biotechnologie végétale
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BIOTECHNOLOGIE VEGETALE Source de biomasse : - alimentation : matière premières indispensables pour l’alimentation humaine et animale - industries agroalimentaires : transformation de la matière première (ex : biscuiterie, industrie sucrières…) - industries semencières dépendant de l’amélioration génétique des plantes (travail de génétique sur des graines) - industrie de l’ornementation : utiliser les biotechnologies pour produire des plantes se prêtant à une commercialisation augmentée et simplifiée. - industrie papetière - industrie des biomatériaux Source d’énergie : - production des arbres et la filière « bois » - production de biocarburants : le végétale est une énergie durable Source de molécules complexes - substances odorantes : industrie des arômes et des parfums. Additifs alimentaires naturels - colorants - substances d’intérêt thérapeutique, industrie du médicament, phytothérapie. Organismes modèles pour la génétique : - découverte des loin de la génétique mendélienne - découverte des transposons - découverte de mécanismes de régulation d’expression d’un génome par des petits ARNs Début du génie génétique : modification du génome d’une plante pour regarder son fonctionnement car ce sont des eucaryotes et les croisements sont simples mises en place de technologie pour connaitre et modifier un génome. Très vite : utilisation du génie génétique dans un but agronomique. Rappel : les plantes ont 3 génomes : nucléaire (structuré comme chez l’animal avec des chromosomes), mitochondrial et chloroplastique. Leur expression est coordonnée, il faut donc toujours prendre en compte chacun de ces génomes et vérifier que l’on n’a pas perturbé l’équilibre qui règne. ARABIDOPSIS THALIANA : UNE PLANTE MODELE - diploïde : toutes les plantes ne sont pas diploïdes, beaucoup de phénomène de polyploïdie petit génome 115,4Mb 5 chromosomes peu de séquences répétées : ce qui est rare, même chez les plantes cycle de vie court (5 semaines) plusieurs milliers de graines avec de nombreux brassages génétiques donc beaucoup de descendants, ce qui permet de nombreux croisements taille moyenne de la plante désavantage : petite fleur, c’est très dur d’enlever la partie mâle de la plante. La bioinformatique permet de repérer d’éventuels gènes d’intérêt thérapeutique grâce à des algorithmes. La difficulté est que les gènes sont morcelés (introns et exons) nécessité d’épissage artificiel grâce à l’homologie des débuts et fins d’intron entre toutes les espèces. La bioinfo permet également de comparer plusieurs génomes. Lorsque l’on travaille sur un génome pas entièrement séquencé : 9% sont des gènes connus, 43% des séquences sont similaires à des protéines connues (fonction putative de la protéine, malgré l’homologie, les protéines n’ont pas forcément la même fonction d’une plante à l’autre), 19% correspondent à une EST (Espece Sequence Tag = étiquette de gènes exprimés) : Formation d’ADNc à partir de tous les ARNs de la plante grâce à une amorce complémentaire de la queue poly A connaissance de l’ADN transcrit donc exprimé et les 29% restants sont prédits par bioinformatique. Les gênes potentiels qui s’expriment : en rouge mais au niveau du centromère on trouve plus de couleur bleue. Sur une seconde ligne on ne met que les EST (preuve que ce gène est transcrit) : très peu d’EST au Biotechnologie Végétale (Hérouart 2010-2011) Page 1 niveau du centromère. Par contre, on trouve de nombreux facteurs de transcription codés par la région centrosomique. Certaines régions codent uniquement pour de l’ADN ribosomal. MODIFICATION DU GENOME PAR GENIE GENETIQUE Génomique = accès à l’information génétique totale du génome (génomique structurale) mais l’expression du génome via les gènes (génomique fonctionnelle) Technique de l’ADN recombinant : création d’un transgène = promoteur + ORF + 3’UTR Mais pour qu’il s’exprime dans