Résonance Magnétique Nucléaire : Application à l`Etude Stucturale

Centre de Biochimie Structurale
UMR UM1 / 5048 CNRS / 554 INSERM
29 rue de Navacelles
34090 Montpellier Cedex
www.cbs.cnrs.fr
Résonance Magnétique
Nucléaire :
Application à l’Etude
Stucturale des Protéines
Christian ROUMESTAND
[email protected]
(04 67 41 77 04)
Découverte du phénomène de
R.M.N.
Edward M. PURCELL
Felix BLOCH
Université de Stanford - USA
Université de Harvard - USA
Prix NOBEL de Physique 1952
Domaines d’applications de la RMN
. RMN à haute résolution dans les
solutions homogènes.
. RMN d’objets vivants (cellules,
organes).
. RMN des solides, polymères.
. Imagerie 3D par RMN (IRM)
Méthode d’analyse non-destructrice
et non invasive
Prix NOBEL de Chimie 1991
Prix NOBEL de Chimie 2002
Richard Robert ERNST
ETH Zürich - SUISSE
Kurt WÜTHRICH
ETH Zürich- SUISSE
«Développement des Techniques
pour la Spectroscopie de RMN à
Haute Résolution»
«Application de la RMNà l’étude
des Macromolécules Biologiques en
solution»
Prix NOBEL de Médecine 2003
Sir Peter MANSFIELD
Université de Nottingham
GRANDE-BRETAGNE
Paul C. LAUTERBUR
Université de l’Illinois
USA
« Utilisation de
magnétique
pour
bidimensionnelle »
gradients de
créer
une
champ
image
« Optimisation de l’utilisation des
gradients. Traitement mathématique et
analyse du signal »
Applications de la RMN en phase liquide
•
Détermination de structures moléculaires
(Chimie)
CH3
– Chimie des produits naturels
CH3
CH3
CH3
– Chimie des produits de synthèse
•
Etude de structures tridimensionnelles
Xylène Ortho
méta
CH3
– Protéines
– Acides Nucléiques
– Polysaccharides
– Complexes
•
Etudes de Processus dynamiques
–Cinétiques de Réactions
–Etudes d’équilibres (Chimiques ou de structures)
–Dynamique intrinsèque des protéines
–Repliement des protéines
•
Etudes d’interactions / Drug Design
–Relations Structure / Activité
Structure 3D de la
protéine oncogénique
MTCP1
para
CH3
LE PHENOMENE
PHYSIQUE
LES PROPRIETES MAGNETIQUES DE LA MATIERE
B0
Diamagnétique : Susceptibilité Magnétique < 0
B0
B0-b
B0
Paramagnétique : Susceptibilité Magnétique > 0
B0
B0+b
B0
Ferromagnétique :
B0+B
B0+B
B0+B
On ne s’intéressera dans ce cours qu’à la RMN des substances diamagnétiques
LA STRUCTURE DE LA MATIERE
Proton
A
A = Nombre de Masse
Neutron
Z = Numéro Atomique
Z
Electron
X
1
1
H
2
1
H
3
1
H
*
LA STRUCTURE DE LA MATIERE
Proton
A
A = Nombre de Masse
Neutron
Z = Numéro Atomique
Z
Electron
X
1
1
2
H
1
I = Nombre de Spin
A pair Z pair
I nul
Z impair I entier
A impair
I demi-entier
H
3
1
H
*
LA STRUCTURE DE LA MATIERE
Proton
A
A = Nombre de Masse
Neutron
Z = Numéro Atomique
Z
Electron
X
1
1
2
H
1
I = Nombre de Spin
A pair Z pair
I nul
Z impair I entier
A impair
I demi-entier
H
3
1
H
*
I 0
Moment de Spin 0
Moment Magnétique 0
LA STRUCTURE DE LA MATIERE
Proton
A
A = Nombre de Masse
Neutron
Z = Numéro Atomique
Z
Electron
X
1
1
2
H
1
I =1/2
I =1
I = Nombre de Spin
A pair Z pair
I nul
Z impair I entier
A impair
H
I demi-entier
3
1
H
*
I =1/2
I 0
Moment de Spin 0
Moment Magnétique 0
La spectroscopie RMN
Définition : Observation des noyaux des atomes magnétiquement actifs
1
15
13
( 1H, 15N, 13C) placés dans un champ magnétique très intense
L’échantillon RMN est une solution (200-500 l) de protéine (0,1 à 1 mM)
