Bactériophage Lambda
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BACTERIOPHAGE LAMBDA PROPRIETES De la même façon que n’importe quel virus, ce phage est incapable de se répliquer en dehors d’une cellule hôte : c’est un parasite obligatoire qui utilise certaines des protéines de son hôte pour se répliquer. SENSIBILITE ET PERMISSIVITE Tous les virus possèdent une spécificité d’hôte, ils n’infectent pas n’importe quelle bactérie. En effet, ils infectent les bactéries dites sensibles. - Sensible : se dit lorsque l’infection peut physiquement avoir lieu, et que le génome viral peut pénétrer au sein de la cellule hôte. Ce processus nécessitant une reconnaissance cellule/virus, les hôtes sensibles possèdent obligatoirement un récepteur spécifique au parasite. Dans le cas d’E. coli par exemple, le récepteur du phage lambda n’est rien d’autre qu’une protéine de transport du maltose. Mais attention, un récepteur n’est pas spécifique à un phage. - Permissive : se dit lorsque la cellule permet la réplication du virus. - Certaines bactéries sont sensibles mais non permissives. Ceci est du à la synthèse d’un répresseur par le génome du phage. Inversement, il existe à l’état naturel des cellules non sensibles mais permissives. Il sera alors possible d’y faire entrer de manière artificielle un virus, lequel s’y répliquera. Les bactéries lysogènes sont immunes envers toute nouvelle infection d’un phage de même type. Les phages pourront intégrer la bactérie mais ne pourra pas réaliser son cycle. Cette immunité est-elle liée au fait que la bactérie soit insensible ou non permissive ? Pour le savoir, il suffit de générer des phages dont l’ADN est radioactif que l’on met en présence de bactéries. Après centrifugation, deux phénomènes peuvent être observés : - On retrouve de la radioactivité dans le culot : le phage a pu pénétrer dans la bactérie, elle est donc non permissive - Il n’y a pas de radioactivité dans le culot : la bactérie est insensible, il n’y a pas synthèse du récepteur nécessaire à la reconnaissance LYSE OU LYSOGENIE Lyse: Transmission horizontale. A la suite de l’infection, les processus cellulaires sont bloqués, la machinerie protéique est utilisée à des fins de réplication, et la centaine de virus néosynthétisés sont relargués en entraînant la mort de l’hôte. Il est commun à tous les virus. Lysogénie: Transmission verticale. Après infection l’ADN du phage s’intègre dans le génome bactérien et demeure silencieux. – Pas de production de phage – Pas de lyse bactérienne – MAIS la lyse peut se produire plus tard, dans chaque descendant Cette dernière stratégie peut s’expliquer de manière simple : un apport réduit en nutriments induit non seulement une disponibilité en énergie et en molécules de base insuffisante en vue de la réplication virale, mais empêche aussi le développement d’une population importante de cellules-hôte. Un cycle lytique, tuant le faible de nombre d’hôtes déjà présents, serait ainsi peu avantageux. Elle ne se passe donc que dans 10% des cas. Chez des virus tempérés (capables de faire les deux types de cycles), la répartition entre lyse et lysogénie pourra donc varier en fonction d’un certain nombre de paramètres relatifs à l’environnement. Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 1 BACTERIES LYSOGENES • • Le génome du phage intégré est appelé prophage. Une bactérie contenant un prophage est une bactérie lysogène. INDUCTION DE BACTERIES LYSOGENES On appelle Induction de la lysogénie le phénomène qui conduit à l’excision du prophage, la réplication de l’ADN du phage, et la lyse de la bactérie hôte. Expérience permettant de visualiser la différence entre un phage lytique et un phage tempéré Une bactérie lysogène peut entrer de nouveau dans un cycle lytique : - De façon spontanée : 1/1000 bactéries - Par un traitement aux UVs qui induit une lyse massive : le prophage sort du génome et entraine sa réplication. COMMENT GENERER DES MUTANTS? Rappel : les mutations apparaissent lors de la réplication à cause des polymérases et d’une mauvaise relecture - Infection de bactéries sensibles et permissives par un phage WT Agents mutagènes lyse Récupération des phages produits Test individuel du phénotype de chaque phage produit (travail sur dilution limite pour être sûr de n’avoir qu’un phage par bactérie.) COMMENT SAVOIR COMBIEN DE GENES DIFFERENTS SONT IMPLIQUES DANS LA LYSOGENIE? Il faut tout d’abord pouvoir isoler les mutants de la lysogénie sans devoir séquencer tous les génomes : technique des plages de lyse. Principe : étalement sur boite de bactéries ne contenant qu’un seul phage - 10% de ces bactéries entreront en lysogénie et ne se lyseront pas : pas de formation de plage de lyse - 90% vont se lyser et libérer des phages qui vont attaquer les bactéries environnantes qui elles-même deviendront lytiques ou lysogènes : formation de plages de lyse troubles - Si les phages sont des mutants de la lysogénie, ils ne seront pas capables de former des bactéries lysogènes : il y aura donc 100% de plages claires. DOMINANCE/RECESSIVITE • • • • • Co-infection de bactéries (Sensibles et Permissives) avec un phage WT et un phage mutant à haute M.O.I. (multiplicité d’infection) Elimination de l’excès de phage par centrifugation Mélange des bactéries infectées avec des bactéries non infectées ( bactéries indicatrices) dans de la gélose Etalement sur boite On observe deux types de résultats : Plages claires : les bactéries pratiquent uniquement la lyse, ce sont des mutants dominants. Plages troubles (contenant des petites colonies de bactéries immunes) : o On retrouve dans toutes les bactéries lysogènes un génome WT. Les phénotypes ne s’entravent pas mutuellement : on parle de cisdominance (le mutant ne gène pas le sauvage mais ce dernier ne l’aide pas à pratiquer la lyse). o On retrouve dans les bactéries lysogènes un génome WT ou mutant : c’est un mutant récessif. Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 2 CIS-DOMINANCE/RECESSIVITE? Le sauvage aide le mutant récessif à s’intégrer au génome bactérien. Le cis-dominant pourra également s’intégrer, mais à la prochaine multiplication, il reprendra son cycle lytique et induira donc une plage claire. Il faut récupérer les prophages : – Repiquer les bactéries lysogènes des plages troubles – Induire la lyse de ces bactéries par traitement aux UVs – Diluer les phages produits, infection à faible MOI – Tester individuellement leur phénotype • 50% troubles, 50% claires : le mutant est récessif • 100% troubles : le mutant est cis dominant COMMENT GENERER DES MUTANTS THERMOSENSIBLES? Les mutants thermosensibles sont des mutants qui se comportent comme des WT à température permissive (mais attention, la mutation ne disparait pas, mais elle n’a pas d’effet à cette température) et comme des mutants à température restrictive. Ils contiennent donc une mutation dans l’ORF, ce qui induit la formation d’une protéine mutée. Ces mutants nous permettent de distinguer les mutants de la lyse (qui ne peuvent pas former de plages) des bactéries lysogènes. - Infection de bactéries sensibles et permissives par un phage WT - Agents mutagènes - Récupération des phages produits (répliques des plages de lyse sur de nouvelles boîtes) - Test individuel du phénotype de chaque phage produit à température permissive (basse) et à température restrictive (forte) : obtention de plages claires ou aucune plage COMMENT DISTINGUER LES FONCTIONS D ’ETABLISSEMENT ET DE MAINTIEN DE LA LYSOGENIE? On observe 4 mutants thermosensibles différents sont obtenus : CI, CII, CIII, Cint (car 4 