Remerciements

Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Remerciements J’aimerais remercier toutes les personnes qui m’ont aidée, d'une manière ou d'une autre,
dans l’accomplissement de mon stage et de mon mémoire.
Je veux d’abord remercier mes parents pour tous ce qu’ils ont faits pour moi. Merci
maman et papa, pour la chance et la confiance que vous m’avez données, l’opportunité
de me laisser partir en France, pour les bons soins, d’être toujours présent dans les
moments difficiles, … Merci pour tout.
Aussi un grand merci à toute ma famille et à mon compagnon pour l’appui moral qu’ils
m’ont donné pendant ces quatre mois.
Ensuite, je remercie de tout cœur l’équipe complète de Monsieur Lehmann. Grâce à eux
mon stage a été agréable et très instructif. Je me suis directement sentie acceptée dans
l’équipe et ils m’ont toujours soutenu. J’ai toujours pu compter sur eux. Un merci spécial
à Monsieur Stephane Roche et Monsieur Sylvain Lehmann pour la manière dont ils
m’ont guidé pendant mon stage et leurs conseils lors de la rédaction de mon mémoire.
Après je remercie Monsieur Bart Quartier pour la réalisation de mon dossier
« ERASMUS » et Madame Nicole Kellner pour m’avoir aidé à trouver mon stage. Je
tiens également à remercier avec Madame Mieke Demeyere pour la coordination de mon
mémoire.
Bien sûr, je remercie tous mes professeurs de Howest, département Simon Stevin, pour
les connaissances qu’ils m’ont apporté pendant ces trois ans.
Saeremans Evyne 1 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Résumé Dans ce projet, nous faisons une étude protéomique. L’étude utilise quatre sortes des
cellules de quarte personnes différentes:
1. Monocytes
2. Ostéoclastes dérivés de monocytes (stade terminale de différenciation)
3. Cellules dendritiques
4. Ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques (stade terminale de différenciation)
Les cellules viennent des personnes avec la maladie polyarthrite rhumatoïde.
Les protéines proviennent de cellules cultivées dans un laboratoire à Lyon (France).
D’abord nous faisons l’extraction des protéines. Cette extraction est faite grâce à un
tampon de lyse. Ceci évite d’avoir à séparer les cellules du support par une technique
enzymatique qui dégraderait les protéines.
Ensuite, nous pouvons réaliser le dosage des protéines. Il a pour but de déterminer la
concentration en protéines dans chaque échantillon. Notre méthode de dosage utilise une
précipitation préalable des protéines, car le tampon de lyse n’est pas compatible avec le
dosage. Il nécessite en premier lieu la préparation d’un courbe étalon réalisé à partir de
bovine serum albumine (BSA) à différentes concentrations. Cette courbe est décroissante:
plus l’échantillon est concentré, moins il absorbe à 480 nm. Les protéines forment un
complexe avec un colorant. Ce complexe absorbe à 480 nm. La mesure de l’absorbance
des échantillons et la comparaison avec la courbe étalon permettent de déduire la
concentration en protéines.
Pendant la première dimension les protéines vont être séparées dans un champ électrique
selon leur point isoélectrique (pI). Cette séparation s’effectue sur une bandelette
contenant un gel d’immobiline déshydraté (gel d’acryl/bisacrylamide à 4% et un
ampholyte créant un gradient de pH stable). L’ampholyte est un mélange complexe de
molécules tampons amphotères qui permet de créer un gradient continu.
Au départ, les bandelettes de première dimension sont déshydratées, elles sont capables
d’absorber au maximum 250 μl d’échantillon lors de leur réhydratation dans le tampon.
Nous plaçons dans un sarcophage l’échantillon dont le volume a été ajusté à 250 μl et une bandelette de focalisation. Le volume de protéines à déposer est déduit de la
concentration. Grâce à la deuxième dimension les protéines vont être séparées selon leur poids
moléculaire apparent.
Les bandelettes de la première dimension sont réhydratées avec un tampon SDSéquilibration contenant en premier lieu du dithiothreitol (DTT) puis de l’iodoacétamide.
Elles sont ensuite déposées en haut des gels. L’ensemble est scellé avec de l’agarose qui
permet le contact direct avec le tampon de migration.
Les gels sont déposés dans les cuves de migration en présence du tampon de migration.
La séparation selon le poids moléculaire apparent a ensuite lieu dans un champ
électrique.
Saeremans Evyne 2 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Une fois la migration terminée les gels sont placés dans une solution de fixation et sont
maintenus sous agitation jusqu’à la coloration.
Pour l’analyse des gels, nous colorons les gels au nitrate d’argent. Ensuite, ils ont été
digitalisés et analysés par le logiciel Progenisis SameSpots. Cela nous permet de conclure de
les monocytes sont plus différent que tous les autres cellules.
L’identification des protéines est possible si nous colorons les gels au bleu de Coomassie.
Pour cela les cellules identiques de chaque personne ont été mélangées. Nous ne pouvons
encore rien conclure parce que l’identification avec le spectrophotomètre est encore en
cours.
Saeremans Evyne 3 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Abréviation et symboles Ac
ACR
APS
BSA
CHAPS
CRP
DDT
DMARD's
EDTA
FGF
GM-CSF
HLA
IEF
IL-1
IPG
Lymphocyte B
Lymphocyte T
NK cells
NSAID's
PAA
pH
pI
SDS
SDS-PAGE
TEMED
TNF-a
TRIS
VS
Saeremans Evyne Anticorps
American College of Rheumatology
Ammonium persulfate
Bovine serum albumine
3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]1-propanesulfate
C-reactive protein
Dithiothreitol
Disease-modifying antirhumatic drugs
Ethylenediaminetetraacetic acid
Fibroblast growth factor
Granulocyte-macrophage colony stimulating factor
Human leucocyte antigen
Isoelectric focusing
Interleukine 1
Immobilized pH gradient
Lymphocyte bone
Lymphocyte thymus
Naturel Killer Cells
Non-steroidal anti-inflammatory drugs
Polyacrylamide
Potentiel hydrogène
Point isoélectrique
Sodium dodecyl sulfate
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Tetramethylethylenediamine
Tumor necrosis factor alpha
2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol
Vitesse de sédimentation
4 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Glossaire Antigènes des leucocytes humains
Ce sont des molécules à la surface des cellules
qui permettent l'identification par le système
immunitaire.
Chondrocyte
Ce sont les cellules du cartilage.
C-reactive protéine
Une protéine de phase aiguë de la réponse
immunitaire exclusivement synthétisée par le
foie.
Cytokine
Ce sont des substances solubles de
communication synthétisées par les cellules du
système immunitaire ou par d'autres cellules
et/ou tissus, agissant à distance sur d'autres
cellules pour en réguler l'activité et la fonction.
Effet Peltier
C'est un phénomène physique de déplacement
de chaleur en présence d'un courant L'effet se
produit dans des matériaux conducteurs de
natures différentes liés par des jonctions
(contacts). L'une des jonctions se refroidit alors
légèrement, pendant que l'autre se réchauffe.
Un autre nom c'est effet thermoélectrique
électrique.
Facteur de croissance des fibroblastes
C'est une famille de 22 protéines identifiées à
ce jour chez l'homme. Ce sont des protéines
qui activent la migration et la multiplication de
cellules cibles.
Facteur nécrosant des tumeurs alpha
C’est une importante cytokine impliquée dans
l'inflammation systémique et dans la réaction
de phase aiguë.
Fibroblaste
C'est une cellule présente dans le tissu
conjonctif, elle est parfois appelée cellule de
soutien.
Granulocyte-macrophage colony
stimulating factor
Saeremans Evyne C'est une cytokine avec les fonctions d’un
globule blanc facteur de croissance. Il stimule
les cellules souches pour produire des
granulocytes et monocytes.
5 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Granulocyte
C'est un globule blanc qualifié de ‘non
spécifique’ dans la mesure où il n’a pas dirigé
contre un seul antigène.
Immunoglobuline
La superfamille des immunoglobulines est un
large groupe de glycoprotéines membranaires
mais aussi solubles, impliquées dans les
phénomènes de reconnaissance, de liaison et
d'adhésion des cellules.
Interleukine 1
C’est une cytokine sécrétée par les
macrophages, les monocytes et les cellules
dendritiques. Elle joue un rôle proéminent dans
la réponse inflammatoire du corps aux
infections.
Leucocyte
Les leucocytes ou globules blancs sont des
cellules produites dans la moelle osseuse et
présentes dans le sang, la lymphe, les organes
lymphoïdes (ganglions, rate, amygdale et
végétations adénoïdes et plaques de Peyer) et
de nombreux tissus conjonctifs de l'organisme.
Lymphocyte B
Ce sont des lymphocytes qui ont pour rôle de
fabriquer des immunoglobulines appelées
anticorps: ils sont donc responsables de
l'immunité humorale.
Lymphocyte T
Il joue un grand rôle dans la réponse
immunitaire secondaire. « T » est l'abréviation
de thymus, l'organe dans lequel leur
développement s'achève.
Ils sont responsables de l'immunité cellulaire.
Lysosome
Ce sont des organites intracellulaires présents
dans le cytosol. Ils ont pour fonction de
dégrader des composant par grâce à trois types
d'enzymes: des lipases, des protéases et des
osidases.
