sujet ECE 2005 - Document sans
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748906106 I-7 Immunologie DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Fiche sujet - élève Lorsqu’un antigène a pénétré dans un organisme, le processus d’immunisation consiste à synthétiser des anticorps spécifiques. Les anticorps sont alors présents dans le sérum et permettent une réponse immunitaire efficace. Une électrophorèse de protéines et sa lecture optique permettent de détecter la présence d’anticorps dans le sérum d’un sujet immunisé. On cherche à déterminer si un lapin a subi une immunisation récente contre l’antigène BSA (ou autre antigène). Matériel : cuve à électrophorèse ; tampon d’électrophorèse à pH 9,2 ; trois verres de montre, deux bandes d’acétate, papier filtre ; trois applicateurs de sérum (lamelles de dépôt en verre ou équivalent) ; sérum d’un lapin L1 ayant subi une immunisation récente contre la BSA (ou un autre antigène) ; sérum d’un lapin L2 non immunisé ; sérum d’un lapin L testé ; ordinateur, résultats d’électrophorèse numérisés dans un fichier - image et tableau à remplir dans un fichier – texte ; logiciel MESURIM et fiche technique d’utilisation pour lecture optique de bande d’électrophorèse. Activités et déroulement des activités 1- Mettre en œuvre le protocole en suivant les indications de la fiche technique 1 - électrophorèse. Appeler l’examinateur pour vérifier le montage et accéder aux fichiers suivants : résultats numérisés et tableau à remplir pour les questions 3 et 4 2- Justifier l’intérêt de l’analyse des sérums des trois lapins. Capacités et critères d’évaluation Barème Réaliser une manipulation en suivant un protocole - Respect des étapes du protocole. - Utilisation maîtrisée du matériel. - Organisation de la paillasse. 10 Adopter une démarche explicative 2 3- Réaliser une lecture optique des résultats numérisés avec le logiciel MESURIM en utilisant les indications de la fiche technique 2 - MESURIM. Utiliser un logiciel de traitement d’image Utilisation maîtrisée des fonctionnalités du logiciel 3 4- Légender complètement, avec votre traitement de texte habituel, le document constitué à l’aide de la fiche technique 1 - électrophorèse. Utiliser un logiciel de traitement de texte Légendes complètes et correctes – titre adapté 3 5- Conclure, en argumentant à l’aide des données fournies, si le lapin testé a subi ou non une immunisation récente contre la BSA (ou autre antigène). Adopter une démarche explicative 2 748906106 I-7 Immunologie Fiche technique 1 - électrophorèse – élève DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Principe : en milieu basique, les protéines sont chargées négativement ; lorsqu’un mélange de protéines est soumis à un champ électrique, les protéines migrent à une distance caractéristique de leur taille et de leur charge. Les anticorps font partie des gamma globulines Remarques : La migration durant une heure, des bandes d’acétate après migration et déjà colorées au rouge Ponceau seront distribuées. Le rouge Ponceau est un colorant spécifique des protéines, car ayant pour elles une grande affinité. Protocole d’utilisation du matériel : MISE EN PLACE DES BANDES D’ACETATE DE CELLULOSE DANS LA CUVE. 1. Remplir la cuve à électrophorèse au 2/3 avec la solution tampon, de chaque côté, en évitant tout débordement. Ne jamais toucher les bandes d’acétate avec les doigts, sinon des traces de doigts apparaîtront à la coloration. 2. Sortir les bandes des bacs à l’aide d’une pince, les placer entre 2 feuilles de papier filtre et les sécher à l’aide d’un mouvement rapide. 3. Fixer les bandes d’acétate de cellulose sur le portoir de la cuve, tendues le plus possible (sans les déchirer bien entendu), de façon à ce que la face mate qui est absorbante soit sur le dessus (encoche de la bande en bas à droite). Les bandes doivent être parallèles entre elles et perpendiculaires à l’axe du portoir pour permettre une migration des protéines dans l’axe du portoir. 4. Poser le portoir dans la cuve et vérifier que les extrémités de chaque bande trempent dans le tampon de la cuve. DEPOT DES SERUMS 1. Tremper l’applicateur dans le sérum du lapin L, déposer rapidement l’applicateur près du bord, du côté biseauté et perpendiculairement à l’axe du portoir. (Faire une application bien nette) 2. Faire de même sur une autre bande pour le sérum L1 et le sérum L2 (pour ces sérums, le dépôt se fait sur la même bande, en veillant à ce que les tâches ne se touchent pas). 1. 2. 3. 4. 5. MISE EN ROUTE DE L’ELECTROPHORESE Fermer la cuve avec le couvercle : côté cathode (pôle négatif, borne noire) près du bord avec encoche. Relier la cuve au générateur à l’aide du cordon. Respecter la correspondance des couleurs entre cordons et douilles. Régler la tension de l’alimentation sur 160V. Raccorder l’appareil au secteur. Mettre sous tension. La migration démarre et durera une heure. Les résultats fournis sont colorés au rouge Ponceau. 