Marquages immunohistochimiques
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APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Marquages immunohistochimiques IMMUNOCYTOCHIMIE Technique directe Traceur Anticorps Antigène Tissu Technique indirecte Test de spécificité par compétition Sensibilité Marquages multiples Traceur 1 Traceur 2 Ac II Ac I Marquages multiples Spécificité - Spécificité respective des anticorps et des méthodes de révélation - Absence de réactions croisées Sensibilité - Sensibilité respective des anticorps, des réactifs et des systèmes de révélation - Limitations liées au masquage potentiel de sites antigéniques par le premier système de révélation - Limitations liées à lencombrement stérique (cas de la détection dantigènes colocalisés au sein dun même élément cellulaire) APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Fixation des tissus Finalité: - Immobiliser les molécules in situ (antigènes) - Préserver laspect (ultra)structural du tissu Inconvénients: - Modification des antigènes pouvant changer leur affinité pour les anticorps - Réticulation du tissu freinant ou empêchant la diffusion des réactifs Choix du fixateur: - Selon le type dobservation envisagée (m. optique ou électronique) - Selon les structures à préserver - Selon les molécules à immobiliser Compromis Principaux fixateurs Déshydratants alcools, acétone, lyophilisation Agents précipitants acide picrique, acide acétique Agents de pontage chimique formaldéhyde, glutaraldéhyde, acroléine Acide tannique Tétroxyde dosmium (acide osmique) Principaux fixateurs Fixateurs aldéhydiques Réagissent essentiellement avec les groupements aminés des protéines Tétroxyde dosmium (acide osmique) Réagit principalement sur les doubles liaisons insaturées des lipides. Indispensable pour une bonne préservation des membranes en microscopie électronique. Utilisé en post-fixation après la fixation aldéhydique Action des fixateurs sur les tissus Inclusion Résines époxy (hydrophobes) Epon, Araldite, Spurr Les monomères époxy forment un réseau de polymères branchés en présence de diamines - Polymérisation à chaud (60°C) - Stables sous le faisceau délectrons - Préservation optimale des détails ultrastructuraux - Viscosité élevée - Imperméables après polymérisation - Bonne dureté pour la coupe Résines acryliques (généralement hydrophiles) LR-White, Lowicryl, Métacrylates - Peuvent polymériser à basse température sous UV - Un peu instables sous le faisceau délectrons - Moins ramifiées et plus poreuses - Nétablissent pas de liaisons covalentes avec les constituants cellulaires - Perméables après polymérisation - Faible viscosité - Dureté un peu irrégulière (coupe plus difficile) APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Traceurs fluorescents Fluorescéine (vert) Rhodamine (rouge) Texas red (rouge) Phycoérythrine B et R (rouge) Cyanines (vert à infrarouge) Alexa (bleu à infrarouge) Fluorescence Émission Absorption e1 > e2 1 < 2 e1=h/1 noyau orbital haute (état excité) e2=h/2 noyau orbital basse (état de repos) Excités par le rayonnement dune lampe à vapeurs de mercure ou dun laser, les fluorochromes émettent une lumière de plus grande longueur donde que la lumière dexcitation Principaux fluorochromes Principales sources dexcitation Propriétés ondulatoires de la lumière Autres traceurs Radioactifs Tritium (3H) Iode (125I) Révélation photographique (radioautograhie sur film ou sur émulsion nucléaire selon le niveau de résolution souhaité) Enzymatiques Peroxydase Phosphatase alcaline Glucose oxydase Révélation à laide dun substrat et dun chromogène (peroxydase : H2O2 + 3,3-diaminobenzidine) Particulaires Ferritine (10nm) Or colloïdal (1nm à 20nm) Visualisation directe ou après intensification à largent (or colloïdal, selon la taille des particules) APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Microscope à fluorescence conventionnel Principe de fonctionnement du microscope confocal Principe de la microscopie confocale Caractéristiques: photomultiplicateur lumière réfléchie hors focus lumière réfléchie objectif source d’illumination laser ponctuelle excitation au point focal dans l’échantillon un diaphragme de détection