dans un tampon
La spectroscopie RMN
Définition : Observation des noyaux des atomes magnétiquement actifs
1
15
13
( 1H, 15N, 13C) placés dans un champ magnétique très intense
La spectroscopie RMN
Définition : Observation des noyaux des atomes magnétiquement actifs
1
15
13
( 1H, 15N, 13C) placés dans un champ magnétique très intense
Un
Un aimant
aimant supraconducteur
supraconducteur plongé
plongé dans
dans l’hélium
l’hélium
liquide
liquide crée
crée un
un champ
champ magnétique
magnétique statique
statique de
de
10
10 àà 20
20 Teslas
Teslas
La spectroscopie RMN
Définition : Observation des noyaux des atomes magnétiquement actifs
1
15
13
( 1H, 15N, 13C) placés dans un champ magnétique très intense
Les
Les dipoles
dipoles magnétiques
magnétiques nucléaires
nucléaires (spins)
(spins) s’alignent
s’alignent
dans
dans le
le champ
champ statique
statique
Un
Un aimant
aimant supraconducteur
supraconducteur plongé
plongé dans
dans l’hélium
l’hélium
liquide
liquide crée
crée un
un champ
champ magnétique
magnétique statique
statique de
de
10
10 àà 20
20 Teslas
Teslas
La
La majorité
majorité des
des spins
spins devient
devient parallèle
parallèle au
au champ,
champ,
créant
créant une
une aimantation
aimantation macroscopique
macroscopique dans
dans
l’échantillon
l’échantillon
La spectroscopie RMN
Définition : Observation des noyaux des atomes magnétiquement actifs
1
15
13
( 1H, 15N, 13C) placés dans un champ magnétique très intense
Les
Les dipoles
dipoles magnétiques
magnétiques nucléaires
nucléaires (spins)
(spins) s’alignent
s’alignent
dans
dans le
le champ
champ statique
statique
Un
Un aimant
aimant supraconducteur
supraconducteur plongé
plongé dans
dans l’hélium
l’hélium
liquide
liquide crée
crée un
un champ
champ magnétique
magnétique statique
statique de
de
10
10 àà 20
20 Teslas
Teslas
La
La majorité
majorité des
des spins
spins devient
devient parallèle
parallèle au
au champ,
champ,
créant
créant une
une aimantation
aimantation macroscopique
macroscopique dans
dans
l’échantillon
l’échantillon
1
La RMN se focalise surtout sur les noyaux d’hydrogène 1H (protons)
Sans B0
E
E0
Le cas du spin 1/2
avec B0
Sans B0
E
E = + h 0/2
E0
E = - h 0/2
Le cas du spin 1/2
avec B0
Sans B0
E
E = + h 0/2
E0
L’effet Zeeman Nucléaire
E = - h 0/2
Le cas du spin 1/2
avec B0
Sans B0
E
E = + h 0/2
E0
E = - h 0/2
Le cas du spin 1/2
avec B0
Sans B0
E
E = + h 0/2
E0
E = - h 0/2
Loi de Boltzmann
PP E
2KBT
Le cas du spin 1/2
avec B0
Sans B0
E
E = + h 0/2
Loi de Boltzmann
PP E
2KBT
(relation de Larmor)
0 = B0/2
E0
E = - h 0/2
Le cas du spin 1/2
avec B0
Sans B0
E
E = + h 0/2
Loi de Boltzmann
PP E
2KBT
(relation de Larmor)
0 = B0/2
E0
B1
E = - h 0/2
Loi de Bohr:
E = h 0
= h B0/2
L’équilibre thermodynamique
(spin 1/2)
Microscopique
B0
, -1/2
, +1/2
Boltzmann law:
PP E
2KBT
Soumises à un champ magnétique B0, les
particules vont peupler 2 niveau d’énergie :
un niveau de basse énergie (, +1/2) avec le
moment magnétique parallèle à l’induction
magnétique, et un niveau de haute énergie
(, -1/2) avec le moment magnétique
antiparallèle à B0. Les populations de spins
sur les 2 niveaux ne sont pas égales : la
distribution suit la loi de Boltzmann, avec
un excès de spins paralèles à B0 sur le
niveau de basse énergie à l’équilibre
thermodynamique.
