TP 9 Immunoprécipitation du complexe Antigène-Anticorps

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TP 9 Immunoprécipitation du complexe Antigène-Anticorps : Réaction d’Ouchterlony
L’immunité
adaptative,
prolongement
de l’immunité
innée (3-A-2)
Problématique
scientifique
L’immunité adaptative
s’ajoute à l’immunité in-
née. Comment mettre en
évidence que l’action des
molécules intervenant
dans l’immunité adapta-
tive est spécique ?.
Mode opératoire
Pendant le TP
Mettre en évidence la spécicité de la réponse
immunitaire par réalisation expérimentale d'une
immunoprécipitation et visualisation du complexe
antigène-anticorps formé.
Cette immunodiffusion, appelée réaction d’Ouch-
terlony, est basée sur la diffusion de molécules (an-
tigènes et anticorps) disposées dans des puits creux
de milieu gélosé.
La reconnaissance de l’anticorps et de l’antigène
conduit à la formation du complexe Immun qui
bloque la migration impliquant la formation d’un
arc de précipitation.
Avant le TP
Préparation de la gélose :
- Mettre la poudre contenant l'agar-agar dans
200 mL d'eau distillée puis porter l’ensemble à
ébullition.
- Répartir à l'aide d'une pipette à raison de 5 mL
par boîte....
- Laisser refroidir, puis conserver les boîtes au réfri-
gérateur (les retourner pour éviter que la conden-
sation ne coule sur le milieu gélosé).
Préparation des colorants :
- Pour 200 mL de colorant : Mélanger : 100 mL
d'éthanol 90° ou absolu, 90 mL d'eau distillée,
10 mL d'acide éthanoïque pur, et le bleu fourni
dans le kit.
- Pour la solution de décoloration : Mélanger
174 mL d'eau distillée, 16 mL d'acide éthanoïque
pur et 10 mL d'éthanol.
Sortir le matériel biologique (antigène et anticorps)
du congélateur une heure avant le début de la
séance.
- Distribuer une boite de pétri gélosée par binôme.
- Creuser 1 puits central et cinq puits périphériques
Pour cela, placer la mire plastiée sous la boite de
pétri, perforer la gélose à l’aide à l’aide de l’em-
porte pièce , retirer l’emporte pièce, puis éjecter la
gélose à l’aide de la poire. Il faut retirer complète-
ment la gélose de chaque puits
Trucs et astuces
L‘arc blanc de précipitation
du complexe peut être rendu
plus visible par l’utilisation
d’un fond noir et d’un éclai-
rage latéral.
Quelques préparations cor-
rectes peuvent être conge-
lées pour une exploitation
et une illustration ultérieure,
en cours ou l‘année suivante
par exemple. La décongéla-
tion est effective en quelques
heures
- Identier les puits sous la boite à l’aide d’un feutre
- Déposer 15 microlitres de solution contenant des
anticorps dans le puits central
- Déposer également 15 microlitres des différentes
solutions contenant les antigènes dans les diffé-
rents puits (puits 2 : témoin positif, puits 3 : témoin
négatif, puits 4 : sérum complet de bovin, puits 5 :
sérum complet de lapin ; puits 6 : sérum complet
d’âne…)
- Désinfecter la paillasse à l’alcool ou à l’eau de
javel et travailler dans le champ de stérilité d’une
amme.
- Placer un papier ltre dans le couvercle et l’humi-
dier à l’aide d’eau distillée, refermer la boite. Ré-
péter cette opération au moins une fois par jour.
- Une fois l’arc de précipitation formé retirer les
boites de l’étuve, et les conserver au réfrigérateur.
Attention : il est indispensable de ne jamais faire
déborder les puits et d’éviter tout contact entre les
solutions
- Déposer les boites dans un incubateur à 30°C .
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TP de Sciences de la Vie
Matériel nécessaire Ré-
fé-
Éthanol dénaturé 95° Réf. 102 002
Acide éthanoïque ; 1 L Réf. 106 110
TP Ouchterlony Réf. 115 027
Consommables pour TP
Ouchterlony Réf. 115 028
Mini-incubateur Réf. 535 050
Pince fine en acier inox
110 mm (modèle standard) Réf. 564 034
Micropipette à volume
variable Eco 2-20 µL Réf. 703 323
Cônes jaunes 10-200 µL
pour micropipettes
(lot de 1000 en vrac) Réf. 723 020
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sur www.jeulin.fr
TS
le
TP 9 Immunoprécipitation du complexe Antigène-Anticorps : Réaction d’Ouchterlony
Résultats et exploitations
En résumé
L'observation peut alors se faire directe-
ment sur un fond noir, on peut également
réaliser une coloration du complexe immun
formé à l'aide du bleu de Coomassie.
La coloration et le rinçage s'effectuent avec
15 mL de solution.
Sur fond noir, on observe un arc de précipi-
tation face au témoin positif alors que rien
n’est observable face au témoin négatif : Il
n’y a donc pas eu de contamination.
On observe un arc de précipitation entre le
puits central et le puits 1 contenant le sérum
anti BSA.
Aucun arc n’est observé ailleurs dans la
boite. Les anticorps réagissent donc spécifi-
quement.
Les anticorps de bovin réagissent uniquement le serum de bovin. Les sérums d’âne ou de
lapin ne provoquent aucune réaction. La réaction est donc bien spécifique.
Pour aller plus loin
En ne donnant pas d’indication sur la na-
ture des anticorps dans le puis central, une
réflexion peut être engagée avec les élèves
pour mettre en évidence le caractère spéci-
fique de la réaction qui a lieu contre l’albu-
mine bovine.
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