diaphragme de détection "pinhole" miroir dichroïque laser lamelle échantillon lame excitation diaphragme d’émission hors focus échantillon plan focal illumination Conventionnel Confocal Microscopie confocale à balayage laser coupe optique (2D) Z-Série (3D) Y X t0 t1 ….t Z Time series (4D) Centre de Microscopie et Imagerie Station de microscopie confocale Microscope Leica TCS SP2 avec AOTF et détection spectrale Ensemble de sources laser : argon et hélium/néon Laser pulsé femtoseconde Coherent Mira 9000 accordable APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Doubles marquages immunocytochimiques Anticorps primaires despèces différentes Anticorps secondaires de même espèce Lapin Souris Chèvre Doubles marquages immunocytochimiques Anticorps primaires despèces différentes Anticorps secondaires despèces différentes Chèvre Lapin (sérum non immun) Lapin Souris Lapin Spectres démission des fluorochromes et cross-talk 100 Alexa-488 Alexa-633 Alexa-546 80 60 Cross-talk 40 20 0 400 450 500 550 600 650 700 Longueur d’onde (nm) 750 800 Cross-talk : sélection du signal émis Filtres bande-passe 100 Alexa-488 Alexa-633 Alexa-546 80 60 40 20 0 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Longueur d’onde (nm) Plasticité gliale dans le NSC ZT02 GFAP/VIP ZT18 DM VL CO CO Innervation glutamatergique des neurones à VIP du NSC Série Z 0,64 µm Superposition Analyse semi-quantitative Innervation glutamatergique des neurones à VIP du NSC: Analyse semi-quantitative 2.0 * 1.5 1.0 180 Bassoon VIP vGlut1-2 150 gray levels 120 0.5 90 60 30 0.0 0 1 11 21 31 distance (px) 41 51 ZT02 ZT18 Expression neuronale de P-ERK1/2 dans le NSC VIP P-ERK1/2GRP P-ERK1/2 GRP/VIP GRP P-ERK1/2VIP/GRP Guillaumond et al., J. Neurochem., 2007 Distribution spatiale et temporelle de P-ERK1/2 dans le NSC 21% 1 - VIP 64% 15% Jour 2 - P-ERK1/2 3 - GRP 4 - P-ERK1/2GRP 26% Nuit 54% 20% 5 - GRP/VIP 6 - P-ERK1/2VIP/GRP VIP ZT18 AVP GRP VIP/GRP non identifiés Guillaumond et al., J. Neurochem., 2007 TP : Expression et colocalisation neuronale de marqueurs rythmiques: Triple marquage P-ERK1/2/VIP/GRP dans le NSC chez le rat Protocole de marquage Fixation par perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde 4% Echantillonnage de lhypothalamus antérieur contenant le NSC sur coupes frontales de 50 µm (vibratome) Jour 1: Rinçages dans un tampon Tris pH 7,5 (3X10 min) Préincubation dans du sérum normal de chèvre (NGS) 30% + Triton X-100 0,2% (15min) Anti-P-ERK1/2 (monoclonal souris) 1/200 dans Tris + NGS 1% (4°C, sous agitation) Jour 2 : Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Chèvre anti-IgG de souris conjugué à Alexa-568 (1/200, 2h) Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Anti-VIP (polyclonal lapin) 1/1000 + Anti-GRP (polyclonal cobaye) 1/1000 dans Tris + NGS 1% (4°C, sous agitation) Jour 3 : Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Chèvre anti-IgG de lapin conjugué à FITC (1/200) + Chèvre anti-IgG de cobaye conjugué à Alexa-647 (1/200) (2h) Rinçages Tris (3X10min) Montages des coupes sur lames gélatinées dans un tampon phosphate glycériné Conservation des coupes à -20°C APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Microscopie électronique en transmission Centre de Microscopie et Imagerie Station de microscopie électronique Microscope électronique à transmission Philips CM 10 Centre de Microscopie et Imagerie Station dultramicrotomie Ultramicrotome Reichert Ultracut S Module d’ultracryotomie FCS APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Techniques de marquage en neurobiologie appliquées à la microscopie électronique RADIOAUTOGRAPHIE Principe: Détection dun signal radioactif émis par le tissu à laide dune émulsion «nucléaire» liquide Techniques de marquage en neurobiologie appliquées à la microscopie électronique RADIOAUTOGRAPHIE Applications: Renouvellement des constituants cellulaires Etude du transport axonal Traçage de voies nerveuses Visualisation des sites de capture des monamines (terminaisons catécholaminergiques et sérotoninergiques) Radioautographie après capture de (3H)-monoamines (microscopie optique) (3H)5-HT (3H)DA (3H)5-HT Organe vasculaire de la lame terminale Noyau