L’équilibre thermodynamique
(spin 1/2)
Microscopique
B0
, -1/2
Le
moment
magnétique
n’est
pas
complètement aligné avec B0 : à cause de la
loi de Laplace, le vecteur magnétique va
tourner (d’où le nom de “spin”!) à une
vitesse qui dépends de sa fréquence de
Larmor.
, +1/2
L’équilibre thermodynamique
(spin 1/2)
Microscopique
, -1/2
B0
Le
moment
magnétique
n’est
pas
complètement aligné avec B0 : à cause de la
loi de Laplace, le vecteur magnétique va
tourner (d’où le nom de “spin”!) à une
vitesse qui dépends de sa fréquence de
Larmor.
, +1/2
Larmor law:
= B0 /2
L’équilibre thermodynamique
(spin 1/2)
Microscopique
Macroscopique
, -1/2
B0
z
M0
x
, +1/2
Larmor law:
= B0 /2
y
Tous les vecteurs d’aimantation
microscopique tournent à la même
vitesse mais sans cohérence de
phase.
=> l’aimantation Macroscopique
n’existe que selon l’axe z.
Perturbation de l’équilibre thermodynamique
E = + h 0/2
B0
B1
Excitation
Loi de Bohr:
E = h0
E = - h 0/2
= hB0/2
Si l’on applique un champ R.F. coherent B1 à la fréquence de Larmor :
- on induit des transitions entre les niveaux d’énergie et , ce qui diminue
la différence de population;
- les spins concernés par les transitions “s’alignent” avec B1: ils gagnent de la
cohérence de phase.
Perturbation de l’équilibre thermodynamique
Microscopique
Macroscopique
B0
z
Mz
x
Mxy
y
L’aimantation selon z diminue, et une composante macroscopique apparait dans
le plan xy. Par conséquent, l’aimantation macroscopique bascule vers le plan xy,
tout en précessant à la fréquence de Larmor.
Expérience RMN standart
Au moyen d’un second champ magnétique B11, appliqué pendant une courte durée,
on peut basculer l’aimantation des spins d’un angle que l’on peut contrôler
Expérience RMN standart
r
r r
dM
= M B0
dt
Au moyen d’un second champ magnétique B11, appliqué pendant une courte durée,
on peut basculer l’aimantation des spins d’un angle que l’on peut contrôler
Signal de Précession Libre
My = M0 cos (20t) x exp (-t /T2)
B0
Expérience RMN :
Le
Le signal
signal détecté
détecté est
est une
une sinusoïde
sinusoïde amortie
amortie ::
•• Le
Le dipole
dipole tourne
tourne autour
autour de
de l’axe
l’axe du
du champ
champ avec
avec une
une fréquence
fréquence == B
Boo/2
/2 •• La
La relaxation
relaxation ramène
ramène l’aimantation
l’aimantation àà l’état
l’état d’équilibre
d’équilibre
Signal de Précession Libre
My = M0 cos (20t) x exp (-t /T2)
B0
Expérience RMN :
Le
Le signal
signal détecté
détecté est
est une
une sinusoïde
sinusoïde amortie
amortie ::
•• Le
Le dipole
dipole tourne
tourne autour
autour de
de l’axe
l’axe du
du champ
champ avec
avec une
une fréquence
fréquence == B
Boo/2
/2 •• La
La relaxation
relaxation ramène
ramène l’aimantation
l’aimantation àà l’état
l’état d’équilibre
d’équilibre
moment gyromagntique
Signal de Précession Libre
My = M0 cos (20t) x exp (-t /T2)
B0
Expérience RMN :
Le
Le signal
signal détecté
détecté est
est une
une sinusoïde
sinusoïde amortie
amortie ::
•• Le
Le dipole
dipole tourne
tourne autour
autour de
de l’axe
l’axe du
du champ
champ avec
avec une
une fréquence
fréquence == B
Boo/2
/2 •• La
La relaxation
relaxation ramène
ramène l’aimantation
l’aimantation àà l’état
l’état d’équilibre
d’équilibre
2 informations :
fréquence & constante de temps d’amortissement (T22)
moment gyromagntique
Les Origines de la Relaxation
RMN
La relaxation est due à des transitions induites
par le «bruit magnetique» de l’échantillon.