Saeremans Evyne 6 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Macrophage
Les macrophages sont des cellules infiltrant les
tissus. Ils proviennent de la différenciation de
leucocytes sanguins, les monocytes. Les
monocytes et les macrophages sont des
phagocytes (cellules capables de phagocytose).
Ils participent à l’immunité innée en tant que
défense non-spécifique, mais sont capables de
participer à l’immunité adaptative via le
phénomène d’opsonisation. Leur rôle est de
phagocyter les débris cellulaires et les
pathogènes. À l’instar des cellules dendritiques,
ils sont capables de se comporter comme
cellule présentatrice d'antigène. C'est une
grosse cellule arrondie avec un noyau excentré
et des vacuoles dans son cytoplasme.
Natural Killer Cells
Ce sont des cellules de l'immunité innée des
mammifères. Ils sont capables de lyser des
cellules étrangères à l'organisme de manière
indépendante de l'antigène et sans activation
préalable.
Ostéoclaste
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées
possédant de quelques noyaux à une
cinquantaine de noyaux (syncytium) d'origine
hématopoïétique. Les cellules myéloïdes se
différencient en promonocytes pour donner
ensuite naissance aux: - cellules dendritiques monocytes (puis macrophages par fusion des
monocytes) - pré-ostéoclastes (puis ostéoclastes
par fusion des pré-ostéoclastes). Ce sont les
cellules responsables de la résorption osseuse,
d'une part en diminuant le pH au contact de la
matrice osseuse, d'autre part en sécrétant des
enzymes protéolytiques, ce qui amène la
dégradation de la trame osseuse. Ils sont
présents dans le tissu osseux en voie de
résorption.
Phagocytose
Le procédé par lequel les microbes sont détruits
par certains globules blancs ou leucocytes.
Saeremans Evyne 7 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Plasmocyte
Saeremans Evyne Les plasmocytes (parfois appelés cellules
plasmatiques ou plasmatocytes) sont des
globules blancs du sang. Ces cellules sont
productrices d'anticorps, et elles sont le stade
final de différenciation des lymphocytes B. A la
différence d'autres Lymphocytes B, qui
présentent leurs anticorps au niveau de leur
surface membranaire, les plasmocytes sont
capables de produire des anticorps solubles. De
plus, ces cellules se caractérisent par une
incapacité de prolifération (contrairement aux
autres stades d'activation des lymphocytes).
8 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Liste des tables et illustrations Figure 2‐2: Gauche = articulation normale, droite = articulation avec polyarthrite rhumatoïde [3] .................................. 16 Figure 2‐3: La cause de polyarthrite rhumatoïde [2] ............... 18 Figure 2‐4: L’usage du DMARD’s et NSAID’s ......................... 18 Figure 2‐5: Charge des protéines .................................. 20 Figure 2‐6: L'effet de sodiumdodecylsulfate (SDS) [8] ............. 22 Figure 2‐7: Le bisacrylamide « branche » a l’acrylamide .......... 23 Figure 2‐8: Les étapes du Western Blot [12] ....................... 24 Figure 3‐1: Dépôt de l’échantillon ................................ 28 Figure 3‐2: Dépôt de la bandelette ................................ 29 Figure 3‐3: Dépôt du sarcophage dans l’iPGPhor .................... 29 Figure 3‐4: Panneau de contrôle de l’IPGPhor ...................... 30 Figure 3‐5: Première ensemble ..................................... 31 Figure 3‐6: Deuxième ensemble ..................................... 31 Figure 3‐7: Troisième ensemble .................................... 32 Figure 3‐8: Manière pour serrer les vis ........................... 32 Figure 3‐9: L’ensemble pendant la polymérisation .................. 33 Figure 3‐10: La vue d'en haut pour couler les gels ................ 33 Figure 3‐11: La vue de face pour couler les gels .................. 33 Figure 3‐12: L’ensemble pendant la polymérisation ................. 34 Figure 3‐13: L’ensemble préparé pour le Hoefer Electrophorese Unit 34 Figure 3‐14: le Hoefer Electrophorese Unit ........................ 35 Figure 3‐15: Ouvrir ou créer un document avec Progenis SameSpots .. 39 Figure 3‐16: Une vue d’ensemble de Progenis SameSpots ............. 39 Figure 3‐17: Cadre Vector Editing ................................. 40 Figure 3‐18: Cadre Whole Image .................................... 40 Figure 3‐19: Adapter la grandeur du cadre orange et le contraste des gels .............................................................. 40 Figure 3‐20: L’écran après avoir appuyé sur Automatic Vecteurs .... 41 Figure 3‐21: L’écran pour la fonction prefiltering ................ 42 Figure 3‐22: L’écran pour ajouter des groups ...................... 42 Figure 3‐23: L’écran pour organiser les gels ...................... 43 Figure 3‐24: L’écran avec les résultats ........................... 44 Figure 4‐1: Courbe standard acquis la première fois ............... 54 Figure 4‐2: Courbe standard acquis la deuxième fois ............... 55 Figure 4‐3: Courbe standard acquis la troisième fois .............. 56 Figure 4‐4: Courbe standard acquis la quatrième fois .............. 58 Figure 4‐5: Exemple d’une protéine présente chez les monocytes .... 61 Figure 4‐6: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les monocytes ..................................................... 61 Figure 4‐7: Exemple d’une protéine présente chez les monocytes et les cellules dendritiques ......................................... 62 Saeremans Evyne 9 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Figure 4‐8: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les monocytes et les cellules dendritiques ........................ 62 Figure 4‐9: Exemple d’une protéine présente chez les cellules dendritiques ...................................................... 63 Figure 4‐10: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les cellules dendritiques ......................................... 63 Figure 4‐11: Exemple d’une protéine présente chez les ostéoclastes dérivés de monocytes et les ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques les cellules dendritiques ............................ 64 Figure 4‐12: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les ostéoclastes dérivés de monocytes et les ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques les cellules dendritiques ................... 64 Figure 4‐13: Un exemple d’une protéine qui est représentées par plusieurs spots ................................................... 65 Figure 4‐14: Un exemple d’une protéine qui est stable ............. 66 Figure 4‐15: La graphique d’une protéine stable ................... 66 Figure 4‐16: La l’actine est une protéine stable chez les quatre sortes des cellules ............................................... 67 Figure 4‐17: La graphique de la l’actine, une protéine stable chez les quatre sortes des cellules .................................... 67 Figure 4‐18: Un exemple d’une protéine ou le logiciel a fait une faute d’association ............................................... 68 Figure 4‐19: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de monocytes ...................................................... 69 Figure 4‐20: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de monocytes ...................................................... 70 Figure 1: Gel coloré au bleu de Coomassie: Cellules dendritiques .. 78 Figure 2: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques ............................................. 79 Figure 3: Gel coloré au bleu de Coomassie: Cellules dendritiques ‐ Positions des protéines piquées ................................... 81 Figure 4: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques ............................................. 82 Saeremans Evyne 10 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Tableau 2‐1: Plan faisable pour IEF ............................... 21 Tableau 3‐1: Numéro externe versus numéro interne ................. 25 Tableau 3‐2: Composition de la solution de coloration dépendant du nombre d’échantillons ............................................. 26 Tableau 3‐3: Composition de la gamme étalon BSA ................... 27 Tableau 3‐4: Composition des solutions pour la coloration au nitrate d’argent .......................................................... 38 Tableau 3‐5: Mélange pour réaliser l’identification des protéines . 46 Tableau 3‐6: Solutions pour l’extraction des peptides ............. 48 Tableau 4‐1: Résultats de la gamme étalon, première fois .......... 53 Tableau 4‐2: Résultats des échantillons 480 jusqu'à 487 ........... 53 Tableau 4‐3: Résultats de la gamme étalon, deuxième fois .......... 54 Tableau 4‐4: Résultats des échantillons 488 jusqu'à 495 (deuxième fois) ............................................................. 55 Tableau 4‐5: Résultats de la gamme étalon, troisième fois ......... 56 Tableau 4‐6: Résultats de la gamme étalon, quatrième fois ......... 57 Tableau 4‐7: Résultats des échantillons 488 jusqu'à 495 (quatrième fois) ............................................................. 57 Tableau 4‐8: Résultats de la première dimension ................... 59 Tableau 4‐9: Résultats de la deuxième dimension ................... 60 Tableau 4‐10: Résultats de la première dimension (gradient pH 4‐7) 68 Tableau 4‐11: Résultats de la deuxième dimension (gradient pH 4‐7) 69 Tableau 1: Composition du tampon de lyse .......................... 75 Tableau 2: Composition du tampon réhydratation .................... 75 Tableau 3: Composition du tampon de migration ..................... 75 Tableau 4: Composition du tampon ‘Gel Bas’ pH 8,8 ................. 76 Tableau 5: Composition du tampon SDS‐équilibration ................ 76 Tableau 6: Composition de la solution de fixation ................. 77 Saeremans Evyne 11 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Sommaire Remerciements ...................................................... 1 Résumé ............................................................. 2 Abréviation et symboles ............................................ 4 Glossaire .......................................................... 5 Liste des tables et illustrations .................................. 9 Sommaire .......................................................... 12 1 Introduction, aperçu de la situation et énoncé du problème .... 14 2 Bibliographie ................................................. 15 2.1 Qu'est‐ce que la polyarthrite rhumatoïde? .................. 15 2.1.1 Arthrite ............................................... 15 2.1.2 Le diagnostic .......................................... 18 2.1.3 Quelles sortes de médicament y a‐t‐il? .................. 18 2.2 La protéomique par électrophorèse bidimensionnelle ......... 19 2.2.1 Première dimension ...................................... 19 2.2.2 Deuxième dimension ...................................... 21 2.3 Visualisation des protéines ................................ 23 2.3.1 Coloration au nitrate d’argent .......................... 23 2.3.2 Bleu de Coomassie ...................................... 24 2.3.3 Western Blot ............................................ 24 3 Matériel et méthodes .......................................... 25 3.1 Extraction des protéines ................................... 25 3.2 Dosage des protéines ....................................... 26 3.3 Analyse des gels ........................................... 28 3.3.1 Focalisation isoélectrique .............................. 28 3.3.2 SDS–PAGE ................................................ 31 3.4 Identification des protéines ............................... 46 3.4.1 Focalisation isoélectrique .............................. 46 3.4.2 SDS‐PAGE ................................................ 47 3.4.3 Coloration au bleu de Coomassie ......................... 47 3.5 Autres appareillages utilisés .............................. 50 Saeremans Evyne 12 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde 4 Résultats et discussion ....................................... 53 4.1 Dosage des protéines ....................................... 53 4.1.1 Première fois ........................................... 53 4.1.2 Deuxième fois ........................................... 54 4.1.3 Troisième fois .......................................... 56 4.1.4 Quatrième fois .......................................... 57 4.2 Analyse des gels ........................................... 59 4.2.1 Focalisation isoélectrique .............................. 59 4.2.2 SDS–PAGE ................................................ 60 4.2.3 Nitrate d’argent ........................................ 60 4.3 Identification des protéines ............................... 68 4.3.1 Focalisation isoélectrique .............................. 68 4.3.2 SDS‐PAGE ................................................ 69 4.3.3 Blue de Coomassie ....................................... 69 5 Conclusion .................................................... 71 Références bibliographiques ....................................... 72 Annexes ........................................................... 74 Annexe 1–Préparation des tampons ................................ 75 Annexe 2–Résultats: coloration au bleu de Coomassie ............. 78 Annexe 3–Résultats: Coloration au bleu de Coomassie, positions des protéines piquées ............................................... 80 Saeremans Evyne 13 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde 1 Introduction, aperçu de la situation et énoncé du problème Ce projet est réalisé dans le laboratoire Biochimie B à Montpellier. Le laboratoire
Biochimie B est composé d’une partie délocalisé du CNRS et d’une partie hospitalière.
