Traitement des Images Fluorescentes, Restauration - TIMC-IMAG

Traitement des Images Fluorescentes,
Restauration & Déconvolution
Yves USSON
Reconnaissance des Formes & Microscopie Quantitative
Lab. TIMC UMR 5525 CNRS, IN3S, Grenoble
Yves Usson
Paris, 2003
Propriétés des images de microscopies phoniques
Lumière transmise
Fluorescence
- Niveau élevé
levé de lumiè
lumière
--> bon rapport signal sur bruit
- Niveau faible de lumiè
lumière
--> mauvais rapport signal sur bruit
- L’
L’absorption est un processus multiplicatif
--> contraste élevé
levé de marquage
- L!’é
mission de lumiè
L!’émission
lumière est un processus
additif
- Processus d!’
illumination-collection
d!’illumination-collection
cohé
cohérent
--> peu de lumiè
lumière diffracté
diffractée et
diffusé
diffusée
- Processus d!’é
mission non-cohé
d!’émission
non-cohérent
--> diffraction et diffusion élevé
levées
Le contraste et la résolution
spatiale sont altérées par une
«!brume!» caractéristique
Images bruitées
Yves Usson
Paris, 2003
Le bruit photonique dans les images de
fluorescence et traitement numérique
Yves Usson
Paris, 2003
Le bruit photonique dans les images de fluorescentes
“Le bruit photonique” : de quoi s’agit-il?
Rapport signal/bruit
(SNR)
-> moyenne / variation
Image de FISH
Histogramme d’
d’intensité
intensité
Yves Usson
Paris, 2003
Le bruit photonique dans les images de fluorescentes
Propriétés statistiques du bruit photonique
2
Bruit de Poisson : µ = !
1.00
Source 3 photons/ms
0.80
0.60
1.0 2.2 3.2
4.5
5.5
0.40
0.20
2
4
1
6
3
0.00
0
2
4
6
8
10
12
14
“mauvais” SNR
Temps d’inté
intégration 1ms : signal
moyen 3 photons
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38 40
“bon” SNR
µ
SNR(dB) = 10 log " $
# 3! %
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration : suppression du bruit de Poisson
Amélioration du SNR : filtrage par intégration temporelle
Temps d’intégration 0,5 s
integration 2 s
integration 16 s
Réalisé pendant l’acquisition : moyennage d’images,
filtrage de Kalman
Yves Usson
Paris, 2003
Filtrage numérique du bruit photonique
Filtres directs
Filtres adaptatifs
Convolution liné
linéaire
Adapté
Adapté aux bruits
gaussien et de Poisson
Rapide, peut être ité
itéré
Altè
Altère la ré
résolution !
Filtre de rang (Mé
(Médian)
Adapté
Adapté au bruit impulsionnel
Rapide, peut être ité
itéré
Pré
Préserve les bords
Détruit les structure fines
et peut cré
créer des textures
peu naturelles !
Filtres stochastiques
Moyenne tronqué
tronquée
Propagation de gradient
Diffusion anisotropique
Adapté
Adapté aux bruits gaussien et
de Poisson
Assez rapide, peut être ité
itéré
Pré
Préserve les bords
Pré
Préserve les structures fines
Repose sur la connaissance
des paramè
paramètres du bruit !
Champs de Markov
Filtre à relaxation
Filtre quasi idé
idéal !
Ttrrèè
èèss
ss
lleenntt
!
Ttrr
Solution idé
idéale
quand les ordinateurs
seront mille fois plus
puissants !
Yves Usson
Paris, 2003
Filtrage numérique du bruit photonique
Evaluation de diverse techniques
Image de test
Yves Usson
Paris, 2003
Filtrage numérique du bruit photonique
Evaluation de diverse techniques
Image test
+ bruit
Yves Usson
Paris, 2003
Filtrage numérique du bruit photonique
Filtrage Gaussien
Image filtrée
Yves Usson
Paris, 2003
Filtrage numérique du bruit photonique
Filtrage d’ordre (filtre médian)
Image filtrée
Yves Usson
Paris, 2003
Le bruit photonique dans les images de fluorescentes
Filtrage adaptatif : Propagation du gradient
Module d’analyse
Détection de gradient
et de lignes
Pondé
Pondération
Image bruitée
Filtre
Gaussien
Image filtrée
x
+
x
Module de filtrage
Yves Usson
Paris, 2003
Filtrage numérique du bruit photonique
Filtrage adaptatif
Image filtrée
Yves Usson
Paris, 2003
Bruit photonique dans les images de fluorescence
Image brute
Yves Usson
Filtre adaptatif
Filtre médian
Paris, 2003
Restauration de la résolution latérale
des images de fluorescence
Déconvolution numérique 2D
Yves Usson
Paris, 2003
Résolution des images de microscopie
oxy
ixy
ixy i=
=xyh!
oxyo+
xy h
xy !
xy n
[
!1 !1
ˆ
oˆxy o
=xyh=
"xy i"
xynxy
xy h
xy i!
