15 Les cytokines de la famille c sont importantes pour la génération, le développement, l’activation et l’homéostasie des lymphocytes T. Comme mentionné précédemment, l’IL-7 est importante pour la génération et le maintien de la population de lymphocytes T naïfs tandis que les lymphocytes mémoires nécessitent de l’IL-7 pour leur survie et de l’IL-15 pour leur prolifération. L’IL-2 est principalement impliquée dans l’expansion clonale des lymphocytes T activés, dans la contraction des lymphocytes T CD8 effecteurs à la fin de la réponse immunitaire et dans la génération et le maintien de lymphocytes T CD4 régulateurs. L’IL-4 est impliquée dans la polarisation des lymphocytes T CD4 vers un phénotype de type Th2 qui oriente la réponse immunitaire vers une réponse de type humorale. L’IL-9 est une cytokine de la famille c qui est produite principalement par un nouveau type de lymphocytes T CD4 appelé Th9. L’IL-4 et le TGF sont nécessaires afin de polariser un lymphocyte T CD4 en Th9. L’IL-9 agit principalement sur les mastocytes, les lymphocytes T régulateurs, les cellules Th17 et les CPA en induisant certaines cytokines. L’IL-9 est impliquée dans l’inflammation allergique, dans certains cas elle peut aggraver les maladies auto-immunes et augmenter l’élimination de certains parasites (Noelle et al., 2010). 7.3. Rôles biologiques de l’IL-21 La chaîne alpha du récepteur de l’IL-21 est la dernière chaîne de récepteur appartenant à la famille c à avoir été découverte en 2000 (Ozaki et al., 2000 ; Parrish-Novak et al., 2000). L’IL-21R a été trouvé par bio-informatique en identifiant les séquences codant pour les motifs qui caractérisent les récepteurs de cytokines de type I (voir section famille cytokine). Cette technique ne permet toutefois pas d’identifier le ligand du récepteur. L’IL-21 a été identifié en transfectant la chaîne du récepteur IL-21R chez des cellules BaF3, ces cellules ont été ensuite misent en contact avec le surnageant d’une centaine de lignées cellulaires stimulées au PMA (Parrish-Novak et al., 2000). Cette technique a permis d’identifier que des cellules CD3 positives produisent le ligand. 24 L’IL-21R est exprimée chez les lymphocytes B, les lymphocytes T, les « natural killer » (NK) DC, les macrophages et les kératinocytes (Spolski et al., 2008). L’expression de l’IL-21R est augmentée lors de leur l’activation (Mehta et al., 2004 ; Spolski et al., 2008). L’expression de l’IL-21R est régulée à la hausse lors de l’activation des lymphocytes T et est dépendant du facteur de transcription Sp1 (Wu et al., 2005). Le patron d’expression cellulaire de l’IL-21R indique que l’IL-21 agit à la fois sur le système immunitaire inné et acquis. L’IL-21 est produite principalement après activation des lymphocytes T CD4 de type Th17 et des cellules NKT (Figure 6). La présence d’IL-6 ou d’IL-21 entraîne aussi la production d’IL-21 par les Th17. De plus, il a été montré que l’IL-7 et l’IL-15 pouvaient induire la production d’IL-21 chez des lymphocytes T CD3+ humains, cette production était augmentée lors d’ajout d’IL-21 (Caprioli et al., 2008). La région régulatrice du promoteur de l’IL-21 contient trois sites de liaison pour NF-AT, et en absence du site NF-AT, il n’y a pas de production d’IL-21 après une stimulation avec le calcium ionophore ionomycine. Le promoteur de l’IL-21 contient une séquence d’activation IFN (GAS) qui peut lier les facteurs de transcriptions STAT. L’inhibition de STAT3 bloque la production d’IL-21 après stimulation avec l’IL-21. Il a été récemment rapporté qu’un certain sous-type de lymphocytes T CD8 (Tc17) pouvait produire de l’IL-21 lorsqu’il était stimulé avec de l’IL-6 ou de l’IL-21 en présence de TGF- en présence d’anti-CD3 (Huber et al., 2009 ; Ortega et al., 2009). Cependant, ces lymphocytes T CD8 étaient moins cytotoxiques in vitro, mais engendraient un plus grand rejet des tumeurs in vivo (Hinrichs et al., 2008). Les lymphocytes T CD8 qui sont activés par un antigène en présence d’IL-21 expriment moins le CD44 et le CD25 (IL-2R) et produisent moins d’IFN. Ces lymphocytes produisent plus d’IL-2, et expriment plus fortement le CD62L à leur surface ce qui leurs permettent de migrer aux ganglions expliquant partiellement les effets de rejet de tumeurs in vivo. La surexpression de l’IL-21 entraîne une accumulation de lymphocytes T CD8 ayant un phénotype mémoire central dans les ganglions et dans la rate ainsi qu’une réduction de la proportion de lymphocytes T naïfs (Allard et al., 2007). 25 L’IL-21 peut agir comme co-stimulateur en augmentant la capacité cytotoxique ainsi que la production d’IFN par les lymphocytes T CD8 (Parrish-Novak et al., 2000). De plus, la surexpression d’IL-21 ou l’injection d’IL-21 augmente l’élimination virale et empêche l’épuisement des lymphocytes T CD8 lors d’une infection chronique (Elsaesser et al., 2009). L’IL-21 agit de façon synergique avec l’IL-7, l’IL-15 et l’IL-18 afin d’augmenter la production d’IFN par les lymphocytes T CD8 après stimulation antigénique (Strengell et al., 2003 ; Alves et al., 2005 ; Zeng et al., 2005). De plus, il a été montré que l’IL-21 a un effet synergique avec l’IL-7 ou l’IL-15 en augmentant la prolifération des lymphocytes T CD8 naïfs (Alves et al., 2005) et effecteurs (Zeng et al., 2005 ; Liu et al., 2007). Les souris déficientes en IL-21 n’ont pas d’anomalies notables en ce qui concerne la génération des lymphocytes, mais montrent une déficience pour ce qui est de la réponse cytotoxique des lymphocytes T CD8 (Zeng et al., 2005). L’IL-21 en combinaison avec l’IL-15 entraîne une régulation à la hausse de l’expression du CD28 à la surface des lymphocytes T CD8 (Alves et al., 2005). La présence d’IL-21 lors de la maturation des DC semble inhiber leur maturation en réduisant l’expression du CMH-II et en empêchant la maturation induite par le LPS (Brandt et al., 2003). De plus, l’IL-21 augmente l’expression de SOCS1 et SOCS3 chez les DC inhibant leur fonction (Strengell et al., 2006). L’IL-21 est impliquée dans la production d’anticorps et chez les souris IL-21-/- IL21R-/- il y a une augmentation des IgE et une diminution des IgG. Les souris mutantes pour l’IL-4 et l’IL-21 ont une déficience en anticorps (IgG et certains IgM) semblable à ce que nous observions chez les souris XSCID suggérant une collaboration entre l’IL4 et l’IL-21 dans la production d’anticorps (Ozaki et al., 2002). Les souris IL-21 transgéniques ont une augmentation marquée d’IgG et d’IgM sans toutefois avoir une différence dans la quantité d’IgE. L’IL-21 entraîne l’apoptose des lymphocytes B fraichement isolés ou B stimulés avec CD40 ou avec un anticorps anti-IgM. L’IL-21 semble induire l’apoptose des lymphocytes B qui ne sont pas complètement activés. Cependant, la stimulation du BCR et le CD40 chez des lymphocytes B activés au LPS semblent prévenir l’effet proapoptotique de l’IL-21. Ces résultats indiquent que l’IL-21 serait impliquée dans la maturation des lymphocytes B dépendante des 26 lymphocytes T et dans l’inhibition des lymphocytes B autoréactifs (Jin et al., 2004 ; Leonard et al., 2008). L’IL-21 serait impliquée dans la formation des centres germinaux dans les organes lymphoïdes secondaires (Vogelzang et al., 2008). Cette zone permet la costimulation des lymphocytes B par les lymphocytes T CD4 induisant ainsi la permutation somatique, le « class switch » et la sélection de lymphocytes B de forte affinité. Les lymphocytes T CD4 de cette zone ne correspondraient pas au sous-type Th1 ou Th2, mais plutôt à un nouveau sous-type nommé Th folliculaire (Tfh). Les Tfh produisent principalement de l’IL-10 et de l’IL-21 et se caractérisent par l’expression du CXCR5 qui leur permet de migrer vers les centres germinaux à l’intérieur des ganglions. L’IL-21 et l’IL-6 sont impliquées dans la formation des Tfh, car l’absence de ces deux cytokines inhibe la formation des Tfh et des centres germinaux. L’une des hypothèses est que la formation des Tfh soit intimement liée au Th17, ces deux sous-types de lymphocytes T CD4 dépendent de l’IL-21 et de l’IL-6 et du facteur de transcription STAT3 pour leur génération. Cependant, les Tfh ne nécessitent pas de TGF- ou le facteur de transcription RORt (Nurieva et al., 2008b ; Silver et al., 2008). L’IL-21 influence aussi les cellules NK en augmentant la prolifération, la cytotoxicité et la production d’IFN suite à une stimulation avec l’IL-15 (Sivori et al., 2003 ; Brady et al., 2004 ; Leonard et al., 2008). L’IL-21 est aussi impliquée dans plusieurs pathologies, dont les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn et de la colite ulcéreuse. Les maladies inflammatoires de l’intestin résultent d’une cascade d’évènements cellulaires orchestrée par des cytokines inflammatoires sécrétées par des cellules lymphoïdes et non lymphoïdes. L’IL-21 est fortement exprimée chez les patients souffrant de la maladie de Crohn et de la colite ulcéreuse (Fantini et al., 2008). L’IL-21 est aussi impliquée dans plusieurs types de cancers, dont le myélome multiple qui est un néoplasme de lymphocytes B activé et différentié de façon terminale. L’IL-21 entraînerait la prolifération et l’inhibition de l’apoptose des cellules du myélome multiple (Brenne et al., 2002 ; Menoret et al., 2008). L’IL-21 ne semble pas appartenir au paradigme Th1/Th2, car les premiers articles à ce sujet indiquent que l’IL-21 favorise la polarisation vers le phénotype Th1 27 en induisant le facteur de transcription T-bet, la production d’IFN (Strengell et al., 2002) et en inhibant la production d’IgE (Ozaki et al., 2002 ; Shang et al., 2006). De plus, la présence de l’IL-21 a été montrée importante dans la polarisation Th1 et la production d’IFN dans la maladie de Crohn et de la colite ulcéreuse (Monteleone et al., 2005). Cependant, des études contradictoires ont montré que l’IL-21 semble bloquer la polarisation des lymphocytes T CD4 Th1 en inhibant la production d’IFN (Mehta et al., 2004 ; Suto et al., 2006). Finalement, il a été découvert que l’IL-21 était produite par un nouveau sous-type de lymphocytes T CD4 « helper » nommé Th-17 dû à sa production d’IL-17. Les Th-17 sont la principale source d’IL-21 et leur découverte résout le paradigme Th1/Th2. s Figure 6 : Rôles biologiques de l’IL-21. (Leonard et al., 2008) 28 7.4. Rôles biologiques de l’IL-6 L’IL-6 est une cytokine pléiotropique ayant des effets sur la régulation immune, l’hématopoïèse, l’inflammation et l’oncogenèse (Kishimoto, 2010). L’IL-6 est principalement exprimée par les CPA activées (DC, macrophages, lymphocytes B) et par des cellules non hématopoïétiques dont les kératinocytes, fibroblastes, cellules épithéliales et astrocytes (Dienz et al., 2009). L’IL-6 est produite par une variété de stimulus, dont l’IL-1, le TNF- et le LPS. L’IL-6 est un facteur de survie pour les lymphocytes T CD4 puisqu’il favorise l’expression de Bcl-2. L’IL-6 augmente la prolifération et l’activation des lymphocytes T. La présence d’IL-6 lors de l’activation des lymphocytes T CD4 augmente la production d’IL-4 et favorise ainsi la réponse de type Th2. L’IL-6 serait aussi importante pour la génération des Th17. Chez les souris IL6-/-, il y a une diminution du nombre de leucocytes au site inflammatoire (Romano et al., 1997). L’IL-6 est impliquée dans la réponse inflammatoire, régule à la hausse la protéine C réactive (CRP), le fibrinogène et la protéine amyloïde A dans le sérum (Kishimoto, 2005). 7.5. Récepteurs des cytokines partageant la chaîne gamma commune (c) Les récepteurs de cytokines de la famille de c font partie de la famille de récepteurs de cytokines de type I. Ces récepteurs comptent plusieurs membres (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21) et partagent la même chaîne c (Figure 7). 29 Figure 7 : Récepteurs de la famille de l’IL-2. Les récepteurs de la famille de l’IL-2 partagent la chaîne commune gamma (c) et une chaîne alpha propre à chaque cytokine. De plus, les récepteurs de l’IL-2 et de l’IL-15 partagent la chaîne IL-2R. *Inspiré de l’article (Kovanen et al., 2004) Les récepteurs de l’IL-2 et de l’IL-15 possèdent un autre niveau de complexité, ces deux récepteurs partagent la chaîne IL-2/15R et la chaîne c. Le récepteur de l’IL-2 est hétérotrimérique et composé de la chaîne IL-2R/IL-2/15R et c. La chaîne IL-2R a une faible affinité pour l’IL-2 (Kd~10−8 M) et n’a pas de capacité de signalisation. Les chaînes IL-2/15R et c ont une affinité moyenne pour l’IL-2 (Kd~10−9 M), mais cette liaison n’engendre qu’une faible signalisation. La formation de l’hétérotrimère (IL-2R ; IL-2/15R ; c) engendre un récepteur de forte affinité (Kd~10−11 M) qui permet d’engendrer une signalisation. Il a été montré que l’IL2/15R formait un hétérodimère avec la chaîne IL-2 en absence d’IL-2, et que la présence d’IL-2 était nécessaire afin de recruter la chaîne c (Bodnar et al., 2008). Il a été observé une augmentation de l’expression de la chaîne IL-2R après activation des lymphocytes T CD8 (Kim et al., 2006). L’IL-15 induit aussi la signalisation par le complexe IL-2/15R et c, mais contrairement à l’IL-2R, l’IL-15R a une forte affinité pour l’IL-15 (Kd~10−11 M). Contrairement aux cytokines de la même famille, il a été montré que l’IL-15 agit sur les cellules cibles principalement par le mécanisme de « transprésentation ». Dans 30 les cellules productrices, l’IL-15 liée à la chaîne l’IL-15R est transprésentée aux cellules exprimant le récepteur complexe IL-15R/c (Stonier et al., ; Dubois et al., 2002). De plus, il a été montré que le complexe IL-15/IL-15R était internalisé et recyclé à la surface pour permettre une stimulation prolongée de l’IL-15 en absence de production de novo (Dubois et al., 2002). La transprésentation de l’IL-15 semble être la voie majeure de l’IL-15, les lymphocytes T mémoires expriment simultanément les chaînes du récepteur de l’IL-15 permettant l’utilisation à la fois de la présentation cis et trans de la cytokine (Vamosi et al., 2004). Contrairement à ce qui a été expliqué dans la section précédente, les chaînes IL-2R et IL-15R ne contiennent pas de domaine CMB, mais plutôt un ou deux domaines « sushi » (Lorenzen et al., 2006). Le récepteur de l’IL-7 est un hétérodimère formé de l’IL-7R et de la chaîne c. La chaîne c n’a aucune affinité pour l’IL-7, tandis que la chaîne IL-7R possède une affinité intermédiaire (Kd = 250 pM) et que l’hétérodimère (IL-7R/c) forme un récepteur de forte affinité (Kd = 40 pM). Le récepteur de l’IL-7 possède deux sites de liaison, l’un de forte affinité dépendant de la chaîne c et l’autre de basse affinité dépendant seulement de l’IL-7R. Seul le récepteur de forte affinité a la capacité de produire une signalisation (Jiang et al., 2005). L’IL-21 a une faible affinité pour la chaîne c (160 M), mais une forte affinité pour l’IL-21R (70 pM) indiquant que l’IL-21 se fixe premièrement à IL-21R, la chaîne c est recrutée par la suite. Le complexe IL-21/c a une affinité intermédiaire pour l’IL-21 (160 nM) (Zhang et al., 2003). Les récepteurs de la famille c sont importants dans l’hématopoïèse, la thymopoïèse, l’homéostasie et l’activation des lymphocytes T. En l’absence de la chaîne c, il n’y a pas de lymphocytes T. L’expression des diverses chaînes des récepteurs de la famille de c varie selon le stade de différenciation du lymphocyte T (naïfs, effecteurs, mémoires) (Figure 8). 31 Contraction Figure 8 : Phénotypes et nombre relatif de lymphocytes T CD8+ avant, pendant l’activation et lors de la génération de lymphocytes T CD8+ mémoires. Inspiré de l’article de (Badovinac et al., 2002) 32 7.6. Récepteur des cytokines partageant la chaîne commune gp130 Les cytokines de la famille de l’IL-6 font partie de la famille de récepteurs de cytokines de type I et ont toutes en commun la chaîne gp130. Ces récepteurs comptent plusieurs membres, dont l’IL-6, leukemia inhibitory factor (Nikolich-Zugich et al., 2004), l’IL-11, oncostatin M (OSM), ciliary neurotrophic factor (CNTF), cardiotropin-1 (CT-1) cardiotrophin-like cytokine (CLC) et neuropoietin (NPN). La chaîne commune gp130 est exprimée de façon ubiquitaire par tous les types cellulaires, l’effet des cytokines dépend de l’expression de la chaîne alpha et de la présence de la cytokine. Les cytokines qui partagent la chaîne gp130 ont plusieurs rôles dans l’organisme, elles sont impliquées dans l’hématopoïèse, l’inflammation, le développement du système nerveux et la survie des cellules du myocarde (CarbiaNagashima et al., 2004). La délétion de la chaîne gp130 entraîne la mort in utéro indiquant l’importance de ces cytokines dans l’embryogenèse. Afin d’élucider le rôle de chaque cytokine de cette famille, des souris mutantes pour les chaînes alpha ont été générées (Ernst et al., 2004). Les souris déficientes pour IL-6R ont une plus grande susceptibilité aux infections due à une déficience dans l’hématopoïèse, dans la synthèse des protéines impliquées dans la phase aiguë de l’inflammation, dans la production de chimiokins et dans le recrutement de leucocytes au site d’inflammation. Les autres cytokines de la famille du gp130 n’ont pas d’effet direct en ce qui concerne le système immunitaire. L’IL-6 a une faible affinité pour l’IL-6-R (1-1.6 nM) (Hibi et al., 1990) tandis que le complexe IL-6R/gp130 a une affinité élevée pour l’IL-6 (40-70 pM) (Taga et al., 1989). La chaîne IL-6R n’est pas exprimée par tous les types cellulaires, cependant il existe une forme soluble de la chaîne alpha du récepteur de l’IL-6 (sIL-6R). Il a été montré que la chaîne alpha du récepteur soluble de l’IL-6(sIL-6R) peut transprésenter l’IL-6 à une cellule dépourvue de la chaîne alpha, mais exprimant la chaîne commune gp130 (Hurst et al., 2001). La chaîne l’sIL-6R est issue de deux sources : 1- le clivage protéolytique de la forme membranaire ; 2- l’épissage alternatif de l’ARNm codant pour IL-6R. La forme soluble du récepteur de l’IL-6 (sIL-6R couplé à l’IL-6 agit comme un agoniste en induisant la signalisation des cellules qui 33 expriment la chaîne commune gp130 ce qui explique l’effet pléiotropique de l’IL-6. La chaîne commune gp130 se retrouve aussi sous forme soluble (sgp130), mais contrairement à sIL-6R elle a un effet antagoniste sur la signalisation du récepteur de l’IL-6 (Kamimura et al., 2003). 8. Signalisation des récepteurs de cytokines Les récepteurs de cytokines n’ont pas d’activité tyrosine kinase intrinsèque. Cependant ils possèdent une tyrosine kinase constitutivement associée faisant partie de la famille des Janus-Kinases (Jaks) (Ihle et al., 1997). Il y a quatre membres connus de la famille JAK (Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2). Jak1, Jak2, Tyk2 sont exprimés de façon ubiquitaire, tandis que JAK3 est exprimé principalement dans les cellules hématopoïétiques (Kawamura et al., 1994). Les JAKs sont associés, de manière noncovalente, à des résidus hydrophobes (Box1/2) situés dans la région juxtamembranaire de la queue cytoplasmique des récepteurs de cytokines. Ces résidus sont hautement conservés chez les récepteurs de type I et de type II (Constantinescu et al., 2001) et lient de façon différentielle les différents JAK (Murray, 2007). La structure des JAKs est divisée en 7 domaines nommés Janus homology domain (JH1-7). JH1 est le domaine qui possède l’activité kinase tandis que JH2 est un domaine pseudokinase. Les autres domaines n’ont pas d’activité kinase, mais semblent jouer un rôle dans la régulation de l’activité catalytique des JAK. Un domaine FERM (4.1, Ezrin, radixin, moesin) qui s’étend du domaine JH4 à JH7 permet la liaison au récepteur. La liaison de la cytokine à l’une des chaînes du récepteur entraîne le recrutement des autres chaînes induisant ainsi le rapprochement des Jak ce qui induit l’interphosphorylation des résidus tyrosines situés sur leur domaine catalytique et leur activation. Les Jaks activés vont phosphoryler les résidus tyrosines situés sur la queue cytoplasmique des récepteurs de cytokines. Les résidus tyrosines phosphorylés situés sur la queue du récepteur deviennent des points d’ancrage pour des facteurs de signalisation possédant un domaine SH2 (Src-Homology-2) ou PTB (Phosphotyrosine-Binding). Ces facteurs de signalisation peuvent activer 3 voies principales : la voie des « Signal Transducer and 34 Activator of Transcription » (STATs), des « Mitogen-Activated Protein Kinase » (MAPK) et des « phosphoinositide 3-kinases » (PI3K) (Benczik et al., 2004). Il y a 7 membres connus de la famille des STAT (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6), chacun se liant grâce à leur domaine SH2 par la queue du récepteur contenant un résidu tyrosine phosphorylée. Une fois recrutés au récepteur, les facteurs de transcription STAT sont à leur tour phosphorylés sur des résidus tyrosines par les protéines JAKs. La phosphorylation permet à la fois la dissociation des STAT du récepteur et leur homodimérisation ou hétérodimérisation. Le complexe migre ensuite au noyau où il exerce un rôle de facteur de transcription. Ils se lient sur les promoteurs des gènes possédant les séquences spécifiques IRES (IFN-stimulated response elements) et GAS (-activated sequence) (Lin et al., 2000 ; Soldaini et al., 2000). Figure 9 : Signalisation des cytokines par la voie des JAK/STAT. 35 Il n’est pas encore bien connu comment un aussi petit nombre de kinases et de facteurs de transcription peuvent engendrer des effets biologiques aussi complexes médiés par une grande variété de récepteurs. L’une des hypothèses est un contrôle rigoureux de la durée et de l’intensité des différentes voies de signalisation. L’un des exemples est la phosphorylation du facteur de transcription STAT3 lors d’une stimulation du récepteur de l’IL-6 ainsi que celui de l’IL-10. L’IL-6 induit une réponse inflammatoire, tandis que l’IL-10 induit une réponse anti-inflammatoire. L’une des hypothèses est que l’IL-10 et l’IL-6 induisent l’inhibiteur de signalisation SOCS3 cependant, SOCS3 inhibe seulement la signalisation du récepteur de l’IL-6 (Yasukawa et al., 2003). De plus, la balance entre l’intensité des deux voies de signalisation peut entraîner des effets biologiques différents comme une phosphorylation plus importante du facteur de transcription STAT1 entraînant l’apoptose, tandis qu’une phosphorylation importante de STAT3 entraîne la prolifération. La coopération, l’inhibition ou la concurrence entre différentes voies de signalisations peuvent expliquer les différents effets biologiques de l’utilisation des mêmes voies de signalisation par des différentes cytokines (Ernst et al., 2004). 8.1. Signalisation des récepteurs de cytokines de la famille c Les cytokines de la famille c utilisent JAK1 et JAK3 pour produire leur signalisation. JAK3 est constitutivement associé à la chaîne c, l’absence de JAK3 ou de la chaîne c entraîne une immunodéficience sévère (SCID) (Noguchi et al., 1993). Il a été aussi montré que JAK3 et JAK1 pouvaient être associés à la chaîne IL2/15R du récepteur de l’IL-2 ou de l’IL-15 (Zhu et al., 1998). Les souris déficientes pour le gène codant pour JAK1 sont aussi immunodéficientes, car JAK1 est impliqué dans la signalisation des cytokines utilisant la chaîne c. Ces souris meurent à la naissance dues à des problèmes neurologiques (Rodig et al., 1998). L’absence de l’une des chaînes de la famille c entraîne certaines déficiences immunologiques indiquant un rôle plus spécifique de ces récepteurs (Tableau 4) (Leonard et al., 2005). 