CNRS est l’abréviation pour Centre Nationale de la Recherche Scientifique. Le
laboratoire se trouve dans les bâtiments de l’hôpital Saint-Eloi. Elle a une triple vocation:
1. La recherche clinique
2. Les actes d’analyse de biologie médicale
3. La formation des internes et stagiaires
Le responsable d’Unité est Pr. Lehmann, Ph.D. et MD, le biologiste Dr. Roche, Ph.D.
Touts les deux m’ont guidé pendant ce projet.
Ce rapport de stage est une partie d’un projet sur les ostéoclastes. Le but de ce rapport est
l’étude protéomique de la différenciation des ostéoclastes. La technique utilisée est
l’électrophorèse 2D. Ainsi nous séparons les protéines en deux phases successives. Dans
la première dimension ou la focalisation isoélectrique, les protéines sont séparées selon
leur point isoélectrique. Dans la deuxième dimension ou le SDS–PAGE, les protéines
sont séparées selon leur poids moléculaire.
Pour l’analyse des gels, nous les colorons avec le nitrate d’argent. L’analyse est possible
avec le logiciel Progenesis SameSpots. L’indentification est possible si nous colorons les
gels avec le bleu de Coomassie. Pour indique quelle protéines nous avons piqué, nous
utilisons le logiciel ImageMaster en Melanie Vieuwer. La différence entre les réalisations des
gels est que les gels pour l’analyse sont réalisé avec un gradient de pH 3-10 et pour
l’identification un pH gradient de 4-7.
Saeremans Evyne 14 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie 2 Bibliographie Dans ce projet nous avons travaillé avec des cellules polyarthrite rhumatoïde en
protéomique. Voici une explication sur la maladie et les techniques utilisées.
2.1 Qu'est‐ce que la polyarthrite rhumatoïde? La polyarthrite rhumatoïde est une maladie autoimmune: le système immunitaire se
retourne contre son propre corps. Les lymphocytes, agents du système immunitaire, font
dégrade le tissu synovial et provoquent des synovites. Pendant l’inflammation, le tissu
synovial augmente de taille et provoque un gonflement [1].
La polyarthrite rhumatoïde est l’affection rhumatismale la plus courante. La maladie
affecte principalement les articulations périphériques (mains, pieds et genoux) mais aussi
d’autres organes.
L’American College of Rheumatology (ACR) a dressé une liste de critères pour classer les
syndromes. Au minimum quatre de sept critères suivants doivent être remplis:
1. Raideur du matin (minimum une heure)
2. Arthrite dans trois ou plus de domaines articulaires
3. Arthrite dans les articulations des mains
4. Enflure symétrique
5. Présence de nodules rhumatoïdes
6. Présence de facteurs rhumatoïdes dans le sérum
Les facteurs rhumatoïdes sont des anticorps qui sont axés sur les fragments
constants d’anticorps.
7. Changement radiologique typique de la polyarthrite rhumatoïde [2]
2.1.1
Arthrite [3] Sur la figure 2.1 (à gauche), est schématisée une articulation normale et sur la figure 2.1
(à droite) une articulation arthritique.
Typique pour une articulation normale, on voit l’os (numéro 1 sur figure 2.1), la capsule
articulaire (numéro 2 sur figure 2.1) et la synovie (numéro 3 sur figure 2.1). Dans une
arthrite, la muqueuse grossit. Il y a plus de synovies et il se forme des diverticules
(numéro 4 sur figure 2.1). Cela cause les symptômes inflammatoires. Dans un stade plus
avancé dans la maladie, le cartilage et l’os peuvent être endommagés (numéro 5 sur
figure 2.1).
En plus des articulations, les tendons et les muscles peuvent être atteint. Les gaines
tendineuses sont couvertes par une muqueuse. Cette muqueuse peut être inflammée et le
tendon ne peut plus bouger librement.
Saeremans Evyne 15 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie Figure 2-1: Gauche = articulation normale, droite = articulation avec polyarthrite rhumatoïde [3]
2.1.1.1
Structure cellulaire de la membrane synoviale [2] Une caractéristique typique de la polyarthrite rhumatoïde est l’élargissement et la
distension de la membrane synoviale associée à une prolifération de la couche cellulaire,
essentiellement des macrophages et des fibroblastes. Une infiltration des lymphocytes T
peut être observée.
2.1.1.2
Cellules dans l’articulation arthrite Dans l’articulation arthrite, on retrouve les cellules suivantes:
ƒ les lymphocytes T,
ƒ lymphocytes B,
ƒ plasmocytes,
ƒ granulocytes,
ƒ lymphocytes NK (sigle de l'anglais Natural Killer),
ƒ cellules dendritiques,
ƒ monocytes/macrophages et
ƒ cellules de l’endothélium [2].
Dans ce projet, les monocytes et les cellules dendritiques sont les cellules utilisées.
Les monocytes
Les monocytes sont des cellules sanguines de la famille des leucocytes (globules
blancs) qui évoluent en macrophages.
Les précurseurs de ces cellules se trouvent dans la moelle osseuse rouge sous
formes de monoblastes qui évolueront en promonocytes. Les phagocytes qui en
dérivent sont responsables de la phagocytose et sont présents dans le sang et dans
certains tissus.
Ce sont les plus grandes cellules circulant dans le sang. Ils ont une forme ronde ou
ovale.
Il comporte de très fines granulations (contenant plusieurs variétés d'estérases) et
de nombreux lysosomes (le monocyte est en effet capable de phagocytose.) Son
noyau est de forme variable (dit en "drapeau" ou en "fer à cheval"). Le monocyte
est une cellule mobile, capable de se différencier en phagocytes: macrophages dans
le tissu conjonctif, microglyocytes dans le système nerveux central, ostéoclastes
dans l'os [4].
Saeremans Evyne 16 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire qui font partie
du système réticulohistiocytaire et qui se présentent dans certaines conditions,
comme leur nom l'indique, des dendrites (des prolongements cytoplasmiques). Ce
sont des cellules phagocytaires, exprimant un large éventail de protéines
permettant de détecter la présence de pathogènes et font partie des cellules
présentant des antigènes. Ces cellules ont pour origine les pro-monocytes.
Les cellules dendritiques ont deux fonctions principales:
ƒ le déclenchement de la réponse immunitaire adaptative, dont les acteurs
principaux sont les lymphocytes T et les lymphocytes B, dirigées contre des
antigènes du "non-soi".
ƒ le maintien de la tolérance centrale au "soi" dans le thymus, par le
processus impliquant les lymphocytes T dit de sélection négative [5].