]
Disque d’
d’Airy (PSF)
Source ponctuelle
Rayons diffracté
diffractés
Yves Usson
Plan image
Paris, 2003
Résolution des images de microscopie
Mesure de la fonction d’étalement du point (PSF)
Image de microbilles (0,2µm)
Profil d’intensité théorique
Profil d’intensité mesuré
Echantillon de part et d’autre Echantillon de part et d’autre
Profil d’intensité théorique
Profil d’intensité théorique
Echantillon centré
Profil d’intensité mesuré
Echantillon centré
Yves Usson
Paris, 2003
Résolution des images de microscopie
Déconvolution contrainte itérative
image i
PSF h
Estimateur
ô
convolution
estimateur
flou
différences
erreurs i
correction
Filtre de
bruit
Yves Usson
nouvel
estimateur
Paris, 2003
Résolution des images de microscopie
Déconvolution contrainte itérative
Image test synthétique
Flou et bruit
Image test floue
Restauration simple
Image test restaurée
Restauration améliorée
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution latérale
Déconvolution numérique
Surface d’intensité
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution latérale
Déconvolution numérique
karyotype de souris DAPI
Yves Usson
Restauration : “banding” lisible
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
des images de fluorescence
Déconvolution numérique 3D
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
Plan focal xy
Section xz
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
Stratégies
Déconvolution
contrainte itérative
Microscope confocal
Déconvolution “plus proches voisins”
Ramener la lumière là où
Eliminer la lumière hors-focale !
elle doit être !
(rejeter les photons dispersés)
(reconcentrer les photons dispersés)
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
L’algorithme des plus proches voisins :
Introduit par Castleman en 1964 pour la microscopie en champ
clair
Postulat : un pixel dans le plan focal est la somme de lumière
appartenant effectivement au plan focal et de lumière parasite.
Cette dernière correspond à une fraction de la lumière contenue
par le diabolo d’illumination (cône d’illumination et cône de
dispersion de part et autre du plan focal).
Algorithme : pour un pixel donné, moyenner les intensités des
pixels situés dans les plans immédiatement au-dessus et en
dessous du plan focal qui intersectent le cône d’illumination ou
de dispersion. Retrancher un pourcentage de cette moyenne de
la valeur du pixel considéré.
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
L’algorithme des “plus proches voisins”
0µm
1.44µm
2.88µm
4.32µm
10µ
10µm
5.76µm
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
L’algorithme des “plus proches voisins”(Castleman 1967)
Plan
au-dessus
au-dessus
Plan
courant
Plan
en-dessous
en-dessous
Soustraction des
plans sous et sussusjacent flous
Plan restauré
restauré
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
L’algorithme des “plus proches voisins”
0µm
1.44µm
2.88µm
4.32µm
5.76µm
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
L’algorithme des “plus proches voisins”
Données brutes 3D
Données restaurées
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
L’algorithme des “plus proches voisins”
Section brute non-confocale
non-confocale
Yves Usson
Section restauré
restaurée
Section confocale
Paris, 2003
Résolution dans les images de microscopie 3D
Mesure de la fonction d’étalement du point (PSF)
Séries des sections
optiques confocales
de billes fluorescentes
d’un diamètre de
0,2µm
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration 3D : déconvolution contrainte itérative
Spermatozoïde démembrané de Xenopus laevis incubé
dans des extraits d’œuf. Cinétique de condensation chromosomique
Plan focal XY
Yves Usson
Plans XZ
reconstruction 3D
Paris, 2003
Restauration 3D : déconvolution contrainte itérative
Yves Usson
Paris, 2003
Restauration de la résolution axiale
Remarques importantes :
- Il est essentiel d’utiliser la PSF expérimentale
L’utilisation d’une PSF théorique ne permet une
restauration optimale
- La PSF empirique doit être symétrisée par révolution
autour de l’axe Z ( pas aussi performant que la PSF brute
mais offre une meilleur stabilité des algorithmes tout en
donnant une restauration très satisfaisante)
- N’ayez jamais totalement confiance dans le résultat
d’une restauration !
Si quelqu!’un vous dit que vous pouvez avoir une confiance
aveugle dans un algorithme, c’est un sacré galéjeur !
Yves Usson
Paris, 2003