Les noyaux ne sont pas isolés dans une molécule : ils sont
entourés d’autres noyaux qui se comportent comme des
dipoles
magnétiques
microscopiques.
Le
mouvement
Brownien de ces dipoles microscopiques est responsable
du bruit magnétique.
Relaxation Longitudinale ou Spin-Réseau
B0
«Bruit Magnetique»
Relaxation T1
z
Mz
x
Mxy
MzM0
dMz
=
dt
T1
z
M0
y
x
y
Relaxation Transverse ou Spin-Spin
B’
B’
B0
Relaxation T2
Mxy
dM xy
=
dt
T2
z
Mz
Mz
x
Mxy
z
y
x
Mxy
y
Relation entre T1, T2 et mouvement
T2 long
L
(0 = 400 MHz)
L
L
L
T2 court
P
P
Réorientation
rapide
Réorientation
lente
Fréquences de LARMOR de quelques noyaux communs
(mesurées dans un champ B0 = 2.35 T)
NOYAU
1H
2H
13C
17O
14N
15N
31P
19F
23Na
I
1/2
1
1/2
5/2
1
1/2
1/2
1/2
3/2
(MHz)
Abondance
100
15,351
25,144
13,557
7,224
10,133
40,481
94,077
26,451
naturelle (%)
99,98
1,5 10-2
1,108
3,7 10-2
99,63
0,37
100
100
100
Fréquences de LARMOR de quelques noyaux communs
(mesurées dans un champ B0 = 2.35 T)
NOYAU
1H
2H
13C
17O
14N
15N
31P
19F
23Na
I
1/2
1
1/2
5/2
1
1/2
1/2
1/2
3/2
(MHz)
Abondance
100
15,351
25,144
13,557
7,224
10,133
40,481
94,077
26,451
naturelle (%)
99,98
1,5 10-2
1,108
3,7 10-2
99,63
0,37
100
100
100
La fréquences de LARMOR ne dépend que du champ
statique B0 et du
du noyau observé…
Champ local et «Blindage Nucléaire»
B0
B0
B0
B0
B = B0 - B’ = B0(1-)
B’
B = Champ «Local»
= constante d’écran
B0
B0(1)
=
2
Noyau nu
hB0
Noyau dans
un atome
hB0(1)
Dans une molécule tous les noyaux ne “voient” pas
le même champ magnétique
Les électrons qui gravitent autour de la molécule font écran au champ magnétique
C
N
H
H
B0
La nature des groupements chimiques, les liaison
hydrogènes, modifient la distribution des électrons et
donc le champ effectif “vu” par les spins nucléaires
Déplacement chimique (ppm)
Influence de la liaison à un halogène
I
1,0
Br Cl
F
2,0
b
3,0
4,0
a
b
a
CH3X
CH3CH2X
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Electronégativité (Pauling)
Plus, l’halogène est électronégatif, plus il va dépeupler le groupement voisin de
ses électrons, et plus les protons de ce groupement seront déblindés.