2.1.1.3
La pathogenèse [2] Les lymphocytes T et B migrent des vaisseaux post capillaires dans la membrane
synoviale vers le tissu. Les cellules synoviales avec des classes II – Antigènes des
leucocytes humains (HLA) déviés et des molécules co-stimulation, offrent le peptide
inconnu aux lymphocytes T. Ensuite, les cytokines stimulent l’activation du système des
différentes cellules. Les cellules-B sont activées par la stimulation poly clonale. Les
cellules-B activées produisent des immunoglobulines, principal facteur rhumatoïde, qui
stimulent l’activation du complément.
2.1.1.4
La cause de la maladie [2] Un antigène inconnu stimule l’activation des lymphocytes T, qui à son tour activent les
macrophages synoviaux. Les macrophages produisent les cytokines Facteur nécrosant
des tumeurs alpha (TNF-α) et interleukine 1 (IL-1), qui activent les ostéoclastes et
chondrocytes (vois figure 2.2) et provoque une destruction du cartilage et de l’os. Les
chondrocytes produisent une importante quantité de Facteur de croissance des
fibroblastes (FGF) et de granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Le
GM-CSF induit un cycle qui peut mener à la réactivation des macrophages. Ceci peut
expliquer la durée importante du processus pathologique.
Saeremans Evyne 17 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie Figure 2-2: La cause de polyarthrite rhumatoïde [2]
2.1.2
Le diagnostic [3] Le diagnostic est fait grâce à l’anamnèse, un examen physique et un examen du sang.
Dans l’examen physique, le rhumatologue regarde si les articulations sont inflammées ou
non. L’examen du sang est important pour détecter des anomalies de la vitesse de
sédimentation (VS) et de la valeur de la protéine C réactive (CRP). En cas
d'inflammation, le taux de CRP augmente rapidement.
Généralement, les valeurs du CRP et VS indiquent l’importance de l’inflammation.
2.1.3
Quelles sortes de médicament y a‐t‐il? [3] Il y a cinq genres de médicaments, souvent prise combinés:
ƒ Les calmants
Cette sorte de médicament influence le sentiment de douleur, mais n’a pas un effet antiinflammatoire.
ƒ Les Anti inflammatoire non stéroïdien (NSAID’s) et Disease–modifying
antirheumatic drugs (DMARD’s)
Les DMARD’s forment la basse du traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les
NSAID’s sont utile pendant les recrutes aiguë. Figure 2-3: L’usage du DMARD’s et NSAID’s
Saeremans Evyne 18 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie Les NSAID’s sont diviser dont deux groupes : les anti-inflammatoire classique et les Cox2-inhibiteurs.
ƒ Corticostéroïdes
Ce sont des hormones stéroïdes naturelles sécrétées chez les êtres humains par la glande
corticosurrénale.
ƒ Biologicals
Ce sont des médicaments qui contiennent des protéines, comme des anticorps et
cytokines ou des fragments des protéines ou des peptides synthétiques.
Il est important de ne pas rester alité lors d’une crise de polyarthrite rhumatoïde. Il est
cependant conseillé d’éviter les sports de contacts et les sports qui demandent une grande
dépense physique.
Les sports conseillers sont: la natation, le vélo et la promenade. Parce que lors de la
pratique de ces sports, on bouge régulièrement et les articulations ne reçoivent pas de
grands chocs.
2.2 La protéomique par électrophorèse bidimensionnelle L’électrophorèse bidimensionnelle est utilisée pour l’analyse des mélanges protéiques
complexes provenant de cellules, tissus ou autres échantillons biologiques.
Les protéines sont isolées, selon deux caractéristiques indépendantes en deux phases
successives. Dans la première dimension ou la focalisation isoélectrique, les protéines
sont dissociées selon leur point isoélectrique. Dans la deuxième dimension ou le sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel électrophorèses (SDS-PAGE), les protéines sont
séparées selon leur poids moléculaire [6].
Les informations obtenues:
ƒ le point isoélectrique,
ƒ le poids moléculaire,
ƒ la quantité [6].
2.2.1
Première dimension [6] La première dimension ou la focalisation isoélectrique (IEF) est la méthode qui sépare les
protéines en se servant de leur point isoélectrique (pI).
Les protéines sont des molécules amphotères; elles peuvent être chargées positivement,
négativement ou ne pas avoir de charge selon le pH de la solution dans laquelle elles se
trouvent. La charge nette d’une protéine est la somme des charges négatives et positives
de ses extrémités et des chaînes latérale des acides aminés qui la composent.
Le point isoélectrique correspond au pH où la charge nette globale de la protéine est
égale à zéro, où le pH est égale au pI (vois figure 2.3 a). Les protéines ont une charge
positive si le pH de leur milieu est plus petit que leur pI et elles ont une charge négative si
le pH de leur milieu est plus grand que leur pI (vois figure 2.3 b).
Saeremans Evyne 19 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie Figure 2-4: Charge des protéines
La présence d’un gradient de pH est de la plus haute importance pour la technique d’IEF.
Avec un gradient de pH, sous l’influence du champ électrique, une protéine va migrer
vers une position dans le gradient où son charge net est égale à zéro.
Une protéine avec un charge nette positive va migrer à la cathode, elle sera
progressivement moins chargée positivement du fait du gradient de pH jusqu’à son pI.
Une protéine avec un charge nette négative va migrer à la anode, elle va être
progressivement moins chargée négativement du fait du gradient de pH jusqu’à ce qu’elle
arrive à son pI.
Quand une protéine part de son pI, elle reçoit une charge et elle retourne à son pI. On
appelle ça l’effet focus du IEF, ça concentre les protéines en leur pI cela permet de
séparer les protéines en se servant d’une différence très petite dans leur charge.
La focalisation se termine à la cote du gradient pH et du champ électrique.
Pour améliorer la réalisation et pour simplifier les manipulations, l’ Immobilized pH
gradient (IPG) gel est fixé sur une bande en plastique. Ensuite le gel est lavé pour effacer
les catalyseurs et les monomères qui ne sont pas polymérisés, autrement ils peuvent
modifier les protéines. A la fin, si le gel est séché, il est coupé les bandes en une largeur
de 3 millimètres.
L’IEF est exporté avec les bandes IPG, qu’on place horizontalement sur une unité
d’électrophorèse. L’usage de l’unité a deux avantages:
Saeremans Evyne 20 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie 1. La focalisation isoélectrique a besoin de refroidissement efficace et de pour
pouvoir contrôler précisément les températures. Le système utilisé est une plaque
horizontale à effet Peltier.
2. Une tension très importante (8000 Volts) est nécessaire afin d’avoir une bonne
focalisation.
L’IEF est exporté en montant le voltage peu à peu. Un plan faisable est visible dans le
tableau 2.1.
Tableau 2-1: Plan faisable pour IEF
Réhydratante: 6 h 20°C
Volt 30 200 1000 3000 8000 8000 2.2.2
Heures Step/gradient
3 2 1 1 2 7 Step Step Step Step Gradient Step Deuxième dimension La deuxième dimension ou SDS-PAGE est une méthode sensible et rapide avec une
bonne puissance séparative permettant de pour pouvoir séparer les protéines dans les
conditions dénaturées fondées sur leur taille apparente [7].
D’abord, les protéines sont dénaturées, elles perdent leur structure secondaire et tertiaire
à cause de la chaleur et une manipulation avec du sodiumdodecylsulfate (SDS). SDS est
un détergent anionique qui existe à partir d’une C12-chaîne aliphatique avec à la fin un
groupe de sulfate qui est fort négativement chargé (hydrophile). Il a l’inclination de
s’attacher aux protéines et il désintègre les membranes et il libère les protéines qui sont
attachées aux membranes. SDS se colle à beaucoup de sortes des protéines dans plus ou
moins la même quantité (1,4 g SDS/g protéine, cela correspond à 1 molécule de SDS par
2 aminoacides résidus).
Quand le SDS se colle aux protéines, les protéines reçoivent une charge négative. Parce
que le propre charge des protéines est très petit en comparaison avec le charge obtenu de
SDS, toutes les protéines vont porter le même charge et dans un champ électrique, ils
vont se bouger avec la même vitesse vers le même pôle (anode) (vois figure 2.4) [7].
Saeremans Evyne 21 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie Figure 2-5: L'effet de sodiumdodecylsulfate (SDS) [8]
De plus, le SDS rompt les ponts hydrogènes, bloque les interactions hydrophobes, et
déplie partiellement les protéines. Les protéines sont totalement dépliées par l’urée et
réduites par addition de dithiothréitol (DTT). Elles sont ensuite alkylées par addition
d’iodoacétamide afin d’éviter la reformation des ponts disulfures.
Un aperçu des ingrédients chimiques pour faire le gel:
1. Tris (tris (hydroxyl methyl) aminomethane)
Tris est l’abréviation de 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol.
Il est utilisé comme tampon à cause qu’il est une substance inoffensive pour presque
toutes les protéines [7].
2. Acrylamide-bisacrylamide
L’acrylamide est une poudre blanche. Quand on la dissout dans l’eau, l’auto
polymérisation d’acrylamide se déroule. C’est un procès lent mais spontané où les
molécules d’acrylamide se transforment sous une forme de chaine. Quand il y a des
radicaux libres, les monomères d’acrylamide sont activés. Ces radicaux polymérisèrent
plus vite. Une solution de ces polymères est visqueuse, mais ne forme pas un gel parce
qu’une chaîne glisse sur une autre chaîne. Pour cela un mélange
acrylamide/bisacrylamide est utilisé en proportion 37,5:1. Le bisacrylamide est un
polymère « brancé » qui permet la réticulation de l’acrylamide lord de sa polymérisation
radicalaire (vois figure 2.6).