36 Tableau 4 : Phénotypes des souris déficientes en cytokines ou en leurs récepteurs de la famille IL-2 Délétion IL-2 IL-2R IL-2R IL-7 IL-7R Phénotypes immunologiques des souris Maladie auto-immune due à l’absence de Treg Prolifération Ag spécifique des lymphocytes T CD4+ Même phénotype que l’IL-2, mais absence de cellules NK (Signalisation IL-15) Déficience dans le développement des lymphocytes T et B. (Plus sévère pour IL-7R) IL-15 Diminution du nombre de lymphocytes T et des cellules NK IL-15R Diminution importante des lymphocytes T CD8+ mémoires c IL-9 IL-9R IL-4 IL-4R IL-21R SCID, absence de lymphocytes T, B et NK. Production excessive de mucus Prolifération excessive des mastocytes Développement d’un lymphome thymique Diminution de la concentration en IgG1 et IgE Les lymphocytes T, B et cellules NK sont normaux Diminution des IgG1, augmentation des IgE (dépendante de IL-4) *Inspiré de l’article Kovanen (2004) 37 La chaîne IL-2/15R est impliquée dans la formation du récepteur de l’IL-2 et l’IL-15, possède 6 sites potentiels de phosphorylation (Y338, Y355, Y358, Y368, Y392, Y510) par JAK1 et JAK3. Cependant, seulement certains résidus tyrosines sont impliqués dans le recrutement de protéines adaptatrices impliquées dans la signalisation. La phosphorylation en Y392 et Y510 a été rapportée comme étant importante pour le recrutement et la phosphorylation sur des résidus tyrosines de STAT5 qui est essentielle pour la survie des cellules hématopoïétiques. De plus, la phosphorylation Y338 est importante dans l’activation de la voie MAPK et de la voie PI3K (Gaffen, 2001). Il a été aussi montré que l’activité de la Src kinase Lck était augmentée après stimulation avec de l’IL-2 et pouvait entraîner la phosphorylation in vitro des tyrosines 355, 358, 368, 392 et 519, mais pas la tyrosine 388 (Hatakeyama et al., 1991 ; Delespine-Carmagnat et al., 1999). Syk est une autre protéine tyrosine kinase (PTK) associée à la région riche en résidus sérines située sur la queue cytoplasmique de l’IL-2/15R, mais sa fonction reste nébuleuse (Ellery et al., 2002). La chaîne IL-7 (CD127) possède trois résidus tyrosines dans sa portion cytoplasmique, cependant seulement la phosphorylation de la tyrosine 449 (Y449) a été identifiée comme étant importante pour la signalisation (Fry et al., 2002 ; Jiang et al., 2004). Le site de phosphorylation Y449 est le point d’ancrage principal pour STAT5a/b puisque la phosphorylation de STAT5 est abolie lors de la mutation du site Y449. La signalisation de l’IL-7 entraîne aussi une faible phosphorylation en tyrosine de STAT3 et de STAT1, cependant la mutation du point d’ancrage Y449 n’affecte pas leur phosphorylation (Kim et al., 2003). Il a été montré chez les lymphocytes B que la phosphorylation du résidu tyrosine 449 était nécessaire afin d’activer la voie de PI3K. Cependant, chez les lymphocytes T, il a été montré que la sous-unité p85 de PI3K pouvait s’associer directement à JAK3 (Sharfe et al., 1995). L’activation de la voie de PI3K/Akt est importante, le métabolisme et la prolifération des lymphocytes T puisque cette voie augmente l’expression du récepteur du glucose (Glut-1) et du récepteur de la transferrine (CD71) (Swainson et al., 2007). Il a été montré que certaines Src kinase dont p59fyn et de p56lck pouvaient interagir avec le domaine A riche en résidus acides du récepteur IL-7R (Page et al., 1995). Par contre, l’ablation de p59fyn ou de p56lck n’a aucune influence sur l’effet prolifératif de l’IL-7 (Seddon et 38 al., 2002). L’une des fonctions principales de l’IL-7 est de maintenir la viabilité des lymphocytes T en augmentant l’expression des protéines antiapoptotiques Bcl-2 et Mcl-1 ainsi qu’en redistribuant les protéines proapoptotiques telles que Bax et Bad (Mazzucchelli et al., 2007). L’IL-21 est la dernière cytokine découverte de la famille c. Contrairement aux autres membres de cette famille qui induisent une phosphorylation importante du facteur de transcription STAT5 sur le résidu tyrosine, la stimulation du récepteur de l’IL-21 par IL-21 entraîne une phosphorylation importante du résidu tyrosine du facteur de transcription STAT3 et de STAT1 ainsi qu’une plus faible phosphorylation de STAT5. La phosphorylation de STAT3 est maintenue tandis que la phosphorylation de STAT5 est transitoire. L’IL-21R possède 6 résidus tyrosines dans sa partie cytoplasmique (Y281, Y319, Y361, Y369, 397, Y510). Cependant, seul le résidu Y510 semble être important afin d’induire de la prolifération ainsi que la phosphosphorylation de STAT3 et de STAT1. La voie de PI3K/Akt est aussi activée par l’IL-21 et module la survie en augmentant l’expression des facteurs de survie BCL-2 et MCL-1 et inhibe les facteurs proapoptotiques tels que BAX et BAD (Zeng et al., 2007 ; Rochman et al., 2009). (Figure 10) IL-21R = 6 Y Figure 10 : Signalisation du récepteur de l’IL-21. Inspiré de l’article de (Leonard et al., 2008) 39 8.2. Signalisation des récepteurs de cytokines de la famille gp130 L’IL-6 est une cytokine importante de la famille de gp130 et possède un effet direct sur la réponse immune. La liaison de l’IL-6 à l’IL-6R entraîne le rapprochement des deux chaînes gp130 et l’interphosphorylation de JAKs constitutivement associés à la chaîne gp130. La chaîne IL-6R possède un court domaine intracellulaire qui ne permet pas d’activité de signalisation. Il a été montré que la chaîne soluble l’IL-6R pouvait entraîner la signalisation en s’associant à la chaîne gp130, cette stimulation se nomme la trans-signalisation (Peters et al., 1998). L’endothélium des vaisseaux sanguins n’exprime pas à leur surface la chaîne IL-6R, cependant la stimulation des cellules endothéliales avec de l’IL-6 est nécessaire afin que ces cellules produisent des chimiokines et des molécules d’adhésions impliquées dans le recrutement des leucocytes au site d’inflammation. Le clivage de l’IL-6R de la surface des neutrophiles lors du processus d’inflammation permet la transprésentation de l’IL-6 aux cellules endothéliales des vaisseaux sanguins (Hurst et al., 2001). La chaîne gp130 est associée à JAK1, JAK2 ou TYK2. L’activation des JAK entraîne la phosphorylation des résidus tyrosines situés dans la queue cytoplasmique des chaînes du gp130. La chaîne gp130 de souris a cinq sites de phosphorylation en tyrosine (Y757, Y765, Y812, Y904, Y914). Les sites Y765 àY914 ont été identifiés pouvant lier STAT1 et STAT3, alors que le site Y765 permet la liaison de SHP2. La phosphorylation de SHP2 induit l’activation de la voie des MAPK et de PI3K/AKT (Figure 11) (Ernst et al., 2004). Les voies de signalisation sont sous le contrôle de plusieurs voies de rétro-inhibition, dont la phosphatase SHP2, SOCS3 recrutés par Y757 et par les PIAS. De plus, l’IL-6 induit une phosphorylation de STAT3 sur un résidu sérine (S727) impliqué dans la transactivation maximale de STAT3 (Schuringa et al., 2000). La réponse biologique d’une stimulation du récepteur de l’IL-6 semble être contrôlée par la durée (induction de SOCS3) et le seuil d’activation, c’est-à-dire la phosphorylation de l’un ou des quatre résidus tyrosines du gp130 impliqués dans le recrutement de STAT1/3. De plus, il semble exister un équilibre entre l’activation de la voie de STAT1/3 et celle des MAPK (ER1/2). Il a été observé qu’une forte phosphorylation des STAT1/3 était associée à une forte phosphorylation d’ERK1/2. 40 L’induction de SOCS3 par les STAT induirait à la fois l’inhibition de la voie des STAT et celle des MAPK. Le bris de cet équilibre pourrait engendrer diverses pathologies (Ernst et al., 2004). gp130 = 5 Y Figure 11 : Signalisation du récepteur de l’IL-6. Inspiré de l’article de (Ernst et al., 2004) 41 9. Inhibition de la voie de signalisation des cytokines Les cytokines ont un rôle très important dans l’homéostasie des lymphocytes T. La durée et l’intensité de la signalisation de ces récepteurs de cytokines sont contrôlées par plusieurs mécanismes et une dérégulation du contrôle de la signalisation des cytokines se traduisant par une perte d’homéostasie. L’absence de contrôle de la signalisation des cytokines entraîne des effets pathologiques, dont certains cancers et certaines maladies auto-immunes (Valentino et al., 2006). Il existe plusieurs mécanismes de contrôle de la signalisation des cytokines de la famille c et gp130, dont les récepteurs solubles, les PIAS, les phosphatases et les SOCS. 9.1. Récepteurs de cytokines solubles Les chaînes de récepteurs solubles peuvent agir comme agoniste ou antagoniste sur la réponse biologique de cette cytokine et peuvent exercer un rôle important sur le contrôle de l’inflammation. Les chaînes solubles des récepteurs de cytokines peuvent être générées par clivage protéolytique de l’ectodomaine, par épissage alternatif ou par la transcription d’un gène différent codant seulement pour l’ectodomaine de la chaîne du récepteur (Levine, 2004). Il existe plusieurs chaînes solubles des récepteurs de la famille c dont IL-2R, IL-2/15R, c, IL-4R, IL-7R, IL-9R et IL-15R. Il a été montré que la forme soluble de l’IL-2R et l’IL-7R était impliquée dans l’inhibition des effets biologiques par séquestration de ces cytokines. De plus, la présence de la forme soluble de l’IL-2R et l’IL-7R corrèlerait avec un mauvais pronostic pour certaines maladies autoimmunes et dans certains cas d’infection au VIH (Witkowska, 2005 ; Crawley et al., 2010). La forme soluble de l’IL-15R antagonise l’effet de l’IL-15 (Mortier et al., 2004) et est associée à un mauvais pronostic de certains types de cancer (Badoual et al., 2008). La forme soluble de l’IL-6R est un agoniste impliqué dans la transprésentation de l’IL-6, tandis que la chaîne commune gp130 soluble est un antagoniste de l’IL-6 puisqu’il entre en compétition avec la chaîne gp130 membranaire (Jostock et al., 2001). 42 9.2. « Protein inhibitor of activated STAT » (PIAS) Les PIAS ont été originellement découverts comme un inhibiteur des facteurs de transcription STAT, plus précisément PIAS1 qui inhibe STAT1 et PIAS3 qui inhibe STAT3. La famille des PIAS comprend PIAS1 à 4 et qui sont principalement des corégulateurs de facteurs de transcription. Les PIAS peuvent avoir un effet activateur ou répresseur. Les PIAS1 et 3 ont un effet inhibiteur en empêchant la liaison de STAT1, STAT3 et STAT5 à l’ADN. Les PIAS possèdent aussi une activité déacétylase qui peut modifier la chromatine afin d’inhiber la transcription des gènes ciblés par les facteurs de transcription STAT (Tussie-Luna et al., 2002). Il a été découvert que les PIAS ont une activité SUMO-E3-ligase qui serait impliquée dans la sumoïlation de certains facteurs de transcription, entraînant leur inhibition ou leur activation (Jackson, 2001). Les souris déficientes en PIAS n’ont pas de pathologie importante, donc les PIAS semblent avoir un effet redondant dans le contrôle de la signalisation des facteurs de transcription STATS (Liu et al., 2004). 9.3. Phosphatases La signalisation des récepteurs de cytokines utilise principalement la voie JAK/STAT impliquant la phosphorylation des résidus tyrosines situés sur des molécules impliquées dans la signalisation. La déphosphorylation des résidus tyrosines par des phosphatases atténue la signalisation des récepteurs de cytokines. Les phosphatases SHP-1, SHP-2, CD45, PTB1B et les « T cell PTP » sont connues comme étant impliquées dans le contrôle de la signalisation des cytokines. Les phosphatases sont des enzymes impliquées dans le clivage du groupement phosphate des acides aminés phosphorylés. Les phosphatases SHP (Src Homology 2 domain containing tyrosine Phosphatases) ont un domaine SH2 impliqué dans la liaison de résidus tyrosines phosphorylés (Neel, 1993). SHP1 est exprimé de manière constitutive par des cellules hématopoïétiques et régule négativement la signalisation de l’IL-4 en déphosphorylant le récepteur de l’IL-4 ou JAK1 (Kashiwada et al., 2001). SHP2 est exprimé de façon ubiquitaire et semble avoir un rôle positif et négatif dans la signalisation des cytokines. SHP2 a un effet positif sur la signalisation en activant 43 la voie des MAPKs (ERK1/2). Cependant, SHP2 dans certaines situations peut déphosphoryler les STATs, les JAKs et certains récepteurs de cytokines et entraîner une inhibition de la signalisation (Gadina et al., 1998 ; Salmond et al., 2006). Le CD45 est une phosphatase membranaire qui est fortement exprimée à la surface des cellules hématopoïétiques et joue un rôle majeur dans la signalisation des lymphocytes T en activant la Src kinase Lck (Penninger et al., 2001). La molécule de CD45 peut directement lier et déphosphoryler JAK et l’inhiber en hydrolysant le groupement tyrosine de son site d’activation (Irie-Sasaki et al., 2001). 9.4. « Suppressor of cytokines signaling » (SOCS) Les SOCS sont des protéines impliquées dans la rétroaction négative de la signalisation de la majorité des récepteurs de cytokines. Contrairement aux autres types d’inhibition, les SOCS sont induits par la voie JAK/STAT des récepteurs de cytokines. Les SOCS sont induits par plusieurs cytokines dont la famille c (Alexander, 2002), gp130 et des interférons (Kubo et al., 2003a). Les SOCS utilisent quatre façons pour inhiber la signalisation des cytokines : ils bloquent le recrutement des facteurs de transcription STAT au récepteur, ils dégradent le récepteur et ils peuvent inhiber l’activité catalytique de JAK. La famille de SOCS comporte huit membres (SOCS1-7 et CIS) qui partagent des domaines communs, dont une boîte SOCS et un domaine SH2, et possèdent une région N-terminale variable. La boîte SOCS fait le lien entre la machinerie d’ubiquitination impliquée dans la dégradation via le protéasome et JAK ou du récepteur de cytokines (Kamura et al., 2004). Le motif « SOCS box » de SOCS1 et de SOCS3 est impliqué dans l’interaction avec l’élongine B et C du complexe E3 ubiquitine ligase (Kamura et al., 1998). Le complexe E3 ubiquitine ligase comprend l’élongine B et l’élongine C, cullin2/5, Roc1/Rbx1 et l’enzyme E2 du système d’ubiquitine (Kamura et al., 2002). Ce complexe enzymatique est impliqué dans l’ubiquitination des protéines destinées à la dégradation par la voie du protéasome. Il a été montré que SOCS1 est impliqué dans l’ubiquitination et la dégradation de JAK2 et de Vav phosphorylé (De Sepulveda et al., 2000). Cependant, la délétion du motif « SOCS box » n’engendre pas d’impact considérable dans l’inhibition de la 44 signalisation des cytokines in vitro, indiquant que la dégradation n’est pas le principal moyen d’inhibition de la signalisation des récepteurs des cytokines de la famille c et gp130 (Nicholson et al., 1999 ; Zhang et al., 2001). Le domaine SH2 des SOCS est impliqué dans la liaison aux tyrosines phosphorylées permettant la liaison au récepteur de cytokine phosphorylé et au JAK activé (Kubo et al., 2003b). La liaison des SOCS permet la dégradation des STAT par le protéasome. La liaison de SOCS au récepteur entraîne un encombrement stérique empêchant le recrutement des facteurs de transcription STAT aux récepteurs des cytokines. Dans la région N-termiale de SOCS 1 et de SOCS3, il y a un domaine KIR (kinase inhibitory region) qui est impliqué dans l’inhibition de l’activité kinase des JAK (Waiboci et al., 2007). De plus, il a été montré que SOCS3, un inhibiteur de la signalisation et SHP2 un activateur de la signalisation entre en compétition pour une tyrosine phosphorylée de gp130 du récepteur de l’IL-6. Le recrutement de SHP2 au récepteur de cytokine est impliqué dans l’activation de la voie des MAPs kinases. Il est possible que SOCS3 inhibe à la fois la voie des JAK/STAT et la voie des MAPs kinase (Kubo et al., 2003a). Les protéines les mieux caractérisées de la famille des SOCS sont CIS, SOCS1, SOCS2 et SOCS3. SOCS1 a des fonctions biologiques importantes puisque les souris déficientes en SOCS1 meurent dans les trois premières semaines après la naissance. Ces souris souffrent d’une lymphopénie sévère, l’activation des lymphocytes T périphériques, une nécrose du foie et l’infiltration de plusieurs organes par des cellules mononuclées. La majorité de ces symptômes peut être attribuée à une hyperactivation de la signalisation du récepteur de l’IFN. SOCS1 est un régulateur important de la signalisation du récepteur de l’IFN, cependant, les souris déficientes en SOCS1 et en IFN meurent quand même prématurément. Les études sur des souris Socs1-/-Ifng-/- indiquent que SOCS1 est aussi impliqué dans le contrôle d’autres cytokines comme l’IL-2 (Sporri et al., 2001), l’IL-6 (Diehl et al., 2000), l’IL-12 (Eyles et al., 2002), l’IL-15 (Ilangumaran, et al., 2003 ; Ilangumaran et al., 2003b) et IL-21 (Gangnon et al., 2008). Les souris dont seulement les lymphocytes T sont déficients en SOCS1 ne développent pas les maladies inflammatoires et la mort néonatale associée aux souris Socs1-/-. Ce résultat indique que SOCS1 a un effet sur 45 les lymphocytes, mais aussi sur d’autres types cellulaires, dont les CPA (Chong et al., 2003). L’expression de SOCS1 varie au cours de la maturation des thymocytes dans le thymus. Les lymphocytes T CD4+CD8+ (double positif, DP) expriment fortement SOCS1 ce qui inhibe la signalisation du récepteur de l’IL-7. Le niveau d’expression de SOCS1 diminue par la suite chez les thymocytes CD8 + et CD4+ simple positif (SP). Les souris dont les lymphocytes sont déficients en SOCS1 ont un ratio plus élevé de lymphocytes T CD8 ayant un phénotype mémoire (Chong et al., 2003) (Ramanathan et al., 2003). Le développement des thymocytes CD8+ SP serait favorisé attribuable à une hypersensibilité des lymphocytes T Socs1-/- à l’IL-15 et à l’IL-7 (Brugnera et al., 2000 ; Ilangumaran, Ramanathan et al., 2003a). Les thymocytes CD8+ SP qui sont déficients en SOCS1 possèdent un phénotype mémoire (CD44Hi) qui serait principalement dû à une hypersensibilité à l’IL-7 (Chong et al., 2003) (Ramanathan et al., 2003 ; Gagnon et al. 2006). SOCS1 semble aussi jouer un rôle dans la signalisation du TCR puisque les lymphocytes T CD8 déficients en SOCS1 ont un phénotype hyperactivé. De plus, les souris TCR transgénique Socs1-/- Rag1-+/+ meurent de façon prématurée comparativement aux souris Socs1-/- Rag1-/- indiquant la nécessité de lymphocytes T matures pour engendrer les pathologies (Marine et al., 1999). Les souris déficientes en SOCS-3 meurent au cours de la gestation due à une déficience de l’érythropoïèse (Marine et al., 1999) ainsi qu’à un problème dans la formation du placenta (Roberts et al., 2001). SOCS3 pourrait diminuer l’effet proinflammatoire de l’IL-6 dans certaines maladies inflammatoires comme la maladie de Crohn et l’arthrite. 46 Figure 12 : Inhibition des voies de signalisation des récepteurs de cytokines 47 10. Signalisation du TCR La signalisation du complexe du TCR n’est pas un événement linéaire, mais un réseau complexe intégrant plusieurs protéines et voies de signalisation. L’initiation de la signalisation du TCR n’est pas encore totalement comprise même après 30 ans de recherche. 10.1. Caractéristiques du récepteur du TCR Les TCR sont constitués de deux chaînes polypeptidiques, une chaîne alpha et une chaîne bêta, qui sont reliées par un pont disulfure. Les TCR ont une diversité structurale qui est caractérisée par une zone variable permettant de reconnaître un antigène et un segment constant qui est impliqué dans la reconnaissance des différents sous-types de CMH (Van Der Merwe et al., 2011). La partie variable des chaînes alpha et bêta du TCR est codée par plusieurs segments de gène nommé V, D et J. Le réarrangement de ces segments de gène engendre une diversité de polypeptides. La formation de dimère des chaînes TCR alpha et bêta génère une très grande diversité (1x1013) (Nikolich-Zugich et al., 2004). Le TCR doit avoir la capacité de discriminer les peptides du soi, qui sont présentés en très grande abondance, des antigènes étrangers à l’organisme. De plus, chaque lymphocyte T exprime un seul type de TCR, qui reconnaît seulement quelques peptides avec des affinités semblables, dont des peptides du soi et possiblement des antigènes étrangers à l’organisme. Le TCR est un récepteur polyvalent puisqu’avec une plage d’affinité restreinte, il permet de produire des réponses différentes, c’est-à-dire, un peptide du soi entraîne la survie tandis que les antigènes entraînent l’activation. 10.2. Affinité et avidité du TCR L’affinité est la force d’interaction entre un récepteur et son ligand et peut varier selon les conditions du milieu (concentration en sel, pH, température). En condition physiologique, l’affinité d’un TCR pour un ligand ne varie pas. Il ne faut cependant pas confondre affinité, une force d’interaction, et avidité qui est la réponse 48 physiologique de la stimulation des récepteurs. La réponse physiologique suite à la stimulation du TCR par un ligand ne dépend pas seulement de l’affinité du TCR, mais aussi de l’environnement dans lequel le TCR se retrouve. Il y a plusieurs facteurs pouvant influencer l’avidité du TCR : 1- la quantité de corécepteurs stimulateurs (CD8, CD28, OX40, GITR) (Chen et al., 2013) 2- la quantité de corécepteurs inhibiteurs (CD5) (Azzam et al., 2001), 3- le positionnement spatio-temporel des différentes molécules impliquées dans la signalisation du TCR (agrégation, ségrégation) (Yokosuka et al., 2009). 10.3. Initiation de la signalisation par le complexe du TCR Le complexe du TCR est formé de plusieurs chaînes dont le dimère TCR impliqué dans la reconnaissance de l’antigène présenté par le CMH. Les dimères de CD3 () possèdent des motifs ITAM impliqués dans la signalisation. Présentement, trois mécanismes d’initiations de la signalisation ont été proposés afin d’expliquer les caractéristiques uniques du TCR. 1- L’agrégation L’agrégation est le rapprochement des différentes molécules impliquées dans la signalisation du TCR permettant la phosphorylation des ITAM des CD3 par Lck. L’utilisation d’anticorps primaires contre le TCR, le CD3, le CD8 et la liaison de ces anticorps avec un anticorps secondaire permettent de rapprocher les différentes molécules impliquées dans la signalisation du TCR. Il a été montré que le TCR était monomérique et se regroupait pour former des microgroupements lors de l’activation du lymphocyte T (Varma et al., 2006). Une récente publication a montré que la reconnaissance d’un peptide du soi par un TCR permettait d’amplifier la signalisation du TCR reconnaissant un antigène en rapprochant les différentes molécules impliquées dans la signalisation du complexe du TCR (Krogsgaard et al., 2005). (Figure 13) 49 Figure 13 : Initiation de la signalisation du TCR par agrégation. A- Hétérodimérisation du corécepteur CD8 avec le complexe TCR/CMH permettant le recrutement de la Scr kinase Lck. B- Le modèle de pseudo-dimère : la formation du complexe du TCR avec un peptide du soi (vert) présenté par un CMH permet le recrutement de corécepteurs au complexe du TCR reconnaissant un antigène (rouge). Inspiré de l’article (Van Der Merwe et al., 2011) 2- Changement de conformation La queue cytoplasmique de la chaîne du CD3 et CD3 interagirait avec le feuillet interne de la membrane lipidique masquant ainsi leurs sites de phosphorylation. La libération des sites ITAM de la chaîne du CD3 de la couche lipidique serait due à une force physique (changement de conformation) ou à un changement dans le micro environnement de la chaîne du CD3 (Aivazian et al., 2000 ; Xu et al., 2008). Il a été aussi montré qu’un changement de conformation de la chaîne du CD3 conduirait à l’exposition d’un site riche en résidus prolines permettant le recrutement de la protéine kinase non catalytique (Menoret et al., 2008; Gil et al., 2002). Le changement conformationnel des différentes molécules impliquées dans la signalisation du TCR reste encore un sujet de controverse puisque la structure du complexe du TCR demeure encore mal comprise. 50 3- Ségrégation Lors de l’initiation de la signalisation du TCR, il y a agrégation de certaines molécules du complexe du TCR ainsi que l’exclusion de protéine phosphatase comme le CD45 et le CD148 (Alarcon et al., 2006). Deux mécanismes de ségrégation ont été caractérisés. Le premier mécanisme entraîne la ségrégation des différentes molécules impliquées dans la signalisation du TCR selon la taille de leurs ectodomaines. Il a été montré que la troncation de la phosphatase CD45 ainsi que l’élongation du CMH permettaient le recrutement de la phosphatase au complexe du TCR inhibant ainsi la signalisation (Davis et al., 2006). Le deuxième mécanisme de ségrégation est l’organisation membranaire des protéines impliquées dans la signalisation du TCR qui serait dépendante de l’inclusion ou de l’exclusion dans les radeaux lipidiques. Les radeaux lipidiques sont des domaines lipidiques riches en glycosphingolipides, sphingomyélines et cholestérol (Simons et al., 2000). Certaines protéines sont exclues ou recrutées dans les radeaux lipidiques selon l’addition d’acide palmitique ou myristique (Levental et al., 2011). Les molécules Lck, Lat, CD8 et CD3 sont constitutivement associées aux radeaux lipidiques, tandis que le TCR et les chaînes CD3, sont recrutées après activation du TCR. L’une des controverses du rôle des radeaux lipidiques dans la ségrégation de diverses molécules impliquées dans la signalisation du TCR vient du fait qu’ils sont très petits et éphémères (He et al., 2005). La microscopie confocale ainsi que la solubilisation des membranes par des détergents non ioniques suivie d’une séparation par gradients de sucrose ont été utilisées afin de déterminer la composition des molécules dans les radeaux lipidiques. Cependant, il a été montré que ces techniques n’ont pas la résolution adéquate afin de déterminer le positionnement exact des molécules (Kenworthy, 2008). 51 Figure 14 : Ségrégation du complexe du TCR. A- Ségrégation par la taille du domaine extracellulaire. B- Ségrégation selon le partitionnement différentiel dans les radeaux lipidiques. 52 10.4. Organisation spatio-temporelle du complexe du TCR L’initiation de la signalisation du TCR nécessite une organisation spatiotemporelle des différentes protéines membranaires impliquées dans la signalisation du TCR. La synapse immune est le contact entre le complexe TCR, des molécules d’adhésion à la surface du lymphocyte T et une autre cellule présentant un antigène par un CMH (Dustin et al., 2010). Il y a ségrégation des molécules d’adhésions et du complexe du TCR formant une structure nommée « supramolecular activation cluster » (SMAC) (Dustin et al., 1998 ; Monks et al., 1998). Cette structure concentrique a une partie centrale (cSMAC) riche en complexes du TCR, une partie périphérique (pSMAC) riche en molécules d’adhésion (LFA-1) et une partie distale (dSMAC) riche en molécules de CD45 (Freiberg et al., 2002). La formation d’une synapse immune permet une interaction stable entre le lymphocyte T et l’CPA ainsi que la formation d’une plateforme de signalisation. La formation de la synapse immune est un processus actif qui nécessite l’action de l’actine et de la myosine (Dustin et al., 1998). L’initiation de la signalisation du TCR commence par la coalescence en micrograppes du complexe du TCR et de la molécule d’adhésion LFA-1. Ces grappes migrent au travers de la zone dSMAC riche en CD45 grâce à des molécules d’actine. La répartition des protéines dans le pSMAC et cSMAC semble être dépendante de la force d’interaction avec l’actine et de la taille de la protéine membranaire (Choudhuri et al., 2005). La migration du complexe TCR/CD8/Lck à travers la zone riche en phosphatase CD45 permet l’activation de la Scr kinase Lck par déphosphorylation la tyrosine 505 (Y505) (Ostergaard et al., 1989). L’interaction transitoire entre la phosphatase CD45 et Lck lors de l’initiation de la signalisation du TCR permet l’activation de Lck tout en évitant l’effet inhibiteur de la phosphatase lors de la suite de la signalisation du TCR. Lorsque le CD45 n’est pas exclu du cSMAC, il y a inhibition de la signalisation du TCR (Irles et al., 2003 ; Choudhuri et al., 2005). 