suprachiasmatique Radioautographie après capture de (3H)-sérotonine (microscopie électronique) organe vasculaire de la lame terminale Noyau arqué Techniques de marquage en neurobiologie appliquées à la microscopie électronique IMMUNOCYTOCHIMIE Principe: Détection dune substance dintérêt après application dun anticorps spécifique et révélation des complexes antigènesanticorps à laide dun marqueur. Les marqueurs Enzymatiques Peroxydase révélée par: Diaminobenzidine Dihydrochlorure de benzidine Tétraméthyl benzidine Particulaires Ferritine (10nm) Or colloïdal (1nm à 20nm) Radioactifs Tritium (3H) Iode (125I) Techniques de marquage immunocytochimique Révélation des complexes antigènes-anticorps: Techniques directes Techniques indirectes Application des anticorps: Avant inclusion (pre-embedding) Après inclusion (post-embedding) Combinaison des deux approches (marquages multiples) Méthode Peroxydase-Anti-Peroxydase (PAP) ETAPES 3 3 22 1 1 Méthode Avidine-Biotine-Peroxydase (ABC) Complexe ABC Anticorps secondaire biotinylé Anticorps primaire Anticorps primaire Immunomarquage tyrosine hydroxylase (peroxydase, coupes sériées) Innervation dopaminergique du neostriatum Descarries et al., J. Comp. Neurol., 375, 167-186, 1996 Immunomarquage (Tyrosine Hydroxylase) Radiomarquage après capture de (3H)-dopamine Epv Eminence médiane : Terminaisons dopaminergiques tubéro-infundibulaires Epv : Espace périvasculaire * Terminaisons non marquées T : pied tanycytaire Flêches : fenestrations de lendothélium vasculaire APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATION NEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE I - Immunocytochimie : généralités II - Préparation des tissus A - Fixation B - Inclusion III - Traceurs IV - Microscopie de fluorescence A - Microscopie de fluorescence conventionnelle B - Microscopie confocale à balayage laser V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence VI - Microscopie électronique A - Microscopie électronique en transmission B - Techniques de marquages en microscopie électronique C - Applications aux marquages multiples Marquages combinés Radioautographie (monoamines) / immunocytochimie Noyau suprachiasmatique : interactions sérotonine (3H-5-HT) / GABA (anti-GAD) Marquages combinés Immunocytochimie associant différents marqueurs en pré et/ou post-enrobage -------------------------------------------------------------------------Le choix de lapproche doit tenir compte: de lorigine des anticorps primaires disponibles (espèces différentes ou même espèce) de la sensibilité et/ou de la résolution recherchée(s) des limitations respectives des méthodes qui seront associées Double marquage en pré-enrobage Immunocytochimie (peroxydase) + radioimmunocytochimie (125I) Noyau paraventriculaire : colocalisation tyrosine hydroxylase/NPY Double marquage en pré-enrobage Peroxydase / or 1nm intensifié à largent 1µm Noyau suprachiasmatique : innervation sérotoninergique des neurones à vasopressine Double marquage en pré-enrobage Peroxydase révélée à laide de chromogènes distincts Anti-A (espèce a) Anti-B (espèce b) Anti-IgG espèce a Anti-IgG espèce b (espèce c) (espèce c) PAP (espèce b) PAP (espèce a) PAP (espèce a) 3,3-diaminobenzidine Benzidine dihydrochloride Double immunoperoxydase + radioautographie Triple marquage Anti-A (espèce a) Anti-IgG espèce a (espèce c) 5-HT Anti-B (espèce b) Anti-IgG espèce b + (espèce c) PAP (espèce b) PAP (espèce a) capture (3H)5-HT PAP (espèce a) VIP 3,3-diaminobenzidine Benzidine dihydrochloride GABA Double marquage en post-enrobage (or colloïdal 5nm vs 15nm) Anticorps primaires despèces différentes Double marquage en post-enrobage (or colloïdal 5nm vs 15nm) Anticorps primaires de même espèce Face A Face B Face A Face B Face B Face A Co-localisation CRF/AVP dans léminence médiane Double marquage immunocytochimique à lor colloïdal Contrôle 5 nm : CRF 15 nm : AVP A, B : parvocellulaires C : magnocellulaires Surrénalectomie D : parvocellulaires E : magnocellulaires Bertini and Kiss, Neuroscience, 42, 237-244, 1991 Double marquage en pré/ post-enrobage (peroxydase/or colloïdal 15nm) Innervation sérotoninergique et GABA-ergique des neurones du noyau rouge