Saeremans Evyne 22 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie Figure 2-6: Le bisacrylamide « branche » a l’acrylamide
L’acrylamide et le bisacrylamide sont neurotoxiques.
Il est essentiel de garder la solution dans un lieu froid, sombre et sec, cela pour diminué
l’autopolymérisation et l’hydrolyse [7].
3. Ammonium persulfate (APS) et tetramethylethylenediamine (TEMED)
Ces deux produits induisent une polymérisation rapide. Quand la quantité d’APS et
TEMED monte, la longueur de la chaîne des polymères baisse, l’état trouble monte et
l’élasticité du gel baisse. Quand la quantité baisse, c’est le contraire qui se passe.
La concentration la plus basse de polymérisation est utilisée [7]. 2.3 Visualisation des protéines 2.3.1
Coloration au nitrate d’argent [9] La coloration est basée sur la réduction d’argent ionique pour obtenir l’argent métallique.
Les protéines séparées sur le gel polyacrylamide sont fixées dans une solution de 50%
méthanol-5% acétique acide-eau. Ensuite, le gel est incubé avec une solution de
sensibilisation, comme le thiosulfate de sodium. Les sensibilisateurs sont utiliser pour
augmenter le contraste entre les bandes des protéines colorées et l’arrière-plan, avec
comme conséquence, d’augmenter la sensibilité.
Les sensibilisateurs travaillent par différents mécanismes chimiques:
1. Augmenter la liaison du nitrate d’argent
2. Créer des bandes cachées dans la précipitation des micros granulés d’argent
sulfide.
3. Favoriser la réduction d’argent
4. Induire la formation de complexes avec les cations d’argent qui ne sont pas
attachés aux protéines.
Après la sensibilisation, le gel est exposé à une solution de nitrate d’argent. Dans cette
phase, les complexes protéines–argent subissent plus vite la réduction que les ions
d’argent libre. Les particules colloïdales font apparaître les bandes des protéines sur la
surface du gel.
Les avantages de la coloration au nitrate d’argent par rapport au bleu de Coomassie:
1. La sensibilité est environ 10 fois plus grande,
2. Limite de détection: 1–10 ng.
Saeremans Evyne 23 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Bibliographie 2.3.2
Bleu de Coomassie [10] Le bleu de Coomassie est un colorant bleu communément employé en électrophorèse sur
gel de polyacrylamide avec sodiumdodécylsulfate (SDS-PAGE).
Le bleu de Coomassie se lie supposément aux protéines via physisorption aux acides
aminés basiques et aux aromatiques.
Dans un milieu très acide il est plus stable pendant la forme double protomé, dans un
milieu très basic, la forme plus stable est la forme pas protomé.
La limite de détection est de 100 ng.
2.3.3
Western Blot Western Blot est une technique qui consiste à transférer les protéines contenues dans le
gel sur une membrane. Ce transfert se fait également par électrophorèse. Une fois les
protéines transférées, on peut les identifier. La meilleure méthode pour caractériser une
protéine au milieu d’autres protéines est l’immunomarquage. La protéine joue le rôle
d’un antigène face à des anticorps spécifiques (anticorps primaires) de cette protéine. Une
fois le complexe antigène-anticorps formé, il faut le détecter. Cette étape se fait grâce à un
deuxième anticorps (anticorps secondaire) dirigé contre l’anticorps primaire. L’anticorps
secondaire est couplé à une enzyme qui permet de détecter l’anticorps grâce à une
méthode de chemiluminescence [11].
Les étapes du Western Blot sont montrées dans figure 2.7.
Figure 2-7: Les étapes du Western Blot [12]
Saeremans Evyne 24 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes 3 Matériel et méthodes Les protéines proviennent de cellules cultivées dans un laboratoire à Lyon (France).
Nous avons utilisé 16 échantillons provenant de 4 personnes différentes (A-B-C-D).
L’état de différenciation des cellules est codé grâce à des chiffres: 1. Monocytes
2. Ostéoclastes dérivés de monocytes (stade terminale de différenciation)
3. Cellules dendritiques
4. Ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques (stade terminale de différenciation)
3.1 Extraction des protéines a. Méthode Nous décongelons le lysat à température ambiante. Dans chaque échantillon, nous
ajoutons 200 μl de tampon de lyse. Après, 1/100e de spermine dihydrate 2,4 M a été
rajouté, soit 3 μl de spermine dihydrate par échantillon. Après une incubation d’une
heure à température ambiante, nous centrifugeons à 21000 g, 1 h, à 20°C. Nous
récupérons le surnageant et nous l’aliquotes par fraction de 50 μl.
À partir de maintenant nous utilisons le numéro interne (voir tableau 3.1).
Tableau 3-1: Numéro externe versus numéro interne
Numéro externe Numéro interne
A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 C1 C2 C3 C4 D1 D2 D3 D4 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 b. Produits Spermine dihydrate
Formule: C10H26N4 . 2 H2O
Masse moléculaire: 238,38 g/mol
Masse: 5 g
Marque: Fluka
Lot: 0124087/1
Saeremans Evyne 25 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Tampon de lyse (préparation: vois annexe 1) Conservé à: -20°C
Composition:
CHAPS
Formule: C32H58N2O7S
Masse moléculaire: 614,89 g/mol
Masse: 250 g
Marque: SIGMA-ALDRICH
Lot: 077K530013
Dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT)
Formule: C14H9C15
Masse moléculaire: 354,49 g/mol
Masse: 25 g
Marque: SIGMA
Lot: EC 222–468–7
Urée
Formule: NH2CONH2
Masse moléculaire: 60,06 g/mol
Masse: 500 g
Marque: Amersham Biosciences
Lot: 17–1319–01
Thiourée
Formule: CH4N5S
Masse moléculaire: 76,12 g/mol
Masse: 100 g
Marque: Amersham Biosciences
Lot: RPN 630 1V
3.2 Dosage des protéines a. Méthode
Pour le dosage des protéines, nous utilisons le 2–D Quant Kit. Ce dernier est fait
spécifiquement pour la détermination de la concentration protéique d’échantillons utilisés
en électrophorèse 2D. Il est important de conserver le kit à 4°C. Les échantillons, gardés
à -80°C, sont décongelés juste avant le dosage.
D’abord, nous faisons la solution de coloration. Le volume est fonction du nombre
d’échantillons (voir table 3.2).
Tableau 3-2: Composition de la solution de coloration dépendant du nombre d’échantillons
Nb de tube Color Reagent A (ml) Color Reagent B (µl) Saeremans Evyne 7 8 9 10 11 12 15 20 25 8 9 10 11 12 13 16 21 26 80 90 100 110 120 130 160 210 260 26 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Ensuite, nous préparons la courbe de titration. Pour cela, nous déposons dans les tubes
de la gamme étalon les volumes de BSA notés dans la tableau 3.3. La BSA utilisée a une
concentration de 2 μg/μl.
Tableau 3-3: Composition de la gamme étalon BSA
Tube 1 2 3 4 5 6 Volume BSA (µl) 0 1 2,5 5 10 20 Quantité (µg) 0 2 5 10 20 40 Quand tout est prêt, nous décongelons les échantillons, puis nous les vortexons et les
centrifugeons.
La première partie du dosage est la précipitation des échantillons:
ƒ Ajout de 500 μl de solution de précipitation et agitation des tubes au vortex.
ƒ Incubation 2 min à température ambiante.
ƒ Ajout de 500 μl de co-précipitant et agitation des tubes au vortex.
ƒ Centrifugation 5 min à 10000 g à température ambiante.
ƒ Elimination du surnageant rapidement après la fin de la centrifugation par
renversement du tube.
ƒ Recentrifugation des tubes 5 min à 10000 g à température ambiante.
ƒ Elimination du surnageant restant avec une micropipette sans toucher le culot. Ne
pas laisser de liquide visible.
La deuxième partie est la coloration des échantillons:
ƒ Ajout de 100 μl de solution de cuivre et 400 μl d’eau milliQ.
ƒ Agitation des tubes au vortex.
ƒ Ajout de 1 ml de solution de coloration en s’assurant que le mélange se fait
immédiatement par l’introduction de la solution.
ƒ Incubation 15 min à température ambiante.
Ensuite lecture de l’absorbance à 480 nm.
b. Matériel 2 – D Quant Kit
EttanTM Sample preparation kits and reagents
Contenant:
Precipitant
250 ml
Co–precipitant
250 ml
Copper solution
50 ml
Color reagent
A
2 x 250 ml
B
5 ml
BSA standard solution (2 mg/ml)
5 ml
Lot: 070701
Date d’expiration: Juillet 2008
Conservé à: 4°C – 8°C
Fabricant: Amersham biosciences
Saeremans Evyne 27 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Spectrophotomètre
Modèle: DU ® 640 B
Marque: Beckman
Numéro: 431 94 13
3.3 Analyse des gels 3.3.1 Focalisation isoélectrique a. Méthode
Nous décongelons les échantillons et le tampon de réhydratation. Le tampon de
réhydratation ne peut pas être chauffé parce qu’il contient de l’urée. Si nous le chauffons,
l’urée va se dissoudre et perdre sa fonctionnalité.