53 10.5. Signalisation distale du TCR L’étape initiale de la signalisation du TCR est l’activation de la Scr kinase Lck par la phosphatase CD45 qui déphosphoryle la tyrosine 505 (Y505) inhibitrice. La molécule Lck est recrutée au complexe du TCR et associée avec la molécule CD8 qui interagit à la fois avec le TCR et le CMH-I (Veillette et al., 1988). Le recrutement de la molécule Lck activée au complexe du TCR entraîne la phosphorylation des ITAM des chaînes CD3. Par la suite, la phosphorylation des ITAM permet le recrutement et la phosphorylation de la molécule ZAP70. La protéine adaptatrice LAT et SLP-76 sont la cible de ZAP70 qui entraîne leur phosphorylation sur les résidus tyrosines. Ces deux protéines adaptatrices sont impliquées dans l’organisation du « signalosome » du TCR et permet l’activation de plusieurs voies de signalisation. La déficience en CD45, Lck, ZAP70, LAT ou SLP-76 entraîne une perte importante de la signalisation du TCR (Zhang et al., 1999 ; Koretzky et al., 2006). La protéine adaptatrice LAT possède 9 résidus tyrosines qui, une fois phosphorylés, permet le recrutement de la molécule PLC1, la protéine p85 de l’enzyme PI3 kinase, GRB2 et GADS (Sommers et al., 2004). SLP-76 est recruté au complexe de signalisation par Gad et possède 3 résidus tyrosines pouvant être phosphorylés ce qui permet le recrutement de Vav1, Nck et Itk (Koretzky et al., 2006). La signalisation du TCR n’est pas un événement linéaire et simple comme résumé précédemment. Il a été montré que Itk, de la famille de Tec kinase, est impliqué dans le recrutement de Vav1 à la synapse immunologique et que Vav1 est important pour la phosphorylation et permet le recrutement de SLP-76 et de Itk à LAT (Smith-Garvin et al., 2009). Cependant, Itk est recruté à la membrane grâce à son domaine PH qui a une affinité pour PIP3 phosphorylée par la PI3 kinase. De plus, PLC1 interagit avec LAT, SLP-76 et Vav1, cette interaction semble nécessaire afin d’induire la bonne conformation de la molécule PLC1 pour permettre l’activité catalytique (Beach et al., 2007). La PLC1 activée hydrolyse le PI(4,5)P2 en second messager IP3 et DAG. La production de DAG entraîne l’activation de deux voies de signalisation : la voie de Ras et celle de PKC. La voie de la molécule Ras est impliquée dans l’activation de la sérine/thréonine kinase Raf-1, une MAPK kinase kinase (MAPKKK), 54 qui est impliquée dans l’activation des MAPKK, qui est à son tour impliqué dans l’activation des MAPK (Erk1/2). L’activité kinase d’ERK1/2 conduit à l’activation d’Elk1 qui contribue à l’activation de « Activator Protein-1 » (AP-1) impliqué dans la régulation de l’expression de Fos dans le complexe de transcription (Jun/Fos). Ras est activé lorsqu’il est couplé au GTP ce qui est facilité par les GEF et inhibé par les GAP. Il y a deux GEF chez les lymphocytes T, SOS et RasGRP. RasGRP semble être dominant, car SOS ne peut pas compenser la perte de RasGRP. Ras GRP est recruté à la membrane par un domaine liant les DAG produit par la PKC (Ebinu et al., 1998 ; Roose et al., 2005) tandis que SOS est constitutivement lié a Grb2 après activation du TCR (Finco et al., 1998). RasGRP et SOS seraient impliqués dans une boucle d’amplification positive importante pour une signalisation robuste de la voie de Ras (Roose et al., 2007). La production de DAG par la PLC1 entraîne le recrutement des kinases de la famille de PKC dont PKC à la membrane grâce à leur domaine pouvant lier DAG (Hayashi et al., 2007). Il y a aussi d’autres protéines impliquées dans la signalisation proximale du TCR comme Vav1, PI3K, PDK1 qui sont impliquées dans la localisation membranaire de PKC, c’est-à-dire à la membrane de la région de contact du lymphocyte T avec l’CPA (synapse immune). PKC régule l’activation canonique et non canonique de NF-B. Le calcium est un second messager universel des cellules eucaryotes. La stimulation du complexe du TCR entraîne une modulation du Ca2+ à l’intérieur du lymphocyte (Feske et al. 2007). La PLC1 activé génère de l’IP3 qui stimule l’ouverture de canaux calcique appelée IP3 récepteur du réticulum endoplasmique (RE). La déplétion des réserves intracellulaires de calcium entraîne l’ouverture des canaux CRAC à la membrane plasmique par les STIM du RE. 55 Avant propos Cette étude porte sur les effets synergiques de cytokines pro-inflammatoires l’IL6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 ou IL-15, sur les lymphocytes T CD8 murin. L’IL-21 est une cytokine pro-inflammatoire qui a été récemment découverte et dont les effets sur les lymphocytes T CD8 n’ont pas été tous caractérisés. Le rationnel de cette étude est que lors d’une infection, les lymphocytes T CD8 situés dans les ganglions lymphatiques seraient premièrement en contact avec des cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-21) ainsi que des cytokines impliquées dans leur homéostasie (IL-7, IL-15) avant d’entrer en contact avec les pathogènes. Il a été récemment montré que l’IL-21 a un effet synergique avec l’IL-15 en stimulant la prolifération des lymphocytes T CD8 en absence d’antigène. Le récepteur de l’IL-21 partage certaines voies de signalisation avec le récepteur de l’IL-6. L’hypothèse de cette étude est que l’IL-6 pourrait avoir des effets synergiques avec l’IL-7 ou l’IL-15 en augmentant la prolifération, la cytotoxicité ainsi que l’avidité du TCR chez les lymphocytes T CD8. Les objectifs de ces articles sont d’étudier les effets synergiques de l’IL-6 ou IL21 en combinaison avec l’IL-7 ou l’IL-15 sur la prolifération, la cytotoxicité ainsi que l’avidité du TCR chez les lymphocytes T CD8 murin. Les mécanismes moléculaires impliqués dans cette synergie seront aussi étudiés. 56 CHAPITRE 2 - ARTICLE 1 IL-6, in synergy with IL-7 or IL-15, stimulates TCR-independent proliferation and functional differentiation of CD8+ T lymphocytes Auteurs de l’article : Julien Gagnon, Sheela Ramanathan, Chantal Leblanc, Alexandre Cloutier, Patrick P. McDonald and Subburaj Ilangumaran Statut de l’article : Publié le 12 juin 2008 The Journal of Immunology, volume 180, numéro 12, pages 7958-7968. Avant-propos : Dans cette étude, j’ai réalisé la grande majorité des expériences menant aux résultats présentés. J’ai conçu et planifié les expériences en collaboration avec certains auteurs de l’article. J’ai interprété et analysé les résultats ainsi que la confection des figures. Les expériences EMSA ont été effectuées par un collaborateur. Ces résultats m’ont permis d’écrire une ébauche de l’article. 57 58 Résumé Il a été montré que la cytokine pro-inflammatoire IL-21 avait un effet synergique avec l’IL-15 et augmentait la prolifération des lymphocytes T CD8 et ceci indépendamment de l’antigène. L’IL-6 comme l’IL-21 induit la phosphorylation de STAT3 et a un effet synergique sur la prolifération basale induite par l’IL-7 ou l’IL-15 et augmente de façon importante la prolifération des lymphocytes T CD8. De plus, la combinaison d’IL-15 avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraîne une prolifération préférentielle des lymphocytes T mémoires tandis que la combinaison avec l’IL-7 entraîne une prolifération des lymphocytes T naïfs. La stimulation des lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 ou l’IL-15 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraîne une augmentation de la phosphorylation des résidus tyrosines de STAT5 ainsi qu’une augmentation de la liaison à l’ADN comparativement aux cytokines seules. Nous avons étudié l’effet d’une préstimulation avec l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 ou l’IL-15 sur une réponse subséquente à un antigène. Nous avons observé qu’une stimulation de 3 jours avec les combinaisons de cytokines indiquées entraînait une augmentation de l’avidité du TCR ainsi qu’une prolifération accrue à l’antigène. De plus, les lymphocytes T CD8 ayant été stimulés avec les combinaisons de cytokines étaient plus cytotoxiques. La stimulation avec les cytokines pro-inflammatoires en combinaison avec IL-7 ou IL-15 entraîne un changement phénotypique qui est différent que celui des lymphocytes T CD8 activés. Dans cet article, nous proposons que l’IL-6 ait la capacité à sensibiliser les lymphocytes T CD8 permettant ainsi la transition entre la réponse immunitaire innée et adaptative. 59 IL-6, in synergy with IL-7 or IL-15, stimulates TCR-independent proliferation and functional differentiation of CD8+ T lymphocytes1 Julien Gagnon,* Sheela Ramanathan,* ‡ Chantal Leblanc,* Alexandre Cloutier,† Patrick P. McDonald† and Subburaj Ilangumaran2*‡ *Immunology division, Department of Pediatrics, † Pulmonary division, Department of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Sherbrooke, Québec, Canada ‡ Centre de recherche clinique Etienne-Le Bel, Centre Hospitalier de l’université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada Running Title: TCR-independent activation of CD8+ T cells by IL-6 Keywords: Rodents, T cells, cytokines, cell activation, cell proliferation, cell differentiation 60 Abstract Recent reports have shown that IL-21, in synergy with IL-15, stimulates proliferation of CD8+ T lymphocytes in the absence of signaling via the TCR. Here, we show that IL-6, which induces phosphorylation of STAT3 similarly to IL-21, also can stimulate proliferation of CD8+ T cells in synergy with IL-7 or IL-15. IL-6 displays a stronger synergy with IL-7 than with IL15 to stimulate naïve CD8+ T cells. Concomitant stimulation by IL-6 or IL-21 augments phosphorylation and DNA binding activity of STAT5 induced by IL-7 or IL-15. Like IL-21, IL-6 reduces the TCR signaling threshold required to stimulate CD8+ T cells. Prior culture of P14 TCR transgenic CD8+ T cells with IL-6 or IL-21 in the presence of IL-7 or IL-15 augments their proliferation and cytolytic activity upon subsequent stimulation by antigen. Furthermore, cytokine stimulation induces quantitatively and qualitatively distinct phenotypic changes on CD8+ T cells compared to those induced by TCR signaling. We propose that the ability of IL-6 to induce TCR-independent activation of CD8+ T cells in synergy with IL-7 or IL-15 may play an important role in the transition from innate to adaptive immunity. Introduction Cytokines play a central role in maintaining the homeostasis of CD8+ T lymphocytes. Naïve CD8+ T cells depend on IL-7 for survival (RATHMELL et al., 2001; VIVIEN et al., 2001; KHALED et al., 2002; MARRACK et al., 2004). Several cytokines including IL-2, IL4, IL-6, IL-7 and IL-15 modulate the expression of IL-7R on CD8+ T cells, presumably to enable the limiting quantity of IL-7 to efficiently stimulate T cells that have not received any other survival signal (XUE et al., 2002; PARK et al., 2004). IL-7 is also required for the generation of CD8+ memory T cells (SCHLUNS et al., 2000; SEDDON et al., 2003), whereas IL-15 controls their long-term survival and renewal (LODOLCE et al., 1998; BECKER et al., 2002; PRLIC et al., 2002). When adoptively transferred to lymphopenic hosts, naïve and memory CD8+ T cells undergo rapid homeostatic proliferation mediated by IL-7 and IL-15, to restore the T cell pool (TANCHOT et al., 1995; GOLDRATH et al., 2002; PRLIC et al., 2002; MA et al., 2006). Homeostatic proliferation of naïve CD8+ T cells requires, in addition to IL-7, signaling via the TCR resulting from contact with self-MHC: peptide complexes 61 (TANCHOT et al., 1997; FREITAS et al., 2000; JAMESON, 2002; PRLIC et al., 2002). Memory CD8+ T cells do not require TCR signals to undergo homeostatic expansion but are critically dependent on IL-15 (TANCHOT et al., 1997; LODOLCE et al., 1998; MURALIKRISHNA et al., 1999; MA et al., 2006). Recent findings suggest that naïve CD8+ T cells may not be stringently dependent on TCR signals to undergo proliferation. We and others have reported that simultaneous stimulation by IL-15 and IL-21 induces proliferation and effector functions of naïve CD8+ T cells (ZENG et al., 2005; GAGNON et al., 2007). A variety of stimuli can induce IL-15 expression in different myeloid cells, whereas IL-21 is produced by activated CD4+ T cells, TH17 cells and NKT cells (TAGAYA et al., 1996; HOFMEISTER et al., 1999; PARRISHNOVAK et al., 2000; COQUET et al., 2007; NURIEVA et al., 2007). IL-21 also augments proliferation of T cells stimulated via the TCR (PARRISH-NOVAK et al., 2000). These findings have raised the prospects of using IL-15 and IL-21 to foster in vivo expansion of tumor-specific CTLs (ZENG et al., 2005). However, the possibility that such Ag non-specific activation of naïve CD8+ T cells by cytokines may also trigger autoreactive CD8+ T cells has not been ignored (KING et al., 2004; LEONARD et al., 2005; KRUPICA et al., 2006). Receptors for IL-7, IL-15 and IL-21 contain distinct ligand-binding subunits and the common gamma chain (c) (KOVANEN et al., 2004). IL-2 receptor (IL-2R) and IL-15R complexes also share the IL-2/15R subunit. These cytokine receptors rely on the JAK-STAT signaling pathway to transduce cellular activation signals (Ihle et al., 1995). The c chain signals via JAK3 and STAT5 whereas IL-7R, IL-21R and IL-2/15R use JAK1 to activate STAT3 (LIN et al., 1995; TAGAYA et al., 1996; HOFMEISTER et al., 1999; KOVANEN et al., 2004). IL-21 also activates STAT1 (HABIB et al., 2003). We have shown that suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) attenuates IL-15 and IL-21 signaling in CD8+ T cells by decreasing the duration of STAT signaling (ILANGUMARAN et al., 2003; GAGNON et al., 2007). Interestingly, IL-6, which belongs to a distinct family of cytokines that utilizes the gp130 receptor for signaling, induces strong STAT3 phosphorylation and a less-pronounced activation of STAT1, which is very similar to the IL-21-induced signaling pathway (TAGA et al., 1997; HABIB et al., 2003; HEINRICH et al., 2003). IL-6 is a multifunctional cytokine and has been associated with inflammation and immune responses (KAPLANSKI et al., 2003; 62 JONES, 2005). In T lymphocytes, IL-6 shares certain functional features with IL-21. Both IL6 and IL-21 enhance T lymphocyte viability (TEAGUE et al., 1997; TAKEDA et al., 1998; NARIMATSU et al., 2001; ROCHMAN et al., 2005; ZENG et al., 2005) and can synergize with TCR signals to augment T cell proliferation (SEPULVEDA et al., 1999; PARRISHNOVAK et al., 2000). Here we report that like IL-21, IL-6 can synergize with IL-15 or IL-7 to stimulate TCR-independent proliferation and effector functions of CD8+ T lymphocytes. Materials and methods Mice C57BL/6 mice and Rag1-/- mice in C57BL/6 background were purchased from the Jackson Laboratory. H-Y TCR transgenic (H-Y TCRtg) mice (KISIELOW et al., 1988) were obtained from Dr. Philippe Poussier (Sunnybrook and Women’s College Hospital, Toronto, ON). P14 TCRtg mice (OHASHI et al., 1989) were kindly provided by Dr. P. Ohashi (University of Toronto). The H-Y TCR recognizes the male-specific H-Y antigen whereas the P14 TCR recognizes the gp33-41 (KAVYNFATM) epitope from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) glycoprotein, both in the context of MHC class I molecule H2Db. Rag1-/-H-Y TCRtg mice were generated in our animal facility. Six to eight 8 wk-old mice were used in all experiments. All experiments on mice were carried out with strict adherence to institutional guidelines. Antibodies and reagents Antibodies against mouse CD4, CD8, CD16/CD32, CD44, CD62L, CD69, CD122, CD127, TCR (H57) and Ly6C conjugated to FITC, PE or biotin were purchased from BD Pharmingen Biosciences (Palo Alto, CA). Antibodies to mouse IL-6R and IL-21R were purchased from Biolegend (San Diego, CA) and eBiosciences (San Diego, CA), respectively. T3.70 mAb was purified from hybridoma supernatant and conjugated to FITC or biotin. Streptavidin-spectral red was from Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL). Recombinant cytokines IFN, IL-2, IL-6, IL-7, IL-15 and IL-21 were purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN). RPMI-1640 cell culture medium and fetal bovine serum (FBS) were from Sigma Aldrich (Oakville, ON). 5-(6)carboxyfluorescein diacetate 63 succinimidyl ester (CFSE) was purchased from Molecular Probes (Eugene, OR). Phosphospecific rabbit polyclonal antibodies to STAT5, STAT3 and STAT1 were obtained from Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Rabbit polyclonal antibodies to STAT5, STAT3 and STAT1 were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Pharmacological inhibitors of Src family protein tyrosine kinases (PP2), phosphatidylinositol 3-kinase (LY 294002), p38 MAPK (SB 202190), MEK (PD 98059), JNK (JNK inhibitor II), and the JAK-STAT3 pathway (JSI-124) were purchased from Calbiochem. Flow cytometry and magnetic cell sorting Single cell suspensions in PBS containing 5% FBS and 0.05% sodium azide were preincubated with anti-CD16/CD32 Ab for 10 min to block Fc receptors. Expression of cell surface markers was estimated by standard two- or three- color staining using FITC-, PE- and biotin-conjugated primary antibodies followed by ST-SPRD. Data acquisition and analysis were done on a FACS Calibur using CellQuest software (Becton Dickinson). To evaluate the expression of granzyme B, stimulated cells were stained with anti-CD8 Ab, fixed in 1% paraformaldehyde, permeabilized with 0.5 % saponin in PBS containing 1% BSA, stained with anti-human granzyme B Ab (Invitrogen-Caltag) and analyzed by flow cytometry. CD8+ T cells were purified using magnetic beads (Miltenyi Biotech) following the manufacturer’s instructions to more than 99% purity. To purify CD8+CD44hi and CD8+CD44lo subsets, CD8+ T cells from lymph node (Huber et al., 2009) cells were first purified by negative selection using anti-CD4 and anti-CD19 magnetic beads, followed by positive selection of the CD44hi subset using anti-CD44 Ab and utilizing two MACS columns in succession to attain desired purity. Cell proliferation assays Proliferation of total splenocytes or purified T cell subsets was measured by [3H]thymidine incorporation assay. Total splenocytes or lymph node cells (2x105 cells per well), or purified T cell subsets (1x105 cells per well) were stimulated with indicated concentrations of cytokines in 200 ul of RPMI-1640 medium in 96-well culture plates for 72 h. Alternately, cells were stimulated with anti-mouse CD3/CD28 Dynabeads (Invitrogen) or gp33-41 peptide in presence of irradiated splenocytes from C57Bl/6 mice as APC. One uCi of methyl-[3H]- 64 thymidine (NEN Life Sciences, Boston, MA) was added per well during the last 8 h of culture. The cells were harvested onto glass fiber filter mats and the incorporated radioactivity was measured in a Top Count microplate scintillation counter (PerkinElmer). The CFSE dye dilution assay was used to estimate the number of divisions of the cell cycle within each T cell subset following cytokine stimulation. Total splenocytes or lymph node cells were incubated at 1 107 cells/ml in PBS containing 5 uM CFSE for 5 min at room temperature. The reaction was quenched with an equal volume of FBS. The cells were washed twice and stimulated with indicated cytokines for 3-5 days and then labeled for surface markers. Sequential reduction in dye content, which reflects successive divisions of the cell cycle, was followed within gated CD4 and CD8 T cell subsets. Generation of memory H-Y TCRtg CD8+ T cells Memory H-Y TCRtg CD8+ T cells were generated following a published protocol (VEIGA-FERNANDES et al., 2000). Briefly, 0.5 106 MACS-purified naive H-Y TCRtg CD8+ T cells from Rag1-/- H-Y TCRtg female mice were injected into Rag1-/- females along with 1 106 irradiated total bone marrow cells from Rag1-/- males as immunogen and 0.5 106 purified CD4+ T cells from female C57Bl/6 mice as helper T cells. Memory H-Y TCRtg CD8+ T cells were recovered from the recipient mice eight weeks after immunization. Western blot MACS-purified 1 106 CD8+ T cells were washed and resuspended in starving medium for 2 h (RPMI-1640 medium containing 0.5% FBS, 1 mg/ml BSA, and 50 M 2mercaptoethanol) before stimulation with the indicated cytokines either alone or in combination in a volume of 0.5 ml. At indicated time points after stimulation, the cells were lysed in SDS-PAGE sample buffer. Equivalent amounts of proteins were electrophoresed in SDS-PAGE gels, transferred to PVDF membranes, probed with phospho-specific antibodies and developed using the ECL reagent (GE-Amersham). Blots were stripped, blocked and reprobed to determine the total amount of individual STAT proteins. 65 Preparation of nuclear extract and Electrophoresis mobility shift assay MACS-purified 5 x106 P14 TCRtg CD8+ T cells were starved in serum-free RPMI-1640 medium for 2 h before stimulation with cytokines. At indicated time points after stimulation, the cells were washed in ice-cold PBS and nuclear extracts were prepared (ANDREWS et al., 1991). Briefly, the cells were lysed in cold hypotonic lysis buffer (10 mM HEPES pH 7.9, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.2 mM PMSF and protease inhibitors) followed by lysis of the sedimented nuclei in high salt buffer (20 mM HEPES pH 7.9, 25% glycerol, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.2 mM PMSF). A small aliquot of the clarified nuclear extracts was saved for protein quantification and the rest was stored frozen at –70oC until EMSA was carried out. To analyze the binding of STAT proteins to DNA, 3 μg of nuclear protein was incubated in DNA binding buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% NP-40, 5% glycerol containing 40 μg/ml of poly dI-dC and 300 μg/ml of acetylated BSA) for 15 min at room temperature with a [32P]radiolabeled 39-bp oligonucleotide probe corresponding to the IFN response region (GRR) located within the FcRI/CD64 gene promoter (5'- ACGATGTTTCAAGGATTTGAGATGTATTTCCCAGAAAAG-3') (PEARSE et al., 1991; JOHNSTON et al., 1995). In ‘supershift’ analyses to determine the specificity of STAT binding, 1 μg of antiSTAT3 or anti-STAT5 Ab (Santa Cruz) was added to the nuclear extract 30 min prior to incubation with the labeled GRR oligonucleotide probe. DNA binding reactions were electrophoresed on 5.5% acrylamide gels in 0.75x TBE buffer at 4°C. The gels were dried and exposed to Hyperfilm MP (GE Healthcare) with intensifying screens at –80°C. Cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay EL-4 cells (H-2b) were prepared by incubation with 400 µCi/ml 51Cr (NEN Life Science) Boston, MA) and the stimulatory GP33 (KAVYNFATM) or nonstimulatory AV (SGPSNTPPEI) peptide for 2 h at 37°C (NGUYEN et al., 2002). These target cells were washed three times and plated in 96-well round-bottomed microtiter plates with indicated effector P14 TCRtg CD8+ T cells at different effector to target cell ratios. After incubation for 7 h at 37°C, 100 µl of supernatant was counted for 60 sec using a gamma counter (Perkin Elmer). Maximal release was achieved by adding Triton X-100 to a final concentration of one 66 percent. Percentage of specific lysis was calculated as (cpm sample release - cpm spontaneous release)/(cpm maximal release - cpm spontaneous release) x 100. Results IL-6 stimulates Ag-independent proliferation of CD8+ T lymphocytes in synergy with IL-7 or IL-15 IL-21 can stimulate proliferation of CD8+ T lymphocytes in synergy with IL-7 or IL-15 independently of signaling via the TCR (Fig. 1A) (ZENG et al., 2005; GAGNON et al., 2007). Whereas IL-7 and IL-15 induce phosphorylation of STAT5 in CD8+ T lymphocytes, IL-21 induces phosphorylation of STAT3 and STAT1 (Fig. 1B) (LEONARD et al., 2005; GAGNON et al., 2007). Since IL-21 alone does not induce proliferation of CD8+ T lymphocytes, its ability to induce Ag-independent proliferation of CD8+ T cells in the presence of IL-7 or IL-15 (Fig. 1A) could result from synergy between STAT3 and STAT5 signaling pathways. To test this hypothesis, we investigated whether other cytokines that induce STAT3 phosphorylation also showed a capacity to stimulate proliferation of CD8+ T cells in synergy with IL-7 or IL15. IL-6 and IFN have been shown to induce phosphorylation of STAT3 and STAT1 in T lymphocytes (FINBLOOM et al., 1995; TEAGUE et al., 2000; TANABE et al., 2005). However, IL-6 was more efficient than IFN in inducing STAT3 phosphorylation, while IFN induced a strong STAT1 activation (Fig. 1B). Whereas IL-6 promotes survival of resting T cells (TEAGUE et al., 1997; TAKEDA et al., 1998; TEAGUE et al., 2000; NARIMATSU et al., 2001; ROCHMAN et al., 2005), IFN augments the survival of activated T cells (MARRACK et al., 1999). Therefore, we examined whether IL-6 and IFN stimulated CD8+ T cells in synergy with IL-7 and IL-15. We observed that IL-6, but not IFN, stimulated proliferation of purified CD8+ T lymphocytes in the presence of IL-7 or IL-15 (Fig. 1C). These results supported the idea that simultaneous activation of STAT3 and STAT5 might underlie the ability of IL-21 and IL-6 to synergize with IL-7 or IL-15 in stimulating proliferation of CD8+ T lymphocytes. To compare the TCR-independent cytokine-driven responses with stimulation induced via the TCR, we used CD8+ T cells expressing the P14 transgenic TCR. P14 TCRtg CD8+ T 67 cells express a clonotypic TCR that recognizes a peptide antigen (gp33-41) of lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein (OHASHI et al., 1991; SEBZDA et al., 1996). As shown in Fig. 1D, proliferation stimulated by cytokines alone was modest compared to that induced by the antigenic peptide gp33 presented by irradiated APC. Nonetheless, the significant level of proliferation induced by cytokines raised the possibility that such cytokine-driven proliferation may potentially contribute to the overall T cell response during infections. Therefore, we carried out a detailed characterization antigen-independent proliferation of CD8 T cells driven by cytokines. 68 Figure 1. IL-6 induces proliferation of CD8+ T cells in the presence of IL-7 or IL-15. (A) IL-21 induces Ag-independent proliferation of CD8+ T cells in synergy with IL-7 or IL-15. CD8+ T cells purified from C57Bl/6 mice were stimulated with IL-7 (5 ng/ml) or IL-15 (10 ng/ml) either alone, or in the presence of IL-21 (10 ng/ml). Cell proliferation was measured after 3 days by [3H]-thymidine incorporation for 8-10 h. Data (mean standard error) shown are representative of four independent experiments. (B) IL-6 induces strong phosphorylation of STAT3 in CD8+ T cells. Purified CD8+ T cells were stimulated for 15 min with IL-6 (1 ng/ml), IFN (100 U/ml) or IL-21 (10 ng/ml). Cell lysates containing equivalent amount of proteins were analyzed by western blot for the indicated phospho-STAT proteins. The membranes were stripped and reprobed with anti-STAT Ab. Data shown are representative of three separate experiments. (C) IL-6, but not IFN, induces proliferation of CD8+ T cells stimulated by IL-7 or IL-15. Purified CD8+ T cells from C57Bl/6 mice were stimulated with indicated cytokines, at the same concentrations used in the above experiments. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. Data (mean SE) are representative of three independent experiments. (D) Cytokine-stimulated proliferation of CD8+ T cells was modest compared to the Ag-induced response. CD8+ T cells purified from P14 TCRtg mice were stimulated with indicated cytokines, at the same concentrations used above, or with 1 ug/ml of gp33 peptide presented by irradiated C57Bl/6 splenocytes. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation after 3 days. Representative data from two separate experiments are shown. 69 Evaluation of the synergistic effects of different concentrations of IL-6 or IL-21 in presence of IL-15 showed that IL-6 stimulated proliferation of purified CD8+ T cells as efficiently as IL-21 (Fig. 2A). Since the molecular weights of IL-6 and IL-21 are 30 kDa and 15 kDa respectively, IL-6 appeared to be more potent than IL-21. However, when proliferation of CD8+ T cells was assessed by the CFSE-based proliferation assay using total lymph node cells, IL-21 elicited a slightly stronger response than IL-6 in terms of the proportion of cells in successive divisions of the cell cycle (Fig. 2B, upper and lower panels). This variation between assays using purified CD8+ T cells and total lymph node cell population may arise from depletion of IL-6 by other cell types present in the total lymph node cell cultures. Furthermore, differences in receptor expression and cytokine concentrations in the tissue microenvironment could also influence the relative contribution of IL-6 and IL-21 in an inflammatory setting in vivo. Like IL-21 (ZENG et al., 2005; GAGNON et al., 2007), IL-6 did not stimulate proliferation of CD4+ T cells either alone or in combination with IL-2, IL-7 or IL-15 (data not shown). These cytokine stimulations also failed to induce any significant expansion of NK cells (data not shown). These results show that IL-6 can substitute for IL-21 in stimulating Ag-independent proliferation of CD8+ T cells in the presence of IL-7 or IL-15. 