Terminale S Fiche Méthode #15 – Réaliser un test ELISA

Terminale S
Fiche Méthode #15 – Réaliser un test ELISA
OBJECTIF
La pénétration du VIH (agent pathogène présentant divers
antigènes) dans l’organisme déclenche une réaction du
système immunitaire qui se traduit par la production
d’anticorps anti-VIH.
Le test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
consiste à repérer la présence dans le sang d’anticorps
anti-VIH et de diagnostiquer la séropositivité.
Dans la procédure suivante, les anticorps détectés seront
ceux de la BSA (sérum albumine de bovine) dans le sérum
de lapins préalablement mis en contact ou non avec cet
antigène.
MATERIEL
 Une barrette de 8 puits au fond desquels sont fixés
des antigènes BSA (un côté des barrettes possède
une encoche qui permet de repérer le puits 1 et le
puits 6)
 Des solutions d’anticorps de différentes concentrations
(en µg d’Ac.mL-1 : de C1= 17 à C7 = 1,06)
 Eau distillée (ED)
 Solution sans anticorps, constituant le témoin (SO)
 Sérums de lapins à tester (sT1 & sT2)
 Solution d’anticorps de détection (anticorps conjugués
Ac2)
 Solution de lavage, tampon PBS-tween (PBS
Phosphate Buffer Saline)
 Solution de TMB (tétraméthylbenzidine) incolore,
substrat de l’enzyme peroxydase (sTMB)
PROTOCOLE
1. À l’aide d’une pipette, déposer 2 gouttes (soit 80 μl) de
chaque solution dans le puits correspondant
Puits
Solution
P1
SO
P2
C1
P3
C
3
P4
C5
P
5
C
7
P6
C6
(sT1)
P7
C7
(sT2)
P8
C5
2. Laisser incuber 15 minutes à température ambiante
sur la paillasse
3. Vider les puits par retournement d’un geste rapide et
franc au-dessus de l’évier, tamponner le dessus des
puits sur du papier filtre
4. Laver 2-3 fois avec du tampon PBS-tween. Le lavage
s’effectue en remplissant totalement les puits puis en
vidant à nouveau par retournement sec.
5. À l’aide d’une micropipette, déposer 2 gouttes de la
solution Ac2 dans les puits 1 à 7 ; déposer 2 gouttes
d’eau distillée (ED) dans le puits 8.
6. Laisser incuber 15 minutes à température ambiante
sur la paillasse
7. Vider les puits par retournement et laver 2-3 fois avec
du tampon PBS-tween.
8. À l’aide d’une micropipette, déposer 2 gouttes de
solution TMB (substrat de la péroxydase) dans tous
les puits
9. Laisser incuber 5 minutes à température ambiante sur
la paillasse.
10. Observer une coloration éventuelle
11. Effectuer les lectures.
INTERPRETATION
On peut utiliser les figurés ci-dessous pour présenter les
différentes étapes du test