Nous voulons déposer une quantité de 30 μg par échantillon. Pour chaque bandelette de
13 cm, le volume final de dépôt est de 250 μl. Avec le volume (250 μl) et la concentration
protéique que nous avons obtenue par dosage des protéines, nous pouvons calculer le
volume d’échantillons nécessaire pour avoir une quantité de 30 μg.
Dans un tube, nous mélangeons alors le volume d’échantillons approprié avec le tampon
de réhydratation. Nous ajoutons également 1μl d’IPG Buffer pH 3–10, car les bandelettes
que nous utilisons ont aussi un gradient de pH 3–10.
Après agitation et centrifugation des tubes, nous pouvons déposer les échantillons dans
les sarcophages.
Dépôt des échantillons:
ƒ Prélever 125 μl d’échantillon avec une pipette 200 μl (figure 3.1).
ƒ Déposer l'échantillon de façon à le répartir tout le long du sarcophage (soit par
agitation du sarcophage soit par méthode de dépôt).
ƒ Déposer à nouveau 125 μl d’échantillon (figure 3.1).
Figure 3-1: Dépôt de l’échantillon
ƒ
Prendre une bandelette de focalisation: 13 cm et gradient de pH: 3–10 et enlever le
film plastique protecteur.
Saeremans Evyne 28 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes ƒ
Placer la bandelette sur l'échantillon, face "acrylamide" contre l'échantillon, côté
® ou pointu à la pointe du sarcophage (Figure 3.2).
Figure 3-2: Dépôt de la bandelette
ƒ
ƒ
Recouvrir la bandelette d’environ 3 ml d'huile minérale. Pour cela, déposer l’huile
du coté carré du sarcophage.
Fermer le couvercle du sarcophage.
Mise en route de l’IPGPhor:
ƒ Déposer les sarcophages sur les électrodes de l'appareil IPGPhor, comme présenté
sur la figure 3.3 si dessous.
Figure 3-3: Dépôt du sarcophage dans l’iPGPhor
ƒ
ƒ
Mettre les trois « boudins » en mousse sur les sarcophages. Chaque boudin doit
toucher un morceau du sarcophage. Fermer le couvercle de l’appareil.
Choisir le programme avec les boutons 2 et 3 (Figure 3.4).
Pour ce projet, nous avons employé le programme 6:
Total: 23 h 8000 V 13 cm
Réhydratation: 6 h 20°C
30 V step 3 h
200 V step 2 h
1 000 V step 1 h
3 000 V step 1 h
8 000 V gradient 2 h
8 000 V step 7 h
ƒ
Appuyer sur START (Bouton 1, Figure 3.4).
Saeremans Evyne 29 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes ƒ
ƒ
Renseigner le nombre de bandelettes avec les boutons 2 et 3 (Figure 3.4).
Appuyer sur START (Bouton 1, Figure 3.4).
Figure 3-4: Panneau de contrôle de l’IPGPhor
Après 23h de migration, nous pouvons récupérer les bandelettes à l’aide d’une pince fine
pour les placer, sans les rincer, dans des tubes préalablement annoté. Ces derniers sont
conservées à -20 °C.
b. Matériel Sarcophage
Marque: Amersham pharmacia biotech
Bandelette
Marque: GE Healthcare
Nom: ImmobilineTM Drystrip
pH 3–10, 13 cm
Drypolyacrylamide gel strip with an immobilized pH
Grandeur: 130 x 3 x 0,5 cm
IPGphor
IPGphor et IPGphor II
Fabricant: Amersham Biosciences
c. Produits
Tampon réhydratation Volume: 250 μl
Fabriqué le: 24/07/2008
Conservé à: -20°C
Composition:
CHAPS
Dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT)
Urée
Saeremans Evyne 30 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Huile de paraffine, visqueux
Volume: 2,5 litres
Marque: Riedel–de haën
Lot: 41 600
IPG buffer, pH 3–10
Volume: 1 ml
Lot: 17–6000–87
Label no: 71–5007–35–EC
3.3.2 SDS–PAGE a. Méthode
Pour commencer nous préparons des gels acrylamide–bis–acrylamide 12%. Pour cela,
nous avons deux manières différentes. Les trois premières phases sont les mêmes:
ƒ Vérifier les plaques en verre. Elles doivent être bien égales.
ƒ Nettoyer les plaques en verre et les spacers avec de l’alcool.
Raison: Les impuretés peuvent empêcher la migration.
ƒ Monter l’ensemble comme sur la figure 3.5.
Figure 3-5: Première ensemble
Première manière:
ƒ Monter l’ensemble comme sur la figure 3.6.
Figure 3-6: Deuxième ensemble
Saeremans Evyne 31 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes ƒ Mettre une couche de graisse sur le coussin gris.
Raison: Pour que l’ensemble colle bien au coussin, et réduire ainsi les probabilités de
fuite.
ƒ Monter l’ensemble comme sur la figure 3.7.
Avec le Spacer Positioning Guide, poser les spacers bien au fond.
Figure 3-7: Troisième ensemble
ƒ
Serrer les vis: 1 avec 1, 2 avec 2, 3 avec 3, … (voir figure 3.8).
Quand nous serrons les vis, nous devons bien pousser sur l’ensemble.
Figure 3-8: Manière pour serrer les vis
Parcourir à nouveau la série des vis afin de bien s’assurer qu’elles sont toutes bien
serrées.
Composition du gel (pour 4 gels):
ƒ
Acrylamide–bis–acrylamide 40%
Tampon « Gel Bas »
Eau
TEMED
ASP
ƒ
30 ml
25 ml
44,5 ml
50 μl
500 μl
Verser le mélange entre les 2 plaques en verre. Vérifier qu’il n’y ait pas de fuite,
puis mettre le restant du liquide jusqu’à 0,5 cm du bord.
Saeremans Evyne 32 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes ƒ Mettre une couche de 2–propanol par-dessus.
Raison: Pour empêcher le haut du gel de s’assécher.
ƒ Mettre un plastique sur l’ensemble comme montré sur la figure 3.9.
Raison: Pour éviter l’évaporation du 2–propanol.
Astuce: S’il reste du liquide, mettre le gobelet avec le liquide à côté de l’ensemble.
Ainsi, nous voyons quand le mélange est polymérisé.
Figure 3-9: L’ensemble pendant la polymérisation
Deuxième manière:
ƒ Monter l’ensemble comme sur les figures 3.10 et 3.11.
Figure 3-10: La vue d'en haut pour couler les gels
Figure 3-11: La vue de face pour couler les gels
ƒ
Composition du gel:
Acrylamide–bis–acrylamide 40%
Tampon « Gel Bas »
Eau
TEMED
ASP
ƒ
150 ml
125 ml
22,25 ml
250 μl
2500 μl
Verser le mélange devant la première plaque en verre. Remplir jusqu'à 0,5 cm du
bord.
Saeremans Evyne 33 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes ƒ Mettre une couche de 2–propanol.
Raison: Pour empêcher le haut du gel de s’assécher.
ƒ Mettre un plastique sur l’ensemble (voir figure 3.12).
Raison: Pour éviter l’évaporation du 2–propanol.
Astuce: S’il reste du liquide, mettre le gobelet avec le liquide à côté de l’ensemble.
Ainsi, nous voyons quand le mélange est polymérisé.
Figure 3-12: L’ensemble pendant la polymérisation
Une fois que les gels sont prêts, nous montons l’ensemble comme indiqué dans la figure
3.13.
Figure 3-13: L’ensemble préparé pour le Hoefer Electrophorese Unit
Saeremans Evyne 34 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Maintenant, nous pouvons placer l’ensemble dans le Hoefer Electrophorese Unit (Figure
3.14).
Figure 3-14: le Hoefer Electrophorese Unit
Après 17 heures de migration, nous mettons les gels dans la solution de fixation jusqu’à
ce que nous commencions la coloration.
b. Matériel Hoefer Electrophorese Unit
Marque: Amersham pharmacia biotech
Model: SE 600 Serie
Numéro (1): 2008 73 84
Numéro (2): 2008 70 78
MultiTemp III
Marque: Amersham pharmacia biotech
Plaques en verre
Marque: Amersham Bioscience corp
c. Produits Acrylamide bisacrylamide 37.5 :1
Volume: 1 litre
Marque: Qbiogene
Lot: B083601
!! Conserver à 4°C !!
