Traitement et analyse d`images 2D et 3D - TIMC-IMAG

Institut Albert Bonniot
Domaine de la Merci
38706 La Tronche cedex
[email protected]
Yves Usson
Traitement et analyse d’images 2D et 3D
Module de Microscopie Structurale
Cours n° 6
DEA de Biologie Structurale et Fonctionnelle - DEA de Biologie Cellulaire et Moléculaire
Université Joseph Fourier
NUMERISATION
Image analogique
Capteur vidéo
Image physique
Objectif
Préparation cytologique
Fichier de mesures
cell 1 : 1.05 30.48 0.23
.......
cell 2: 1.98 29.00 0.75
Yves Usson 1999
EXTRACTION DE MESURES
Masques de segmentation
SEGMENTATION
Image numérique
125 63 64 58 72
27
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Etapes de la cytométrie par analyse d’image
Université Joseph Fourier
Coordonnée spatiale y (µm)
Coordonnée spatiale x (µm)
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
5
10
hématies
noyau
15
20
fond
Coordonnée spatiale x (µm)
Nature de l’image
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Intensité de la lumière
25
Yves Usson 1999
Université Joseph Fourier
Image numérique 256x256
pixels
Yves Usson 1999
points élémentaires ou
pixels (picture elements)
Agrandissement de la zone
encadrée (8 fois)
L’image numérique
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Yves Usson 1999
Taille du pixel
0,8 x 0,8µm
Nombre de pixels
32x32
Taille du pixel
0,4 x 0,4µm
Nombre de pixels
64x64
Université Joseph Fourier
Taille du pixel
0,2 x 0,2µm
Nombre de pixels
128x128
Taille du pixel
0,1 x 0,1µm
Nombre de pixels
256x256
L’échantillonnage spatial
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Yves Usson 1999
Dynamique : 8
niveaux de gris
Dynamique : 16
niveaux de gris
Université Joseph Fourier
Dynamique : 32
niveaux de gris
Dynamique : 256
niveaux de gris
L’échantillonnage dynamique
Microscopie quantitative - Analyse d’images
30
60
120
150
Niveau de gris
90
210
180
240
Université Joseph Fourier
Distribution des niveaux de gris dans une image numérique.
L’axe vertical correspond au nombre de pixels par classe de
niveau de gris. L’axe horizontal correspond aux niveaux de
gris : 0 -> noir et 255 -> blanc
0
Image et information
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Nombre de pixels
Yves Usson 1999
30
60
120
150
Niveau de gris
90
210
180
240
Segmentation par fenêtre de
seuillage sur l’histogramme
des intensités
0
B
A
Masque binaire
Segmentation - Approche par régions
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Université Joseph Fourier
Nombre de pixels
Yves Usson 1999
pixels “objet”
pixels “fond”
Université Joseph Fourier
Filtrage de Sobel
(valeur absolue de la dérivée seconde)
0
0
50
100
150
200
250
0
0
50
100
150
200
250
Gx =
50
50
||
150
150
200
200
Ix-1 - 2.Ix + Ix+1
100
100
||
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Segmentation - Approche par frontières
250
250
Yves Usson 1999
Université Joseph Fourier
Seuil de
détection
0
0
50
100
150
200
250
50
100
Image filtrée : image des gradients
150
200
Seuillage des niveaux
de gris
250
Masque binaire
Yves Usson 1999
Squelette binaire
Calcul du squelette
du masque binaire
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Segmentation - Approche par frontières
Yves Usson 1999
Les pixels de l’objet au contact du
fond deviennent des pixels du fond
Les pixels du fond au contact de
l’objet deviennent des pixels objets
Université Joseph Fourier
EROSION
DILATATION
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Filtrage morphologique
Université Joseph Fourier
Erosions
Erosions
Dilatations
Opération d’ouverture
Dilatations
Opération de fermeture
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Filtrage de forme
Yves Usson 1999
Ensembles séparés
Université Joseph Fourier
Image binaire
Chemin connexe
Chemin non-connexe
1
1 1
1 1
1
2
2 2
2 2
2
3
3 3
3 3 3
3 3 3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2 2
2 2
2
Image des étiquettes
3 3 3 3
3 3
3
3 3
3 3 3
3 3 3
1
1 1
1 1
1
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Etiquetage en composantes connexes
Yves Usson 1999
Université Joseph Fourier
7 ensembles de composantes