n’importe quelle cellule il faut un promoteur spécialisé Universalité du code génétique : choix entres les gènes des plantes ou d’autres organismes Pour éviter le problème de l’épissage, on choisit toujours de l’ADNc Pour modifier le génome d’une bactérie : isoler un gène muté que l’on insert dans un plasmide qui n’est pas autoréplicable, puis on sélectionne la bactérie capable de faire de la recombinaison homologue. On ne sait pas faire ça chez les plantes, on ajoute de l’information ou on modifie l’expression mais on ne peut pas remplacer totalement un gène (on commence grâce au système Cre/lox). Les plantes transgéniques sont donc des mutantes d’insertion (même si on peut utiliser d’autres organismes que la plante pour le gène muté). Si on insert : promoteur + ORF pas de fin de transcription, ni poly-A sans lequel ils seront dégradés dans le noyau (sauf un). Il faut donc rajouter ces signaux en 3’UTR fonctionnelle chez la plante. Pour faire entrer le transgène : on fragilise les membranes mais le problème chez les végétaux est la présence de la paroi. L’induction du transgène peut donc être directe (physique ou chimique) ou indirecte (via agrobacterium tumefaciens). L’intégration du transgène se fait au hasard dans le génome de la plante du transgène ou de plusieurs copies du transgène. Problème : on ne peut pas maitriser le lieu de l’insertion du transgène (on peut mais c’est compliqué de sélectionner le peu de plante qui ont subit la recombinaison homologue, contrairement aux bactéries où il suffit d’un gène de sélection), ce qui peut perturber la région génique où il s’est inséré : on sélectionne les plantes qui l’ont intégré dans une séquence qui n’a pas d’impact (séquences répétées par exemple) afin de ne pas étudier la perte de fonction à cause du transgène mais bien l’expression de celui-ci. TRANSGENESE DIRECTE METHODE 1 - mélange de protoplastes (cellule sans paroi pectocellulosique grâce à des pectidases et cellulases) + ADN du transgène dans un tampon. - déstabilisation de la membrane plasmique pas un traitement chimique (polyéthylène glycol = PEG) ou par choc électrique (électroporation qui modifie le potentiel de membrane) - expression transitoire du transgène mais intégration dans le génome possible - régénération d’une plante à partir du protoplaste transgénique, mais très difficile. On sait dédifférencier une cellule végétale ! problème : un protoplaste est très fragile, beaucoup meurent. La régénération à partir d’un protoplaste est très difficile, notamment parce qu’il faut qu’elle régénère sa paroi. Méthode utilisée comme test afin de vérifier si le gène s’exprime de façon transitoire ou pas. METHODE 2 - bombardement de tissus végétaux (embryons, feuille…) de particules (avant on utilisait l’or) enrobées d’ADN du transgène grâce à des canons à particules survie de quelques cellules (assez faible) expression transitoire mais intégration au génome possible régénération d’une plante à partir des cellules transgéniques On utilise cette méthode pour le maïs car il n’est pas sensible à agrobacterium. Biotechnologie Végétale (Hérouart 2010-2011) Page 2 METHODE INDIRECTE : AGROBACTERIUM TUMEFACIENS C’est en étudiant une maladie de plante qu’à été découvert ce système : galle du collet (jonction entre la tige et ses racines) = prolifération cellulaire indéterminée (certains l’appellent cancer végétal). Cette maladie est le résultat d’une infection bactérienne par agrobacterium tumefaciens. Bactérie gram- qui vit dans le sol, préférentiellement dans la rhizosphère (au contact des racines de plantes, sans végétaux la bactérie survit mais ne se divise pas). Température de croissance optimale 28°C et à 37°C elle perd son plasmide (plasmide thermosensible) perd son pouvoir pathogène le plasmide contient de l’information essentielle pour la pathogénie : plasmide TI (tumor Inducing) Le plus simple pour muter une bactérie : grâce aux transposons (plus facile