Ammonium persulfate (APS)
Formule: (NH4)2S2O8
Masse moléculaire: 228,20 g/mol
Masse: 100 g
Marque: Eurobio
Lot: 096928
Saeremans Evyne 35 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Tétra – méthyl – éthylenediamine (TEMED)
Formule: C6H16N2
Masse moléculaire: 116,21 g/mol
Volume: 50 ml
Marque: Qbiogene
Lot: 522A6232
Tampon de migration (préparation: voir annexe 1) Glycine
Masse moléculaire: 75,07 g/mol
Masse: 1 kg
Marque: MP Biomedicals, LLC
Lot: 5929J
Sodium dodécyl sulfate (SDS)
Formule: C12H25O4S
Masse moléculaire: 288,38 g/mol
Masse: 1 kg
Marque: SIGMA
Lot: EC 205 – 788 – 1
Tris –(hydroxymethyl) aminomethane Formule: C4H11NO3
Masse moléculaire: 121,14 g/mol
Masse: 1 kg
Marque: Prolabo
Lot: MO31
Tampon « Gel Bas » pH 8,8 (préparation: voir annexe 1)
Volume: 1 litre
Fabriqué le: 04/09/2008
Conservé à: 4°C
Tris
Formule: C4H11NO3HCl
Masse moléculaire: 157,6 g/mol
Masse: 1 kg
Marque: SIGMA
Lot: EC 214 – 684 – 5
SDS
Tris –(hydroxymethyl) aminomethane
Tampon SDS – équilibration (préparation: voir annexe 1)
Bleu de bromophénol
Formule: C19H10Br4O5S
Masse moléculaire: 669,96 g/mol
Masse: 5 g
Marque: SIGMA
Saeremans Evyne 36 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Glycérol
Formule: C3H8O3
Masse moléculaire: 92,09 g/mol
Volume: 1 litre
Marque: Prolabo
Lot: 08D240524
Urée
SDS
Tampon « Gel Bas » pH 8,8
Solution de fixation (préparation: voir annexe 1) Acide Acétique 80%
Formule: C2H4O2
Masse moléculaire: 60,05 g/mol
Volume: 5 litres
Marque: Prolabo
Lot: 20 103.364
Ethanol 96%
Formule: C2H5OH
Masse moléculaire: 46,07 g/mol
Volume: 5 litres
Marque: API
Lot: 157.06.08
Agarose (préparation: voir annexe 1)
Agarose
Masse: 100 g
Marque: GibcoBRL
Lot: 78 K2170
Bleu de bromophénol
Saeremans Evyne 37 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes 3.3.3 Coloration au nitrate d’argent a. Méthode Pour commencer, nous préparons les solutions que nous trouvons dans tableau 3.4.
Tableau 3-4: Composition des solutions pour la coloration au nitrate d’argent
Solution Produits 2 gels 4 gels A B C D E F Conservation Ethanol (96%) Acide Acétique 80%
L'eau Ethanol (96%) L'eau Thiosulfate L'eau Nitrate d'argent L'eau Carbonate Formaldéhyde Solution C L'eau EDTA L'eau Glycérol L'eau 500 ml 100 ml 400 ml 25 ml 475 ml 100 mg 500 ml 1 g 500 ml 15 g 250 µl 10 ml 490 ml 14 g 1 l 100 ml 900 ml 500 ml 100 ml 400 ml 50 ml 950 ml 200 mg 1 l 2 g 1 l 30 g 500 µl 20 ml 980 ml 14 g 1 l 100 ml 900 ml Nous retrouvons les gels dans la solution de fixation. Un gel peut être laissé trois jours
maximum dans la solution A.
ƒ Enlever la solution A (fixation).
ƒ Mettre 250 ml de solution B (Ethanol 5%) et attendre 15 min sous agitation.
ƒ Rincer 3x avec au moins 500 ml d’eau millipore pendant 5 min.
ƒ Mettre au moins 250 ml de solution C (Thiosulfate) et agiter 2 min.
ƒ Rincer 3x avec au moins 500 ml d’eau millipore pendant 30 sec.
ƒ Mettre 200 ml de solution D (Nitrate d’argent) et agiter pendant 25 min.
ƒ Rincer 2x avec au moins 500 ml d’eau millipore pendant 1 min.
ƒ Mettre la solution E (de révélation) et attendre la révélation des protéines (entre 2
et 10 min environ).
ƒ Pour arrêter la coloration, enlever la solution E et mettre la solution F (arrêt) sans
rincer les gels.
ƒ Attendre 10 min sous agitation douce.
ƒ Rincer les gels avec 500 ml d’eau millipore.
ƒ Numériser les gels.
ƒ Mettre les gels dans la solution de conservation.
ƒ Attendre 20 min sous agitation douce.
ƒ Seller les gels entre deux films plastiques avec un peu de solution de conservation.
Il est important de ne jamais mettre de solution de conservation (glycérol) directement
dans les boites de coloration.
Maintenant que les gels sont colorés, nous pouvons réaliser l’analyse des gels. Cette
dernière est faite grâce au logiciel Progenis SameSpots.
Saeremans Evyne 38 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes S’il y a déjà un document avec les gels nécessaire, appuyer sur 1 (figure 3.15), sinon pour
faire un nouveau document appuyer sur 2 (figure 3.15).
Figure 3-15: Ouvrir ou créer un document avec Progenis SameSpots
Si nous ouvrons un document, nous arrivons à une fenêtre (voir figure 3.16) qui nous
donne une vue d’ensemble de tout ce que nous pouvons faire.
Figure 3-16: Une vue d’ensemble de Progenis SameSpots
D’abord, nous choisissons un gel comme gel référence : ce gel est le gel mauve. Ensuite,
nous pouvons placer des vecteurs (cercle rouge). Pour cela, nous prenons le gel vert et
Saeremans Evyne 39 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes nous le glissons sur le mauve. Tout cela est réalisé dans le cadre Vector Editing (figure
3.17).
Figure 3-17: Cadre Vector Editing
Pour savoir dans quelle partie du gel nous travaillons, nous avons le cadre jaune dans
Whole Image (figure 3.18).
Figure 3-18: Cadre Whole Image
En bas à gauche de l’écran (voir figure 3.19), nous pouvons choisir la grandeur du cadre
orange, ainsi que le contraste des gels.
Figure 3-19: Adapter la grandeur du cadre orange et le contraste des gels
Si nous reprenons la figure 3.16, nous retrouvons encore deux autres cadres:
A: Transition
Saeremans Evyne 40 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Ce cadre nous montre le cadre orange des deux gels en grand. Les deux
gels changent toujours.
B: Checkerboard
Ce cadre nous donne une vue de tous les gels. Chaque petit cadre est une
partie d’un gel.
Le bouton Show aligned (figure 3.16, cadre jaune) nous permet de superposer les spots
suivant les vecteurs que nous avons créés précédemment. Des nouveaux spots se
retrouvent ainsi quasiment superposés et cela nous permet de rajouter d’autres vecteurs
plus facilement.
Une fois tous les vecteurs misent en place, nous appuyons sur le bouton Automatic
Vecteurs (figure 3.16, cadre vert). Maintenant, le programme va placer automatiquement
des vecteurs sur tous les gels (figure 3.20, vecteurs bleus).
Figure 3-20: L’écran après avoir appuyé sur Automatic Vecteurs
L’avantage est que nous pouvons supprimer des vecteurs en se plaçant dessus puis en
appuyant sur le bouton droit de la souris.
Si le logiciel a placé tous les vecteurs, nous reprenons les gels un par un et nous vérifions
les correspondances données. Pour indiquer quel zone nous avons déjà fait, nous
choisissons une autre couleur au cadre (voir figure 3.20), partie Whole Image en appuyant
sur la touche 1 du clavier. Si nous trouvons que les vecteurs sont correctement placés,
nous appuyons sur Include (figure 3.20, cadre rouge).
La prochaine étape est Prefiltering (vois figure 3.21). Ici nous pouvons éliminer les spots
que nous pensons que ce sont des impuretés. Dans le cadre rouge nous pouvons donner
un volume. Toutes les taches qui ont un volume plus petit vont être éliminées.
Saeremans Evyne 41 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Figure 3-21: L’écran pour la fonction prefiltering
Après, nous pouvons mettre les gels dans des groupes (vois figure 3.22). Pour ajouter un
groupe, nous utilisons le butons Add group.
Figure 3-22: L’écran pour ajouter des groups
Ensuite, nous donnons tous les groups un nom et nous prenons les gels et nous les
mettons dans les groups (figure 3.23).
Saeremans Evyne 42 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Figure 3-23: L’écran pour organiser les gels
Nous voyons à l’écran avec les résultats des comparaisons de gels. Sur figure 3.24 nous
voyons un graphique qui nous donne le volume normalisé dans chaque condition. A cote
de la graphique en a une vue générale du gel (vois cadre verte, figure 3.24). Le cadre bleu
nous voyons l’image de la protéine est sur le gel. Avec le cadre rouge (figure 3.24) nous
pouvons change le contraste et la grandeur.
Ensuite il y a quarte buttons qui sont importante pour spécifie la protéine:
1: Split
Si le logiciel prends deux protéines pour une protéine, nous pouvons les
séparés.
2: Merge
Si le logiciel sépare une protéine, nous pouvons les rassembler.
3: Delete
Pour supprimer des impuretés.
4: Add
C’est pour ajouter des protéines, ou des partis des protéines que le logiciel
n’a pas fait.
Si une protéine est acceptable, nous pouvons le sélecter avec Tag (cadre jeune, figure
3.24).
