TP 9 Immunoprécipitation du complexe Antigène-Anticorps
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TP 9 Immunoprécipitation du complexe Antigène-Antico L’immunité adaptative, prolongement de l’immunité innée (3-A-2) Mode opératoire Mettre en évidence la spécificité de la réponse immunitaire par réalisation expérimentale d'une immunoprécipitation et visualisation du complexe antigène-anticorps formé. Cette immunodiffusion, appelée réaction d’Ouchterlony, est basée sur la diffusion de molécules (an- tigènes et anticorps) disposées dans des puits creux de milieu gélosé. La reconnaissance de l’anticorps et de l’antigène conduit à la formation du complexe Immun qui bloque la migration impliquant la formation d’un arc de précipitation. Problématique scientifique L’immunité adaptative s’ajoute à l’immunité innée. Comment mettre en évidence que l’action des molécules intervenant dans l’immunité adaptative est spécifique ?. Avant le TP Préparation de la gélose : - Mettre la poudre contenant l'agar-agar dans 200 mL d'eau distillée puis porter l’ensemble à ébullition. - Répartir à l'aide d'une pipette à raison de 5 mL par boîte.... - Laisser refroidir, puis conserver les boîtes au réfrigérateur (les retourner pour éviter que la condensation ne coule sur le milieu gélosé). Préparation des colorants : - Pour 200 mL de colorant : Mélanger : 100 mL d'éthanol 90° ou absolu, 90 mL d'eau distillée, 10 mL d'acide éthanoïque pur, et le bleu fourni dans le kit. - Pour la solution de décoloration : Mélanger 174 mL d'eau distillée, 16 mL d'acide éthanoïque pur et 10 mL d'éthanol. Pendant le TP Sortir le matériel biologique (antigène et anticorps) du congélateur une heure avant le début de la séance. - Distribuer une boite de pétri gélosée par binôme. - Creuser 1 puits central et cinq puits périphériques Pour cela, placer la mire plastifiée sous la boite de pétri, perforer la gélose à l’aide à l’aide de l’emporte pièce , retirer l’emporte pièce, puis éjecter la gélose à l’aide de la poire. Il faut retirer complètement la gélose de chaque puits - Identifier les puits sous la boite à l’aide d’un feutre - Déposer 15 microlitres de solution contenant des anticorps dans le puits central - Déposer également 15 microlitres des différentes solutions contenant les antigènes dans les différents puits (puits 2 : témoin positif, puits 3 : témoin négatif, puits 4 : sérum complet de bovin, puits 5 : sérum complet de lapin ; puits 6 : sérum complet d’âne…) - Désinfecter la paillasse à l’alcool ou à l’eau de javel et travailler dans le champ de stérilité d’une flamme. - Placer un papier filtre dans le couvercle et l’humidifier à l’aide d’eau distillée, refermer la boite. Répéter cette opération au moins une fois par jour. - Une fois l’arc de précipitation formé retirer les boites de l’étuve, et les conserver au réfrigérateur. Trucs et astuces L‘arc blanc de précipitation du complexe peut être rendu plus visible par l’utilisation d’un fond noir et d’un éclairage latéral. Quelques préparations correctes peuvent être congelées pour une exploitation et une illustration ultérieure, en cours ou l‘année suivante par exemple. La décongélation est effective en quelques heures Attention : il est indispensable de ne jamais faire déborder les puits et d’éviter tout contact entre les solutions - Déposer les boites dans un incubateur à 30°C . • 38 38.indd 38 28/08/12 11:16 TS nticorps : Réaction d’Ouchterlony Résultats et exploitations le Matériel nécessaire Éthanol dénaturé 95° Réf. 102 002 Acide éthanoïque ; 1 L Réf. 106 110 TP Ouchterlony Réf. 115 027 Consommables pour TP Ouchterlony Réf. 115 028 Mini-incubateur Réf. 535 050 Pince fine en acier inox 110 mm (modèle standard) Réf. 564 034 n’est observable face au témoin négatif : Il n’y a donc pas eu de contamination. On observe un arc de précipitation entre le puits central et le puits 1 contenant le sérum anti BSA. Aucun arc n’est observé ailleurs dans la boite. Les anticorps réagissent donc spécifiquement. Réf. 703 323 Réf. 723 020 TP de Sciences de la Vie Micropipette à volume variable Eco 2-20 µL Cônes jaunes 10-200 µL pour micropipettes (lot de 1000 en vrac) L'observation peut alors se faire directement sur un fond noir, on peut également réaliser une coloration du complexe immun formé à l'aide du bleu de Coomassie. La coloration et le rinçage s'effectuent avec 15 mL de solution. Sur fond noir, on observe un arc de précipitation face au témoin positif alors que rien Réfé- Retrouvez le TP sur www.jeulin.fr En résumé Les anticorps de bovin réagissent uniquement le serum de bovin. Les sérums d’âne ou de lapin ne provoquent aucune réaction. La réaction est donc bien spécifique. Ayez le réflexe Jeulin Pocket Retrouvez tous nos TP et de nombreuses autres ressources sur votre smartphone grâce à l'application Jeulin Pocket disponible sur Androïd Play Store ou Apple Store. Pour aller plus loin En ne donnant pas d’indication sur la nature des anticorps dans le puis central, une réflexion peut être engagée avec les élèves pour mettre en évidence le caractère spécifique de la réaction qui a lieu contre l’albumine bovine. 39 • 38.indd 39 28/08/12 11:16