que par les mutations EMS) car on connait le transposon donc on peut savoir où il est inséré. Si l’insertion provoque une perte de fonction de la pathogénie : on a interrompu un gène nécessaire à la pathogénie. Plasmide isolé puis séquencé (un peu dur car gros) : gènes de virulence : vir. Ce sont des opérons (polycistroniques). L’insertion d’un transposon n’inhibe pas totalement le pouvoir pathogène (mais on considère qu’il l’inhibe totalement) tDNA (transfert DNA) : qui se transfert seul dans la cellule de galle (de la plante). Avant, on ne connaissait que les virus capables de transférer une partie de leur génome, en règle générale, les bactéries n’en sont pas capables. C’est une région qui possède des séquences bordantes particulières (droite et gauche) qui sont palindromiques qui correspondent à des sites de restriction capables de rompre la liaison phosphodiester par des protéines virD codées par les gènes vir du plasmide. 4 gènes entre ces séquences : deux (iaa) qui produisent un excès d’hormone végétale (auxines) chez la plante, 1 gène qui entraîne une surproduction de cytokinines (ipt). Ces gènes entraîne prolifération cellulaire indifférenciée (cal) ce sont des gènes oncogènes. Le quatrième gène code pour la production d’opines = dérivés d’aa (arg et lys) que l’on retrouve uniquement dans les cellules galleuses et dans certaines bactéries. Il code soit pour la nopaline synthase (NOS) ou l’octopine synthase (OCS). - un gène de catabolisme de l’opine non contenu dans la partie tDNA utilise l’opine produit par la plante (par le tDNA) comme substrat carboné et azoté pour proliférer. Cette infection se fait que sur une plante blessée car il dépend de la production d’un dérivé phénolique produit par la plante lorsqu’elle est blessée : les phenylpropanoïdes pour se défendre des pathogènes. Par exemple, l’acétosyringone est détectée par agrobacterium tumefaciens chimiotactisme qui attire la bactérie au contact de la plante (grâce aux rhizoflagelles des bactéries) cette molécule va induire l’expression des gènes vir de la bactérie. Vir A est une protéine membranaire qui s’auto phosphoryle suite à la détection de phenylpropanoides. Elle phosphoryle ensuite vir G par transfert de son groupement Phosphate, c’est un facteur de transcription de l’ensemble des protéines vir. Biotechnologie Végétale (Hérouart 2010-2011) Page 3 FONCTION PROTEINES DE VIRULENCE Production du tDNA = clivage de la liaison phosphodiester du plasmide grâce à virD sur un des brins du bord droit. o il peut être transferé sous forme monobrin à la plante. o Vir D est accroché à l’extrémité 5’ du tDNA o Il y a une protection du tDNA par une protéine Vir E2 o Le complexe T = ADN simple brin + Vir D + Vir E2 est sortie par Vir B (système de transport) mais on ne sait pas comment ce complexe rentre dans la cellule hôte de la plante. Peut être par opportunisme car on ne retrouve pas de mutant d’arabidopsis thaliana incapable de faire rentrer ce complexe. Les molécules Vir E2 et Vir D2 sont reconnues par la plante car elles ressemblent à des molécules normalement adressées au noyau, il y a donc translocation active par les pores nucléaires et insertion dans le génome par recombinaison homologue (=illégitime). PRODUCTION D’UN PLASMIDE TI DESARME En laboratoire, tout les gènes d’induction de la prolifération cellulaire (iaa, ipt, opine catabolisme) sont supprimés et les gènes vir permettant le transfert du transgène sont conservés. Problème : il est difficile d’obtenir un bon rendement avec un gros plasmide. Solution = division du plasmide en 2 plasmides : - mini plasmide Ti désarmé = ori T + ori T E.coli + promoteur 35S (fort et constitutif) + ORF + 3’ UTR (queue poly A pour sortir du noyau) + gène de sélection (antibiotique = NPT néomycine phosphotransférase II (aussi kanamycine)) Problème : transfert de ce gène de résistance à une autre espèce. - partie basse = plasmide helper Gènes rapporteur d’activité