70 Figure 2 : Comparison of the synergistic effects of IL-6 and IL-21 in stimulating proliferation CD8+ T cells in the presence of IL-7 or IL-15. (A) Purified CD8+ T cells from C57Bl/6 mice were stimulated with 2.5 ng/ml of IL-15 either alone, or in the presence of indicated concentrations of IL-6 or IL-21. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. Mean standard error, representative of three separate experiments, is shown. (B) Total lymph node cells from C57Bl/6 mice were labeled with CFSE and stimulated with the indicated cytokines at the same concentrations used in Fig. 1. Cytokines and media were replenished on day 3. After five days of culture, the cells were labeled with antiCD4 and anti-CD8 Ab and analyzed by flow cytometry. CFSE fluorescence on gated CD8+ T cells is shown from one of the four separate experiments. CD4+ T cells and NK cells did not proliferate under these conditions. Lower panels show the frequency of cells in each division of the cell cycle indicated by dashed lines in the upper panel. 71 Synergistic stimulation of CD8+ T cells by IL-6 in the presence of IL-7 or IL-15 occurs in both naïve and memory cell compartments IL-15 stimulates proliferation of memory but not naïve CD8+ T cells (ZENG et al., 2005). Concomitant stimulation with IL-21 not only augments the proliferation of memory CD8+ T cells but also stimulates naïve CD8+ T cells to proliferate in response to IL-15 (ZENG et al., 2005; GAGNON et al., 2007). To determine whether IL-6 displays a similar synergy as IL-21 in stimulating naïve and memory CD8+ T cells, we used CD8+ T cells expressing the transgenic (Bonilla et al., 2010) H-Y TCR (KISIELOW et al., 1988). The H-Y TCR is specific to the KCSRNRQYL peptide of the male-specific H-Y Ag and displays minimal reactivity to environmental or self-antigens (ERNST et al., 1999). CD8+ T cells bearing the H-Y TCR can be identified using the mAb T3.70 (ROCHA et al., 1991). All CD8+T3.70+ Tg T cells in Rag1/- H-Y TCRtg female mice are naïve (VEIGA-FERNANDES et al., 2000) and exhibit CD44lo phenotype (Fig. 3A). We have generated memory H-Y TCRtg T cells by immunizing Rag1-/females harboring adoptively transferred naïve H-Y TCRtg T cells with male cells. Memory HY TCRtg CD8+ T cells uniformly displayed CD44hi phenotype and exhibited higher level of CD44, Ly6C, CD127 (IL-7R) and CD122 (IL-2/15R) (Fig. 3A). We cultured purified naïve or memory H-Y TCRtg CD8+ T cells with IL-7 or IL-15 in the presence or absence of IL-6 or IL-21. Three days later, naïve H-Y TCRtg CD8+ T cells showed negligible proliferation in response to IL-7 or IL-15 (Fig. 3B). Concomitant stimulation with IL-6 or IL-21 induced proliferation of naïve CD8+ T cells in response to IL-7 and to a lesser extent to IL-15. This synergistic response was significantly higher in presence of IL-21 than IL-6. In contrast to naïve cells, memory H-Y TCRtg CD8+ T cells proliferated strongly to IL-15 and to a slightly lesser extent to IL-7. IL-21, but not IL-6, significantly augmented the IL-15 or IL-7 induced proliferation of memory CD8+ T cells. The memory H-Y TCRtg CD8+ T cells were generated in Rag1-/- mice. To determine whether the lymphopenic environment of the host might have modulated the cytokine responses of memory H-Y TCRtg CD8+ T cells, we evaluated their cytokine responses of CD44lo and CD44hi CD8+ T cells purified from C57Bl/6 mice (Fig. 3C). Compared to CD44lo cells, the CD44hi population showed elevated expression of Ly-6C, CD122 and CD127 memory markers (Fig. 3D). As shown for H-Y TCRtg CD8+ T cells, CD44lo cells displayed increased synergy with IL-7 and CD44hi cells with IL-15 (Fig. 3E). Unlike memory H-Y 72 TCRtg CD8+ T cells, which did not respond to synergistic stimulation with IL-6 (Fig 3B, right panel), CD44hi cells displayed strong proliferation in response to IL-15 plus IL-6 (Fig. 3E). Nonetheless, IL-21 provided a stronger stimulus than IL-6 in the presence of IL-7 or IL-15 to CD44hi cells. Collectively, these results show that IL-6 and IL-21 synergize strongly with IL-7 to stimulate proliferation of naïve CD8+ T cells and with IL-15 to stimulate memory CD8+ T cells, and that these synergistic effects were more pronounced in the presence of IL-21 than IL-6. 73 Figure 3. IL-6 stimulates proliferation of naïve and memory CD8+ T cells in synergy with IL-7 or IL-15. (A) Peripheral lymph node cells from naïve Rag1-/-H-Y TCRtg mice, and Rag1-/- females harboring memory H-Y TCRtg T cells (see Materials and Methods) were stained with antibodies against CD8, the transgenic TCR (T3.70) and one of the indicated memory cell markers. Representative data on the expression of individual memory markers in gated naïve (shaded histograms) and memory (line histogram) CD8+T3.70+ H-Y TCRtg T cells are shown. (B) Purified naïve and memory CD8+ T3.70+ H-Y TCRtg T cells were stimulated with indicated cytokines at the same concentrations as in Fig. 1, and cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. Representative data from two independent experiments are shown. Statistical comparison was made using Student’s t-test and p values are indicated. n.s, not significant (p >0.05). (C) MACS purification of naïve (CD44lo) and memory (CD44hi) phenotype cells from negatively selected CD8+ T cells of C57Bl/6 mice. (D) Expression of memory cell markers in CD44lo and CD44hi CD8+ T cell subsets. (E) Purified CD44lo and CD44hi CD8+ T cell subsets were stimulated with indicated cytokines, and proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. Representative results from two separate experiments are shown. 74 IL-6 and IL-21 augment STAT5 activation induced by IL-7 or IL-15 in CD8+ T lymphocytes To investigate whether synergistic stimulation by IL-6 modulates the STAT signaling pathway triggered by IL-7 or IL-15, we examined phosphorylation of STAT5 and STAT3 proteins following cytokine stimulation. For this purpose, we used CD8+ T cells purified from P14 TCRtg mice. More than 90% of these cells displayed a naïve CD44lo phenotype (data not shown). P14 cells were stimulated by IL-7 or IL-15 in the presence or absence of IL-6 or IL21, and phosphorylation of STAT proteins was evaluated by western blot. Consistent with the fact that IL-7 is an essential survival cytokine for naïve CD8+ T cells (PARK et al., 2007), IL7 induced a strong phosphorylation of STAT5 on Tyr694, whereas IL-15 elicited a weak phospho-STAT5 signal (Fig. 4A). Concomitant stimulation with IL-6 or IL-21 augmented the phospho-STAT5 signal induced by IL-7 or IL-15 by more than 2-fold (Fig. 4A and 4B). IL-6 and IL-21 induced strong phosphorylation of STAT3 on Tyr705, and small but significant phosphorylation on Ser727 residue (Fig. 4A). Neither IL-7 nor IL-15 caused an appreciable increase in phosphorylation of STAT3 induced by IL-6 or IL-21 (Figs. 4A and 4B). Phosphorylation of STAT1 stimulated by IL-6 or IL-21 was also not significantly affected in the presence of IL-7 or IL-15 (Fig. 4A). These observations suggest that increased STAT5 signaling could be an important mechanism underlying the proliferation of CD8+ T cells stimulated by IL-7 or IL-15 in synergy with IL-21 or IL-6. To determine whether the increased STAT5 phosphorylation was associated with enhanced DNA binding activity, we carried out EMSA using the GRR probe, which has been previously used to reveal STAT5 activation in T cells by IL-15 (JOHNSTON et al., 1995). As shown in Fig. 4C, stimulation of P14 TCRtg CD8+ cells with IL-7 in the presence of IL-6 or IL-21 augmented the amount of nuclear STAT proteins binding to the probe. The GRR sequence is known to bind STAT5-, STAT3- and STAT1-containing complexes, and a comparison with the western blot results (Fig. 4A) indicated that the IL-7-induced upper band contained STAT5, whereas the faster migrating band in IL-21- or IL-6- stimulated cells represented a STAT3-containing complex. This prediction was confirmed by supershift assays using STAT5 and STAT3 specific antibodies. As shown in Fig. 4D, the anti-STAT5 Ab completely retarded the migration of STAT5-DNA complex, whereas the anti-STAT3 Ab 75 reacted with the lower band. These observations show that concomitant stimulation by IL-7 and IL-6 or IL-21 increases phosphorylation and DNA-binding activity of STAT5. Synergistic stimulation by IL-21 or IL-6, in addition to augmenting phosphorylation of STAT5 induced by IL-7 or IL-15, might modulate the kinetics of STAT5 activation. To address this question, we evaluated the decay kinetics of the phospho-STAT5 signal in P14 cells at different time points after a brief stimulation for 15 min by IL-7, either alone or in combination with IL-6 or IL-21 (Fig. 4E). IL-6 and IL-21 increased the magnitude of STAT5 phosphorylation as expected, but did not modulate the duration of the STAT5 signal, as the signal declined at a comparable rate under all three stimulatory conditions. These observations suggest that increased signal strength but not an increase in the signal duration of STAT5 phosphorylation contribute to the synergistic stimulation of CD8+ T cells by cytokines. Consistent with a critical role for the JAK-STAT pathway, an inhibitor of STAT3 activation, JSI-124 (BLASKOVICH et al., 2003), almost completely inhibited the cytokineinduced proliferation (Fig. 4F). Since IL-7 and IL-6 also stimulate the PI3K and MAPK pathways (HEINRICH et al., 2003; JIANG et al., 2005), we examined whether pharmacological inhibitors of these signaling pathways would modulate the proliferation of CD8+ T cells induced by cytokines. Our results show that the PI3K inhibitor LY294002 and the p38 MAPK inhibitor SB 202190 severely compromised proliferation induced by IL-7 or IL-15 in the presence of IL-21 or IL-6 (Fig. 4F). These observations are consistent with a recent report that PI3K and MAPK pathways are important for IL-21-mediated activation of CD8+ T cells (ZENG et al., 2007). Interestingly, an inhibitor of the Src family PTKs, PP2, also strongly inhibited the cytokine-induced proliferation (Fig. 4F). It is noteworthy that p56lck and p59fyn, PTKs that play important role in T cell activation via the TCR (MUSTELIN et al., 2003), also interact with IL-7 and has a potential to interact with the IL-15 receptor complex (HATAKEYAMA et al., 1991; KOBAYASHI et al., 1993; HOFMEISTER et al., 1999). Hence, in addition to the JAK-STAT pathway, Src family PTKs, PI3K and p38 MAPK also seem to contribute to the synergistic stimulation of CD8+ T cells by cytokines. 76 77 Figure 4. Concomitant stimulation of CD8+ T lymphocytes by IL-6 or IL-21 augments STAT5 phosphorylation and its DNA-binding activity induced by IL-7 or IL-15. (A) Purified P14 TCRtg CD8+ T cells were stimulated with the indicated combinations of cytokines at the same concentrations used in Fig. 1. Twenty min after stimulation, the cells were lysed and phosphorylation of the indicated STAT molecules was evaluated by western blot. The blots were reprobed to determine the amount of total STAT proteins. This experiment has been repeated more than three times with similar results. (B) The ratio between the signal intensity of phospho-STAT and total STAT proteins shown in (A) was calculated from densitometric units of the protein bands corresponding to each stimulus. (C) EMSA. Purified P14 TCRtg CD8+ T cells were stimulated with the indicated combinations of cytokines at the same concentrations used in (A). Twenty min after stimulation, nuclear extracts were prepared. Equivalent amount of nuclear proteins were incubated with [32P]labelled GRR probe and the DNA protein complexes were separated by electrophoresis and detected by autoradiography. (D) supershift assay: To determine the specificity of STAT binding, anti-STAT3 or anti-STAT5 Ab were incubated with the nuclear extracts before the addition of the labeled probe. Representative data from three independent experiments are shown. (E) Synergistic stimulation by IL-21 or IL-6 does not augment the duration of IL-7induced STAT5 activation. CD8+ T cells purified from P14 TCRtg mice were stimulated with IL-7 either alone or in combination with IL-6 or IL-21 for 15 min. Stimulated cells were either lysed immediately, or washed and incubated in cytokine-free medium and lysed after indicated duration (chase). Whole cell lysates were evaluated for phospho-STAT5 and total STAT5 protein levels. Data from one of the two experiments with comparable results are shown. (F) Inhibitors of Src family PTKs, PI3K and MAPK pathway block cytokine-induced proliferation of CD8 T cells. Total lymph node cells (5 x 104 cells per well) of C57Bl/6 mice were stimulated with indicated combinations of cytokines in 96-well microtiter plates. Pharmacological inhibitors of Src family protein tyrosine kinases (PP2,1.25 M), phosphatidylinositol 3-kinase (LY 294002, 1,25 M), p38 MAPK (SB 202190, 750 nM), MEK (PD 98059, 10 M), JNK (JNK inhibitor II, 5 M), or the JAK-STAT3 pathway (JSI124, 1.25 M) were added at the initiation of culture. [3H]-thymidine was added during the last 8-10 h of 3 days culture period. Proliferation data shown are representative of three independent experiments. Percent inhibition was calculated based on values obtained without the addition of any inhibitor. 78 Prior activation by cytokines augments proliferation and effector functions of CD8+ T lymphocytes upon subsequent stimulation via the TCR IL-21 and IL-6 have been shown to augment proliferation of T cells following stimulation of the TCR by anti-CD3 Ab or allogenic splenocytes (SEPULVEDA et al., 1999; PARRISH-NOVAK et al., 2000; KASAIAN et al., 2002). To compare the synergistic effect of IL-6 and IL-21 on TCR signaling, we stimulated naïve P14 TCRtg CD8+ T cells with platebound anti-CD3 mAb either alone or in the presence of IL-21 or IL-6. We observed that IL-6 augmented the proliferation of CD8+ T cells induced via the TCR much more efficiently than IL-21 (Fig. 5A, left panel). IL-7 augmented the anti-CD3 response as efficiently as IL-6. However, neither IL-6 nor IL-21 increased the strong proliferation induced by the antigenic peptide, whereas IL-7 significantly augmented this response (Fig. 5A, right panel). These results suggested that the synergistic effect of IL-6 or IL-21 might be superfluous in the presence of co-stimulatory signals provided by antigen presenting cells, whereas the wellknown pro-survival function of IL-7 (HOFMEISTER et al., 1999) might have contributed to the increased response. Interestingly, naïve P14 TCRtg CD8+ T cells that have been prestimulated with IL-7 in the presence of IL-6 or IL-21 showed heightened proliferation in response to very low concentrations of gp33 peptide or anti-TCR Ab in the absence of added cytokines (Fig. 5B, left and right panels). This priming effect was not observed with cells that were pre-stimulated with IL-7 alone. Similar results were obtained when CD8 T cells were pre-stimulated with IL-15 in the presence of IL-6 or IL-21 (Fig. 5C, left and right panels). 79 Figure 5. Pre-stimulation of CD8+ T cells with IL-6 and IL-7 lowers the TCR signaling threshold. (A) Purified P14 TCRtg CD8+ T cells were stimulated with indicated combinations of plate-bound anti-CD3 mAb (left panel) or the gp33-41 peptide presented by irradiated splenocytes as APCs (right panel), in the absence or presence of IL-7, IL-6 or IL-21. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. Representative data from three separate experiments are shown. (B) Purified P14 TCRtg CD8+ T cells, either freshly isolated (none) or cultured with indicated cytokines for 3 days and washed were stimulated with antiCD3 mAb (left panel) or the gp33-41 peptide and APC (right panel) without any cytokine supplement. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. Results from one of the two independent experiments are shown. (C) Purified P14 cells were stimulated as described in (B) except that IL-15 was used instead of IL-7 either alone or in combination with IL-6 or IL-21 for priming. Unlike the IL-7 stimulation, cell recovery following IL-15 stimulation alone was meager and these cells responded poorly to subsequent stimulation via the TCR. 80 To determine whether cytokine stimulation of CD8+ T cells also induced effector functions, we evaluated CTL response of P14 TCRtg CD8+ T cells stimulated with cytokines without and with subsequent stimulation by gp33 peptide in the absence of added cytokines. Stimulation by IL-7 in the presence of IL-6 or IL-21, but not in their absence, induced significant level of CTL activity against gp33 peptide-pulsed target cells (Fig. 6A, upper panel). However, the magnitude of these cytokine-induced responses was considerably lower than the CTL activity stimulated by the antigenic peptide. Interestingly, the cytokine- activated cells showed dramatically higher CTL activity when subsequently stimulated by the antigenic peptide, which was evident at very low effector:target ratio (Fig. 6A, lower panel). This increase in cytolytic activity was associated with an increase in the expression of granzyme B (Fig. 6B). P14 TCRtg CD8+ T cells stimulated by cytokines alone did not upregulate granzyme B, however these cells showed a greater induction of granzyme B upon re-stimulation by antigenic peptide. CD8 T cells pre-stimulated with IL-15 in the presence of IL-6 or IL-21 also caused a similar increase in CTL activity following subsequent Ag stimulation (Fig. 6C). Collectively, these results indicate that prior exposure of CD8+ T cells to inflammatory cytokines generated by the innate immune response can profoundly augment their responsiveness to Ag. 81 Figure 6. Cytokine-stimulated CD8+ T cells display increased cytolytic activity following Ag re-stimulation. Total lymph node cells from P14 TCRtg mice were stimulated with gp33 peptide for 3 days or indicated cytokines for 5 days and CTL activity was measured by 51Crrelease assay using EL4 target cells loaded with gp33 peptide (A, upper panel). Cells stimulated by the control AV peptide displayed negligible CTL activity (data not shown). Cells cultured for 4 days with cytokines were washed and subsequently stimulated with a suboptimal concentration of gp33 peptide (0.01 g/ml) for 2 days without cytokine addition. CTL activity was measured at lower effector:target ratios (A, lower panel). For comparison, freshly isolated P14 cells were stimulated at the same concentration of gp33 peptide for 2 days (open circles). Cells from the above experiment were stained for intracellular granzyme B (B, upper panel). The increase in the mean fluorescence intensity (MFI) of granzyme B caused by prior cytokine stimulation was calculated based on the induction caused by gp33 alone (B, lower panel). Representative data from four separate experiments are shown. (C) P14 TCR tg T cells were cultured with IL-6 or IL-21 in the presence of IL-15 for 4 days, washed and stimulated with gp33 peptide for additional 2 days. CTL activity was measured as described above. Data from one of the two independent experiments are shown. Cell recovery after culture with IL-21, IL-6 or IL-15 alone was too low to carry out CTL assay. 82 Synergistic stimulation by cytokines induces distinct phenotypic differentiation of CD8+ T lymphocytes CD8+ T cells stimulated via the TCR either by antigenic peptide or by a combination of anti-CD3 and anti-CD28 mAb undergo proliferation accompanied by distinct alterations in the expression of the TCR, co-receptors, adhesion molecules and cytokine receptors (ULLMAN et al., 1990). Since cytokine stimulation of CD8+ T cells induced a 5 to 10-fold less proliferation compared to TCR stimulation (Fig. 1D), we examined whether synergistic stimulation by IL-7 and IL-6 or IL-21 induced a similar modulation of cell surface molecules as signaling via the TCR (Fig. 7A). Cells stimulated via the TCR showed significant upregulation of all three chains of the IL-2 receptor (CD25, CD122 and CD132) and CD69. In comparison, cytokineinduced proliferation was accompanied by only a modest increase in the expression of IL2R, IL-2 and CD69, and a strong upregulation of the c chain. On the other hand, the expression of IL-7R (CD127) was augmented by TCR signaling but not by cytokine stimulation. TCR signaling increased the expression of CD44 but decreased those of CD62L and the TCR. In contrast, synergistic stimulation by cytokines strongly increased the expression of CD62L and TCR, with a modest increase in CD44 expression. As shown recently (PARK et al., 2007), cytokine stimulation markedly augmented the expression of the CD8 co-receptor. IL-15 also induced a similarly distinct phenotypic profile as IL-7 in the presence of IL-6 or IL-21 (Fig. 7B). For most markers, IL-7 or IL-15 alone was as efficient as the cytokine combinations, indicating that IL-6 and IL-21, which are necessary to induce proliferation (Fig. 1), do not contribute significantly to the distinct phenotypic changes associated with synergistic cytokine stimulation. These results indicate that (i) even though the TCR and cytokine stimuli induce proliferation of CD8+ T cells, they modulate the expression of cell surface molecules in a significantly different manner, and (Fujii et al., 2004) cytokineinduced phenotypic differentiation occurs independently of cell proliferation. 83 Figure 7. Cytokine stimulation of P14 cells induces a distinct phenotypic differentiation program compared to stimulation via the TCR. (A) Total splenocytes from P14 TCRtg mice were stimulated with indicated cytokines, gp33 peptide in the presence of irradiated autologous APC or a combination of anti-CD3 and anti-CD28 mAb for 3 days. Expression of indicated cell surface molecule was evaluated by flow cytometry (filled histograms). Freshly isolated P14 cells served as control (line histogram). The mean fluorescence intensity (geometric mean) of activated cells is given within each histogram plot, and the value for unstimulated P14 cells is given below each marker label. Data shown are representative of four independent experiments. (B) Cells stimulated with IL-15 either alone or in the presence IL-6 or IL-21 as in (A) displayed similar phenotypic changes as IL-7 stimulated CD8+ T cells. Representative markers from one of the three separate experiments are shown. 