TD régulations génétiques50.09 KB

TD régulations génétiques
Problème 1
Un centre infectieux = tout ce qui est capable de donner une plage de lyse.
= toutes bactéries infectées engagées dans une phase de lyse + phage.
Phages libres = phage en dehors de la bactérie (ex : généré par cycle de lyse)
Phages totaux = phage dedans (juste avant lyse) ou dehors.
Pour mesurer :
 Centre infectieux :
1. Prélever un aliquot
2. Le diluer
3. Rajouter des bactéries indicatrices (P&S)
4. Étaler
 Phages libres :
1. Prélever un aliquot
2. Centrifuger pour éliminer les bactéries
3. Diluer le surnageant
4. Rajouter les bactéries indicatrices
5. Étaler
 Phages totaux :
1. Prélever un aliquot
2. Ajouter du chloroforme pour casser les membranes des bactéries
3. Centrifuger
4. Diluer le surnageant
5. Rajouter les bactéries indicatrices
6. Étaler
 Bactéries :
On fait une lecture de DO : DO de 1= 108 bactéries.
Ici ce n’est pas possible car la concentration de bactéries est trop faible.
1 bactérie infectée = 100 phages
Selon la loi de Poisson :
37% ne sont pas infectées
63% sont infectées
On a donc 6,3.105 bactéries infectées mais
seul 90% vont donner des plages de lyse =
6,9.105X0,9 = 5,67.105bactéries
Problème 2
2. les 12 tubes troubles contiennent des bactéries lysogènes. On a une MOI de 100 donc toutes les bactéries sont infectés.
On centrifuge et on dilue pour avoir 100 bactéries dans 100 ml.
Selon la loi de Poisson on a : 64 tubes avec bactéries et 36 sans bactéries.
Parmi les 64 tubes on en a 12 troubles donc qui contiennent des bactéries lysogènes provenant d’une surinfection ou d’une
induction.
3. les 88 tubes limpides correspondent au 64tubes avec bactéries moins les 12 troubles, plus les 36 sans bactéries.
Donc les 88 tubes vides contiennent soit un phage soit rien.
1
Problème 3
Pour montrer que les mutants sont cis-dominants ou récessifs il faut :
1. Co-infection 1WT 1mutts à haute MOI, à température restrictive.
2. Centrifugation pour récupérer les bactéries infectées.
3. Ajout de bactéries indicatrices et étalement à température restrictive.
 Plage claire = mutant dominant
 Plage trouble = mutant récessif ou cis-dominant
4. Repiquer les microcolonies de bactéries lysogènes et croissance à température restrictive.
5. Induction de la lyse aux U.V
6. Dilution et infection à basse MOI
7. Ajout de bactérie indicatrice et étalement à température restrictive.
 60 plages troubles = mutant cis-dominant
 30 plages claires et 30 plages troubles = mutant récessif
Puis on fait un test de complémentation seulement avec les mutants récessifs.
1. Co-infection de 2mutantsts récessif à haute MOI à température restrictive.
2. Centrifugation pour récupérer les bactéries infectées.
3. Ajout de bactéries indicatrices et étalement à température restrictive.
 Plage claire = mutants ne complémentent pas car sont dans le même groupe de complémentation.
 Plage trouble = mutants complémentent car sont dans des groupes de complémentation différents.