facilement repérables : luciférase ; GFP Méthode la plus utilisée sauf chez arabidopsis thaliana : Fragment de feuilles = blessure mis en contact avec A. tumefaciens Transfert sur un milieu de culture en agarose + minéraux en asepsie auxines + cytokines Kanamycine Autres antibiotiques (meurt A. tumefaciens) Antiobiotique bactériostatique : arrête la croissance bactérienne sans tuer les bactéries. Il y a formation d’un cal, il y a ensuite régénération pour reformer un organisme entier par culture en agar puis en terre. Ensuite il y a sélection des plantes qui n’ont qu’une copie du plasmide. TRANSFORMATION IN PLANTA VIA FLORAL DIP CHEZ A. THALIANA On part d’une plante en début de floraison, on plonge tout la partie aérienne dans une solution bactérienne d’A. tumefaciens. Il y a blessures dans les fleurs qui permettent le passage de la bactérie fécondation dans le milieu bactérien. Il y a production de graines transgéniques immédiatement. Utilisation d’un autres marqueur de sélection = tolérance a un herbicide (EPSP synthétase = résistance au gluphosate (roudup) ou PAT = glufosinate ammonium = Basta; AgrEvo = Liberty; Bayer). Il est egalement possible d’utiliser une autre souche bactérienne : agrobacterium rhizogenes. Obtention de plantes transgéniques composites = partie aérienne wt et racinaire transgénique. Il n’y a pas de formation de galle mais de cheveux racinaire anarchique. Ces racines prolifèrent sans aucun contrôle quelque soit le milieu. La culture de racine sans partie aérienne est possible. MODIFICATION DE L’EXPRESSION GENIQUE CHEZ UNE PLANTE Biotechnologie Végétale (Hérouart 2010-2011) Page 4 2 options : - surexpression = promoteur constitutif - Extinction = ARN interférence production d’un ARNm antisens : 35S + petite partie 3’ UTR de l’ORF (famille multigénique) + boucle + même fragment antisens + 3’ UTR gène X Il y a formation d’un ARN double brin qui est une aberration provoquant la mise en place d’un système détruisant tout ARN ressemblant à celui-ci y compris les endogènes. PLANTES TRANSGENIQUES RESISTANTES AUX HERBICIDES On ne veut pas de mauvaises herbes dans un champ pour ne pas avoir de compétition pour les nutriments-> problème de rendement et utilisation d’herbicides qui peuvent être néfastes pour l’homme à certaines doses. Résistance au glyphosate (roudup du méchant Monsanto !) : Pour qu’une plante soit plus tolérante, il faut plus d’enzyme d’EPSP synthase pour les mêmes concentrations de glyphosate et de PEP synthèse d’aa aromatiques. Plantes transgéniques avec surexpression du gene codant pour l’enzyme EPSP synthase. On peut donc mettre moins de glyphosate ou moins régulièrement mais et soja transgénique résistants à l’herbicide. RESISTANCE AUX INSECTES PHYTOPHAGES Résistance aux insectes phytophages, sous forme larvaire (chenille) qui sont de grands destructeurs de parties aériennes, posent un problème de rentabilité et entraine une perte de culture. Pour lutter, les chercheurs ont découvert une bactérie : bacillus thuringiensis, gram +. On épand cette bactérie à l’état de spore. Lorsqu’elle sporule elle produit des cristaux d’une toxine : entomotoxine qui va être toxique pour les insectes. c’est une famille de gènes qui codent pour ces protéines Cry (gènes Cry IA,IB, II, III…). La protoxine n’est pas toxique, la partie N-term va être clivée dans l’intestin de l’insecte. Cette protéine entraine des problèmes neurobiologiques qui altèrent le transit intestinal. Si il existe une famille de gènes c’st qu’il y a eu sélection et évolution de cette protéine. Ce n’est pas la même toxine selon la nature de l’insecte. En utilisant des toxines, il est possible d’obtenir des phénotypes résistants. On va directement faire produire les toxines par la plante sans passer par la bactérie. Sur des plants de tabac, les chercheurs ont surexprimé les gènes codant pour la toxine. Mais son veut faire exprimer le gène qu’à l’endroit où les chenilles