Dans une molécule tous les noyaux ne “voient” pas
le même champ magnétique
Les cycles aromatiques se comportent comme des “nano-bobines” de courant
B0
Dans une molécule tous les noyaux ne “voient” pas
le même champ magnétique
Les cycles aromatiques se comportent comme des “nano-bobines” de courant
B0
Dans une molécule tous les noyaux ne “voient” pas
le même champ magnétique
Les cycles aromatiques se comportent comme des “nano-bobines” de courant
B0
Dans une molécule tous les noyaux ne “voient” pas
le même champ magnétique
Les cycles aromatiques se comportent comme des “nano-bobines” de courant
B0
Beff
Le champ local effectif est différent du
champ B0
Dans une molécule tous les noyaux ne “voient” pas
le même champ magnétique
Les cycles aromatiques se comportent comme des “nano-bobines” de courant
B0
Effet des
“groupements
voisins”
Beff
Le champ local effectif est différent du
champ B0
Dans une molécule tous les noyaux ne “voient” pas
le même champ magnétique
Les cycles aromatiques se comportent comme des “nano-bobines” de courant
B0
Effet des
“groupements
voisins”
(Arom., CO…)
Beff
Le champ local effectif est différent du
champ B0
Equivalence Chimique
Equivalence Magnétique
H
O
H
H
H
H
H
H C H
H C H
N
C
C
N
C
C
H
H
O
H
H
O
Des protons placés dans un même environnement
chimique (souvent portés par un même groupement)
résonnent à la même fréquence de Larmor!
Equivalence Chimique
Equivalence Magnétique
H
O
H
H
H
H
H
H C H
H C H
N
C
C
N
C
C
H
H
O
H
H
O
Des protons placés dans un même environnement
chimique (souvent portés par un même groupement)
résonnent à la même fréquence de Larmor!
Equivalence Chimique
Equivalence Magnétique
H
O
H
H
H
H
H
H C H
H C H
N
C
C
N
C
C
H
H
O
H
H
O
Des protons placés dans un même environnement
chimique (souvent portés par un même groupement)
résonnent à la même fréquence de Larmor!
Equivalence Chimique
Equivalence Magnétique
H
O
H
H
H
H
H
H C H
H C H
N
C
C
N
C
C
H
H
O
H
H
O
Des protons placés dans un même environnement
chimique (souvent portés par un même groupement)
résonnent à la même fréquence de Larmor!
Spins multiples
Le signal résultant est la somme des signaux individuels
Spins multiples
Le signal résultant est la somme des signaux individuels
Identification des contributions
individuelles -> Extraction des
fréquences du signal temporel
Transformée de Fourier
Principe de l’analyse en fréquence d’un signal par TF
Sinusoide «Signal»
Sinusoide «d’analyse»
La surface (intégrale) de la
courbe «produit est maximum
lorsque la fréquence d’analyse
a est égale à la fréquence 0
du signal
0
a
0 x a
Délai de
Relaxation
90°x
x NS
DE
DW
Expérience de RMN 1D par
Transformée de Fourier
Délai de
Relaxation
90°x
La TF est une opération discrète!
x
x
x
DE
DW
Expérience de RMN 1D par
Transformée de Fourier
x
x
x
x
x NS
Délai de
Relaxation
90°x
La TF est une opération discrète!
x
x
x
x
x
x
DE
x
x NS
DW
Expérience de RMN 1D par
TF
Transformée de Fourier
x
max
x
x
x
x
0
x
x
max
Délai de
Relaxation
90°x
La TF est une opération discrète!
x
x
x
x
x
x
DE
x
x NS
DW
Expérience de RMN 1D par
TF
Transformée de Fourier
x
Théorème de Nyquist:
x
max
x
x
x
0
x
x
max
Délai de
Relaxation
90°x
La TF est une opération discrète!
x
x
x
x
x
x
DE
x
x NS
DW
Expérience de RMN 1D par
TF
Transformée de Fourier
x
Théorème de Nyquist:
SW=1/(2DW)
x
max
x
x
x
0
x
x
max
T2 et Largeur de Raie
My = M0 cos (20t)) . exp (-t /T2)
y=ax/(1-bx2)
AIMANT
sonde
E
M
I
S
S
I
O
N
amplificateurs
Générateur
d’impulsions
Synthétiseur
de
fréquence
x nb de canaux
commutateur
Pré-amplificateurs
Convertisseur
Analogique-Digital
(ADC)
R
E
C
E
P
T
I
O
N
Aimant Supra-Conducteur (600 MHz)
Pause?