84 Discussion Activation of T lymphocytes via the TCR and concomitant delivery of co-stimulatory signals are the central requirements to mount an effective immune response against pathogens and to discourage activation of autoreactive cells. These requirements can be overcome under certain circumstances such as lymphopenia, where cytokines such as IL-15 and IL-7 induce proliferation of T cells to rapidly restore homeostasis of T lymphocytes (JAMESON, 2002). Transgenic expression of IL-7, IL-15, or constitutively active STAT5, a key signaling molecule downstream of these cytokines, causes an accumulation of CD8+ T cells (NISHIMURA et al., 2000; KIEPER et al., 2002; BURCHILL et al., 2003; KELLY et al., 2003). These observations suggest that Ag-independent stimulation of CD8+ T cells may occur under conditions of cytokine abundance or increased cytokine receptor signaling. An earlier work has shown that bystander activation of CD8+ T cells can occur in vivo during immune response to a viral infection, presumably mediated by cytokines (EHL et al., 1997). The possibility that such bystander activation may contribute to the transition from innate immune responses to adaptive immunity cannot be ignored. In fact, circumstantial evidence suggest that Ag non-specific, cytokine-driven proliferation of autoreactive T cells might be involved the initiation and exacerbation of autoimmune diseases (VON HERRATH et al., 2003; KING et al., 2004). This notion is further supported by recent findings that naïve CD8+ T lymphocytes can be induced to proliferate following synergistic stimulation by IL-15 or IL-7 in the presence of IL-21 (ZENG et al., 2005; GAGNON et al., 2007). Here, we have shown that IL-6, which is secreted by activated cells of the innate and adaptive immune system including monocytes, macrophages, dendritic cells and T and B lymphocytes (YRLID et al., 2000; NAKA et al., 2002), also can synergize with IL-7 or IL-15 to stimulate activation of naïve CD8+ T cells in an Ag independent manner. IL-7 and IL-15 belong to the IL-2 family of cytokines, which require the c chain to transduce cellular activation signals via the JAK-STAT pathway (KOVANEN et al., 2004).The magnitude of STAT5 activation closely correlates with the TCR-independent proliferation of CD8+ T cells stimulated by cytokines. In fact, overexpression of constitutively active STAT5 results in the accumulation of CD8+ T cells whereas STAT5 deficient mice display a paucity of CD8+ T cells (BURCHILL et al., 2003; KELLY et al., 2003). IL-7, but not IL-15, induced a strong phosphorylation of STAT5 in naïve CD8+ T cells (Fig. 4A), 85 whereas both IL-7 and IL-15 strongly activated STAT5 in a polyclonal population of CD8+ T cells, which presumably contains a certain frequency of memory cells (GAGNON et al., 2007). It is likely that elevated expression of IL-2R, c and IL-7R chains in memory CD8+ T cells (TAN et al., 2002) underlies the strong STAT5 phosphorylation induced by IL-15 or IL-7 in polyclonal CD8+ T cells. In naïve CD8+ T cells, augmentation of the IL-7 induced STAT5 phosphorylation by IL-6 or IL-21 could be the primary signaling pathway that stimulates cell proliferation. Data shown in Fig. 4F indicates that other signaling molecules such as Src kinases, PI3K and p38 MAPK also contribute to this synergistic response. Because IL-21 and IL-6 induce minimal or negligible STAT5 activation in naïve CD8+ T cells, but induce strong STAT3 phosphorylation, which is not enough to induce proliferation, it is likely that co-operation between STAT3 and STAT5 pathways underlies the synergistic effect of IL6 and IL-21 in the presence of IL-7. Further investigation is needed to determine how this cooperation rapidly translates into increased STAT5 activation (Fig. 4A). A number of earlier studies have implicated IL-6 in the survival and activation of T cells. However, the underlying mechanisms have not been completely understood. IL-6 can promote proliferation of thymocytes and peripheral T cells induced by mitogens (GARMAN et al., 1987; LE et al., 1988; LOTZ et al., 1988), which has been attributed to its anti-apoptotic function through increased expression of Bcl-2 and inhibition of activation induced cell death (TEAGUE et al., 1997; AYROLDI et al., 1998; TAKEDA et al., 1998; TEAGUE et al., 2000). IL-6 has also been reported to promote differentiation human and murine CTLs (OKADA et al., 1988), which could account for its ability to confer increased resistance to intracellular bacterial infection (LIU et al., 1994). The present study has revealed a novel role for IL-6 in inducing TCR-independent proliferation in CD8+ T cells in synergy with IL-7 or IL-15. IL-6-mediated survival and increased proliferation of T cells has been shown to be dependent on STAT3 (TAKEDA et al., 1998; NARIMATSU et al., 2001). However, concomitant stimulation of naïve CD8+ T cells by IL-7 or IL-15 did not augment the IL-6induced STAT3 phosphorylation (Fig. 4). Therefore, the pro-survival function of STAT3 activated by IL-6 might only play a secondary role in the proliferation and functional differentiation of CD8+ T cells stimulated by the synergistic effect of IL-6 and IL-7 or IL-15. IL-6 plays a critical role during transition from neutrophil-mediated acute inflammation to monocyte- and lymphocyte-dependent immune response (HURST et al., 2001; 86 KAPLANSKI et al., 2003; JONES, 2005). Important mechanisms underlying this transition could be the pro-survival function of IL-6 in T-cells and the recently demonstrated capacity of IL-6 to promote T cell infiltration in inflammatory sites (WEISSENBACH et al., 2004; MCLOUGHLIN et al., 2005). The present study shows that direct stimulatory effect of IL-6 on CD8+ T cells in the present of IL-7 and IL-15 could also contribute to the transition from innate to adaptive immunity. Unlike IL-21, which is produced essentially by activated CD4+ T cells, IL-6 is produced by several cell types including neutrophils, dendritic cells, macrophages, and CD4+ and CD8+ T cells upon activation (PALMA et al., 1992; PARRISHNOVAK et al., 2000; NAKA et al., 2002). Hence, IL-6 will be available from the very beginning of an immune response as an effector molecule of innate immunity even before IL21 becomes available. Since myeloid cells also produce IL-15 in response to innate immune stimuli (TAGAYA et al., 1996), it is conceivable that local activation of recirculating CD8+ T cells can occur at inflammatory sites by the combined action of IL-15 and IL-6. Since these cytokine-activated CD8+ T cells display increased proliferation and effector functions upon subsequent Ag stimulation (Fig. 5 and 6), such bystander activation of CD8+ T cells by cytokines may function to bridge the innate and adaptive immune responses. It is also likely that the distinct cell surface phenotype stimulated by cytokines (Fig. 7) may be useful in facilitating their responses to antigen. For instance, the CD62Lhi phenotype will facilitate the cytokine-primed CD8+ T cells to re-enter peripheral lymph nodes in search of specific antigens (GALKINA et al., 2003; GALKINA et al., 2007). Whereas IL-7 alone can induce this phenotype, the inflammatory cytokines IL-6 and IL-21 are necessary to promote expansion of these cells, and may even help in the acquisition of this phenotype in vivo where IL-7 is limiting. As much as the Ag non-specific activation of CD8+ T cells by IL-6 in the presence of IL-7 or IL-15 would be beneficial to mount protective immune responses, it can also contribute to perpetuation of chronic inflammatory conditions and progression of autoimmune diseases (ISHIHARA et al., 2002; KAPLANSKI et al., 2003; JONES, 2005). Cytolytic activity of cytokine-stimulated CD8 T cells, their reduced antigen threshold to undergo proliferation, and their distinct cell surface phenotype may have important implications in the pathogenesis of autoimmune diseases such as type 1 diabetes in which CD8+ T cells significantly contribute to the disease (WALTER et al., 2005). 87 Acknowledgments S.I. was a Scholar of the Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) and is a CIHR New investigator. P.P.McD. is a FRSQ Scholar. J.G. is supported by a FRSQ doctoral studentship. A.C. is a recipient of CIHR doctoral studentship. References 1. Rathmell, J. C., E. A. Farkash, W. Gao, and C. B. Thompson. 2001. IL-7 enhances the survival and maintains the size of naive T cells. J Immunol 167:6869-6876. 2. Vivien, L., C. Benoist, and D. Mathis. 2001. T lymphocytes need IL-7 but not IL-4 or IL-6 to survive in vivo. Int Immunol 13:763-768. 3. Khaled, A. R., and S. K. Durum. 2002. 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E-mail: [email protected] 3 Abbreviations used in this paper: c, common -chain; GRR, IFN- response region; PTK, protein tyrosine kinase; tg, transgenic. 94 CHAPITRE 3 ARTICLE 2 Increased antigen responsiveness of naive CD8 T cells exposed to IL-7 and IL-21 is associated with decreased CD5 expression Julien Gagnon, Xi Lin Chen, Melissa Forand-Boulerice, Chantal Leblanc, Chander Raman, Sheela Ramanathan and Subburaj Ilangumaran Statut de l’article: Publié en 2010 Immunology and Cell Biology, volume 88, numéro 4, pages 451-460. Avant-propos: Dans cette étude, j’ai réalisé la grande majorité des expériences menant aux résultats présentés. J’ai conçu et planifié les expériences en collaboration avec certains auteurs de l’article. J’ai interprété et analysé les résultats ainsi que la confection des figures. 95 96 Résumé L’exposition de lymphocytes T CD8 à l’IL-7 en combinaison avec l’IL-21 permet une prolifération accrue lors d’une stimulation antigénique subséquente. Dans cet article, nous avons exploré l’aspect temporel et mécanistique de la stimulation par l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7. Une stimulation de 24 heures avec les combinaisons de cytokines est suffisante afin d’observer une augmentation de la prolifération, de la sensibilité et de la cytotoxité des lymphocytes T CD8 P14 TCRtg en réponse à l’antigène. Une préstimulation avec les combinaisons de cytokines stimule une prolifération subséquente à l’antigène en absence de molécule de co-stimulation. La combinaison des cytokines entraîne une forte expression du récepteur de l’IL-2R (CD132) ainsi qu’une augmentation de la production de l’IL-2 après stimulation antigénique, augmentant ainsi l’amplification autocrine. L’augmentation de l’avidité du TCR induit par une stimulation avec les combinaisons de cytokines serait attribuable à la diminution importante de l’expression de CD5 causée, entre autres, par le répresseur de transcription E47. Ces résultats indiquent que la préstimulation avec une combinaison de cytokines influence l’expression à la surface membranaire de molécules impliquées dans le contrôle de la signalisation du TCR. 97 Increased antigen responsiveness of naive CD8 T cells exposed to IL-7 and IL-21 is associated with decreased CD5 expression Julien Gagnon, Xi Lin Chen, Melissa Forand-Boulerice, Chantal Leblanc, Chander Raman*, Sheela Ramanathan and Subburaj Ilangumaran Immunology division, Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Sherbrooke; Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel, Centre Hospitalier de l’université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada; *Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, USA. Running Title: IL-7 downmodulates CD5 expression Corresponding author: Subburaj Ilangumaran Ph.D. Immunology division, Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Sherbrooke 3001 North 12th avenue, Sherbrooke QC J1H 5N4, Canada Tel: 1-819-346 1110 x14834; Fax: 1-819-564 5215 [email protected]) 98 Abstract Exposure of naïve CD8 T cells to the synergistic combination of IL-7 and IL-21 enables them to respond strongly to subsequent antigen stimulation. Mechanisms underlying the increased antigen responsiveness of such cytokine-primed CD8 T cells are not known. Here, we show that a brief exposure of less than 24 h to IL-7 and IL-21 is sufficient to sensitize naïve P14 TCR transgenic CD8 T cells to respond to limiting quantities of antigen, resulting in increased proliferation, IFN secretion and antigen-specific cytolytic activity. Cytokineinduced increase in TCR responsiveness occurs even in the absence of costimulatory signals. Cytokine priming upregulates the expression of the c chain and increases IL-2 production following antigen stimulation, thus enhancing autocrine stimulation. Notably, cytokine priming induces rapid and profound downmodulation of CD5, implicated in the negative regulation of TCR signaling, via induction of the transcriptional repressor E47. These findings show that increased antigen responsiveness of cytokine-primed CD8 T cells results from the modulation of multiple cell surface molecules that influence cytokine receptor and TCR signaling. Key words: IL-7, IL-21, CD8 T cell, CD5, E47, TCR 99 Introduction IL-7 is essential for the development, survival and homeostatsis of T lymphocytes (PESCHON et al., 1994; VON FREEDEN-JEFFRY et al., 1995; SCHLUNS et al., 2000; RATHMELL et al., 2001; TAN et al., 2001). Transgenic expression of IL-7 causes massive increase in T cell number and dysregulates T cell homeostasis (KIEPER et al., 2002). Stromal cells constitutively produce IL-7, but only in limiting quantities (HOFMEISTER et al., 1999; FRY et al., 2005). To conserve the utilization of IL-7 for survival, T cells downregulate the expression of IL-7R chain (CD127) in response to survival signals provided by other cytokines (PARK et al., 2004; MAZZUCCHELLI et al., 2007). IL-7 is also essential for the expansion of the naïve T cell pool following lymphodepletion, however basal signaling via the TCR, delivered upon contact with self MHC molecules, is additionally required to induce homeostatic proliferation of naïve T cells (SCHLUNS et al., 2000; TAN et al., 2001; JAMESON, 2002; GAGNON et al., 2008). Recent studies show that fibroblastic reticular cells in lymph nodes and dendritic cells dynamically regulate the production of IL-7 in response to homeostatic pressure (LINK et al., 2007; GUIMOND et al., 2009). IL-7 expression can also be induced in several other cell types such as keratinocytes, synoviocytes and hepatocytes, often in response to inflammatory and cytokine stimuli such as IFN, TNF, IL-6 and LPS (ARIIZUMI et al., 1995; HARADA et al., 1999; SAWA et al., 2006; SAWA et al., 2009). The inducible IL-7 production and enhanced IL-7 activity following lymphopenia are implicated in the activation of CD4 and CD8 T cells in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, experimental autoimmune encephalomyelitis and type 1 diabetes (SAWA et al., 2006; CALZASCIA et al., 2008; CHURCHMAN et al., 2008; SAWA et al., 2009). A recent study has identified polymorphism in the Il7ra gene as a genetic susceptibility factor for multiple sclerosis (LUNDMARK et al., 2007). Clearly, these studies implicate IL-7 signaling in the activation of potentially autoreactive T cells, however the underlying molecular mechanisms remain to be elucidated. Several studies have shown that IL-7 enhances the adaptive immune response. IL-7 has been reported to be as efficient as or even more potent than IL-2 in expanding anti-tumor CTLs for adoptive cell therapy (JICHA et al., 1991; LYNCH et al., 1991). Administration of IL-7 and Il7 gene therapy induced regression of established tumors and increased antiviral 100 CTL activity, and IL-21 boosts the anti-tumor effect of IL-7 (MURPHY et al., 1993; KOMSCHLIES et al., 1994; ABDUL-HAI et al., 1997; MILLER et al., 2000; ANDERSSON et al., 2009). In vivo, IL-7 induced a 3-fold greater expansion of the CD8 compartment than the CD4 T cell pool (GEISELHART et al., 2001). A recent study has shown that IL-7 acts as an adjuvant in stimulating tumor-specific CTLs, which has been attributed to the downmodulation of Cbl-b, a negative regulator of TCR signaling (PELLEGRINI et al., 2009). Recently, we have shown that stimulation of naïve CD8 T cells expressing the transgenic P14 TCR (P14 cells) with IL-7 in the presence of IL-6 or IL-21 induces antigenindependent proliferation and consequently increases the sensitivity of the responder cells to subsequent stimulation by antigen (GAGNON et al., 2008). Our study suggested that the in vivo anti-tumor effect of IL-7 and its potential to stimulate autoreactive CD8 T cells may result from its ability to synergize with IL-6 or IL-21 to activate CD8 T cells. Consistent with this notion, Liu et al. have shown that IL-21 potentiates the anti-tumor effect of IL-7(LIU et al., 2007). Similarly, IL-21 has been shown to play a critical role in lymphopenia-driven expansion of autoreactive T cells in the NOD mouse (KING et al., 2004; DATTA et al., 2008; SPOLSKI et al., 2008; SUTHERLAND et al., 2009). In this study, we investigated the mechanism by which IL-7, in synergy with IL-21, ‘sensitizes or primes’ naïve CD8 T cells to respond robustly to antigen. 101 Results Cytokines of the innate immune response sensitize naive CD8+ T lymphocytes to subsequent antigen stimulation To determine whether the increased antigen responsiveness of naïve P14 cells prestimulated with IL-7 in the presence IL-6 or IL-21 resulted from the induction of a differentiation program or was a sequel to the antigen non-specific proliferation stimulated by cytokines, we exposed the P14 cells to cytokines for 24 or 48 h, washed off the cytokines and then evaluated their proliferation in response to gp33 peptide antigen. Stimulation with IL-7 and IL-6 or IL-21 for 24 h did not induce proliferation of naïve P14 cells (Fig. 1A) but increased their sensitivity to gp33 peptide by more than 10-fold (Fig. 1B, left panel). Increasing the duration of cytokine prestimulation to 48 h only marginally augmented the response to antigen (Fig. 1B, right panel). The effect of cytokine pre-stimulation in boosting the antigen responsiveness was not secondary to selective increase in cell survival or cellular metabolism, as the addition of IL-21 or IL-6 did not significantly augment the increase the cell viability or cell size caused by IL-7 alone (Fig. 1C). To rule out the possibility that the increased antigen responsiveness of purified P14 cells (Fig. 1B) could result from selective activation of CD44hi memory-like P14 cells that might arise from reactivity towards environmental antigens, or cytokine-driven homeostatic and/or bystander proliferation (SURH et al., 2008), we purified CD8+CD44lo P14 cells (Fig. 1D) and cultured them in the presence of IL-7, either alone or in the presence of IL-21. After 36 h, we evaluated the proliferation of these cytokine-prestimulated and freshly purified CD44lo P14 cells following stimulation with the gp33 peptide presented by irradiated C57Bl/6 splenocytes. As shown in Fig 1D, CD44lo P14 cells pre-stimulated with IL-7 and IL-21, but not those incubated with IL-7 alone, displayed increased sensitivity to limiting quantities of the gp33 peptide antigen. These results showed that naïve CD8 T cells exposed to IL-7 in the presence of IL-21 rapidly acquired an increased sensitivity to antigen, by a process referred herein as ‘cytokine priming in this study (RAMANATHAN et al., 2009). 102 103 Figure 1. Brief exposure to IL-7 and IL-6 or IL-21 is sufficient to ‘prime’ naive CD8 T cells to proliferate robustly upon subsequent antigen stimulation. (A) Purified P14 TCR transgenic CD8 T cells were cultured with IL-7, either alone or in the presence of IL-6 or IL21, for 1, 2 or 3 days. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. For comparison, proliferation induced by antigen in the presence of irradiated C57Bl/6 splenocytes as APC or anti-CD3 + anti-CD28 Ab are shown. (B) Purified P14 cells, either freshly isolated (none) or cultured with indicated cytokines for 1 or 2 days were washed to remove cytokines and equal numbers of CD8 T cells were stimulated with the gp33 peptide presented by irradiated APC without any cytokine supplement. Cell proliferation was measured by [ 3H]thymidine incorporation. For A and B, representative results from more than three independent experiments are shown. (C) CD8+ T cells purified from the P14 TCR transgenic mice were incubated with the indicated cytokines. At the end of the indicated periods of time, the cells were stained with annexin V-PE and the proportion of live cells and the change in cell size were calculated after excluding the debris with a very low FSC value. (D) CD44 lo naïve P14 cells, purified by negative magnetic selection (upper panel, right), were stimulated, either immediately or after incubation with the IL-7 alone or IL-7 and IL-21 for 36 h, with the indicated concentrations of the gp33 peptide presented by irradiated C57Bl/6 splenocytes. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. Data shown in C and D are representative of two independent experiments. 104 Cytokine priming potentiates antigen-induced effector functions of naive CD8+ T cells To determine whether brief cytokine stimulation would also be sufficient to enhance effector functions following Ag stimulation, we stimulated naïve P14 cells by cytokines for 1, 2 or 3 days followed by gp33 peptide stimulation before evaluating their cytolytic activity and cytokine production. Stimulation of naïve P14 cells with IL-7 and IL-6 or IL-21 for only 24 h significantly augmented the CTL activity induced by gp33 stimulation, which was evident at very low effector-target cell ratio of 1:1 (Fig. 2A). Increasing the duration of cytokine prestimulation caused a proportional augmentation of the antigen-induced CTL response (Fig. 2A and 2B). 105 Figure 2. Cytokine priming strongly enhances antigen-induced cytolytic activity in naive CD8 T cells. (A) Total lymph node cells from P14 TCR transgenic mice, cultured with the indicated cytokines for 24 or 48 h, were subsequently stimulated gp33 peptide for 2 days, equalized for CD8 T cells and CTL activity was measured by the 51Cr-release assay using EL4 target cells loaded with gp33 peptide as detailed in the methods section. Under these conditions, target cells loaded with the non-agonist AV peptide were not lysed (data not shown). Cells stimulated by cytokines alone for 1 or 2 days showed negligible CTL activity (not shown). (B) Comparison of the CTL activity of antigen-stimulated P14 cells, which had been previously exposed to the indicated ctokines for 1, 2 or 3 days at the effector:target ratio of 10:1. 106 To examine whether cytokine pre-stimulation also influenced cytokine production upon subsequent antigen stimulation, we measured IFN and IL-2 secretion in naïve P14 cells primed with cytokines for 1, 2 or 3 days prior to antigen stimulation for 2 days. We observed that cytokine prestimulation strongly amplified IFN secretion (Fig. 3A, left panel). Priming by IL-7 and IL-21 increased IFN secretion by 5-fold even after one day of cytokine prestimulation compared to unprimed cells stimulated with antigen (Fig. 3A, left and right panels). The priming cytokines alone failed to induce IFN even after 3 days of stimulation without subsequent antigen stimulation (Fig. 3A, right panel). Similar results were obtained for IL-2 secretion (Fig. 3B). Together, the results shown in Figures 1-3 strongly support our contention that exposure to IL-7 and inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-21 sensitizes naïve CD8 T cells to respond more efficiently and robustly to subsequent stimulation by cognate antigen. 107 Figure 3. Cytokine priming of naive CD8 T cells rapidly enhances antigen-induced secretion of IFN and IL-2. Total lymph node cells from P14 TCR transgenic mice, cultured with the indicated cytokines for 1, 2 or 3 days, were equalized for CD8 T cells and subsequently stimulated gp33 peptide for 2 days. IFN (A) and IL-2 (B) secreted by the antigen-stimulated cells into the culture supernatants were measured by sandwich ELISA (left panels). For comparison, production of IFN and IL-2 by cells stimulated with cytokines or antigen alone for 3 days is shown in the right panel. 108 Autocrine IL-2 signaling is critical for the increased antigen-induced proliferation of cytokine-primed P14 cells We have shown previously that cytokine prestimulation modulated the expression of the IL-2 receptor chains (GAGNON et al., 2008), suggesting that the large amounts of IL-2 produced by cytokine-primed CD8 T cells (Fig. 3B) could significantly contribute to their increased antigen-induced proliferation. To address this question, we first examined whether modulation of the IL-2R expression occurred early during cytokine priming. As shown in Fig. 4A, cytokine priming only modestly increased the expression of IL-2R and IL-2R chains, whereas the expression of the c chain was dramatically increased within 24 h after cytokine priming. Moreover, the induction of the c chain was specifically augmented by the synergistic cytokine combination, whereas IL-7 alone did not have any appreciable effect (Fig. 4A). On the other hand, the expression of IL-7R was profoundly downmodulated by IL-7 alone (Fig. 4A), as documented earlier (PARK et al., 2004). Next, to determine whether IL-2 signaling is important for the increased antigen responsiveness of cytokine primed cells, we added the anti-IL-2R mAb (7D4), which blocks IL-2 signaling. As shown in Fig. 4B, addition of 7D4, but not the IL-7R blocking Ab A7R34, almost completely inhibited the antigen-induced proliferation of cytokine-primed cells. These results show that autocrine IL-2 production and elevated expression of the c chain are important determinants of the increased antigen-induced proliferation of cytokine-primed CD8 T cells. 109 Figure 4. Increased proliferation of cytokine-primed P14 cells to antigen requires autocrine IL-2 stimulation. (A) Total lymph node cells from P14 TCR transgenic mice, cultured with the indicated cytokines, for the indicated periods of time, were evaluated by flow cytometry for the expression of the indicated cytokine receptor chains. Relative fluorescence intensity was calculated based on the mean fluorescence intensity of freshly isolated cells (taken as 100%) evaluated at the same time as cytokine-primed cells. (B) Naïve and cytokineprimed P14 cells were stimulated with gp33 presented by irradiated APC. Blocking antibodies to IL-2R or IL-7R were added at the time of antigen stimulation. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation after 2 days. Representative results from two independent experiments are shown. 110 Cytokine priming augments TCR-stimulated proliferation both directly and via costimulatory receptors Even though increased autocrine IL-2 stimulation is an important contributing factor for the increased antigen-driven proliferation, it only occurs subsequent to the increased sensitivity of cytokine-primed P14 cells to limiting amounts of antigen (Fig. 1B). To investigate whether cytokine priming directly influenced T cell activation, we first evaluated the expression of molecules that directly influence TCR signaling (RUDOLPH et al., 2006; SMITH-GARVIN et al., 2009) at different times after cytokine stimulation. As shown before (PARK et al., 2007; GAGNON et al., 2008), IL-7 alone induced a dramatic increase in the expression of both CD8 and CD8 (Fig. 5A), however this increase was not significantly augmented by the addition of IL-21 or IL-6. Examination of the different costimulatory receptors (WATTS, 2005; PATERSON et al., 2009) showed that the priming cytokines caused a negligible increase in the expression of CD28 and CD137 (4-1BB) (Fig. 5A). Expression of GITR was dramatically increased by cytokine priming within 12 h of stimulation. However, IL-7 alone was as efficient as the IL-7 plus IL-6 or IL-21 combination in augmenting the expression of GITR (Fig. 5A). Only the expression of CD134 (OX40) was significantly augmented by the cytokines in combination than by IL-7 alone (Fig. 5A). These results indicated that not only the increased expression of the CD8 coreceptor but also the upregulation of the costimulatory receptors such as GITR and OX40 could also contribute to the increased antigen responsiveness of cytokine-primed CD8 T cells. However, the increased cell surface expression of these TCR accessory molecules is unlikely to be the principal cause of cytokine priming because IL-7 alone, which did not induce the priming state, efficiently upregulated CD8 and the costimulatory receptors. To test whether cytokine priming modulated the activation of naïve CD8 T cells via CD28, we stimulated the cytokine-primed P14 cells with immobilized anti-CD3 Ab (2C11) either alone or in the presence of soluble anti-CD28 mAb (35.1). We observed that 2 days of exposure to IL-7 alone caused a significant increase in proliferation in response to stimulation via the CD3/TCR complex and CD28 (Fig. 5B). Synergistic stimulation by IL-7 and IL-6 or IL-21 further augmented proliferation in response to anti-CD3 and anti-CD28 (Fig. 5B). However, cytokine priming induced significant proliferation of P14 cells to stimulation of the CD3/TCR complex using immobilized anti-CD3 antibody alone, in the absence of 111 costimulatory signals (Fig. 5B and 5C). These results suggested that cytokine priming might directly influence TCR signaling. To further confirm this possibility, we stimulated purified P14 cells with H2Db:Ig dimer loaded with different concentrations of gp33 peptide. This artificial APC method described by Mecher and colleagues (CURTSINGER et al., 2003), allows stimulation of CD8 T cells by antigen in the absence of all costimulatory signals. As shown in Fig. 5D, only the cells prestimulated with the synergistic cytokine combination showed significant proliferation in response to antigen in the absence of costimulatory signals. These results suggested that cytokine priming could augment antigen-induced proliferation by modulating signaling via both TCR and costimulatory receptors. 