Bactériophage Lambda

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BACTERIOPHAGE LAMBDA
PROPRIETES
De la même façon que n’importe quel virus, ce phage est incapable de se répliquer en dehors d’une cellule hôte :
c’est un parasite obligatoire qui utilise certaines des protéines de son hôte pour se répliquer.
SENSIBILITE ET PERMISSIVITE
Tous les virus possèdent une spécificité d’hôte, ils n’infectent pas n’importe quelle bactérie. En effet, ils infectent les
bactéries dites sensibles.
- Sensible : se dit lorsque l’infection peut physiquement avoir lieu, et que le génome viral peut pénétrer au
sein de la cellule hôte. Ce processus nécessitant une reconnaissance cellule/virus, les hôtes sensibles
possèdent obligatoirement un récepteur spécifique au parasite. Dans le cas d’E. coli par exemple, le
récepteur du phage lambda n’est rien d’autre qu’une protéine de transport du maltose. Mais attention, un
récepteur n’est pas spécifique à un phage.
- Permissive : se dit lorsque la cellule permet la réplication du virus.
- Certaines bactéries sont sensibles mais non permissives. Ceci est du à la synthèse d’un répresseur par le
génome du phage. Inversement, il existe à l’état naturel des cellules non sensibles mais permissives. Il sera
alors possible d’y faire entrer de manière artificielle un virus, lequel s’y répliquera.
Les bactéries lysogènes sont immunes envers toute nouvelle infection d’un phage de même type. Les phages
pourront intégrer la bactérie mais ne pourra pas réaliser son cycle.
Cette immunité est-elle liée au fait que la bactérie soit insensible ou non permissive ?
Pour le savoir, il suffit de générer des phages dont l’ADN est radioactif que l’on met en présence de bactéries. Après
centrifugation, deux phénomènes peuvent être observés :
- On retrouve de la radioactivité dans le culot : le phage a pu pénétrer dans la bactérie, elle est donc non
permissive
- Il n’y a pas de radioactivité dans le culot : la bactérie est insensible, il n’y a pas synthèse du récepteur
nécessaire à la reconnaissance
LYSE OU LYSOGENIE
Lyse: Transmission horizontale. A la suite de l’infection, les processus cellulaires sont bloqués, la machinerie
protéique est utilisée à des fins de réplication, et la centaine de virus néosynthétisés sont relargués en entraînant la
mort de l’hôte. Il est commun à tous les virus.
Lysogénie: Transmission verticale. Après infection l’ADN du phage s’intègre dans le génome bactérien et demeure
silencieux.
– Pas de production de phage
– Pas de lyse bactérienne
– MAIS la lyse peut se produire plus tard, dans chaque descendant
Cette dernière stratégie peut s’expliquer de manière simple : un apport réduit en nutriments induit non seulement
une disponibilité en énergie et en molécules de base insuffisante en vue de la réplication virale, mais empêche aussi
le développement d’une population importante de cellules-hôte. Un cycle lytique, tuant le faible de nombre d’hôtes
déjà présents, serait ainsi peu avantageux. Elle ne se passe donc que dans 10% des cas.
Chez des virus tempérés (capables de faire les deux types de cycles), la répartition entre lyse et lysogénie pourra
donc varier en fonction d’un certain nombre de paramètres relatifs à l’environnement.

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BACTERIES LYSOGENES
• Le génome du phage intégré est appelé prophage.
• Une bactérie contenant un prophage est une bactérie lysogène.
INDUCTION DE BACTERIES LYSOGENES
On appelle Induction de la lysogénie le phénomène qui conduit à
l’excision du prophage, la réplication de l’ADN du phage, et la lyse
de la bactérie hôte.
Expérience permettant de visualiser la différence entre un phage
lytique et un phage tempéré
Une bactérie lysogène peut entrer de nouveau dans un cycle
lytique :
- De façon spontanée : 1/1000 bactéries
- Par un traitement aux UVs qui induit une lyse massive : le
prophage sort du génome et entraine sa réplication.
COMMENT GENERER DES MUTANTS?
Rappel : les mutations apparaissent lors de la réplication à cause des polymérases et d’une mauvaise relecture
- Infection de bactéries sensibles et permissives par un phage WT
- Agents mutagènes  lyse
- Récupération des phages produits
- Test individuel du phénotype de chaque phage produit (travail sur dilution limite pour être sûr de n’avoir
qu’un phage par bactérie.)
COMMENT SAVOIR COMBIEN DE GENES DIFFERENTS SONT IMPLIQUES DANS LA LYSOGENIE?
Il faut tout d’abord pouvoir isoler les mutants de la lysogénie sans devoir séquencer tous les génomes : technique
des plages de lyse.
Principe : étalement sur boite de bactéries ne contenant qu’un seul phage
- 10% de ces bactéries entreront en lysogénie et ne se lyseront pas : pas de formation de plage de lyse
- 90% vont se lyser et libérer des phages qui vont attaquer les bactéries environnantes qui elles-même
deviendront lytiques ou lysogènes : formation de plages de lyse troubles
- Si les phages sont des mutants de la lysogénie, ils ne seront pas capables de former des bactéries lysogènes :
il y aura donc 100% de plages claires.
DOMINANCE/RECESSIVITE
• Co-infection de bactéries (Sensibles et Permissives) avec un phage WT et un phage mutant à haute M.O.I.
(multiplicité d’infection)
• Elimination de l’excès de phage par centrifugation
• Mélange des bactéries infectées avec des bactéries non infectées ( bactéries indicatrices) dans de la gélose
• Etalement sur boite
• On observe deux types de résultats :
 Plages claires : les bactéries pratiquent uniquement la lyse, ce sont des mutants dominants.
 Plages troubles (contenant des petites colonies de bactéries immunes) :
o On retrouve dans toutes les bactéries lysogènes un génome WT. Les phénotypes ne s’entravent pas
mutuellement : on parle de cisdominance (le mutant ne gène pas le sauvage mais ce dernier ne
l’aide pas à pratiquer la lyse).
o On retrouve dans les bactéries lysogènes un génome WT ou mutant : c’est un mutant récessif.