Le Spectre 1D Proton d’une protéine :
la charybdotoxine (3 kDa)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
méthyles
H2O
Aromatiques H
NH
10
9
8
7
6
5
(s)
Aliphatiques
4
3
2
1
0 PPM
Le Spectre 1D Proton d’une protéine :
la charybdotoxine (3 kDa)
Problème : complexité des spectres
0
0,2
0,4
0,6
0,8
méthyles
H2O
Aromatiques H
NH
10
9
8
7
6
5
(s)
Aliphatiques
4
3
2
1
0 PPM
Résolution Spectrale et Intensité du Champ de Mesure
4,70 T (200 MHz)
a)
14,10 T (600 MHz)
= B0/2
b)
9
8
7
6
5
PPM
4
3
2
1
0
Le déplacement chimique
C’est une quantification de l’effet de champ local, rendue indépendante du
champ B0: on ne mesure plus la fréquence absolue du noyau, mais la différence
de fréquence avec un noyau référence.
obs ref
6
obs =
10 ppm
0
Ex: un proton qui résonne à 3000 Hz (obs) de la substance de référence (ref = 0)
dans un champ magnétique de 11.75 T (n0 = 500 MHz) aura un déplacement
chimique dobs de:
obs =
TMS : tretra methyle silane
(insoluble dans l’eau)
3000 0
6
10
= 6 ppm
6
500 10
TSP : 3-(Trimethylsilyl)- Propionic acid-D4, sodium salt
Interactions entre spins et
transfert d’aimantation
RMN multidimensionnelle
(2D, 3D…)
Interaction entre spins : couplage scalaire
A
A
B
B
H
H
H
C
C C
Deux spins qui partagent des
électrons de liaison (covalente) sont
couplés. Chaque résonance est
dédoublée.
Interaction entre spins : couplage scalaire
B0
BA
A
A
B
B
H
H
H
C
C C
A
HA
HB
C
Deux spins qui partagent des
électrons de liaison (covalente) sont
couplés. Chaque résonance est
dédoublée.
A
C
Interaction entre spins : couplage scalaire
B0
BA
A
A
B
B
H
H
H
C
C C
BX
B
A
HA
HB
C
Deux spins qui partagent des
électrons de liaison (covalente) sont
couplés. Chaque résonance est
dédoublée.
BX
A
C
B
Interaction entre spins : couplage scalaire
B0
BA
A
A
B
B
H
H
H
BX
B
C
C C
A
HA
HB
C
Deux spins qui partagent des
électrons de liaison (covalente) sont
couplés. Chaque résonance est
dédoublée.
C
B
BX
A
A1
A2
Interaction entre spins : couplage scalaire
A
A
H
H
3J
AB
B
B
H
C
C C
L’écartement entre les deux raies
associées à chaque spin est appelée
constante de couplage J.
AA
BB
Interaction entre spins : couplage scalaire
A
A
H
H
3J
AB
B
B
H
C
C C
L’écartement entre les deux raies
associées à chaque spin est appelée
constante de couplage J.
AA
BB
Rem. Le couplage J ne passe pas
à travers un carbone quaternaire.
Interaction entre spins : couplage scalaire
A
A
B
B
3J
AB
H
H
H
C
C C
L’écartement entre les deux raies
associées à chaque spin est appelée
constante de couplage J.
3
R1
R2
H C H
H C H
JH-H
N
H
3
i
3
JH-H’
C
C
N
H
O
H
JHN-H
i+1
C
C
H
O
AA
BB
Rem. Le couplage J ne passe pas
à travers un carbone quaternaire.
Interaction entre spins : couplage scalaire
A
A
B
B
3J
AB
H
H
H
C
C C
L’écartement entre les deux raies
associées à chaque spin est appelée
constante de couplage J.
