05_I7_B_Num_01.doc I-7 Immunologie Fiche sujet élève
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05_I7_B_Num_01.doc I-7 Immunologie Fiche sujet élève DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Lorsqu’un antigène a pénétré dans un organisme, le processus d’immunisation consiste à synthétiser des anticorps spécifiques. Les anticorps sont alors présents dans le sérum et permettent une réponse immunitaire efficace. Une électrophorèse de protéines et sa lecture optique permettent de détecter la présence d’anticorps dans le sérum d’un sujet immunisé. On cherche à déterminer si un lapin a subi une immunisation récente contre l’antigène BSA (ou autre antigène). Matériel : cuve à électrophorèse ; tampon d’électrophorèse à pH 9,2 ; trois verres de montre, deux bandes d’acétate, papier filtre ; trois applicateurs de sérum (lamelles de dépôt en verre ou équivalent) ; sérum d’un lapin L1 ayant subi une immunisation récente contre la BSA (ou un autre antigène) ; sérum d’un lapin L2 non immunisé ; sérum d’un lapin L testé ; ordinateur, résultats d’électrophorèse numérisés dans un fichier - image et tableau à remplir dans un fichier – texte ; logiciel MESURIM et fiche technique d’utilisation pour lecture optique de bande d’électrophorèse. Activités et déroulement des activités 1- Mettre en œuvre le protocole en suivant les indications de la fiche technique 1 - électrophorèse. Appeler l’examinateur pour vérifier le montage et accéder aux fichiers suivants : résultats numérisés et tableau à remplir pour les questions 3 et 4 2- Justifier l’intérêt de l’analyse des sérums des trois lapins. Capacités et critères d’évaluation Barème Réaliser une manipulation en suivant un protocole - Respect des étapes du protocole. - Utilisation maîtrisée du matériel. - Organisation de la paillasse. 10 Adopter une démarche explicative 2 3- Réaliser une lecture optique des résultats numérisés avec le logiciel MESURIM en utilisant les indications de la fiche technique 2 - MESURIM. Utiliser un logiciel de traitement d’image Utilisation maîtrisée des fonctionnalités du logiciel 3 4- Légender complètement, avec votre traitement de texte habituel, le document constitué à l’aide de la fiche technique 1 - électrophorèse. Utiliser un logiciel de traitement de texte Légendes complètes et correctes – titre adapté 3 5- Conclure, en argumentant à l’aide des données fournies, si le lapin testé a subi ou non une immunisation récente contre la BSA (ou autre antigène). Adopter une démarche explicative 2 05_I7_B_Num_01.doc I-7 Immunologie Fiche technique 1 - électrophorèse – élève DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Principe : en milieu basique, les protéines sont chargées négativement ; lorsqu’un mélange de protéines est soumis à un champ électrique, les protéines migrent à une distance caractéristique de leur taille et de leur charge. Les anticorps font partie des gamma globulines Remarques : La migration durant une heure, des bandes d’acétate après migration et déjà colorées au rouge Ponceau seront distribuées. Le rouge Ponceau est un colorant spécifique des protéines, car ayant pour elles une grande affinité. Protocole d’utilisation du matériel : 1. 2. 3. 4. MISE EN PLACE DES BANDES D’ACETATE DE CELLULOSE DANS LA CUVE. Remplir la cuve à électrophorèse au 2/3 avec la solution tampon, de chaque côté, en évitant tout débordement. Ne jamais toucher les bandes d’acétate avec les doigts, sinon des traces de doigts apparaîtront à la coloration. Sortir les bandes des bacs à l’aide d’une pince, les placer entre 2 feuilles de papier filtre et les sécher à l’aide d’un mouvement rapide. Fixer les bandes d’acétate de cellulose sur le portoir de la cuve, tendues le plus possible (sans les déchirer bien entendu), de façon à ce que la face mate qui est absorbante soit sur le dessus (encoche de la bande en bas à droite). Les bandes doivent être parallèles entre elles et perpendiculaires à l’axe du portoir pour permettre une migration des protéines dans l’axe du portoir. Poser le portoir dans la cuve et vérifier que les extrémités de chaque bande trempent dans le tampon de la cuve. DEPOT DES SERUMS 1. Tremper l’applicateur dans le sérum du lapin L, déposer rapidement l’applicateur près du bord, du côté biseauté et perpendiculairement à l’axe du portoir. (Faire une application bien nette) 2. Faire de même sur une autre bande pour le sérum L1 et le sérum L2 (pour ces sérums, le dépôt se fait sur la même bande, en veillant à ce que les tâches ne se touchent pas). 1. 2. 3. 4. MISE EN ROUTE DE L’ELECTROPHORESE Fermer la cuve avec le couvercle : côté cathode (pôle négatif, borne noire) près du bord avec encoche. Relier la cuve au générateur à l’aide du cordon. Respecter la correspondance des couleurs entre cordons et douilles. Régler la tension de l’alimentation sur 160V. Raccorder l’appareil au secteur. 05_I7_B_Num_01.doc I-7 Immunologie 5. Mettre sous tension. La migration démarre et durera une heure. Les résultats fournis sont colorés au rouge Ponceau. Fiche technique 2 – MESURIM - élève DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Protocole de lecture optique des bandes pour évaluer les concentrations des différentes protéines avec MESURIM Principe : Plus la concentration en protéines est forte dans une portion de bande d’électrophorèse, plus la coloration est forte. On peut donc évaluer les concentrations des différentes catégories de protéines par mesure optique de la densité de coloration sur la bande. Les bandes de gel d’électrophorèse obtenues dans cette étude ont été numérisées à l’aide d’un scanner et sauvegardée dans un seul fichier image. La densité de couleur des images sera ensuite lue avec les outils du logiciel Mesurim. - Lancer MESURIM et ouvrir le fichier, accessible par le menu « fichier » - Cliquer sur l'icône de mesure puis tracer par cliquer – glisser de gauche à droite une ligne horizontale parcourant la première électrophorèse en son milieu (ou une zone plus représentative); c’est la ligne suivant laquelle la mesure d’absorption de lumière sera faite - Choisir dans le menu de mesure le menu Mesure de lumière sur une bande ; une fenêtre de paramétrage apparaît. Choisir : - « largeur en pixel » : 10 - « une mesure en absorption » : - tous (les canaux de couleurs) - « mesures » linéaires puis cliquer sur le bouton Mesurer. Choisir dans le menu « graphique » de la fenêtre de mesure : fond blanc puis copier. Coller ce premier graphique dans le fichier texte ouvert sur le bureau de l’ordinateur, dans la première ligne du tableau dessiné dans ce fichier et enregistrer. Répéter le protocole pour les deux autres profils : ATTENTION : le graphe précédent reste affiché jusqu’à un nouveau clic sur « mesurer ». Coller les graphiques obtenus dans les lignes 2 et 3 du tableau. Redimensionner si nécessaire les images pour que le tableau tienne dans une seule page : enregistrer sur disquette. Utiliser le traitement de textes pour légender, dans les espaces disponibles du tableau, le document ainsi constitué. - , à l’emplacement désigné par l’examinateur.