112 Figure 5. Cytokine priming augments TCR-stimulated proliferation independently of costimulation. (A) Total lymph node cells from P14 TCR transgenic mice, cultured with the indicated cytokines, for the indicated periods of time, were evaluated for the expression of the indicated cell surface molecules by flow cytometry. Relative fluorescence intensity was calculated as in Fig. 4A. (B, C, D) Purified P14 cells were stimulated with (B) polystyrene beads coated with anti-CD3 mAb either alone or along with anti-CD28 mAb (C), the indicated concentrations of anti-CD3 mAb 2C11 immobilized to the culture wells, or (D) immobilized MHC-I (H-2Db):Ig fusion protein dimers loaded with indicated concentrations of the agonist gp33 peptide. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation. For all experiments, data shown are representative of at least three independent experiments. 113 Cytokine priming downregulates CD5 expression in naïve CD8 T cells A recent report has shown that IL-7 antagonizes the negative regulatory mechanisms of TCR signaling by downmodulating the expression of Cbl-b, which occurs within 1 h after exposure to IL-7 (PELLEGRINI et al., 2009). Both Cbl-b and c-Cbl are implicated in negatively regulating TCR signaling and deficiency of either of these molecules decreases the activation threshold in T cells (THIEN et al., 1999; BACHMAIER et al., 2000; JANG et al., 2003). To examine whether priming of naïve CD8 T cells with the synergistic cytokine combination promotes downmodulation of Cbl proteins, we evaluated the expression of Cbl-b and c-Cbl in P14 cells at different time points after exposure to cytokines. As shown in Fig. 6A, IL-7, either alone or in combination with IL-21 failed to modulate the expression of Cbl-b or c-Cbl throughout the culture period of up to 48 h. On the other hand, phosphorylation of LAT, a critical signaling molecule downstream of the TCR (ZHANG et al., 1998; SMITHGARVIN et al., 2009), was consistently elevated in cytokine-primed cells, however, this increase was also caused by IL-7 alone and occurs only after 24 h (Fig. 6A). Next, we examined phosphorylation of LAT in cytokine-primed cells following TCR stimulation by crosslinking the anti-CD3 complex. As shown in Fig. 6B, naïve CD8 T cells stimulated with anti-CD3 induced strong LAT phosphorylation, which was slightly diminished in cells stimulated with the priming cytokine combinations but not with IL-7 alone. These results suggested that cytokine priming may not directly enhance TCR signaling, but might modulate it via other regulators of TCR signaling. During these investigations, we observed that cytokine priming induced a rapid and profound downmodulation of CD5 (Fig. 6C), which is also implicated in the negative regulation of TCR signaling (TARAKHOVSKY et al., 1995; PEREZ-VILLAR et al., 1999). Again, IL-7 alone was very efficient in decreasing the expression of CD5, and addition of IL-6 or IL-21 only marginally increased this downmodulation. Expression of CD5 is regulated primarily at the level of transcription and requires the binding of the Ets1 transcription factor to the Cd5 gene promoter (TUNG et al., 2001). However, two other transcription factors E47 and GATA3 are reported to negatively regulate CD5 expression (YANG et al., 2004; LING et al., 2007), raising the possibility that cytokine priming could downmodulate CD5 via transcriptional repression. GATA3 is an unlikely candidate to repress CD5 expression in cytokine-primed P14 cells, because upon antigen stimulation these cells produce copious 114 amounts of IFN, which requires the transcription factor T-bet that blocks the expression of GATA3 (HO et al., 2002). Expression of the E protein family transcription factor E47 has been correlated with decreased CD5 expression in mature T cells (QUONG et al., 2002; YANG et al., 2004). Therefore, we evaluated the expression of E47 by western blot in P14 cells at different time points after cytokine stimulation. As shown in Fig. 6A, IL-7, both alone and in conjunction with IL-21 or IL-6, upregulated the expression of E47. Consistent with the upregulation of E47, transcription of the Cd5 gene was downmodulated in cytokine-primed cells (Fig. 6D). These results indicate that the cytokine priming induces a genetic program that promotes the antigen responsiveness of naïve CD8 T cells. 115 Figure 6. Cytokine priming rapidly downmodulates CD5 via induction of its transcriptional repressor E47. (A) Purified P14 cells cultured with the indicated cytokines were lysed at the indicated periods of time to evaluate the expression of Cbl-b and c-Cbl, and the phosphorylation status of LAT by western blot. (B) Freshly isolated and cytokine-primed P14 cells were stimulated by crosslinking the CD3-TCR complex using 2C11 and anti-hamster IgG and phosphorylation of LAT and AKT were evaluated. Expression level of ERK1/2 was used to ensure equal sample loading. (C) Total lymph node cells from P14 TCR transgenic mice, cultured with the indicated cytokines, for the indicated periods of time, were evaluated for the expression of CD5 by flow cytometry (left panels). Relative fluorescence intensity (right panel) was calculated as in Fig. 4A. (D) RT-PCR evaluation of Cd5 mRNA in cytokineprimed cells, in comparison to that of 18S rRNA. Ratio between the densitometric values of Cd5 and 18S rRNA, corresponding to the cDNA dilution 1:270, is shown in the right panel. 116 Discussion In this study, we show that IL-7 can profoundly modulate the antigen responsiveness of naïve CD8 T cells that may have important implications in autoimmunity and cancer immunoptherapy. Several studies over the past two decades have highlighted the potential therapeutic use of IL-7 in immune reconstitution of immunodeficient patients as well as in augmenting anti-tumor CTL responses and in generating tumor-specific CTLs in vitro for adoptive immunotherapy (JICHA et al., 1991; KOMSCHLIES et al., 1994; FRY et al., 2002; ALPDOGAN et al., 2005; SPORTES et al., 2008; ANDERSSON et al., 2009; PELLEGRINI et al., 2009). However, a growing number of studies have shown that the immune enhancing properties of IL-7 may significantly contribute to the activation of potentially autoreactive T cells (SAWA et al., 2006; CALZASCIA et al., 2008; CHURCHMAN et al., 2008; SAWA et al., 2009). The mechanisms by which IL-7 enhances T cell responses to tumor antigens and autoantigens remain unclear and are only beginning to be elucidated (PELLEGRINI et al., 2009). Even though IL-7 is critical for homeostatic proliferation of naïve CD8 T cells (SCHLUNS et al., 2000; MACKALL et al., 2001) and in vivo administration of IL-7 enhances the expansion of naive T cells in mice and humans (MACKALL et al., 2001; SPORTES et al., 2008), IL-7 alone induces negligible proliferation of naïve CD8 T cells of human or mouse origin in vitro (ZENG et al., 2005; GAGNON et al., 2007). This could be because naïve CD8 T cells might receive a basal level of TCR signal from MHC-I molecules presenting peptides from self or environmental antigens, which may not be available in in vitro cultures. Signals emanating from the TCR and the IL-7R synergize and compensate for each another’s relative insufficiency (SEDDON et al., 2002; SURH et al., 2008). Accordingly, adoptively transferred OT-I TCR transgenic CD8 T cells undergo negligible homeostatic proliferation in replete OT-I hosts due to competition for self-peptide ligands, but increasing the availability of IL-7 by transgenic expression significantly augments proliferation (KIEPER et al., 2004). Others and we have shown that IL-7 can synergize with inflammatory cytokines such as IL-21 and IL-6 to induce antigen-independent proliferation of murine naïve CD8 T cells expressing a transgenic TCR such as H-Y or P14, or a polyclonal TCR repertoire (LU et al., 2002; ZENG et al., 2005; GAGNON et al., 2007; GAGNON et al., 2008). In this scenario, even though the possibility that the engagement of the TCR with MHC-I molecules of 117 adjacent cells might occur cannot be excluded, this putative interaction is certainly not sufficient to induce proliferation in the presence of IL-7. On the other hand, signals induced by IL-6 or IL-21 can synergize with IL-7 signaling to induce proliferation and effector functions. More importantly, following proliferation-induced by IL-7 and IL-6 or IL-21, naïve CD8 T cells display increased sensitivity to antigens characterized by enhanced proliferation and effector functions (GAGNON et al., 2008). These findings have important implications for the emerging role of IL-7 in triggering autoreactive T cells. It is noteworthy that autoimmune arthritis associated with enhanced IL-6 signaling is dependent on IL-7-dependent proliferation of CD4 T cells (SAWA et al., 2006). This could also be a likely scenario in IL-6-dependent colitis caused by homeostatic expansion of CD8 T cells (TAJIMA et al., 2008). In this study, we show that the ‘primed state’ of naïve CD8 T cells induced by IL-7 in synergy with IL-6 or IL-21 occurs within 24 h following exposure to cytokines, resulting in significantly increased responsiveness to antigens in terms of proliferation, cytolytic effector functions and cytokine production. Such increased antigen responsiveness is a well-known feature of memory CD8 T cells, which has been associated with increased TCR signaling and elevated and altered expression of cell cycle regulators (VEIGA-FERNANDES et al., 2000; KERSH et al., 2003; VEIGA-FERNANDES et al., 2004). A recent report showing decreased expression of Cbl-b in P14 cells within 1 h after exposure to IL-7 (PELLEGRINI et al., 2009) suggested that downmodulation of Cbl-b and increased TCR signaling might underlie the enhanced antigen responsiveness of cytokine-primed P14 cells. However, we did not observe a significant decrease the expression of Cbl-b or c-Cbl in P14 cells stimulated with IL-7, either alone or in combination with IL-6 or IL-21, for up to 40 h. Even though we do not rule out the possibility that downmodulation of Cbl-b may occur at earlier time points after cytokine exposure or subject to experimental variations, our results indicate that downmodulation of Cbl-b is unlikely to be the principal molecular mechanisms underlying the increased antigen responsiveness of P14 cells following priming with IL-7 and IL-21. We have observed that cytokine priming significantly increases the expression of TCR and CD8 coreceptor. It has been clearly demonstrated that increased expression of TCR and CD8 facilitate responsiveness to weakly agonistic TCR ligands (SLIFKA et al., 2001; KERRY et al., 2003; JONES et al., 2008). However, IL-7 alone was as efficient as the combination of IL-7 and IL-21 in upregulating TCR or CD8, indicating that increased expression these 118 molecules per se is insufficient for the priming effect of IL-7 and IL-21. Similarly, the expression of CD5, which is implicated in fine tuning TCR signaling via recruitment of protein tyrosine phosphatase SHP-1 (TARAKHOVSKY et al., 1995; AZZAM et al., 1998; PEREZ-VILLAR et al., 1999; MARQUEZ et al., 2005), was dramatically reduced by IL-7 almost to the same extent as in the presence of IL-21. Previous studies have shown that the expression level of CD5 on T cells is directly proportional to the affinity and avidity of the TCR to its cognate peptide:MHC ligand (AZZAM et al., 1998; KIEPER et al., 2002). Because the kinetics of CD5 downmodulation closely correlated with the enhanced antigen responsiveness of cytokine-primed P14 cells, we believe that the downregulation of CD5 by IL-7 will have a stronger influence on the functional effects of cytokine priming. Even though TCR signaling is known to dynamically modulate the expression of CD5 in CD8 T cells (MARQUEZ et al., 2005), our finding is the first observation of the modulation of CD5 expression by cytokines. Clearly, the priming cytokines decrease CD5 expression via inducing the transcriptional repressor E47. However, the decrease in mRNA level was only two-fold compared to the 4-5-fold decrease in the cell surface expression of CD5. In this context, it is noteworthy that the expression of CD5 is also modulated by internalization from cell surface (LU et al., 2002). Hence, the priming cytokines may decrease CD5 expression via modulating transcriptional and/or post-transcriptional control mechanisms. Upregulation of CD132 is specifically upregulated by IL-7 only in the presence of IL-6 or IL-21, and clearly plays an important role in the increased TCR responses of cytokineprimed cells as blocking IL-2R almost completely abolished the antigen-induced proliferation. Hence increased availability of antigen-induced IL-2 appears to act in an autocrine fashion, aided by increased expression of the c chain (CD132) that forms the high affinity receptor complex with IL-2 and IL-2. Whereas this autocrine IL-2 stimulation could substantially contribute to the overall increase in cell proliferation in cytokine-primed cultures, the molecular events underlying their increased TCR sensitivity appears to be diverse and make a collective contribution to the heightened proliferation and effector functions. Clearly, further investigation is needed to gain a better understanding of priming naïve CD8 T cells by IL-7 in the presence of the inflammatory cytokines IL-21 and IL-6. While IL-6 is produced several different cell types during the innate immune response, microbial infections can induce the expression of IL-21 in NKT cells (ISHIHARA et al., 2002; HARADA et al., 119 2006; COQUET et al., 2007). Given the fact that many autoimmune diseases are often associated with inflammation, priming of potentially autoreactive CD8 T cells by IL-7 in synergy with IL-6 or IL-21 could be a mechanism by which these cytokines promote autoimmune diseases (ISHIHARA et al., 2002; SAWA et al., 2006; CHURCHMAN et al., 2008; SAWA et al., 2009). Methods Mice C57BL/6 mice and Rag1-/- mice in C57BL/6 background were purchased from the Jackson Laboratory. Transgenic mice expressing the P14 TCR, which recognizes the gp33-41 (KAVYNFATM) epitope from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) glycoprotein, both in the context of MHC class I molecule H-2Db (OHASHI et al., 1991; YOKOSUKA et al., 2009) were kindly provided by Dr. P. Ohashi (University of Toronto). Six to eight 8 wkold mice were used in all experiments. All experiments on mice were approved by the institutional animal ethical committee. Antibodies and reagents Antibodies against mouse CD3, CD4, CD5, CD8, CD8, CD25, CD28, CD44, CD62L, CD122, CD127, CD132, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), GITR and TCRV2 conjugated to FITC, PE or biotin were purchased from BD Pharmingen Biosciences, (Palo Alto, CA) or from eBiosciences (San Diego, CA). Streptavidin-spectral red was from Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL). Hybridomas secreting anti-IL-2R (7D4) and anti-IL-7R (A7R34) were kind gifts from Dr. P. Poussier (Univ. of Toronto) and Dr. A. Cumano (Pasteur Institute, Paris) respectively. Recombinant cytokines IL-6, IL-7, IL-15 and IL-21 were purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN). RPMI-1640 cell culture medium and fetal bovine serum (FBS) were from Sigma Aldrich (Oakville, ON). Phosphospecific polyclonal antibodies to STAT5, LAT and AKT were obtained from Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Rabbit polyclonal antibodies to Cbl-b, c-Cbl and ERK1/2 were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti--actin Ab was from Sigma Aldrich. Antibody against E47 was from BD Pharmingen Biosciences. 120 Flow cytometry and magnetic cell sorting Expression of cell surface markers was evaluated by flow cytometry as described previously (GAGNON et al., 2008). To compare the level of expression, the relative fluorescence intensity (RFI) was calculated based on the expression on freshly isolated cells taken as 100%. P14 cells were purified to more than 99% by negative magnetic selection of CD8 T cells using Invitrogen (Dynal) magnetic beads following the manufacturer’s instructions. To enrich CD44lo P14 cells, anti-CD44 antibody was added to the Ab mix used for the negative selection of CD8 T cells. Cell proliferation Total splenocytes or lymph node cells (2x105 cells per well), or purified CD8 T cells (2.5x104 cells per well) were cultured with IL-7 (2.5 ng/ml), either alone or in combination with IL-6 (1 ng/ml) or IL-21 (10 ng/ml) for the indicated periods of time in 200 l of RPMI1640 medium in 96-well culture plates. For ‘cytokine priming’ of CD8 T cells, the cultures were scaled up to 2- 5 ml volume in 24- or 6- well culture clusters, according to the requirement. These ‘cytokine-primed’ and naïve P14 cells were stimulated with polystyrene beads (Dynal, Invitrogen) coated with anti-mouse CD3 mAb (2C11, either alone or along with the anti-CD28 mAb 35.1), or antigenic peptides presented by irradiated splenocytes from C57Bl/6 mice. In some experiments of antigen stimulation, the use of APC were avoided by coating the culture plates with MHC-I H-2Db:Ig dimer to which the antigenic peptides were added at the indicated concentrations (CURTSINGER et al., 2003). Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine incorporation as detailed elsewhere (GAGNON et al., 2008). CTL assay CTL activity was measured using EL-4 cells loaded with the antigenic peptide GP33 as described previously (GAGNON et al., 2008). 121 ELISA The amount of IFN and IL-2 in the culture supernatants was determined by sandwich ELISA following the manufacturer’s instructions using antibody pairs purchased from BD Pharmingen Biosciences (Palo Alto, CA). Cell stimulation and Western blot 1 106 freshly purified or cytokine-prestimulated CD8 T cells were washed and resuspended in starving medium for 2 h (RPMI-1640 medium containing 0.5% FBS, 1 mg/ml BSA, and 50 mM 2-mercaptoethanol) and incubated with anti-CD3 mAb 2C11 in cold for 15 min. The cells were washed off excess Ab, resuspended, brought to 37oC in a water bath and goat anti-hamster IgG (Jackson Labs) was added to crosslink the CD3/TCR complex. At indicated time points ice-cold PBS was added, the cells were quickly spun down and lysed in SDS-PAGE sample buffer. Cytokine-stimulated cells were lysed at the indicated time points. Proteins were electrophoresed in SDS-PAGE gels, transferred to PVDF membranes, probed with the indicated antibodies and revealed using the ECL reagent (GE-Amersham). RT-PCR For RT-PCR analysis of Cd5 gene expression, total RNA was isolated from 1 106 MACS-purified P14 cells, either before after stimulation with the indicated cytokines for 36 h, using the RNA isolation kit from Qiagen. cDNA was synthesized using oligo(dT) primers and Thermoscript Reverse Transcriptase (Roche). PCR was performed on serial dilutions of cDNA using Taq DNA polymerase (Roche) in a T-gradient PCR System (Biometra, Goettingen, Germany). The following sense and antisense primers were used for PCR amplification: Cd5 , 5’-AAGCATCATCCTGACCCTTG-3’ and 5’- AGATCGGTGTAGGGCTCCTT-3’; 18S rRNA, 5’-AGGAATTGACGGAAGGGCAC-3’ and 5’-GTGCAGCCCCGGACATCTAAG-3’. 122 Acknowledgments This work was supported by NSERC Discovery grants to SI (342179-2009) and CIHR operating grant to SR (MOP-86530). SI is a CIHR new investigator. JG is a recipient of FRSQ doctoral fellowship. Centre de Recherche Clinique Étienne-Le Bel du Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke is an FRSQ-funded research center. References 1. Peschon, J.J. et al. Early lymphocyte expansion is severely impaired in interleukin 7 receptor-deficient mice. J Exp Med 180, 1955-1960. (1994). 2. von Freeden-Jeffry, U. et al. Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine. J Exp Med 181, 1519-1526. (1995). 3. Rathmell, J.C., Farkash, E.A., Gao, W. & Thompson, C.B. 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L’augmentation de l’avidité du TCR induite par la combinaison des cytokines corrèle avec une augmentation de l’expression de molécules activatrices telles que le CD8 et le CD45 ainsi qu’une diminution de l’expression de la molécule inhibitrice CD5 chez les lymphocytes T CD8 de souris P14 TCR transgénique exprimant un TCR de forte affinité. Cependant, les lymphocytes T CD8 Pmel-1 exprimant un TCR transgénique de faibles affinités augmentent que faiblement l’expression du CD8 qui est déjà fortement exprimé ainsi que le CD5 qui est déjà fortement diminué. Les lymphocytes T CD8 P14tg expriment fortement le CD8 après stimulation avec l’IL-7 en combinaison avec IL-6 ou IL-21. La stimulation du CD8 seul ou en combinaison avec le CD3 chez les lymphocytes préstimulés avec les combinaisons de cytokines entraine une forte prolifération comparativement aux contrôles indiquant un rôle important du CD8. De plus, le blocage du CD8 lors d’une réponse antigénique diminue fortement la prolifération des lymphocytes T. Cependant, la pré-stimulation avec les combinaisons de cytokines n’entraine qu’un blocage partiel indiquant d’autres mécanismes impliqués dans l’augmentation de l’avidité du TCR. Le CD45 est très fortement exprimé après stimulation avec les combinaisons de cytokines comparativement aux contrôles. Le CD45 est impliqué dans l’initiation de la signalisation du TCR en activant la Src kinase Lck. Cependant, le CD45 a un effet positif sur l’activation de Lck seulement s’il est situé à l’extérieur des radeaux lipidiques. La préstimulation de lymphocytes T CD8 pendant 2 jours avec IL-7 en combinaison avec IL-6 ou IL-21 augmente fortement l’expression du GM1 impliqué dans la formation des radeaux lipidiques chez les lymphocytes T CD8 P14tg comparativement aux contrôles. Cette augmentation du GM1 est moins importante chez les lymphocytes T CD8 Pmel-1 qui expriment un TCR de faible affinité. En conclusion, nos résultats suggèrent que la stimulation synergique avec les cytokines a un effet profond sur les cellules T CD8 qui expriment un TCR de faible affinité. Par conséquent, nous proposons que ce phénomène puisse contribuer à l’activation de cellules T CD8 autoréactives pendant l’évolution des maladies auto-immunes. 128 Matériels et méthodes Souris Les souris C57/Bl/6, Pmel-1 TCRtg ont été achetées chez The Jackson Laboratory. Les souris et H-Y TCRtg ont été obtenus du Dr P. Poussier (Sunnybrook and Women’s College Hospital, Toronto, Canada). Les souris P14 TCRtg ont été obtenues de Dr P. Ohashi (University of Toronto, Toronto, Canada). Toutes les expériences animales ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université de Sherbrooke. Anticorps et réactifs Les anticorps dirigés contre les marqueurs de souris CD3, CD5, CD8, CD8, CD28, CD45RB, TCR B220, conjugués au FITC, PE, ou biotine ont été achetés chez BD Biosciences (Palo Alto, CA). Streptavidin-spectral red a été acheté chez Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). Choléra toxine B AlexaFluor 647 a été achetée chez Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Les cytokines recombinantes IL-2, IL-6, IL-7, IL-15, et IL-21 ont été achetés chez R&D Systems (Minneapolis, MN). Le milieu de culture RPMI 1640 et le FBS ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Les anticorps phospho-spécifiques utilisés pour les immunobavardages de type Western dirigés contre Lat, AKT, Erk-1 et Erk-2 ont été obtenus de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Les anticorps dirigés contre les protéines totales Erk1/2 ainsi que l’actine ont été obtenus de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Cytométrie en flux et purification des cellules Les cellules ont été suspendues dans du PBS contenant 5 % de FBS et 0,05 % azoture de sodium. Les récepteurs FcRs ont été bloqués par l’anti-CD16/CD32 pendant 10 min à 4ºC. Les marqueurs de surface ont été mesurés par marquage trois couleurs FITC, PE, biotine conjuguée avec l’anticorps primaire, suivi d’un marquage à la streptavidin-Spectral red. Les données ont été acquises et analysées avec un FACSCalibur utilisant le logiciel CellQuest (BD Biosciences). L’intensité de fluorescence relative (RFI) a été calculée en attribuant une valeur de 100 % à l’expression des cellules fraichement isolées. 129 Immunobuvardage de type Western Les lymphocytes T CD8 de ganglions totaux ont été purifiés par sélection négative en utilisant des billes magnétiques (Miltenyi Biotec) utilisant les instructions du manufacturier. Un million de lymphocytes T CD8 purifiés par billes magnétiques ont été stimulés pendant deux jours avec les cytokines indiquées. Les lymphocytes T CD8 ont été lavés et incubés avec l’anticorps anti-CD3 (2C11) sur glace pendant 15 min. Les cellules ont été lavées avec du PBS et suspendues dans du milieu RPMI 1640 à 37ºC contenant un anticorps de chèvre antihamster (Jackson Laboratory) durant la période indiquée afin de réticuler l’anticorps anti-CD3. Au temps indiqué, du PBS (4ºC) a été ajouté et les cellules ont été centrifugées et lysées dans du tampon SDS-PAGE. Les échantillons ont été chauffés à 100ºC pendant 5 min avant d’être séparés par électrophorèse dans un gel de type SDS-PAGE. Les protéines ont été ensuite transférées sur une membrane PVDF et révélées avec les anticorps indiqués. Les complexes antigènes-anticorps ont été révélés en utilisant le réactif ECL (GE Healthcare Life Sciences, Baie-D’Urfé, QC). Essai de prolifération par incorporation de [3 H] thymidine Les essais de prolifération ont été effectués en utilisant des lymphocytes T CD8 purifiés de ganglions totaux. Les cellules ont été mises en culture à une concentration de 1 x 105 cellules/puits et stimulées avec les cytokines ou le peptide indiqué dans 200 μl de milieu de culture RPMI 1640 dans une plaque de culture à fond plat pendant 72 h. Alternativement, les cellules ont été préstimulées (2 x 106 cellules/ml) avec les cytokines pendant 2 jours et ensuite mis en culture à une concentration de 1 x 105 cellules/puits et stimulées avec un anticorps antiCD3 et/ou anti-CD8 fixés au fond d’une plaque de culture de 96 puits. Un μCi de méthyl-[3H] thymidine (NEN Life Sciences) a été ajouté durant les derniers 8 h de culture. Les cellules ont été récoltées sur un filtre en fibre de verre. La radioactivité incorporée dans les cellules a été mesurée par Top Count microplate scintillation counter (Perkin Elmer). 