3
R1
R2
H C H
H C H
JH-H
N
H
3
i
3
JH-H’
C
C
N
H
O
H
JHN-H
i+1
C
C
H
O
AA
BB
Rem. Le couplage J ne passe pas
à travers un carbone quaternaire.
Interaction entre spins : couplage scalaire
A
A
B
B
3J
AB
H
H
H
C
C C
L’écartement entre les deux raies
associées à chaque spin est appelée
constante de couplage J.
3
R1
R2
H C H
H C H
JH-H
N
H
3
i
3
JH-H’
C
C
N
H
O
H
JHN-H
i+1
C
C
H
O
AA
BB
Rem. Le couplage J ne passe pas
à travers un carbone quaternaire.
Couplages 1H-1H à 3 liaisons (3J, vicinaux):
Relation de Karplus:
3J
= A + B cos() + C cos2()
Valine :
H3C
O
C
3J
CH3
CH
O
N
C
C
H
H
HN-H 3J
3J
HN
HN-H
H -H H
Transfert d’aimantation via le couplage scalaire
H4
30
CH 3
29
CH3
20
CH36
O
H2
H5
12
25 11
CH3
1
H=GlcAp
COOH
D=Xylp
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
H3
OH
C=Galp
O CH3
O
*
OH
OH
OH
E=Xylp
B=Fucp
OH
G=d-O-Glcp
O
O
OH
OH
O
O
O
CH3
27
O
OH OH
OH
28
C
15
COH
23
O
O
H1
6
4
CH 3
24
CH3
CH2OH
10 9 8
3
O
O
18 17
26
CH3 13
O
CH 3
O
O
OH
OH
F=Xylp
OH
A=Rhap
TOCSY
COSY
Transfert d’aimantation via le couplage scalaire
H4
30
CH 3
29
CH3
20
CH36
O
H2
H5
12
25 11
CH3
1
H=GlcAp
COOH
D=Xylp
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
H3
Protons anomériques
———————————
*
OH
C=Galp
O CH3
O
OH
OH
OH
E=Xylp
B=Fucp
OH
G=d-O-Glcp
O
O
OH
OH
O
O
O
CH3
27
O
OH OH
OH
28
C
15
COH
23
O
O
H1
6
4
CH 3
24
CH3
CH2OH
10 9 8
3
O
O
18 17
26
CH3 13
O
CH 3
O
O
OH
OH
F=Xylp
OH
A=Rhap
TOCSY
COSY
Interaction entre spins : Couplage dipolaire
B0
spin 2
r12
spin 1
I0
I
Deux spins prochent dans l’espace
présentent une interaction dipolaire
(ou dipole-dipole). En solution, ceci ne
conduit pas à un dédoublement de la
raie de résonance comme dans le cas
de l’interaction scalaire, mais à une
modification de ses propriétés de
relaxation qui va se répercuter sur la
valeur de l’intensité de la raie. Ce
phénomène est connu sous le nom
d’effet nucléaire Overhauseur (n0e),
et dépend essentiellement de la
distance séparant les 2 spins.