attaquent la plante. PRODUCTION DE PLANTES OGM DANS LE MONDE : CONTRAINTES OGM : - autorisation attention : le mais ne peut pas se croiser avec aucune flore européenne, on ne peut pas utiliser le cola qui lui peut se croiser il faut donc déclarer avant de faire des essais en champs couverts En France on a testé : le tabac du sud ouest parce qu’il est très facile à transformer et que l’on connait bien dans le monde on cultive : soja > mais > coton > colza OBJECTIF DE L’AMELIO RATION DES PLANTES - rendement / productivité qualité : visuel, odorat, gout et le plus adapté possible pour un futur adaptation à l’environnement : abiotique = eau, acide, froid résistance aux maladies et parasites réduction des intrants production de bioproduits développement durable ? Biotechnologie Végétale (Hérouart 2010-2011) Page 5 LA SELECTION VEGETALE : - - exploitation de la biodiversité génétique mondiale, écosystème pour faire des agrosystèmes. Agrosystème composé d’un patrimoine génétique pour une surface donnée goulot d’étranglement dans la biodiversité, si la plante n’arrive pas à s’adapter, on perd tout le champ obtenir de nouvelles combinaisons de caractères d’intérêt par croisement des géniteurs modifier le génome des plantes pour : - augmenter la diversité génétique des parents géniteurs - étudier la fonction des gènes LES GRANDES ETAPES ACTUELLES DE LA SELECTION : OBJECTIFS : - recenser le matériel génétique existant (variabilité naturelle ou induite) choisir et croiser le matériel de départ créer des lignées hybrides fixer les caractères évaluer la valeur agronomique de la variété inscrire la nouvelle variété au catalogue multiplier les semences commercialisation des… METTRE LE PROGRES GENETIQUE A LA DISPOSITION DES AGRICULTEUR Ce sont des back cross qui permettent d’obtenir une lignée pure d’un caractère B à partir d’une plante hétérozygote. On veut donc des souches les plus homozygotes possible pour faire de la sélection afin de voir la vigueur hybride. Pour obtenir ces homozygotes on part d’haploïdes et on duplique de façon chimique le patrimoine génétique. ex : grain de pollen ou ovule. Ceci est faisable grâce à la potentialité des cellules de se dédifférencier. FORMATION DE PLANTES ANDROGENETIQUE AFIN DE FAIRE DE L’ANDROGENESE. On part de l’anthère que l’on cultive sur milieu synthétique particulier afin de transformer le pollen en une plante. Selon les plantes, on a deux possibilités soit le grain de pollen (microspore) donne directement un embryon (androgenèse directe) ou alors formation d’un cal (indirecte) il faudra alors induire la formation d’un embryon viable haploïde qui donnera une plante haploïde. FORMATION DE PLANTES GYNOGENETIQUES AFIN DE FAIRE DE LA GYNOGENESE Il est possible de faire la même chose en utilisant l’ovaire qui contient les ovules (oosphères) = gynogenèse plantes haploïdes gynogénétiques. PROBLEME : Les plantes haploïdes sont souvent stériles (même s’il y a formation de la fleur). Il faut donc trouver une technique pour rendre ces fleurs diploïdes. SOLUTION : MUTAGENESE La colchicine est un puissant mutagène toxique qui entraine une multiplication sans division du matériel génétique. Cette duplication va également se faire dans les cellules méristématiques (cellules qui se divisent). Obtention d’une plante hybride diploïde homozygote fertile, et l’autre partie sera haploïde stérile. On récupère la partie diploïde afin de faire une diploïdisation. MULTIPLICATION VEGETATIVE CONFORME = MICROBOUTURAGE. Induction d’un développement d’un bourgeon en nombre infini. In vitro. Utilisée pour sauver des plantes (ex : pommes de terre) car elle permet de conserver le matériel génétique et de le multiplier à l’infini. Elle est également utiliser dans la formation de plantes ornementales. Problème : ça coute très cher, donc on privilège la préservation de quelques matériels génétiques très sensibles ou pour des plantes qui ont du mal à pousser sous