130 Essai de blocage du CD8 Les lymphocytes T CD8 P14 TCRtg fraichement purifiés par billes magnétiques ont été stimulés pendant 2 jours avec les cytokines indiquées. Les cellules ont été ensuite lavées et incubées avec 4 μg/ml d’anti-CD8 dans du PBS 4ºC pendant 30 min. Le blocage a été vérifié par FACS en utilisant un anticorps anti-CD8 marqué au FITC. Les lymphocytes T CD8 ont été mis en culture en présence de CPA irradiées (cellules de rate de souris C57/Bl/6) ainsi que 0,03 ou 0,3 μg/ml de gp33. La prolifération des lymphocytes a été mesurée par incorporation de [3 H] thymidine telle que décrite précédemment. Le pourcentage d’inhibition a été calculé (1- (c.p.m CD8 bloqué/c.p.m contrôle) x 100). Résultats L’IL-6 et l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 entrainent des changements phénotypiques différents selon l’affinité du TCR des lymphocytes T CD8 Nous avons montré précédemment que la stimulation de lymphocytes T CD8 P14 par de l’IL-6 ou de l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 entraine des changements phénotypiques (Gagnon et al., 2008) qui varient selon le temps de stimulation (Gagnon et al., 2010). L’expression du CD8 est régulée à la hausse après 24 h de stimulation avec de l’IL-7. Cette augmentation est légèrement plus importante lorsque l’IL-7 est combinée avec de l’IL-6 ou de l’IL-21 (Gagnon et al., 2010). Puisque la molécule CD8 est impliquée dans l’activation de lymphocytes T CD8 (Arcaro et al., 2001), nous avons donc étudié l’effet de « cytokine priming » sur l’expression de CD8 chez des lymphocytes T exprimant un TCR d’affinités différentes. L’expression du CD8 est légèrement plus élevée chez les lymphocytes T CD8 Pmel-1 qui exprime un TCR de faible affinité comparée aux lymphocytes T P14 qui expriment un TCR de forte affinité (Figure 1A). Par contre, les lymphocytes T CD8 issus de souris BL6 qui expriment des TCR polyclonales d’affinités différentes expriment un niveau comparable aux cellules P14. La stimulation avec de l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraine une hausse de l’expression de CD8 chez les lymphocytes T CD8 P14 et BL6, tandis qu’il n’y a pas de différence chez les lymphocytes T issus de souris Pmel-1 (Figure 1A). 131 L’expression de CD8 est comparable entre les cellules P14 et BL6, cependant elle est légèrement inférieure chez les cellules Pmel-1. L’expression de CD8 est modulée de façon similaire à l’expression du CD8 après la stimulation avec les combinaisons de cytokines (IL7+IL-6; IL-7+IL21) (Figure 1A). Comme l’expression du CD8, l’expression du TCR est aussi plus élevée chez les cellules Pmel-1. Cette expression est fortement augmentée après stimulation par l’IL-7 seule ou en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 et le niveau d’expression est comparable entre les cellules P14 et BL/6. La modulation de l’expression de la molécule co-stimulatrice CD28 par les cytokines est comparable entre cellules provenant de souris P14 et Pmel-1 ayant un TCR fort et de faibles affinités, cependant son augmentation est plus importante chez les cellules CD8 non-TCR Tg (Figure 1B). Il est connu que CD5 est un régulateur négatif de la signalisation via le TCR et son expression à la surface cellulaire est proportionnelle à l’affinité du TCR afin de contrôler l’activation du TCR (Azzam et al., 2001; Kassiotis et al., 2003b). Nous avons montré précédemment que l’expression de CD5 à la surface des lymphocytes T CD8 P14 était grandement réduite après stimulation avec l’IL-7 seule et encore plus fortement lors de la combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 (Gagnon et al., 2010). Puisque le niveau d’expression de CD5 varie selon l’affinité du TCR, nous avons examiné l’effet des cytokines sur des lymphocytes T CD8 qui expriment des TCR d’affinités différentes. Les lymphocytes T CD8 de souris P14 expriment un TCR de forte affinité et expriment fortement CD5, tandis que les lymphocytes T CD8 de souris Pmel expriment un TCR de faible affinité et expriment plus faiblement CD5 (Figure 1C). Les souris BL6 qui possèdent un répertoire polyclonal de TCR expriment un niveau intermédiaire de CD5. La stimulation des lymphocytes T CD8 pendant deux jours avec l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraine une diminution de l’expression de CD5 qui est cependant plus importante chez les lymphocytes exprimant un TCR de plus forte affinité (Figure 1C). 132 Figure 1: L’affinité du TCR influence le phénotype des lymphocytes T CD8 après une stimulation de 2 jours avec les cytokines. Les lymphocytes de ganglions totaux de souris P14, pmel et Bl6 ont été stimulés pendant 2 jours avec l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21. Le phénotype a été déterminé par FACS en mesurant l’intensité de fluorescence géométrique moyenne (GeoMean) CD8+ cells. L’intensité de fluorescence relative (RFI) a été calculée relativement à l’intensité de fluorescence de cellules fraîchement isolées (None) à qui une valeur de 100 a été attribuée. 133 La préstimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente la sensibilité de la stimulation du CD8. La protéine CD8 est importante dans la signalisation du TCR puisqu’elle permet la reconnaissance du CMH-I et le recrutement de la Src kinase Lck au complexe du TCR (Kwan Lim et al., 1998). Il est connu que la stimulation du CD8 en combinaison avec le CD3 à l’aide d’anticorps spécifiques induit une signalisation et une prolifération plus intense que l’antiCD3 seul (Emmrich et al., 1986). Nous avons examiné l’effet de la préstimulation avec les cytokines sur la prolifération des lymphocytes T CD8 lors d’une stimulation de la molécule CD8. La préstimulation de lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente fortement leur prolifération subséquente en réponse à un anticorps anti-CD3 en combinaison avec un anticorps anti-CD8 (0,5 à 1 g/ml) (Figure 2 A). La stimulation avec l’anticorps anti-CD8 seul engendre une prolifération qui est comparable à celle observée avec l’anticorps anti-CD3 seul chez les cellules préstimulées avec des cytokines (Figure 2 A, B). La stimulation de CD3 et de CD8 induit une augmentation de la phosphorylation de LAT. La préstimulation avec l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente la phosphorylation de LAT lors de la stimulation subséquente avec de l’anti-CD3/anti-CD8. On peut remarquer que la préstimulation avec l’IL-7 induit une forte phosphorylation de LAT après stimulation anti-CD3 seule ou en combinaison avec anti-CD8, comparativement à la combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 (Figure 2 C). 134 Figure 2: La préstimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente la sensibilité du récepteur CD8. Les lymphocytes T CD8 purifiés de souris P14 ont été stimulés pendant deux jours avec l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL21. A- Les lymphocytes T CD8 ont été ensuite stimulés avec un anticorps anti-CD3 biotine seule ou en combinaison avec un anticorps anti-CD8 biotine. La streptavidine a été utilisée pour réticuler les anticorps. B- Les lymphocytes T ont été aussi stimulés avec un anticorps anti-CD8. La prolifération a été mesurée par incorporation de [3 H]thymidine. C- Les lymphocytes T CD8 fraîchement purifiés de ganglions de souris P14 TCRtg ou stimulés pendant 2 jours avec les cytokines indiquées ont été stimulés avec un anticorps anti-CD3 ou anti-CD8 seul ou en combinaison. 135 L’augmentation de la prolifération à l’antigène induite par une stimulation aux cytokines peut-être partiellement inhibée par un anticorps anti-CD8 bloquant. Nous avons par la suite utilisé un anticorps anti-CD8 afin de bloquer l’effet du CD8 lors d’une réponse d’un lymphocyte T à un antigène présenté par une APC. Une analyse par FACS utilisant un anticorps anti-CD8 couplé à un fluorochrome a révélé que le CD8 a été totalement bloqué (Figure 3 A). Les lymphocytes T P14 qui ont été préstimulés avec les cytokines ont été incubés avec un anticorps anti-CD8 bloquant avant d’être mis en culture avec des APC présentant l’antigène gp33. Le blocage de CD8 lors d’une stimulation antigénique (gp33) entraine une inhibition de 80 % de la prolifération des lymphocytes T CD8 fraîchement isolés de ganglions de souris P14. La préstimulation avec l’IL-7 seule ou en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 réduit l’effet inhibiteur du blocage du CD8 lors d’une stimulation antigénique des lymphocytes T P14. Cette inhibition est encore plus importante lors d’une stimulation avec une concentration faible d’antigène (Figure 3 B). 136 Figure 3: La préstimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente la sensibilité du récepteur CD8. A- Les lymphocytes T CD8 de souris P14 ont été stimulés pendant 2 jours avec les cytokines indiquées et ensuite le CD8 a été bloqué avec un anticorps. Le blocage a été vérifié par marquage avec une anti-CD8 fluorescent et analysé par FACS. BLes lymphocytes ont été ensuite stimulés avec des CPA pulsées avec deux concentrations d’antigène (gp33). La prolifération a été mesurée par l’incorporation de [3 H]thymidine. 137 L’expression de CD45 est régulée fortement à la hausse après stimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21. Le CD45 est une protéine phosphatase qui est impliquée dans l’initiation de la signalisation du TCR et son absence entraine une perte de signalisation. L’isoforme CD45RB est principalement exprimée chez les lymphocytes T naïfs de souris. Lors de l’activation des lymphocytes, il y a une permutation vers l’isoforme CD45RO qui possède une activité phosphatase plus faible (Hermiston et al., 2009). Nous avons observé que la stimulation des lymphocytes T CD8 avec de l’IL-7 pendant deux jours entrainait une forte expression de CD45RB ainsi que toutes les isoformes (Ly5.1). Cette expression était davantage augmentée lorsque l’IL-7 était combinée avec l’IL-6 ou l’IL-21 (Figure 4A). L’augmentation de l’expression du CD45 débute après 24 heures de stimulation et double après 96 h de stimulation avec la combinaison de cytokines (Figure 4B). L’isoforme CD45RA (B220) qui est exprimée principalement chez les lymphocytes B est aussi augmentée (Figure 4C). 138 Figure 4: La stimulation de lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraine une forte expression de CD45. A- Histogramme de l’expression du CD45RB et Ly5.1 chez les lymphocytes T CD8 de ganglions totaux de souris P14 après 3 jours de stimulation avec les cytokines indiquées évaluées par cytométrie en flux. BExpression de CD45RB et Ly5.1 en fonction du temps évaluée par cytométrie en flux. L’intensité relative de fluorescence (RFI) a été calculée à partir de la fluorescence géométrique moyenne des cellules stimulées comparativement aux cellules non stimulées (fixée à 100). CL’intensité de fluorescence relative (RFI) de CD45RB et CD45RA (B220) après 24 h de stimulation avec les cytokines. 139 L’IL-6 et l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 induisent l’expression de GM1. Les radeaux lipidiques jouent un rôle important dans la modulation de l’activation des lymphocytes T. Les radeaux lipidiques sont des structures dynamiques qui permettent d’assembler les protéines impliquées dans la signalisation du TCR ainsi que d’exclurent les protéines inhibitrices (Simons et al., 2000; Cho et al., 2009). Les lymphocytes T CD8 isolés de ganglions lymphatiques de souris P14 et Pmel-1 ont été stimulés pendant 2 jours avec de l’IL-7 seule et en combinaison avec IL-6 ou IL-21. La présence des radeaux lipidiques a été mesurée par FACS, en utilisant la sous-unité B de la toxine du choléra (CtxB) conjuguée à un fluorophore. CtxB reconnaît spécifiquement le ganglioside GM1 enrichi dans les radeaux lipidiques. La stimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 permet une expression deux fois plus élevée du GM1 à la surface cellulaire en comparaison avec les lymphocytes T CD8 fraîchement isolés. L’expression à la surface du GM1 après une stimulation avec l’IL-7 seule augmente seulement 1,5 fois. Il a été montré dans nos travaux précédents qu’une stimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entrainait une augmentation de la taille des lymphocytes T CD8 mesurée par FACS (Gagnon et al., 2010). Cependant, l’augmentation de la taille des lymphocytes T CD8 mesurée par le FSC relatif aux cellules non stimulées n’est pas aussi importante que l’augmentation de l’expression du GM1 à la surface membranaire. Ce résultat indique que l’augmentation du GM1 à la surface cellulaire n’est pas seulement due à l’augmentation de la surface membranaire. Il est à noter que l’expression du GM1 est plus importante chez les lymphocytes T CD8 exprimant un TCR de plus fortes affinités que celui de faible affinité (Ostergaard et al., 1989) (Figure 2 B). Chez les lymphocytes T CD8 de souris P14 et Pmel-1, l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraine une augmentation similaire du GM1, cependant les lymphocytes T CD8 qui expriment un TCR de plus faible affinité exprime relativement moins de GM1. 140 Figure 5: La stimulation avec l’IL-6 et l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 augmente la présence de GM1. Cellules de ganglions totaux de souris P14 et pmel stimulés pendant 2 jours avec l’IL-7 seule ou en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21. Ces cellules ont été ensuite fixées et marquées avec la toxine B du choléra fluorescente et un anticorps anti-CD8 fluorescent. A- Intensité de fluorescence géométrique moyenne du marquage avec la toxine B du choléra mesurée par cytométrie en flux et l’intensité de fluorescence relative (RFI) a été calculée relativement aux cellules fraîchement isolées. B- Le FCS moyen et FCS relatif moyen ont été calculés comparativement aux cellules fraîchement isolées. (n = 2) 141 CHAPITRE 5 - DISCUSSION L’objectif principal du projet de recherche était de caractériser les effets d’une préstimulation avec des cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-21) en combinaison avec des cytokines impliquées dans l’homéostasie des lymphocytes T CD8 naïfs (IL-7) et mémoires (IL-15) sur la réponse antigénique. La base fondamentale des travaux décrits dans cette thèse a pour origine le fait qu’in vivo, les lymphocytes T CD8 circulant sont exposés premièrement aux cytokines proinflammatoires telles que IL-6 ou IL-21, ainsi que les cytokines IL-7 ou IL-15 avant d’être exposés à un antigène présenté par un CMH-I d’une CPA activée dans l’environnement d’un ganglion lymphatique. Les cytokines IL-7 et Il-15 jouent un rôle important dans l’homéostasie des lymphocytes T. L’homéostasie des lymphocytes T CD8 naïfs dépend à la fois d’une stimulation par l’IL-7 ainsi qu’une faible stimulation du TCR par un peptide du soi présenté par un CMH-I (psCMHI). Ces stimulations permettent une prolifération basale des lymphocytes T ainsi que leur maintien en vie. La survie des lymphocytes T mémoires est indépendante du TCR, mais nécessite une stimulation avec de l’IL-7 pour leur survie, ainsi que l’IL-15 pour leur prolifération basale (Boyman et al., 2009). Lors d’une lymphopénie, la concentration importante d’IL-7 et la diminution de la compétition pour les peptides du soi induisent une prolifération des lymphocytes T permettant la reconstitution de la population de lymphocytes T. Les lymphocytes T CD8 exprimant un TCR de fortes affinités prolifèrent davantage, favorisant ainsi l’enrichissement de lymphocytes T autoréactifs (Khoruts et al., 2005). L’IL-6 induit la prolifération des lymphocytes T CD8+ lorsqu’elle est combinée avec de l’IL-7 ou de l’IL-15. Notre groupe (Gagnon et al., 2008) ainsi que d'autres (Zeng et al., 2005) ont rapporté que l’IL-21, en synergie avec l’IL-7 ou l’IL-15, pouvait induire une prolifération importante des lymphocytes T CD8 en l’absence d’expositions à un antigène. L’IL-21 est une cytokine pro-inflammatoire produite principalement par les lymphocytes T CD4 de type Th17 ainsi que par les cellules NKT (Leonard et al., 2005). L’IL-21 et son récepteur sont les dernières découvertes de la famille des récepteurs des cytokines partageant la chaîne commune c. 142 Contrairement aux autres cytokines, cette famille (IL-2, IL-7 et IL-15) qui induit fortement la phosphorylation de STAT5 sur des résidus tyrosines, l’IL-21 induit une forte phosphorylation de STAT3, ainsi qu’une plus faible phosphorylation de STAT1 (Ozaki et al., 2000). D’autres cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-6 et l’IFN induisent la phosphorylation de STAT3 et de STAT1 chez les lymphocytes T CD8 (Page 68 figure 1 B). Contrairement à l’IL21, dont la production est limitée aux cellules du système immunitaire adaptatif, l’IL-6 est une cytokine pléiotropique qui est produite massivement par plusieurs types cellulaires, dont les CPA activées (DC, macrophages, lymphocytes B). L’IL-6 est aussi produite par des cellules non hématopoïétiques, dont les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules épithéliales (Dienz et al., 2009). L’IL-6 a un effet comparable à l’IL-21 lorsqu’elle est combinée avec l’IL-7 ou l’IL-15, induisant ainsi une prolifération beaucoup plus importante par rapport à la stimulation avec les cytokines seules (Page 68, figure 1 C; D). Ces résultats nous permettent d’extrapoler que lors d’une infection, les lymphocytes T CD8 résidants dans les ganglions lymphatiques sont exposés à l’IL-7 systémique ainsi qu’a des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-6 qui est produite de façon systémique et de l’IL-21 produite localement dans les ganglions par des lymphocytes T CD4 Th17. L’IL-6 ou d’IL-21 en présence d’IL-7 ou d’IL-15 engendre une prolifération intense des lymphocytes T CD8 en l’absence d’antigène. La stimulation des lymphocytes T CD8+ avec les combinaisons de cytokines entraine une synergie de leurs voies de signalisation. Le mécanisme permettant la prolifération des lymphocytes T CD8 en présence de combinaison de cytokines (IL-7+IL-6, IL-7+IL-21, IL-15+IL6, IL-15+IL-21) pourrait être attribuable à l’augmentation de la signalisation des récepteurs des cytokines. Il a été observé que la phosphorylation du résidu tyrosine 694 de STAT5 était plus intense chez les lymphocytes T CD8 lorsqu’ils étaient stimulés avec de l’IL-7 ou de l’IL-15 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 (Page 76, figure 4 A et B). Il a été rapporté que les souris transgéniques dont STAT5b est constitutivement activé chez les lymphocytes T ont une prolifération ainsi qu’une activation plus importante des lymphocytes T (Burchill, JI, 2003). Les récepteurs de ces cytokines utilisent aussi d’autres voies de signalisation comme la voie de PI3K/AKT, la voie des MAP kinase (ERK1/2) ainsi que la voie des Src (Fyn/Lck) (Gaffen, 2001; Swainson, Kinet et al., 2007; Rochman, Spolski et al., 2009; Ernst et Jenkins, 2004). La costimulation 143 des lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 entraine une phosphorylation plus importante d’AKT ainsi que de ERK1/2 comparativement à une stimulation avec l’IL-7 seule (Données non présentées). L’utilisation d’inhibiteur de la voie de PI3K/AKT et la voie des MAPK ainsi que la voie des Src (Lck) inhibe fortement la prolifération induite par la combinaison de cytokines (Page 76, figure 4 A et B). Ces voies de signalisation sont aussi impliquées dans la signalisation du TCR chez les lymphocytes T CD8, indiquant une possible synergie entre la signalisation du TCR et celles des cytokines pro-inflammatoires. La présence de cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-6 ou l’IL-21 lors d’une stimulation antigénique augmente fortement la prolifération (Page 79, figure 5 A) ce qui est compatible avec une synergie entre les voies de signalisation de cytokines et du TCR. La préstimulation avec les combinaisons de cytokines augmente la sensibilité aux antigènes ainsi que de la cytotoxicité des lymphocytes T CD8+. La prémisse de l’étude portait sur le contact des lymphocytes T CD8 avec les cytokines (IL-7, IL-15, IL-6, IL-21) dans les ganglions avant d’être exposés aux antigènes. Nous avons donc étudié l’influence de la préstimulation de lymphocytes T CD8 avec l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 sur la prolifération subséquente à une stimulation du TCR. La préstimulation d’une durée minimale de 24 heures avec les combinaisons de cytokines augmente fortement la prolifération induite par une stimulation anti-CD3, ainsi que par une stimulation antigénique (gp33 + CPA) (Page 79 figure 5 B; C; page 102 figure 1 B). On note que la préstimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente l’avidité du TCR puisqu’elle accroît la sensibilité du TCR à de plus faibles concentrations d’anti-CD3 ainsi qu’à de plus faibles concentrations d’antigènes. Les mécanismes par lesquels les cytokines pro-inflammatoires en collaboration avec l’IL-7 ou l’IL-15 entrainant un changement dans l’avidité du TCR ne sont pas bien connus. Les effets des cytokines pro-inflammatoires sur le TCR nécessitaient une préstimulation d’au moins 24 heures afin d’observer une réponse accrue à une stimulation antigénique. La nécessité d’une préstimulation de 24 heures suggère une modification dans le phénotype des lymphocytes T comparativement à une synergie entre les voies de signalisation des cytokines 144 et celle du TCR. Nous avons donc caractérisé le phénotype des lymphocytes T suivant une stimulation avec les combinaisons de cytokines. Les molécules de co-stimulation jouent un rôle important dans l’activation des lymphocytes T en modulant l’avidité du TCR. Le TCR et les molécules de co-stimulation partagent certaines voies de signalisation, une amplification quantitative de ces voies induit une augmentation de l’avidité du TCR nécessaire pour l’activation (Acuto et al., 2003). Nous avons observé que la stimulation avec les combinaisons de cytokines ne modifiait pas l’expression de CD137 (4-1BB), tandis que l’expression était légèrement augmentée pour CD28, ainsi que pour CD134 (OX40). L’expression de GITR était fortement augmentée par l’IL-7 seule, mais cette augmentation n’était pas aussi intense lors de la combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 (Page 112 figure 5 A). L’augmentation de l’expression des molécules de co-stimulation induite par les cytokines pro-inflammatoires ne peut toutefois pas expliquer l’augmentation de l’avidité du TCR. Les lymphocytes T CD8 prolifèrent fortement à une stimulation subséquente à l’antiCD3 ou aux dimères H-2Db en absence de molécules de co-stimulation ce qui n’est pas observé chez les lymphocytes fraîchement isolés. (Page 79 figure 5; page 112 Figure 5 C, D). Les cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-6 ou l’IL-21 stimulent des voies de signalisation similaires à celles induites par les molécules de co-stimulation telles que la voie PI3K/AKT induite par CD28 permettant possiblement de pallier le besoin de co-stimulation (Page 115 figure 6 A, B). Nous ne pouvons toutefois pas exclure l’implication des différentes molécules de co-stimulation dont l’expression est augmentée par l’IL-7 + l’IL-6 et l’IL-7 + l’IL-21, puisqu’une co-stimulation du CD3 et de CD28 augmente fortement la prolifération lorsqu’ils ont été préstimulés avec les combinaisons de cytokines (Page 112 figure 5 B). Ces résultats indiquent que les molécules de co-stimulations sont impliquées dans l’augmentation de la prolifération à l’antigène suite à une stimulation avec les combinaisons de cytokines, mais que leurs rôles semblent limités puisque leurs absences ne réduisent que légèrement leur prolifération à l’antigène. L’activation des lymphocytes T CD8, sans co-stimulation, peut induire la génération de lymphocytes T autoréactifs (Keir et al., 2005). Il a été rapporté que plusieurs maladies auto-immunes se développent à la suite d’une lymphopénie et sont intimement associées à certaines cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-6 et l’IL-21 (Voir tableau 1 et 2 page 19 de la section Introduction). Ces observations 145 indiquent une contribution possible des cytokines inflammatoires (l’IL-6 et de l’IL-21) dans la reconstitution de la population de lymphocytes T, ainsi que dans l’enrichissement de lymphocytes T autoréactifs. Nous avons observé que l’IL-6 ainsi que l’IL-21 augmentaient la prolifération des lymphocytes T CD8 naïfs et mémoires lors de la co-stimulation avec l’IL-7. Cependant, les lymphocytes T CD8 mémoires prolifèrent davantage lors de costimulation des cytokines pro-inflammatoires avec l’IL-15 (Page 73 figure 3 E). Ces résultats indiquent qu’une préstimulation de 24 heures avec des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-6 et l’IL-21 en combinaison avec des cytokines impliquées dans l’homéostasie lymphocytaire telles que l’IL-7 et l’IL-15, entraine une modification de l’avidité du TCR et une prolifération indépendante de molécules de co-stimulations ainsi qu’une activité cytotoxique spécifique importante. Ces résultats sont compatibles avec les observations voulant que l’IL-6 et l’IL-21 contribuent au développement de certaines maladies auto-immunes telles que le diabète (Ramanathan et al., 2011), le rejet de greffe (Baan et al., 2007) et la résorption de tumeurs (Zeng et al., 2005). Des études ont montré que l’IL-6 et l’IL-21 étaient impliquées dans certaines maladies auto-immunes, ainsi que dans le rejet de tumeurs et de greffe. Les lymphocytes T CD8 naïfs fraîchement isolés n’ont pas d’activité cytotoxique. Cependant, la stimulation avec des cytokines pro-inflammatoires (IL-6 ou IL-21) en combinaison avec l’IL-7 augmente la fonction cytotoxique spécifique des lymphocytes T CD8 sans toutefois égaler une préstimulation antigénique. (Page 81 figure 6 A) Ces résultats indiquent que l’IL-6 et l’IL-21 semblent activer les lymphocytes T CD8 puisqu’ils acquièrent une cytotoxicité spécifique qui n’est pas retrouvée chez les lymphocytes T stimulés avec l’IL-7 ainsi que ceux fraîchement isolés. La préstimulation d’au moins 24 heures avec les cytokines pro-inflammatoires en combinaison avec l’IL-7 ou l’IL-15 suivie d’une stimulation avec une concentration minimale d’antigène augmente grandement la cytotoxicité des lymphocytes T CD8 par rapport à la préstimulation avec l’IL-7 seule ou la stimulation antigénique (Page 81 figure 6 A; page 105 figure 2). Cette augmentation de la cytotoxicité de ces lymphocytes corrèle avec une augmentation de la production de Granzyme B (Page 81, figure 6 B). 