connexes
Connexité 4 voisins
voisins latéraux
Masque à étiqueter
Yves Usson 1999
4 ensembles de composantes
connexes
Connexité 8 voisins
voisins latéraux & diagonaux
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Etiquetage - Règles de connexité
Université Joseph Fourier
- Enveloppe convexe
- Orientation
- Grand et petit axe
Yves Usson 1999
- Energie de courbure
- Centre de gravité (analyse de position,
anisotropie, cartographie cellulaire)
- Facteur de forme
- Périmètre (nombre de pixels)
(automate
cellulaire)
extraction de
bord
Profil binaire
- Surface (nombre de pixels)
Masque binaire
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Paramètres morphométriques
Cuvette de référence
Blanc (solvant)
Iref
Isol
Cuvette contenant la solution à
concentration donnée
log
Opérateurs
électroniques cablés
Div
Yves Usson 1999
log Iref
Isol
Densité optique
DO = densité optique
C = concentration
k = constante de proportionnalité
Loi de Beer & Lambert
DO = k C
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Lumière transmise - Densitométrie
Université Joseph Fourier
Source lumineuse λ donnée
Université Joseph Fourier
Image du champ vide
Io
I
Image d’intensité
Op
DO
Opérateur numérique logiciel:
DO = Log (Io ) - Log (I)
Op
Op
Image des densités optiques
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Lumière transmise - Densitométrie
Yves Usson 1999
Université Joseph Fourier
Objectif
Source de
lumière Laser
Miroir dichroïque
Filtre confocal
Photo-détecteur
Yves Usson 1999
Obtention directe de coupes optiques sans
information parasite des plans voisins
Plan focal
Plan image
Image reconstruite point par point
par balayage laser
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Microscope confocal à balayage laser
facette commune
Université Joseph Fourier
voxel
Z
X
Y
Volume numérique
arête commune
Yves Usson 1999
sommet commun
Connexité (voisinage) dans un volume numérique
Pile de sections numérisées
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Description des données 3D
Université Joseph Fourier
Déformations dues aux différences d'indice de réfraction
Bruits photonique et électronique
Atténuation du signal lumineux par l'optique du microscope
Absorption de la lumière par le specimen
Photodégradation des fluorochromes
Yves Usson 1999
Profondeur d'observation limitée par les propriétés des objectifs
Modes de microscopie limités
Limites des méthodes d'acquisition en microscopie confocale
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Axe optique (50µm)
Vue latérale après compensation par une
fonction log-logistique (Rigaut et al., 1991)
Vue latérale brute (noyaux de cellules myocardiques)
40
60
80
60
80
100
Yves Usson 1999
Numéro de section
2,0
0
5,0
3,0
40
100
20
20
Numéro de section
20
4,0
0
0
40
60
0
20
40
60
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Absorption de la lumière par le specimen
Université Joseph Fourier
Axe optique (50µm)
Intensité moyenne
Intensité moyenne
Les molécules de fluorochrome
situées dans le double cône de
lumière sont altérées
Photodégradation
d'une préparation homogène
Université Joseph Fourier
Axe optique
0
50
100
150
200
250
0
2
4
10
12
Temps en min.
8
14
Yves Usson 1999
16
Gel de F.I.T.C.
Photodégradation en fonction
du temps d'exposition
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Photodégradation de la fluorescence
Intensité de fluorescence
Université Joseph Fourier
ôxy = h ⊗ ixy
-1
xy
Source ponctuelle
oxy
rayons diffractés
Restauration par déconvolution
hxy
Convolution par un filtre passe-bas
Plan image
Yves Usson 1999
Disque de Airy
ixy = hxy ⊗ oxy
ixy
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Formation de l’image par une lentille
Université Joseph Fourier
2
1
2
1
Sections XY
Données restaurées
Sections XZ
Données brutes
Yves Usson 1999
Reconstructions
Spermatozoïde démembrané de Xenopus laevis incubé dans un extrait d'oeuf
Etude de la cinétique de recondensation chromosomique (1h30)
Marquage YOYO (de la Barre & Dimitrov)
Microscopie quantitative - Analyse d’images
Restauration de la résolution par déconvolution