groupes de complémentation) - Infection par des mutants thermosensibles de la lysogénie à température permissive, les seules bactéries qui vont pousser seront lysogènes. - Transfert à température restrictive - Test individuel du phénotype de chaque mutant produit. Plusieurs comportements sont observables : Il ne se passe aucun changement : les protéines mutées sont responsables de l’établissement de la lysogénie La lyse se produit malgré l’immunité des bactéries : les protéines mutées sont responsables du maintien. CI est responsable du maintien de la lysogénie CII, CIII et Cint sont impliqués dans l’établissement de la lysogénie. GENETIQUE DU PHAGE LAMBDA REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU GENOME DE LAMBDA Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 3 - - CII et CIII contrôlent la lysogénie CI est un répresseur Q permet le contrôle tardif de la lyse (active l’expression des gènes de lyse) N est un anti-terminateur. Cette protéine permet de passer au-delà du signal de terminaison et de rallonger les transcrits formés lors de la phase immédiate précoce (juste après l’infection) et permet donc la formation d’ARNs polycistroniques (plusieurs ORF). Cro inhibe la synthèse de CI Le promoteur PR est un promoteur constitutif OR1, 2 et 3 sont des régions répétées inversées (opérateurs) : sites de liaison des protéines à l’ADN Les phases immédiate précoce (2-3min) et précoce (10min) sont communes à la lyse et à la lysogénie. Le choix d’un cycle par rapport à l’autre se fait en fonction du nombre de protéine CII-CIII et Cro. Pendant la phase tardive, Cro exerce une régulation sur son propre promoteur afin d’inhiber sa synthèse. Ce processus est irréversible et lorsqu’il se produit, la lyse est lancée. Même l’expression tardive de CI ne suffirait pas à arrêter le cycle en marche. CI peut agir selon deux modes : - Par une relation protéine-protéine - Peut se fixer sur l’ADN, empêchant ainsi l’ARN polymérase de se fixer. Afin de déterminer quel est réellement son type d’action, plusieurs expériences sont nécessaires. POUR SAVOIR SI CI A DE L’AFFINITE POUR L’ADN Utilisation du peu d’affinité de l’ADN double brin pour la membrane de nitrocellulose (ou de nylon). En effet, l’ADN double brin seul, va traverser la membrane et en ressortir. Mais lorsqu’il est en interaction avec une protéine, cette dernière va être retenue par la membrane, avec le morceau d’ADN sur lequel elle est fixée. On met donc CI en présence de l’ADN du phage lambda marqué radioactivement. La protéine s’est fixée sur l’ADN et le complexe sera retenu par la membrane. OU SE FIXE CI ? On suppose que CI empêche la synthèse de Cro, la région cible de fixation de CI sera donc les opérateurs OR1,2,3. Pour cela, on effectue un retard sur gel : comparaison de la migration de l’ADN libre avec l’ADN mis en présence de CI. La protéine retarde la migration de l’ADN. Il est également possible de faire un super retard sur gel en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines fixées à l’ADN. Cette technique nous permet de connaitre la position mais pas précisément. Pour savoir plus précisément, on effectue un foot print (emprunte à la DNAse) : les fragments d’ADN sont marqués radioactivement à une seule extrémité 5’. Digestion ménagée à la DNAse qui va couper l’ADN après chaque nucléotide, faisant apparaitre des brins de différentes tailles. Là où les protéines se sont fixées, elles vont empêcher l’action de la DNAse. Ces fragments n’apparaitront pas lors de la révélation. /!