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CIS-DOMINANCE/RECESSIVITE?
Le sauvage aide le mutant récessif à s’intégrer au génome bactérien. Le cis-dominant pourra également s’intégrer,
mais à la prochaine multiplication, il reprendra son cycle lytique et induira donc une plage claire.
Il faut récupérer les prophages :
– Repiquer les bactéries lysogènes des plages troubles
– Induire la lyse de ces bactéries par traitement aux UVs
– Diluer les phages produits, infection à faible MOI
– Tester individuellement leur phénotype
• 50% troubles, 50% claires : le mutant est récessif
• 100% troubles : le mutant est cis dominant
COMMENT GENERER DES MUTANTS THERMOSENSIBLES?
Les mutants thermosensibles sont des mutants qui se comportent comme des WT à température permissive (mais
attention, la mutation ne disparait pas, mais elle n’a pas d’effet à cette température) et comme des mutants à
température restrictive. Ils contiennent donc une mutation dans l’ORF, ce qui induit la formation d’une protéine
mutée. Ces mutants nous permettent de distinguer les mutants de la lyse (qui ne peuvent pas former de plages) des
bactéries lysogènes.
- Infection de bactéries sensibles et permissives par un phage WT
- Agents mutagènes
- Récupération des phages produits (répliques des plages de lyse sur de nouvelles boîtes)
- Test individuel du phénotype de chaque phage produit à température permissive (basse) et à température
restrictive (forte) : obtention de plages claires ou aucune plage
COMMENT DISTINGUER LES FONCTIONS D ’ETABLISSEMENT ET DE MAINTIEN DE LA LYSOGENIE?
On observe 4 mutants thermosensibles différents sont obtenus : CI, CII, CIII, Cint (car 4 groupes de
complémentation)
- Infection par des mutants thermosensibles de la lysogénie à température permissive, les seules bactéries qui
vont pousser seront lysogènes.
- Transfert à température restrictive
- Test individuel du phénotype de chaque mutant produit. Plusieurs comportements sont observables :
 Il ne se passe aucun changement : les protéines mutées sont responsables de l’établissement de la
lysogénie
 La lyse se produit malgré l’immunité des bactéries : les protéines mutées sont responsables du maintien.
 CI est responsable du maintien de la lysogénie
 CII, CIII et Cint sont impliqués dans l’établissement de la lysogénie.
GENETIQUE DU PHAGE LAMBDA
REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU GENOME DE LAMBDA