146 La stimulation de lymphocytes T CD8+ avec les combinaisons de cytokines diminue l’expression du CD5 augmentant ainsi l’avidité du TCR. On observe une augmentation de l’avidité du TCR des lymphocytes T CD8 après une co-stimulation de L’IL-7 ou de l’IL-15 avec l’IL-6 ou l’IL-21. L’avidité du TCR peut être contrôlée par plusieurs mécanismes, dont des molécules inhibitrices comme le CD5. L’homéostasie des lymphocytes T CD8 dépend d’une stimulation faible du TCR par un antigène du soi présenté par le CMH-I et d’une stimulation avec l’IL-7 (Sprent et al., 2003a; Guimond et al., 2005; Jameson, 2005; Boyman et al., 2007). Cependant, les données démontrant directement l’affinité du TCR pour un antigène du soi sont très peu nombreuses. La caractérisation de souris transgénique exprimant des TCR de différentes affinités a permis d’identifier des marqueurs qui sont exprimés de façon proportionnelle ou inversement proportionnelle à l’affinité du TCR. Ces études ont montré que les lymphocytes exprimant un TCR de forte affinité pour un antigène du soi exprimaient aussi fortement CD5, qui est un régulateur négatif de la signalisation du TCR. Il permet donc de réduire l’avidité d’un TCR de forte affinité envers les antigènes du soi, permettant ainsi de survivre à la sélection négative dans le thymus. L’expression de la molécule CD5, qui est proportionnelle à l’affinité du TCR, permet une régulation de l’avidité du TCR, entrainant ainsi une compétition équitable pour la stimulation du TCR par des peptides du soi lors de l’homéostasie des lymphocytes T (Azzam et al., 1998; Azzam et al., 2001). Une publication récente a montré que l’affinité du TCR, qui est proportionnelle à l’expression de CD5, corrélait aussi avec la prolifération induite par l’IL7, de façon indépendante de l’exposition à un antigène (Palmer et al., 2011). La stimulation des lymphocytes T CD8 P14 avec de l’IL-7 entraine une diminution de l’expression de CD5 à la surface cellulaire. Cette diminution est encore plus marquée lorsque les lymphocytes T CD8 sont cultivés en présence d’une combinaison d’IL-7+IL-6 ou d’IL7+IL-21 (Page 115 figure 6 C). La diminution de la molécule de CD5 à la surface cellulaire semble être attribuable à une répression de transcription de la molécule de CD5 par le facteur de transcription E47 induit par les cytokines (Page 115 figure 6 A), ainsi que par l’internalisation plus importante de la molécule de CD5 (résultats non présentés). On observe une augmentation de la molécule E47, un répresseur de la transcription du CD5, et une augmentation de l’expression de la molécule Cbl impliquée dans l’internalisation et la dégradation de la molécule de CD5. Il a été suggéré que la voie PI3K/AKT est impliquée dans 147 l’internalisation de la molécule de CD5 par la protéine adaptatrice AP2 (Lu et al., 2002). Nous avons observé que la voie PI3K/AKT était fortement activée par les combinaisons de cytokines (Page 115 figure 6 B). La diminution de l’expression à la surface membranaire de la molécule de CD5 après stimulation avec les combinaisons de cytokines pourrait expliquer la prolifération plus importante des lymphocytes T CD8 exposés à l’antigène (Page 79 figure 5). Les lymphocytes T CD8 P14 exprimant un TCR de forte affinité expriment fortement la molécule de CD5 et cette expression est grandement réduite après stimulation avec les combinaisons de cytokines. La diminution de la molécule du CD5 qui est impliquée dans l’inhibition de la signalisation du complexe du TCR pourrait expliquer leur prolifération plus importante. Les lymphocytes T CD8 Pmel-1 expriment un TCR de faible affinité et expriment aussi faiblement le CD5, curieusement cette faible expression n’est pas altérée après stimulation avec les combinaisons de cytokines, possiblement parce que l’expression semble déjà être au minimum (page 132; figure 1 C). L’IL-6 et l’IL-21 augmentent ainsi l’avidité du TCR des lymphocytes exprimant déjà un TCR de forte affinité, pouvant ainsi favoriser l’expansion de lymphocytes T CD8 autoréactifs. L’augmentation de l’avidité du TCR après stimulation des lymphocytes T CD8 avec l’IL-21 et l’IL-6 permettrait d’expliquer leurs implications dans les maladies autoimmunes telles que le diabète et l’absence de la maladie chez les souris déficientes en ces cytokines. Cependant, la diminution de l’expression de CD5 après une stimulation avec l’IL-6 et l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 ne peut pas complètement expliquer l’augmentation aussi importante de la prolifération et de la cytotoxicité des lymphocytes T CD8. La préstimulation de lymphocytes T CD8+ avec les combinaisons de cytokines augmente l’expression du récepteur de l’IL-2 ainsi que la production d’IL-2 après stimulation antigénique. Certaines cytokines, comme l’IL-2, sont produites lors de l’activation des lymphocytes T CD8 et sont impliquées dans l’amplification de leur activation et leur prolifération (Ni et al., 1999). Il a été montré que l’IL2-R et IL-2R forme constitutivement un dimère qui possède une affinité 20 fois plus élevée pour l’IL-2 que la chaîne IL-2R (Pillet et al., 2008)Cependant, la chaîne alpha est 10 fois plus exprimée que les chaînes bêta ou gamma. Nous avons observé qu’une stimulation de 24 à 48 h avec l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison 148 avec l’IL-7 induit une très forte expression de la chaîne IL-2Rc (CD132), qui est partagée par tous les récepteurs de la famille de l’IL-2, ainsi qu’une augmentation de la chaîne IL-2R (CD122), qui est partagée par le récepteur de l’IL-2 et de l’IL-15 (page 109, figure 4 A). Nous n’avons pas observé une augmentation aussi importante de la chaîne IL-2R. Ces résultats semblent indiquer que la combinaison de cytokines (IL-7 + IL-6 ou IL-7 + IL-21) induit la formation d’un complexe de forte affinité IL-2R avec IL-2R qui est déjà fortement présent chez les lymphocytes T CD8 naïfs. Le blocage de la chaîne IL-2R avec un anticorps anéantit l’effet de la préstimulation avec la combinaison de cytokines (Page 109, figure 4 B). De plus, nous avons observé que la préstimulation des lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 et l’IL-21 induisait une augmentation importante de la production d’IL-2 lorsque ces lymphocytes étaient par la suite stimulés avec un antigène (Page 107, Figure 3 B). Ces résultats indiquent que la stimulation de lymphocytes T CD8 avec de l’IL-6 ou de l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 entraine l’augmentation de l’expression du récepteur de l’IL-2 de forte affinité ainsi que la production subséquente d’IL-2 lors de l’activation antigénique, amplifiant ainsi la rétroaction positive de l’IL-2 sur la prolifération et l’activation (Ni et al., 1999). Les cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et l’IL-21) en combinaison avec l’IL-7 influencent l’expression du CD8 impliqué dans la formation du complexe du TCR. Nous avons ensuite examiné l’impact des cytokines pro-inflammatoires sur l’expression des diverses protéines impliquées dans la formation du complexe du TCR. La stimulation avec des cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et l’IL-21) en combinaison avec l’IL-7 durant 24 à 48 heures induit une augmentation de l’expression du TCR ainsi que l’expression de CD8, tandis que l’expression de la molécule de CD3 n’est pas augmentée (Page 83 figure 7; page 112 figure 5;). Le niveau d’expression du TCR joue un rôle dans l’activation des lymphocytes, cependant la variation observée n’est pas assez importante pour expliquer l’augmentation de la sensibilité à l’antigène(Viola et al., 1996). L’expression de CD8 régule l’avidité du TCR en facilitant le recrutement de la Src kinase Lck au complexe du TCR. CD8 possède un site de liaison pour Lck, tandis que CD8 possède un site de palmitoylation permettant le recrutement du complexe CD8 dans les 149 radeaux lipidiques. Le TCR possède un motif (a-CMP) impliqué dans la liaison avec CD8 (Mallaun et al., 2008), et CD8 interagit avec un motif invariable du CMH-I (Dutoit et al., 2003). L’interaction entre Lck/CD8/TCR/CMH-I permet d’augmenter l’avidité du TCR. Par contre, une mutation dans les motifs d’interaction inhibe la réponse des lymphocytes aux antigènes de faible affinité (Kerry et al., 2003). Il a été récemment montré que l’expression de CD8 était inversement proportionnelle à l’affinité du TCR. La stimulation des lymphocytes T avec de l’IL-7 induit une augmentation de l’expression de CD8 tandis que la stimulation du TCR inhibe la signalisation de l’IL-7 induisant ainsi la réduction de l’expression de CD8 (Park et al., 2007; Palmer et al., 2011). Les résultats obtenus montrent que les lymphocytes T CD8 qui expriment un TCR de faible affinité expriment aussi fortement le CD8 et que la stimulation avec l’IL-7 seule ou en combinaison avec des cytokines inflammatoires (IL-6 ou IL-21) n’augmente pas l’expression du CD8. Les lymphocytes T CD8 qui expriment un TCR de fort affinité expriment plus faiblement le CD8 cependant, cette expression peut-être augmentée fortement grâce à une stimulation avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 (Page 83 figure 7 A; page 112, figure 5 a; page 132 figure 1 A). L’expression de CD8 est fortement exprimée chez les lymphocytes T CD8 ayant une forte avidité (Cawthon et al., 2002; Kroger et al., 2007). Nous avons observé que les lymphocytes T CD8 qui expriment un TCR de fort affinité exprimaient plus fortement le CD8 après stimulation avec l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21. Cette augmentation d’expression du CD8 par des cytokines n’est pas observée chez les lymphocytes qui expriment un TCR de faibles affinités (Page 132 figure 1 B). Ces résultats suggèrent que la stimulation avec l’IL-7 amplifie l’expression de CD8 augmentant ainsi l’avidité du TCR de forte affinité des lymphocytes T P14. Cette augmentation n’est pas observée chez les lymphocytes T Pmel-1 exprimant un TCR de faible affinité indiquant que l’expression du CD8 est déjà maximale. La co-stimulation de l’IL-6 ou l’IL-21 avec l’IL-7 n’entraine qu’une augmentation mineure comparativement à la stimulation avec l’IL-7 seule. Ces résultats indiquent que l’expression de CD8 n’est pas un élément majeur dans l’augmentation de l’avidité induite par les cytokines pro-inflammatoires. 150 Il est connu que l’utilisation d’un anticorps bloqueur de CD8 lors d’une stimulation antigénique inhibe fortement la prolifération des lymphocytes T (Takahashi et al., 1992). Nous avons observé que le blocage de CD8 inhibe environ 80% la prolifération induite par la stimulation antigénique chez les lymphocytes T CD8 P14 TCR tg fraîchement isolé. La préstimulation des lymphocytes T CD8 P14 TCRtg avec l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 réduit l’effet inhibiteur de l’anti-CD8 (Page 136 figure 3). Le blocage de la prolifération par l’anti-CD8 est beaucoup plus important à de faibles concentrations d’antigènes, suggérant le rôle du CD8 dans l’augmentation de l’avidité du TCR. Ces résultats semblent aussi indiquer que l’augmentation de l’avidité du TCR induite par les cytokines semble, en partie, indépendante du niveau d’expression de CD8, car le blocage de CD8 n’inhibe pas aussi efficacement la prolifération des lymphocytes T préstimulés avec les cytokines. Cependant, on ne peut pas exclure la possibilité que le blocage de CD8 ait un certain effet prolifératif. Ces résultats indiquent que l’augmentation de l’expression de CD8 pourrait avoir un impact réel sur la prolifération des lymphocytes T suite à une stimulation sous-optimale du TCR. Toutefois, cette augmentation n’explique pas complètement l’accroissement de l’avidité induite par l’IL-6 ou l’IL-21. Ces résultats indiquent que la préstimulation des lymphocytes T CD8 avec des cytokines pro-inflammatoires augmente l’avidité du TCR, contournant ainsi la nécessité des molécules de costimulation lors de l’activation des lymphocytes T CD8, favorisant ainsi l’amplification de lymphocytes T autoréactifs. Les cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et l’IL-21) en combinaison avec l’IL-7 influencent l’expression du CD45 impliqué dans la signalisation du TCR. L’initiation de la signalisation du TCR débute par le recrutement de la Src kinase Lck au TCR par le CD8. Lors du recrutement du complexe CD8/Lck est au centre de la synapse immune, Lck est momentanément en contact avec la phosphatase membranaire CD45. Le CD45 est une phosphatase qui déphosphoryle le résidu tyrosine 505 de Lck, ce qui entraine son autophosphorylation sur un résidu tyrosine 394 et son activation. Cependant, le CD45 peut aussi interférer avec la signalisation du TCR en déphosphorylant la tyrosine 394 du Lck (Dornan S. 2002). Le contrôle de la signalisation du TCR par le CD45 est régulé par l’interaction transitoire du CD45 avec le Lck lors de l’activation des lymphocytes T CD8. Cette interaction est transitoire en raison de l’exclusion du CD45 de la synapse immune ainsi 151 que par la modulation des isoformes du CD45 (Choudhuri, 2005; Irles, 2002, McNeil, 2007). Le CD45 peut être exprimé sous plusieurs isoformes (CD45 RABC, CD45RA, CD45RB, CD45RO) dépendant du type de cellule ainsi que leur état d’activation. Les lymphocytes T CD8 naïfs expriment l’isoforme CD45RB, lors de l’activation, l’isoforme CD45RO est exprimé (Earl, 2008). Nous avons observé que l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente par un facteur de 3 l’expression de CD45RB comparativement aux lymphocytes T CD8 fraîchement isolés (Page 138 figure 4). CD45 se distingue des autres molécules impliquées dans la signalisation du TCR puisque c’est la seule qui soit très fortement exprimée suite à la costimulation de l’IL-7 avec l’IL-6 ou l’IL-21 comparativement à la stimulation avec l’IL-7 seule (Page 112 figure 5 A; page 138 figure 4). L’augmentation de l’expression de CD45 induite par les cytokines pro-inflammatoires pourrait contribuer à une activation accrue de Lck en déphosphorylant le résidu tyrosine 505 inhibitrice, expliquant ainsi l’augmentation de l’avidité du TCR que nous avons observée (Page 79 figure 5). L’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de Lck (PP2) réduit considérablement la prolifération induite par la combinaison des cytokines (Page 77 figure 4 F). Nous avons observé qu’une stimulation de 48 h avec l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmentait la phosphorylation basale des résidus tyrosines de LAT, suggérant une augmentation de l’avidité du TCR aux antigènes du soi (Page 115 figure 6 A; page 134 figure 2 C). Le CD45 régule aussi négativement l’activité de Lck en déphosphorylant le résidu tyrosine 394, indiquant qu’une expression élevée de CD45 pourrait interférer dans la signalisation du TCR (Hermiston et al., 2003). La conciliation de la fonction à la fois activatrice et inhibitrice de CD45 sur l’initiation de la signalisation du TCR a été en partie expliquée par le modèle de cinétique de ségrégation des différentes molécules impliquées dans la signalisation du TCR (Van Der Merwe et al., 2000). Le modèle indique qu’en l’absence de stimulation antigénique, CD45 active et inhibe de façon aléatoire Lck. Cependant, l’interaction du TCR/CD8 avec un peptide présenté par le CMH-I forme un complexe d’environs de 15 nm permettant le rapprochement des membranes plasmiques conduisant à l’exclusion des protéines de tailles supérieures de la zone de contact. La phosphatase CD45 est une protéine de poids moléculaire élevée mesurant entre 23 et 50 nm de long selon leur isoforme et est exclue de la zone de contact au niveau de la synapse immune. Il a été montré que la signalisation du TCR était fortement augmentée dans les microregroupements de TCR 152 entourés de CD45 (Irles et al., 2003; Choudhuri et al., 2005). La signalisation du TCR était par la suite réduite lors de la coalescence des microregroupements pour former le cSMAC de la synapse immune (Yokosuka et al., 2009). Nous avons observé la diminution de la phosphorylation de LAT après stimulation avec un anticorps anti-CD3 soluble réticulé par un anticorps secondaire chez les lymphocytes T CD8 qui ont été préalablement stimulés avec l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7. Ce résultat surprenant était contraire à l’hypothèse que la stimulation avec des cytokines augmentait l’avidité du TCR entrainant ainsi l’augmentation de la phosphorylation de LAT. Ce résultat pourrait être expliqué par le fait que CD45 n’est pas exclu du site de stimulation du complexe du TCR, car la liaison du CD3 est un moyen artificiel d’activer le TCR et ne nécessite pas une interaction avec une CPA qui est importante pour l’exclusion du CD45 due a sa grosseur de la synapse immune. De plus, on peut observer que la diminution de la phosphorylation de LAT correspond à l’augmentation de l’expression de CD45 induite par les cytokines pro-inflammatoires. Ceci pourrait expliquer la prolifération accrue en réponse à l’anti-CD3 puisque ces essais de prolifération ont été effectués avec un anticorps anti-CD3 (mesurant environ 7 nm) fixé sur une surface permettant ainsi l’exclusion du CD45 (mesurant 23-50 nm) du site d’interaction (Irles et al., 2003). Cependant, la ségrégation de CD45 basée sur sa taille moléculaire n’explique pas à elle seule une phosphorylation plus importante de LAT suite à une stimulation avec l’IL-6 ou l’IL21 en combinaison avec l’IL-7 (Page 115 figure 6 B; page 134, figure 2). L’augmentation de la phosphorylation de LAT en présence d’IL-6 ou d’IL-21 pourrait aussi être attribuable à l’exclusion de CD45 des radeaux lipidiques. Chez les lymphocytes T CD8 non activés, 5% du CD45 se retrouve dans les radeaux lipidiques. Une stimulation antigénique entraine l’exclusion de CD45 des radeaux lipidiques de façon actine dépendante (Chichili et al., 2007). L’une des voies principales responsables de la réorganisation du cytosquelette après stimulation antigénique est la voie PI3K (Sechi et al., 2004). Cette voie est fortement activée suite à la stimulation avec l’IL-6 ou L’IL-21 (Page 115, figure 6B), suggérant que les cytokines pourraient induire l’exclusion de CD45 des radeaux lipidiques. De plus, l’expression d’un CD45 mutant qui est constitutivement exclu des radeaux lipidiques augmente la signalisation de ERK1/2 après stimulation par l’anti-CD3 (Zhang et al., 2005). Nous avons aussi observé une augmentation de l’activation de la voie ERK1/2 lorsque les lymphocytes T 153 CD8 étaient préstimulés avec les cytokines (Données non présentées) ce qui suggère l’exclusion potentielle du CD45 des radeaux lipidiques. La stimulation des lymphocytes T CD8 avec les combinaisons de cytokines augmente l’expression du GM1 impliqué dans la formation des radeaux lipidiques. Il est connu qu’une stimulation du complexe TCR/CD28 chez les lymphocytes humains entraine une augmentation de l’expression du GM1. La stimulation du TCR seul n’induit qu’une faible expression et polarisation des radeaux lipidiques. Cependant, la stimulation du co-récepteur CD28 augmente fortement l’expression de GM1 (Martin, JEM, 2001). Il a été récemment montré que la forte expression de GM1, CD5 et la colocalisation de l’IL-2R dans les radeaux lipidiques corrélait avec l’affinité du TCR ainsi qu’à une hypersensibilité aux cytokines (IL-2; IL-7; IL-15) (Cho et al., 2009). La stimulation des lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 seule ou en combinaison avec l’IL-6 et l’IL-21 entraine l’augmentation de la taille des lymphocytes T CD8 ainsi que de l’expression de GM1 à la surface membranaire (Page 140 figure 5). L’augmentation de l’expression du GM1 à la surface des lymphocytes T CD8 dépendante aussi de l’affinité du TCR envers les antigènes du soi, car les lymphocytes exprimant un TCR de plus forte affinité génèrent plus de GM1 et ont une taille plus importante. Ces résultats indiquent qu’il existe possiblement une signalisation croisée entre le TCR et les récepteurs de cytokines. La stimulation des lymphocytes T CD8 avec les combinaisons de cytokines produit un phénotype favorisant leur migration et leur rétention dans les ganglions lymphatiques. Plusieurs facteurs sont impliqués dans le recrutement et la rétention des lymphocytes T CD8 naïfs dans les organes lymphoïdes secondaires. Les lymphocytes T naïfs expriment le récepteur de chimiokine CCR7 qui permet le recrutement aux organes lymphoïdes secondaires par des gradients de chimiokines CCL19 et CCL21. La molécule d’adhésion CD62L et LFA-1 sont impliqués dans le roulement, l’adhésion au HEV et la transmigration des lymphocytes T vers les ganglions (Forster et al., 2008). L’expression transitoire de CD69 lors de l’activation des lymphocytes T entraine la rétention des lymphocytes T dans les ganglions (Shiow et al., 2006), tandis que l’expression de CD44 favorise la migration des lymphocytes T vers les sites inflammatoires (Baaten et al., 2010). Une stimulation des lymphocytes T CD8 avec l’IL-7 en 154 combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 augmente l’expression des molécules de CD62L et de CD69 ce qui suggère la migration des lymphocytes T CD8 aux ganglions et leurs rétentions (Hinrichs et al. 2008). Le CD44 est fortement réduit par l’IL-7 en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 (Page 83, figure 7). La stimulation avec les cytokines pro-inflammatoires semble augmenter l’adhésion, la transmigration ainsi que la rétention des lymphocytes T CD8 aux ganglions lymphatiques. La stimulation avec l’IL-7 seule et en combinaison avec l’IL-6 ou l’IL-21 favorise le recrutement des lymphocytes T CD8 aux ganglions lymphatiques en régulant à la hausse l’expression de CCR7. De plus, les cytokines inhibent la migration des lymphocytes T CD8 naïfs vers la zone d’inflammation en réduisant l’expression de CD44, favorisant les lymphocytes T naïfs à migrer aux ganglions pour être activés, le cas échéant. On observe que les lymphocytes T CD8 qui ont été stimulés avec l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 prolifèrent rapidement en l’absence d’antigène et que le TCR de ces lymphocytes possède une plus forte avidité. Les cytokines pro-inflammatoires semblent contrôler l’avidité du TCR en modifiant l’expression du CD5, CD8, CD45 à la surface des cellules. Cette augmentation de l’avidité du TCR a pour conséquence une prolifération plus importante à l’antigène ainsi qu’une cytotoxicité spécifique plus importante. Il a été aussi montré que les cytokines pouvant remplacer certaines molécules de co-stimulations permettent ainsi l’activation potentielle de lymphocytes T CD8 autoréactifs. 155 CHAPITRE 6 - CONCLUSION Ce projet de recherche nous a permis de mettre en évidence l’influence de certaines cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et IL-21) sur l’activation subséquente des lymphocytes T CD8 par les antigènes. Il est connu que l’IL-6 et l’IL-21 sont produites lors d’infections, de maladies inflammatoires chroniques ainsi que dans les maladies auto-immunes. Le rationnel de ce projet de recherche est que les lymphocytes T CD8 sont exposés aux cytokines proinflammatoires avant de pouvoir réagir contre un antigène spécifique à leur TCR présenté par une CPA activée dans l’environnement d’un ganglion lymphatique. Nous avons montré que l’IL-6 ou l’IL-21 en combinaison avec l’IL-7 augmente fortement la prolifération des lymphocytes T CD8 naïfs exprimant un TCR de forte affinité, en l’absence de stimulation antigénique. De plus, la stimulation des lymphocytes T CD8 mémoires avec de l’IL-6 ou de l’IL-21 en combinaison avec de l’IL-15 entraine aussi une forte augmentation de leur prolifération. Ces résultats indiquent que l’IL-6 et l’IL-21 ont un rôle dans la régénération d’une population de lymphocytes T CD8 mémoires qui serait importantes pour la rémission suite à une lymphopénie. Cependant, ces cytokines pro-inflammatoires pourraient favoriser l’enrichissement de lymphocytes T CD8 exprimant un TCR de forte affinité possiblement autoréactive. La présence de cytokines pro-inflammatoires dans l’environnement des ganglions lymphatiques permettrait d’augmenter le nombre de lymphocytes T CD8 exprimant des TCR de forte affinité contre les peptides du soi. Ces lymphocytes T CD8 prolifèrent davantage et sont aussi plus cytotoxiques lorsqu’ils sont mis en présence d’antigène. L’augmentation de la prolifération des lymphocytes T CD8 mis en présence de cytokines pro-inflammatoires semble être attribuable à une augmentation de l’avidité du TCR. Nous avons observé que les cytokines pro-inflammatoires entrainaient un changement phénotypique tel que l’augmentation de l’expression de CD8 et de CD45, ainsi qu’une forte réduction de l’expression de CD5 chez les lymphocytes T CD8 exprimant un TCR de forte affinité. L’augmentation de l’avidité du TCR permet d’outrepasser la nécessité de molécule de co-stimulation telle que le CD28, indiquant un potentiel d’activation des lymphocytes T CD8 autoréactifs. L’ensemble de nos résultats indiquent que la présence de cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-6 ou l’IL-21 augmente la prolifération, l’avidité du TCR ainsi que son activité 156 cytotoxique spécifique des lymphocytes T CD8. Ces cytokines agiraient comme un couteau à double tranchant favorisant la clairance virale et tumorale, mais favorisant aussi le développement de pathologies inflammatoires et auto-immunes. 157 REMERCIEMENTS J’aimerais remercier ma conjointe Caroline, mes enfants Arnaud et Victor pour tout le bonheur qu’ils m’apportent. J’aimerais remercier mes parents Christiane et Réjean pour leurs encouragements et leur support. J’aimerais tout particulièrement remercier mon clone Vincent, tes conseils m’ont permis de faire de la meilleure science. J’aimerais remercier mon directeur de recherche Dr Ilangumaran, sa très grande patience m’a permis de finir mes études. L’expérience dans votre laboratoire a été très formatrice autant au niveau scientifique, que personnel. J’aimerais remercier Dr Ramanathan pour son appui en ce qui concerne des expériences a été important dans la réussite de mes études. J’aimerais remercier mes collèges de travail passé et présent, votre camaraderie et votre bonne humeur m’ont permis de passer des moments agréables. Un merci tout particulier à Chantal Leblanc, ta présence a été centrale dans la réussite de mes études. Ton très grand sens de l’organisation, ton travail acharné ainsi que ton écoute attentive m’ont permis de me dépasser. Sans toi, cette étude n’aurait pas été possible. J’aimerais remercier Dr Dupuis ainsi que Dr Klarskov pour leurs encouragements ainsi que les passionnantes discussions que nous avons eues. J’aimerais remercier Dr McDonald, Dr Boulay ainsi que Dr Guimond d’avoir pris le temps de lire et commenter ma thèse. 158 RÉFÉRENCES Acuto, O. , Michel, F., 2003, "CD28-mediated co-stimulation: a quantitative support for TCR signalling." Nat Rev Immunol 3(12): 939-951. Aivazian, D. , Stern, L. J., 2000, "Phosphorylation of T cell receptor z,a is regulated by a lipid dependent folding transition." Nat Struct Biol 7(11): 1023-1026. 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