\ Tous les nucléotides de région protégée n’interagissent pas forcément avec la protéine. Afin de connaitre la séquence nucléotidique, on effectue un phage display. Fabrication d’un phage recombinant qui exprime la protéine d’intérêt à sa surface (protéine fusion entre PIII et notre protéine). On piège de nombreuses séquences courtes d’ADN connues (6 ou 7nt générées de façon aléatoire) dans une boite. On injecte ensuite les phages dans chaque puits et on regarde où le phage se fixe (grâce à sa protéine de surface). On compare ensuite avec les séquences de l’ADN afin de trouver les séquences consensus (qui peuvent potentiellement se lier à la protéine). A l’aide de ces expériences on a pu identifier les séquences 0R1,2,3 comme le site potentiel de fixation de CI. On aurait également pu faire une immunoprécipitation de chromatine mais cette technique est moins précise. Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 4 LE REPRESSEUR CI STRUCTURE DU REPRESSEUR CI 2 domaines globulaires et une jonction (connecteur). Le domaine Cterm a une région d’interaction prot/prot et le domaine Nterm possède une helix turn helix pour la liaison à la double hélice d’ADN. La protéine fonctionne en dimère : - deux protéines se collent l’une à l’autre grâce à leur domaine Cterm. - La fixation à l’ADN ne se fait que sous forme de dimère grâce à leur partie Nterm ETUDE DE LA REGULATION DE CI UTILISATION DE LACZ COMME GENE RAPPORTEUR Le promoteur de l’opéron lactose est un promoteur inductible, il ne fonctionne qu’en présence d’inducteur. L’inducteur naturel est le lactose, mais il est également substrat, on utilise donc l’IPTG qui est un inducteur gratuit. Avec coopération sans coopération Grâce à ces courbes, on conclut que CI réprime les promoteurs PR et PL (2 promoteurs constitutifs) 1 : ajout d’IPTG synthèse de CI temps de latence pour la formation de dimères. CI active le promoteur PRM 2 : plateau = vitesse maximale de fonctionnement de l’ARN polymérase 3 : [CI] trop grande inactivation de PRM car CI se fixe aussi sur OR3 La présence de CII permet à la RNA Pol de reconnaître les promoteurs (séquences -35 « absentes ») Des expériences de footprint ont révélé que : [CI] faible : fixation sur OR1 et OR2 [CI] fort : fixation sur OR1, OR2 et OR3 Normalement ORI est vide donc l’ARN polymérase peut se fixer et quand ORI et ORII sont occupé donc l’ARN polymérase ne peut plus se fixer. CI bloque la transcription à partir de pR et l’active à partir de pRM. Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 5 QUELLE EST LA QUANTITE DE CI DANS UNE BACTERIE LYSOGENE ? [CI] oscille entre les valeurs pour laquelle Prm est bloqué et est libéré. L’horloge moléculaire permet de régulé la synthèse de CI Si on mute ORI, CI ne pourra pas se fixer donc il va se fixer sur ORII et ORIII donc Prm ne pourra pas être activé. L’activation de Prm existe parce qu’il y a une activation physique entre l’ARN polymérase et CI ROLE DE CRO SUR CES REGIONS ? Cro : - est un répresseur de Prm à faible concentration. - n’a pas d’effet sur Pr à faible concentration. - est un répresseur de Pr à forte concentration. - est un activateur de Pr’ à forte concentration. S’il on met ces 2 plasmides dans une bactérie on obtient ce graphique : Pr’ est constitutif donc la concentration de βgal n’est jamais égale à zéro. Et d’après ce graphique on voit que Cro est un activateur de Pr’. S’il on met ces 2 plasmides dans une bactérie on obtient ce graphique : Il y a un effet sur Pr. S’il on met ces 3 plasmides dans une bactérie on obtient ce graphique : Au début de l’expérience on se place à température restrictive avec un mutant Cro termosensible donc cela inhibe sont action (mais il est toujours présent) : activation de PRM. Diminution de la température (permissive), Cro redevient alors fonctionnel. Lorsqu’on se place à température permissive on n’augmente plus la concentration en IPTG. Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 6 [Cro] faible : fixation sur OR3 [Cro] moyen : fixation sur OR2 et OR3 [Cro] fort : fixation sur OR1, OR2 et OR3 Donc Cro se fixe sur OR3 puis sur OR2 et OR1, à l’inverse de CI Cro ne peut inhiber Prm qu’en se fixant sur OR3. Donc Cro se fixe sur OR3 puis sur OR2 et OR1, à l’inverse de CI N et Cro sont synthétisés en premier puis CII et CIII. Mais pour que CI active sa propre synthèse il faut qu’il soit quand même un peu synthétisé or Cro agit en premier sur PRM qui inhibe la synthèse de CI. Mais est-ce que CII et CIII peuvent contrer Cro ? Sont-ils des DNA binding ? CIII n’est pas une DNA binding et CII est une DNA binding mais pas dans la région Pr-Prm il se fixe sur Pint, Pre et PaQ anti sens de Q), qui sont des promoteurs cryptiques. Il est essentiel de trouver une séquence TTGC------TTGC car CII se fixe sur ces sites et va permettre d’attiré l’ADN polymérase pour commencé la transcription malgré l’absence de promoteur classique (-35 …) LE ROLE DE CII Pour basculer dans la lysogénie CII est cruciale. CII entre en compétition avec Cro, PRE est activé donc va activer la synthèse de CI même si PRM est bloqué. Plus il y a de CII, plus la rNA polymérase est bloquée sur Pre, plus la concentration de CI va augmenter et la concentration de Cro diminuer. D’où l’importance de la concentration de CII à un temps donné. Si CII échoue, il va y avoir lyse. Si CII permet la synthèse de CI, il va y avoir lysogénie. Pour que CI se fixe sur Prm il faut qu’il n’y ait pas de Cro. Et pour qu’il n’y ait pas de Cro, il faut que Pre soit assez fort pour faire un transcrit (clone CI) /!\ Quand PR est bloqué, CII n’est pas exprimée mais il ne faut pas beaucoup de CII car seules quelques molécules de CI sont nécessaires pour entrer en lysogénie. Parallèlement, CII bloque PaQ et active Int pour qu’il n’y est pas de lysogénie abortive. LES FONCTIONS DE CIII • • Dans les mutants CIII-, la quantité de protéine CII est indétectable (Expérience?) CIII active synthèse de CII CIII stabilise messager CII CIII stabilise la protéine CII Dans les mutants CIII-, la quantité de messagers codant pour CII est correcte mais la protéine est indétectable (Expérience?) CIII n’est pas une protéine DNA binding. En absence de CIII pas de synthèse de CII (pas d’ARN mess, ou instable, pas de protéine ou rapidement dégradée). Pour avoir CII il faut rallonger l’ARN cro grâce à N et CIII ne se fixe pas à l’ADN, première hypothèse fausse. Il faut quantifier les ARN, quantité correcte même sans CIII, deuxième hypothèse invalidée. CIII protège CII ou une protéine cellulaire dégrade CII et donc CIII agit sur cette protéine : effet direct ou indirect. Si cette protéine existe, on devrait être capable de trouver un mutant bactérien dans laquelle la protéase de marche pas, un mutant CIII- plages troubles Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 7 Mise en évidence de mutants bactériens dans lesquels CIII- se comportent, comme un WT: mutants Hfl (= haute fréquence de lysogénie, mutation sur gène Hfl qui code pour la protéase). Si on les infecte par un phage WT on a beaucoup plus de lysogénie (30% de lysogénie car CII s’accumule et n’est pas dégradé) CIII, inhibe une protéase (Hfl) dont CII est la cible. Mais est-ce que Hfl est une protéine site spécifique ou si elle coupe à n’importe quel endroit de la protéine. Il peut exister des mutants de CII résistants à la protéase, mais on n’en trouve pas et lorsque l’on met les deux protéines en présence, Hfl dégrade en petits morceaux CII : elle n’est pas site spécifique. Switch = choix entre lyse ou lysogénie La seule protéine que l’on retrouve chez une protéine immune : CI, ∆G très bas car cette synthèse est régulée par la propre concentration de CI. N est autorégulé par feed back negative (+ il y a de N, plus Il y a rallongement, moins il y a de polymérases disponibles pour la synthèse de N) Cro