748906106 I-7 Immunologie Fiche technique 2 – MESURIM - élève DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Protocole de lecture optique des bandes pour évaluer les concentrations des différentes protéines avec MESURIM Principe : Plus la concentration en protéines est forte dans une portion de bande d’électrophorèse, plus la coloration est forte. On peut donc évaluer les concentrations des différentes catégories de protéines par mesure optique de la densité de coloration sur la bande. Les bandes de gel d’électrophorèse obtenues dans cette étude ont été numérisées à l’aide d’un scanner et sauvegardée dans un seul fichier image. La densité de couleur des images sera ensuite lue avec les outils du logiciel Mesurim. ,à l’emplacement désigné par l’examinateur. - Lancer MESURIM et ouvrir le fichier, accessible par le menu « fichier » - Cliquer sur l'icône de mesure puis tracer par cliquer – glisser de gauche à droite une ligne horizontale parcourant la première électrophorèse en son milieu (ou une zone plus représentative); c’est la ligne suivant laquelle la mesure d’absorption de lumière sera faite - Choisir dans le menu de mesure le menu Mesure de lumière sur une bande ; une fenêtre de paramétrage apparaît. Choisir : - « largeur en pixel » : 10 - « une mesure en absorption » : - tous (les canaux de couleurs) - « mesures » linéaires puis cliquer sur le bouton Mesurer. Choisir dans le menu « graphique » de la fenêtre de mesure : fond blanc puis copier. Coller ce premier graphique dans le fichier texte ouvert sur le bureau de l’ordinateur, dans la première ligne du tableau dessiné dans ce fichier et enregistrer. Répéter le protocole pour les deux autres profils : ATTENTION : le graphe précédent reste affiché jusqu’à un nouveau clic sur « mesurer ». Coller les graphiques obtenus dans les lignes 2 et 3 du tableau. Redimensionner si nécessaire les images pour que le tableau tienne dans une seule page : enregistrer sur disquette. Utiliser le traitement de textes pour légender, dans les espaces disponibles du tableau, le document ainsi constitué. - 748906106 I-7 Immunologie Fiche réponse - élève DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Etablissement : Classe : Nom -Prénom : A rendre à l’issue de l’épreuveDocument secours - élève 748906106 I-7 Immunologie DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Résultats de lecture optique des bandes d’électrophorèse : profil densitométrique du sérum des lapins L1, L2 et L Lapin L1 Lapin L2 Lapin L testé Fiche laboratoire DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS La fiche protocole peut être légèrement modifiée en fonction du matériel (cuve) de l’établissement. Le matériel nécessaire à la réalisation de ce TP est vendu sous forme de KIT par SORDALAB ; d’autres sérums peuvent être utilisés. Avant le début du TP : Préparer le sérum (recon stituer le sérum de lapin). Immerger 2 bandes d’acétate de cellulose dans du tampon 748906106 I-7 Immunologie véronal pendant 10 minutes. Ajouter 200µl d’eau stérile à chaque tube de sérum. Pour les bandes de résultats - élèves : Il faudra réaliser la décoloration à l’acide acétique puis la coloration au rouge Ponceau des bandes (après migration des sérums) avant l’évaluation de l’élève. - Prévoir une solution à 5% d’acide acétique (pour la décoloration des bandes colorées au rouge Ponceau). Pour 250ml de rouge Ponceau : o préparer 1l d’eau acétifiée à 1% (mettre 10ml d’acide acétique dans 1l d’eau déminéralisée). o ajouter 2,5g de rouge Ponceau à 250ml d’eau acétifiée 1%. o conserver au réfrigérateur à l’abri de la lumière. - Préparer une solution de transparisation qui permet de rendre transparentes les bandes après traitement : méthanol (75ml) - acide acétique (20ml) - diacétone alcool (5ml) Pour le sérum à tester, prévoir suivant les cas, et pour diversifier les résultats, du sérum tantôt immunisé, tantôt non immunisé. Numérisation de résultats avec un scanner : Le fichier image de résultats est fourni à titre d’exemple et peut à défaut être utilisé tel quel. Les bandes colorées se conservant très bien, on peut scanner des bandes de résultats obtenues au cours de l’année et faire varier les TP avec des fichiers images de résultats différents comportant un sérum immunisé, un non immunisé et un sérum inconnu variable. Si on dispose d'un scanner à plat compatible Twain, la scannérisation peut se faire à l'aide du logiciel MESURIM, ce qui évitera d'avoir à créer une échelle pour l'image avant la mesure. C'est l'utilitaire normal de scannérisation, propre au scanner qui est appelé par MESURIM. Choisir les paramètres de scannérisation sans détramage ni changement de contraste, qui modifieraient l'image par rapport au document d'origine. Indiquer la résolution utilisée par le scanner lorsque le logiciel le demande. Cela permet d'établir l'échelle de l'image. Sauvegarder l'image dans un fichier .jpg de préférence (les nuances seront mieux conservées qu'avec un fichier .gif). Le fichier utile pour le TP (fichier image résultat retenu) pourra être disponible sur le bureau pour éviter toute perte de temps à l’élève. Ne pas oublier de fournir le chemin d’accès. Si l’impression par l’élève pose trop de problèmes pratiques, faire enregistrer sur disquette pour impression par l’examinateur.Fiche barème d'évaluation DETECTION D’ANTICORPS DANS LE SERUM D’UN LAPIN PAR ELECTROPHORESE VERSION AVEC LECTURE OPTIQUE DES RESULTATS Noms des élèves Capacités et critères d’évaluation (en gras, évaluation pendant la séance) Barème 748906106 I-7 Immunologie 1. Réaliser une manipulation d’après un protocole : - Respect des différentes étapes du protocole - Utilisation maîtrisée du matériel mise en place des bandes dépôt des sérums branchement et mise en route de la cuve - Organisation de la paillasse et rangement du matériel en fin de manipulation 2. Adopter une démarche explicative : Lapins L1 et L2 témoins permettant de détecter par comparaison la position des anticorps et la présence ou non d’anticorps dans le sérum testé. 3. utiliser un logiciel de traitement d’image : Profils densitométriques correctement réalisés, maîtrise des fonctionnalités du logiciel 4. Utiliser un logiciel de traitement de texte - Collage correct, redimensionnement adapté : tableau sur une page, légendes placées judicieusement - Présence d’un titre adapté et légendes correctes 5. Adopter une démarche explicative : Cohérence de la déduction avec les résultats du tableau Note 3 2 2 2 1 2 3 1 2 2 /20