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- CII et CIII contrôlent la lysogénie
- CI est un répresseur
- Q permet le contrôle tardif de la lyse (active l’expression des gènes de lyse)
- N est un anti-terminateur. Cette protéine permet de passer au-delà du signal de terminaison et de rallonger
les transcrits formés lors de la phase immédiate précoce (juste après l’infection) et permet donc la formation
d’ARNs polycistroniques (plusieurs ORF).
- Cro inhibe la synthèse de CI
- Le promoteur PR est un promoteur constitutif
- OR1, 2 et 3 sont des régions répétées inversées (opérateurs) : sites de liaison des protéines à l’ADN
Les phases immédiate précoce (2-3min) et précoce (10min) sont communes à la lyse et à la lysogénie. Le choix d’un
cycle par rapport à l’autre se fait en fonction du nombre de protéine CII-CIII et Cro.
Pendant la phase tardive, Cro exerce une régulation sur son propre promoteur afin d’inhiber sa synthèse. Ce
processus est irréversible et lorsqu’il se produit, la lyse est lancée. Même l’expression tardive de CI ne suffirait pas à
arrêter le cycle en marche.
CI peut agir selon deux modes :
- Par une relation protéine-protéine
- Peut se fixer sur l’ADN, empêchant ainsi l’ARN polymérase de se fixer.
Afin de déterminer quel est réellement son type d’action, plusieurs expériences sont nécessaires.
POUR SAVOIR SI CI A DE L’AFFINITE POUR L’ADN
Utilisation du peu d’affinité de l’ADN double brin pour la membrane de nitrocellulose (ou de nylon). En effet, l’ADN
double brin seul, va traverser la membrane et en ressortir. Mais lorsqu’il est en interaction avec une protéine, cette
dernière va être retenue par la membrane, avec le morceau d’ADN sur lequel elle est fixée.
On met donc CI en présence de l’ADN du phage lambda marqué radioactivement. La protéine s’est fixée sur l’ADN et
le complexe sera retenu par la membrane.
OU SE FIXE CI ?
On suppose que CI empêche la synthèse de Cro, la région cible de fixation de CI sera donc les opérateurs OR1,2,3.
Pour cela, on effectue un retard sur gel : comparaison de la migration de l’ADN libre avec l’ADN mis en présence de
CI. La protéine retarde la migration de l’ADN. Il est également possible de faire un super retard sur gel en utilisant
des anticorps dirigés contre les protéines fixées à l’ADN.
Cette technique nous permet de connaitre la position mais pas précisément.
Pour savoir plus précisément, on effectue un foot print (emprunte à la DNAse) : les fragments d’ADN sont marqués
radioactivement à une seule extrémité 5’. Digestion ménagée à la DNAse qui va couper l’ADN après chaque
nucléotide, faisant apparaitre des brins de différentes tailles. Là où les protéines se sont fixées, elles vont empêcher
l’action de la DNAse. Ces fragments n’apparaitront pas lors de la révélation.
/!\ Tous les nucléotides de région protégée n’interagissent pas forcément avec la protéine.
Afin de connaitre la séquence nucléotidique, on effectue un phage display.
Fabrication d’un phage recombinant qui exprime la protéine d’intérêt à sa surface (protéine fusion entre PIII et notre
protéine).
On piège de nombreuses séquences courtes d’ADN connues (6 ou 7nt générées de façon aléatoire) dans une boite.
On injecte ensuite les phages dans chaque puits et on regarde où le phage se fixe (grâce à sa protéine de surface).
On compare ensuite avec les séquences de l’ADN afin de trouver les séquences consensus (qui peuvent
potentiellement se lier à la protéine).
A l’aide de ces expériences on a pu identifier les séquences 0R1,2,3 comme le site potentiel de fixation de CI.
On aurait également pu faire une immunoprécipitation de chromatine mais cette technique est moins précise.

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LE REPRESSEUR CI
STRUCTURE DU REPRESSEUR CI
2 domaines globulaires et une jonction (connecteur). Le domaine
Cterm a une région d’interaction prot/prot et le domaine Nterm
possède une helix turn helix pour la liaison à la double hélice
d’ADN.
La protéine fonctionne en dimère :
- deux protéines se collent l’une à l’autre grâce à leur
domaine Cterm.
- La fixation à l’ADN ne se fait que sous forme de dimère
grâce à leur partie Nterm
ETUDE DE LA REGULATION DE CI UTILISATION DE LACZ COMME GENE RAPPORTEUR
Le promoteur de l’opéron lactose est un promoteur inductible, il ne fonctionne qu’en présence d’inducteur.
L’inducteur naturel est le lactose, mais il est également substrat, on utilise donc l’IPTG qui est un inducteur gratuit.
Avec coopération sans coopération
Grâce à ces courbes, on conclut que CI réprime les promoteurs PR et PL (2 promoteurs constitutifs)
1 : ajout d’IPTG  synthèse de CI temps de latence pour la formation de dimères. CI
active le promoteur PRM
2 : plateau = vitesse maximale de fonctionnement de l’ARN polymérase
3 : [CI] trop grande  inactivation de PRM car CI se fixe aussi sur OR3
La présence de CII permet à la RNA Pol de reconnaître les promoteurs (séquences -35
« absentes »)
Des expériences de footprint ont révélé que :
[CI] faible : fixation sur OR1 et OR2
[CI] fort : fixation sur OR1, OR2 et OR3
Normalement ORI est vide donc l’ARN polymérase peut se fixer et quand ORI et
ORII sont occupé donc l’ARN polymérase ne peut plus se fixer.
CI bloque la transcription à partir de pR et l’active à partir de pRM.