réprime pL and pR. Cro est autorégulé par feed back négatif. Phase précoce commune aux deux cycles. Lyse : Quand [cro ] atteint un seuil, Q est activé par Cro car il est sous le contrôle de pR’. Son rôle d’antiterminateur permet l’expression des gènes Tardifs et donc des genes lytiques. Lysogénie: • CIII stabilise CII en inhibant la protéase Hfl. • CII active la synthèse de l’integrase • CII active la synthèse de CI • CII réprime la synthèse de Q, car il active le promoteur antisens de Q • CI reprime pL et pR • CI s’autoregule via pRM. • • Phénomènes communs – PR, PL, PR’ actifs : synthèse de N, Cro – antitermination par N : synthèse cIII, cII, Q Lyse: – basse [Cro] : liaison OR3, PRM OFF – haute [Cro] : PR and PL OFF – antitermination par Q + activation de PR’ par Cro Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 8 • Lysogénie: – cII stimule l’expression à partir de PRE (cI repressor) et de PINT (integrase) et réprime l’expression de Q – cIII stabilise cII – cI éteint PR, PL, PR’ (no lytic functions) et stimule PRM INTEGRATION-EXCISION • • Il faut que le génome se circularise INT majoritaire via Pint sous contrôle de CII. Pour qu’il n’y ait qu’une seule recombinaison avec un seule CO. Lorsque le génome intégré: les protéines INT et XIS à concentrations égales sous contrôle de PL La synthèse de Int est supérieure lorsque l’ADN est circulaire car cette synthèse devient sous le contrôle de deux promoteurs (Pint et PL) Mais pour intégrer le génome de lambda dans le génome bactérien, il faut que la [inT]>>[xis] Pour l’excision [int]=[xis] INTEGRATION L’intégration est site spécifique grâce à AttP et AttB. Phénomène réversible qui se fait grâce à une intégrase et pour ressortir il faut Int et Xis. Il faut que l’ADN viral soit surenroulé négativement Int est sous le contr ôle de deux promoteurs donc synthétisé par deux promoteurs. De plus, sib va adopter la conformation en épingle à cheveux, donc va protéger int et donc stabiliser l’ARN. Donc [INT]>>[XIS] 2 façons d’obtenir un ARN messager qui contient Int (soit pas Pint soit par PL) et sib peut former une épingle à cheveux qui stabilise l’ARN Au moment de l’intégration, PL est down régulé donc [int]>[xis] grâce à son promoteur et à la stabilité de ces ARN (sib permet la poursuite de la traduction) A cause de l’intégration Int et sib on été séparés, les messagers ne sont plus stabilisés : Int et Xis seront synthétisés dans les mêmes proportions. EXCISION Quand le génome est intégré on a un génome linéaire : On obtient un transcrit qui code pour INT et pour XIS donc on obtient [INT] = [XIS] Pr et Pl se remette à fonctionner donc il n’y a plus de CI. SIB est séparé de la séquence INT, donc le messager n’est plus stabilisé. Il y a un phénomène d’atténuation de la protéine produite par Pl : Nest plus produit que CIII, CIII est plus produit que XIS et Xis est plus produit que INT. Mais ce phénomène est faible donc on peut dire que [INT] = [XIS]. Remarque: L’intégration/excision du phage λ se fait de la même manière que le phage P1 (Cre = INT) Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 9 INDUCTION Excision spontanée dans 1/1000 ou inductible par agents mutagènes. • • • • • • • Parmi les mutants non inductibles aux UV, on caractérise des mutants de xis et des mutants de CI. Si Xis ne fonctionne pas, on ne pourra jamais avoir excision, donc jamais de réplication donc pas d’induction de cycle lytique. Si CI ne fonctionne pas, résistant à l’induction donc insensible à une protéase donc lors de l’induction il existe une protéase qui dégrade CI : gène RecA Les mutants de CI sont dominants, ils empêchent la dégradation de CI par une enzyme induite par les U.V Mise en évidence de mutants bactériens dans lesquels l’induction aux UV d’un phage WT est impossible : mutants RecAL’irradiation provoque l’activation de la protéine RecA, qui a pour cible le répresseur et le clive en un site spécifique car dommages à l’ADN, donc besoin d’une protéine de réparation (=RecA) Les UV activent la protéine de réparation Rec A CI est substrat de Rec A Les monomères de CI sont clivés: plus de fixation coopérative possible FACTEURS INFLUENÇANT LE % DE LYSOGENIE C’est la quantité de CII et de CIII dans les premières minutes suivant l’infection qui va décider de la lyse ou de la lysogénie. On peut influer sur le choix du cycle par le virus : - En haute MOI, on aura rapidement beaucoup de CII, donc un favoritisme pour la lysogénie. - On peut aussi agir sur la richesse du milieu : la protéase Hfl est sensible a la concentration d’AMPc par exemple. En règle générale, les protéases sont activées en milieu pauvres pour dégrader les proteines et empecher les grosses utilisations d’énergie. Mais dans ce cas, elle sera inhibée, car qui dit milieu pauvre dit favorisation de la lysogenie pour attendre de meilleurs conditions. - Traitement aux UV sur une bactérie lysogène. Les UV ont un pouvoir mutagène, et les bactéries vont donc essayer de réparer les mutations a l’aide de recombinases comme RecA. Mais celle-ci est aussi une protéase qui clive CI au niveau de son pont entre les deux domaines de liaisons : l’affinité pour OR2 ne se calque plus sur celle pour OR1 – PR et PL ne sont plus bloques, et il y a formation de Cro (qui active les fonctions de lyse), CII (activant PI, il y a excision du génome viral), et N. Il y a alors lyse induite. M.O.I. • • Si l’on veut connaître le comportement d’un phage donné on utilisera une faible MOI: au maximum un phage par bactérie, donc la plage de lyse observée sera le reflet de cette infection unique Si l’on veut en moyenne deux phages par bactérie, on utilisera une haute multiplicité d’infection, donc la plage de lyse sera le reflet de la co-infection par deux phages Loi de Poisson : lorsque l’on travaille avec une concentration donnée, pour avoir en moyenne 0 phages, ou 1, 2… on utilise la formule : f(i) = e-m mi / i! i: number in each class m: mean Si MOI =1 e0 = 0,368 bactéries n’auront aucun phage e-1 = 0,368 bactéries auront 1 phage etc. e-2 = 0,184 Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 10 RECOMBINAISON CHEZ LE PHAGE • Il faut là encore qu’au temps t, deux phages se trouvent dans la même bactérie pour que l’échange génétique ait lieu • Pour « voir » les recombinants il faut ensuite examiner le phénotype de chaque phage individuellement : on attend donc un cycle de lyse et on analyse les phénotypes de chaque phage produit en infection à basse MOI. Co infection à haute MOI sur bactérie S et P Elimination d’excès de phages par centrifugation On garde les bactéries infectées dans un tube pour leur lyse : production de descendants de type parentaux et recombinants. La distinction se fait par dilution limite et infection à basse MOI et test des phénotypes, accès aux nombre de recombinants / nb total de descendants: on obtient la distance génétique. DISTANCE GENETIQUE Elle est exprimée en centimorgan (cMo) est égale au % de recombinants obtenus. Attention, souvent quand on fait une analyse phénotypique on n’observe que les phages redevenus WT, c’est-à-dire la moitié des recombinants! 1. Co-infection λCI + λCIII haute MOI 2. Eliminer exces de phage 3. Attendre la lyse 4. Diluer 5. Infection à basse MOI (phénomène individuellement chaque phage) Résultats : Donc si sur 1000 plages on a 5 plages troubles : 𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑖𝑠𝑜𝑛 5×2 = 𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 1000 On multiplie par 2 car on ne voit pas des doubles mutants Régulations génétiques- Bactériophage lambda (2010-2011) Page 11