Problème 4
L1, L2 et L6 ne sont pas dans le même groupe de complémentation
L1 et L3 sont dans le même groupe de complémentation
L4 et L5 sont dans le même groupe de complémentation
Donc on peut dire qu’il y a au moins 3 gènes impliqués dans la lysogénie.
Problème 5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Culture
Dilution
K12
K12
K12λ+
K12 λ+
K12 (intTS)
K12 (intTS)
K12 (CITS)
K12 (CITS)
K12 (CITS)
10-5
10-1
10-5
10-2
10-5
10-1
10-5
ND
10-7
Colonies par boîte
À temps 0
Après 2h à 42°C
40
350
Plages par boîte
Après 2h à 42°C
0
50
0
40
400
0
450
10
0
60
5
150
Les lignes 1 et 2 correspondent à des contrôles
Ligne 1 : 40 colonies de λK12 à t0 = 40x10x105 = 4x107 bactéries/ml
350 colonies de λK12 à 2h = 350x10x105 = 3,5x108 bactéries/ml
 Il y a eu 3 divisions en 2h.
Ligne 2 : il n’y a pas de chiffre car il y a trop de colonies, on a un tapis bactérien. Et il n’y a pas de plages de lyse car les bactéries
n’ont pas étaient infectées par un phage.
Ligne 3 : on a à peu près le même résultat que la ligne 1 donc on peut dire que les bactéries se comportent comme le premier.
Ligne 4 : on ne voit pas de bactérie car il y a un tapis bactérien. On observe 10plages de lyse, on peut dire que c’est une induction
spontanée.
Ligne 5 : le cycle de division et normale c'est-à-dire qu’il y a le même nombre de division. A température restrictive, rien ne
change. Int n’est donc pas impliqué dans le maintient de la lysogénie mais dans son induction.
Ligne 6 : il n’y a pas de plages de lyse, donc il n’y a pas d’induction spontanée  ils ne sont donc pas inductibles car la protéine
int est nécessaire aussi pour l’excision du prophage.
Ligne 7 : 60 colonies = 6x107 bactéries/ml
2
A 42°C, il y a 0 colonies, on a une lyse complète car CI est nécessaire au maintient de la lysogénie.
On ne voit pas de plages de lyse car tout est lysé.
Ligne 8 : il n’y a pas de dilution. On a 5 colonies issues d’apparition de mutants spontanés car on a pas induit de lyse dans ces
bactéries.
Ligne 9 : 150x10x10-7 = 1,5x1010 phages/ml
Au début, on avait 6x107 bactéries/ml, on devrait donc avoir 6x10 9 bactéries/ml. Il y a un facteur 2 entre 6x109 et
1,5x1010 donc les bactéries ont pu faire 1 division avant de faire un cycle de lyse.
Problème 6
1.
2.
3.
4.
5.
Il n’y a pas de coopération entre OR1 et OR2 donc CI bloque OR2 et OR3  Prm est réprimé et Pr est non réprimé  il y
a donc synthèse de Cro donc la concentration de Cro augmente.
Après une coinfection, le Cro synthétisé par le phage I va se fixé sur OR3 du phage
WT.
Le phage I est donc dominant.
Il n’y a aucune action de Prm, donc il n’y a pas de CI. Le phage est dominant.
OR3 est important car si la protéine est produite par une seule bactérie (CI)  la
bactérie va mourir, il va y avoir lyse donc une plage claire, la bactérie va apparaître
comme un mutant de la lysogénie.
 Si le génome qui s’intègre est celui du mutant, la bactérie meurt.
 Si le génome qui s’intègre est celui du sauvage, on va avoir une plage trouble correspondant à la bactérie ne
contenant que des prophages WT. Donc le mutant est cis-dominant.
Le mutant PRE ne fabrique plus de Cro, c’est un mutant de la lysogénie.
On fait une co-infection :
 Si le génome mutant s’intègre, il n’y a pas de problème car la 1ere molécule de CI est déjà synthétisé par WT,
on a plus besoin de PRE.
 Si le génome sauvage s’intègre, il n’y a pas de problème non plus.
Le génome mutant a besoin du WT pour que ca marche donc le mutant est récessif.
CII ne peut pas activé Cint, donc il n’y a pas d’intégrase. Le génome ne peut pas s’intégré. C’est un mutant de la
lysogénie.
On fait une co-infection :L’intégrase est fabriqué par WT, donc le génome Wt ou du mutant va s’intégrer. Le génome est
donc récessif.
Problème 7
a.
On a besoin de Pr pour faire Cro donc c’est un mutant de la lyse. On peut se dire que 100% de bactéries sont lysogène
mais on a besoin de Pr pour faire CII donc non. C’est un mutant impossible à isoler.
b. Il n’y a pas de 1ères molécules de CI synthétisées. Seul, il donne des plages claires donc c’est un mutant de la lysogénie. A
température restrictive, on fait une coinfection :
 Si le mutant s’intègre, CI ne fonctionnera pas
 Si le WT s’intègre, CI fonctionne
Le mutant est cis-dominant car les bactéries lysogènes ne contiennent que des prophages WT.
c. C’est un mutant de la lysogénie cis-dominant.
d. Il n’y a pas de N et CIII donc il n’y a plus de lyse ni de lysogénie car il n’y a pas de Q (anti-terminateur tardif). Le mutant
est impossible a isoler.
Problème 8
Pour tous les mutants on fait :
1. Une co-infection à haute MOI avec les mutants.
2. Centrifugation pour récupérer les bactéries infectées.
3. Attendre la lyse
4. Dilution + bactérie indicatrice puis étalement.
 On utilise les mutants CI et CIII
3
On obtient 4 types de descendants :
 CI parental  plages claires
 CIII parental  plages claires
 CI/CIII recombinant  plages claires
 WT recombinant  plages troubles
plages troubles = ½ recombiant
Ici on attend 5 plages troubles sur 200 plages troubles.
𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠
5
2,5 𝑡𝑟𝑜𝑢𝑏𝑙𝑒𝑠 + 2,5 𝑐𝑙𝑎𝑖𝑟𝑒𝑠
= 5% 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑠 =
=
𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑑𝑎𝑛𝑡𝑠
100
100

On utilise les mutants CIts, CIIts et WT
On obtient 4 types de descendants :
 CIts, CIIts parentaux troubles à 32°C
 claires à 42°C
 lyse si 32°C puis 42°C
 WT parentaux  troubles à 32°C
troubles à 42°C
 lyse si 32°C puis 42°C
 CIts recombinant  troubles à 32°C
claires à 42°C
 lyse si 32°C puis 42°C
ts
 CIII recombinant  troubles à 32°C
claires à 42°C
 pas de lyse si 32°C puis 42°C
2 fréquences parentaux (X) + 2 fréquences recombinants = 100
2X +2Y = nombre total de plages
X plages troubles à 42°C
2X = 99%  X= 48,5%

on attend 97plages troubles/200 plages totales
2Y = 3%  Y = 1,5%

3% = 3 cMo

CI entre II et CIII
On fait une coinfection entre Ci et CII/CIII
 Si l’ordre est CI-CII-CIII  % de recombinant = 3%
 % deWT récupérer = 1,5%
 Si l’ordre est CII-CIII-CI  % de recombinant = 5%
 % de WT récupérér = 2,5%
 Si ordre est CII-CI-CIII  % de recombinant = <<3%
4