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
H
O
H
H
H
H
H-C-H
-N-C-CH H O
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
H
O
H
H
H
H
H-C-H
-N-C-CH H O
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
H
O
H
H
H
H
H-C-H
-N-C-CH H O
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
I
H
O
H
H
H
H
H-C-H
-N-C-CH H O
*
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
I
H
O
H
*
H
H
H
H-C-H
I-I0
-N-C-CH H O
ppm 7
6
5
4
3
2
1
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
I
H
O
H
*
H
H
H
H-C-H
I-I0
-N-C-CH H O
Y22-H'
ppm 7
6
5
4
3
2
1
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
I
H
O
H
*
H
H
H
H-C-H
-N-C-CH H O
I-I0
Y22-H
ppm 7
Y22-H'
6
5
4
3
2
1
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
I
H
O
H
*
H
H
H
H-C-H
-N-C-CH H O
I-I0
Y22-H
ppm 7
C53-H
6
Y22-H'
5
4
3
2
1
Effet Nucléaire Overhauser (nOe)
nOe = ƒ(1/r6)xƒ(c)
I0
Y22-H
*
H
H
I
H
O
H
*
H
H
H
H-C-H
-N-C-CH H O
Transfert
I-I0
d’aimantation via
Y22-H
l’interaction
dipolaire
ppm 7
C53-H
6
Y22-H'
5
4
3
2
1
Signe du nOe et mouvement
L
L
0.5
nOe
POSITIFS
L
L
0.0
P
-0.5
nOe
NEGATIFS
P
-1.0
0c
0.01
0.1
Réorientation
rapide
1
10
100
Réorientation
lente
Impulsions sélectives vs RMN 2D
Impulsions sélectives vs RMN 2D
Spectre total
Impulsions sélectives vs RMN 2D
Spectre total
Impulsions sélectives vs RMN 2D
Spectre total
Spectre édité
Impulsions sélectives vs RMN 2D
Impulsions sélectives vs RMN 2D
F1
F2
Impulsions sélectives vs RMN 2D
F1
F2
Une dimension supplémentaire
dans le domaine
des fréquences
Impulsions sélectives vs RMN 2D
F1
F2
Une dimension supplémentaire
dans le domaine
des fréquences
Une dimension supplémentaire
dans le domaine
des temps
Augmentation de Résolution par Ajout d’une
Dimension Spectrale : RMN 2D
Principe de l’expérience de RMN 2D
Le signal est modulé à la fois pendant t1 et t2.
1, F1
Les expériences RMN à 2 dimensions (2D)
2, F 2
Pic diagonal
Pic croisé
Les Expériences 2D Homonucléaires de base
utilisées en RMN des protéines.
TOCSY 2D (interactions scalaires)
NOESY 2D (interactions dipolaires)
-> Géométrie covalente
-> Structure 3D
10
9
8
7
6
10
9
8
7
6
5
4
PPM
3
2
1
0
PPM
5
4
3
2
1
0
Les Limites de la Spectroscopie 2D Homonucléaire.
2D NOESY
enregistré sur une
protéine de
30 kDa
Résolution Spectrale et Spectres
Hétéro-atomiques.
(ex : 13C)
A)
B)
spectre {13C}, 125 MHz
Carbones :
3.000 Hz
20.000 Hz
Protons :
spectre {1H}, 500 MHz
5.000 Hz
1.500 Hz
RMN 2D Hétéro-nucléaire:
ex : [1H,13C] HSQC
10
20
30
H
CH
130 Hz
50
C
1J
40
60
ppm
6
5
4
3
2
1
Marquage isotopique - RMN
hétéronucléaire
15
N : abondance naturelle 0.3 %
13
C : abondance naturelle 1.1 %
On peut enrichir les protéines recombinantes en azote
15
N ou en carbone 13C en cultivant les cellules sur des
milieux marqués.
L’incorporation d’isotopes permet de résoudre les
ambiguïtés résultant des superpositions spectrales des
atomes d’hydrogène en utilisant la fréquence du noyau
supplémentaire (15N ou 13C )
N
[1H,15N] HSQC
Cys50
Cys7
Cys39
Cys38
Cys17
Cys28
C
1J
NH
90 Hz
L’ expérience 3D «double-résonance»
H
SQ
C
[1H-15N] NOESY-HSQC 3D
1J
NH
nOe
NOESY
L’ expérience 3D «double-résonance»
H
SQ
C
[1H-15N] NOESY-HSQC 3D
1J
NH
nOe
NOESY
L’ expérience 3D «double-résonance»
H
SQ
C
[1H-15N] NOESY-HSQC 3D
1J
NH
nOe
NOESY
L’ expérience 3D «double-résonance»
H
SQ
C
[1H-15N] NOESY-HSQC 3D
1J
NH
nOe
NOESY
Expériences 3D «triple-résonance»
(1H,
15N
,
13C)
STRATEGIE D’ATTRIBUTION
SEQUENTIELLE
(Wüthrich, 1976)