serre. Biotechnologie Végétale (Hérouart 2010-2011) Page 6 La biotech essaye de passer au travers de la reproduction sexuée qui est une grande barrière, notamment inter-espèces. On peut faire des protoplastes qui peuvent fusionner même si ce ne sont pas les mêmes espèces sans qu’il n’y ait eu de fécondation sexuée. On peut également introduire un gène par génie génétique. UNE TROISIEME TECHNIQUE : LA CULTURE D’EMBRYON SANS LA GRAINE Normalement, l’embryon est protégé par l’enveloppe de la graine ou carrément un tissu spécialisé. Problème : avortements d’embryon, le grain de pollen ne germe pas sur l’autre plante barrière spécifique stricte ou le tissu maternel rejette l’embryon. Mais il est possible de sauver cet embryon voué à la mort sorti de la graine. Il faut connaitre le génome pour maitriser exactement ce que l‘on veut apporter comme matériel génétique contrairement à un mélange aléatoire. Augmenter la variabilité génétique : mutagénèse, création de variants, culture d’embryons immatures, fusion de protoplaste, transfert de gènes … on peut passer d’un cycle de 10 à 6ans CLASSIFICATION DES PRODUITS DANS UNE PLANTE - - métabolites primaires : toute molécule impliquée dans la survie, la structure, dans métabolisme primaire qui permet à la cellule de fonctionner (prot qui permettent trad/ transc, duplication ADN…) intermédiaires chimiques dans les grands cycles métaboliques. Sans eux, mort de la plante. Grandes ressemblances avec les cellules animales possibilité de faire des polymères (glcamidon) pour l’adaptation des plantes, essentiel de la biomasse végétale métabolites secondaires : molécules produites en réponse des conditions environnementales qui aide la plante à survivre, lutter, s’adapter mais elles ne sont pas vitales. La plante ne va donc pas produire tout le temps les mêmes métabolites secondaires. CHIMIE LOURDE : Un polymère = unité multipliée à l’infini : amidon, hémicellulose, cellulose, lignine, huiles (+ ou – insaturées que l‘on utilise en diététique) et certaines protéines. Ils sont utilisés afin de faire des produits biodégradables contrairement aux produits issus du pétrole qui sont très stables dans l’environnement. FACTEURS LIMITANTS D E CES POLYMERES BIODEGRADABLES : - prix : très cher (3 à 4 fois plus élevés que les plastiques issus du pétrole) - cout de mise au point des produit et de développement, car c’est très difficile - concurrence industrielle - absence de filières de récupération et de compostage pour le développement durable - confronter les filières de production sans déstabilisation des approvisionnements du marché alimentaire compétition pour les plantes avec l’agroalimentaire, moins d’exportation problème dans les pays en voie de développement qui vivent de notre surplus de biomasse. METABOLITES SECONDAIRES Production répandue ou restreinte à des familles particulières (plantes médicinales), aux genres ou même à l’espèce. Propriétés : bactéricides, insecticides, compétition des plantes pour l’attraction des pollinisateurs, peuvent éloigner les herbivores. Production en très faible quantité, ce qui pose un problème. Ils sont utilisés pour les drogues et produits pharmaceutiques, colorants, édulcorants, matières de base pour les industries chimiques (savons, essences naturelles…) 3 familles majeures : phénylpropanoides, terpènes, alcaloïdes (nicotine, cocaine, cafféine, ce sont les plus utilisés pour la production de médicaments) Production de molécules thérapeutiques cosmétiques d’origine végétales. Extraction à partir de plantes sélectionnées : caractérisation dgénétique de splantes, utilisation de plante génétiquement modifiées. Culture de cellules végétales et production de molécules uniquement en laboratoire : alternative à la culture en champ et à l’utilisation d’animaux ou de cellules. On laisse la cellule à l’état indifférencié. jasmonate, acide salicylique (=, métaux lourds Biotechnologie Végétale (Hérouart 2010-2011) Page 7