Saeremans Evyne 43 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Figure 3-24: L’écran avec les résultats
b. Produits Ethylenediamine tetra acetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Formule: C10H14N2Na2O8 x 2H2O
Masse moléculaire: 372,24 g/mol
Masse: 500 g
Marque: Fluca
Lot: 317705/1
Formaldehyde
Formule: CH2O
Masse moléculaire: 30,03 g/mol
Volume: 1 litre
Marque: Fluca
Lot: 426879/1
Glycérol
Nitrate d’argent
Formule: AgNO3
Masse moléculaire: 169,88 g/mol
Masse: 250 g
Marque: Fluca
Lot: 107 5873
Sodium carbonate decahydrate
Formule: CNa2O3 x 10H2O
Masse moléculaire: 286.14 g/mol
Masse: 1 kg
Marque: Fluca
Lot: 132 3961 Saeremans Evyne 44 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Sodium thiosulfate anhydrous
Formule: Na2O3S2
Masse moléculaire: 158.11 g/mol
Masse: 250 g
Marque: Fluca
Lot: 406037 / 1
Saeremans Evyne 45 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes 3.4 Identification des protéines 3.4.1
Focalisation isoélectrique a. Méthode Nous devons faire un mélange de chaque sorte d’échantillon pour pouvoir identifier les
protéines d’intérêt. Nous devons avoir une quantité totale de 400 μg de protéines. Pour
réaliser cela, nous faisons un mélange comme indiqué dans le tableau 3.5. Nous ne
faisons pas un mélange avec des monocytes parce que nous n’avions plus assez
d’échantillon disponible.
Tableau 3-5: Mélange pour réaliser l’identification des protéines
MoOC Échantillon Concentration Volume Quantité
µg/µl µl µg 481 485 489 493 1,50 1,87 0,65 3,28 50 50 40 65 75,0 93,5 26,0 231,0 Total 407,7 DC Échantillon Concentration Volume Quantité
µg/µl µl µg 482 486 490 494 1,70 1,39 3,20 3,54 50 50 40 35 85,0 69,0 128,0 123,9 Total 405,9 DCOC Échantillon Concentration Volume Quantité
µg/µl µl µg 483 487 491 495 Saeremans Evyne 1,66 2,20 3,16 2,24 70 40 40 35 116,2 88,0 126,4 78,4 Total 409,0 46 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Chaque mélange est concentré dans un VIVASPIN500. Nous centrifugeons les tubes
pendant 1h à 10000 g. Ensuite, nous transvasons le volume mort restant dans un tube
propre. Pour être certain de tout récupérer, nous rinçons trois fois le filtre avec 20 μl de
tampon de réhydratation, puis nous complétons les tubes à un volume final de 250 μl
toujours avec du tampon de réhydratation.
Nous ajoutons 1 μl d’IPG Buffer pH 4–7, parce que les bandelettes que nous utilisons ont
un gradient de pH 4–7.
La suite est identique comme indiqué précédemment (page 27, sous le titre ’3.3.1
Focalisation isoélectrique’), mais à la différence que nous utilisons des bandelettes avec
un gradient de pH 4-7.
3.4.2
SDS‐PAGE Voir protocole 3.3.2 SDS–PAGE (page 31).
3.4.3
Coloration au bleu de Coomassie Dès que le SDS-PAGE est réussi, nous colorons les gels avec du bleu de Coomassie.
Nous reprenons les gels dans la solution de fixation (= solution 1). Le gel doit être laissé
au minimum 20 minutes dans cette solution. Entre-temps, nous préparons la solution 2
avec une composition suivante:
250 ml d’eau milliQ
250 ml d’éthanol 96%
(Pour un gel)
Ensuite, nous suivons les étapes si dessous:
ƒ Enlever la solution de fixation et mettre la solution 2.
ƒ Attendre 10 min sous agitation.
ƒ Enlever la solution 2 et mettre de l’eau milliQ.
ƒ Attendre 5 min sous agitation.
ƒ Répéter 3 fois le rinçage avec l’eau milliQ.
ƒ Enlever l’eau milliQ et recouvrir le gel avec le colorant.
ƒ Attendre un minimum d’une heure sous agitation.
ƒ Rincer 3 fois 5 min avec l’eau milliQ sous agitation.
ƒ Numériser les gels.
Une fois le gel coloré, nous pouvons identifier les spots par digestion in-gel. A partir de
maintenant, il est important de travailler sous hotte PCR pour empêcher les
contaminations.
Nous ouvrons d’abord les gels avec le logiciel ImageMaster en Melanie Vieuwer. Avec le
logiciel, nous donnons un numéro à chaque spot que nous allons piquer (voir annexe 1, 2
et 3), suivant leur position dans la plaque 96 puits. Nous piquons alors chaque spot que
nous voulons identifier avec un embout de pipette et nous le déposons dans un puits
d’une plaque 96 puits.
Saeremans Evyne 47 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Si cela est nécessaire, nous pouvons les conserver à 4°C, sinon, nous continuons par un
lavage des bouts de gel découpé. Pour cela, nous commençons par préparer du
NH4HCO3 100mM, (dissoudre 0,1581 g de NH4HCO3 dans 20 ml d’eau milliQ), puis
nous effectuons les étapes suivantes:
ƒ Ajouter 20 μl d’acétonitrile.
ƒ Attendre 10 min.
ƒ Enlever et jeter le liquide.
ƒ Ajouter 20 μl de NH4HCO3.
ƒ Attendre 10 min.
ƒ Ajouter 20 μl d’acétonitrile.
ƒ Attendre 10 min.
ƒ Enlever et jeter le liquide.
ƒ Ajouter 20 μl d’acétonitrile.
ƒ Attendre 10 min.
ƒ Enlever et jeter le liquide.
ƒ Ajouter 20 μl d’acétonitrile.
ƒ Attendre 5 min.
ƒ Enlever et jeter le liquide.
ƒ Laisse sécher les tubes à l'air libre pendant 20 min.
Nous préparons la solution d’enzyme pendant le séchage.
Nous utilisons un pot d’enzyme lyophilisé de 20 μg pour une plaque 96 puits. Nous
ajoutons 200 μl de tampon Trypsin Resuspension buffer et 800 μl de NH4HCO3 100mM
dans le pot. Nous agitons doucement le pot, puis nous laissons reposer l’enzyme remis en
solution.
Après les 20 min de séchage, nous ajoutons 10 μl de la solution d’enzyme dans chaque
puit. Les morceaux de gel doivent être juste recouverts et laissés à incubation pendant 18
h à température ambiante (25°C).
Toutes les solutions restantes doivent être jetées parce qu’elles ne sont pas stables.
Par la suite, nous faisons l’extraction des peptides issus de la digestion trypsique des
protéines. Il est important ici de conserver les mêmes embouts de pipette. Nous prenons
une deuxième plaque 96 puits pour réaliser cela. Maintenant, nous pouvons laisser les
embouts dans la deuxième plaque, où nous retrouvons aussi les extractions des peptides.
Nous préparons les solutions indiquées dans le tableau 3.6.
Tableau 3-6: Solutions pour l’extraction des peptides
NH4HCO3 100 mM (Ammonium Bicarbonate) Concentration Quantité NH4HCO3 100 mM 0,1581 g H2O 20 ml Acide Formique 5% Acide Formique 5% Concentration 100% Quantité 500 µl H2O 9,5 ml Nous procédons comme ci-dessous pour l’extraction:
Saeremans Evyne 48 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes ƒ Prélever le liquide de la digestion et le déposer dans le puits.
ƒ Mettre 10 μl d’acétonitrile.
ƒ Incuber 10 min à T° ambiante.
ƒ Récupérer le surnageant avec le même embout.
ƒ Ajouter 10 μl de NH4HCO3.
ƒ Attendre 10mn à T° ambiante. Nous pouvons laisser le tube ouvert à cette étapeci.
ƒ Ajouter 10 μl d’acétonitrile sur la phase liquide.
ƒ Incuber 10 min.
ƒ Récupérer le surnageant et les regrouper.
ƒ Mettre 10 μl d’acide formique à 5 % (V/V) préparé extemporanément. n
ƒ Incuber 10 min à T° ambiante.
ƒ Rajouter 10 μl d’acétonitrile pur sur la phase liquide.
ƒ Incuber 10 min et récupérer le surnageant avec le même cône.
ƒ Réaliser la même opération une 2ième fois. (repèren)
ƒ Congeler les échantillons à -20 °C.
b. Matériel VIVASPIN 500
Marque: Sartorius Stedium Biotech
Lot: 09VS50004
c. Produits Solution de fixation Acide Acétique 80%
Ethanol 96%
Coomassie
Volume: 1 litre
Marque: BIO RAD
Lot: BS072112
Acétonitrile, anhydrous 99,8 %
Formule: CH3CN
Masse moléculaire: 41,05 g/mol
Volume: 100 ml
Marque: Aldrich Chemistry
Lot: 200–835–2
!! Ne jamais prélever directement !!
Ammonium hydrogen carbonate
Formule: CH5NO3
Masse moléculaire: 79,06 g/mol
Massa: 100 g
Marque: Fluka
Lot: 1157892
Sequencing Grade Medified Trypsin, Porcine
Marque: Promega
Saeremans Evyne 49 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Masse: 20 μg
Garder: -20°C
Lot: 24247001
Trypsin Resuspension buffer
Marque: Promega
Volume: 1 ml
Garder: -20°C
Lot: 24247001
3.5 Autres appareillages utilisés a. Agitateur automatique Marque: Bibby
Model: HB 502
b. Balances
Marque: Sartorius
Min–max: 10 mg – 220 g
Code: CPA 22 45 - OCE
Marque: Ohaus
Min–max: 0,1 g – 2100 g
Code: 87 284 268 57
Model: Adventure Pro AV 2101
c. Centrifugeuses Modèle: Biofuge PrimoR
Marque: Heraeus
Modèle: Heraeus PICO17
Marque: Thermo Scientific
d. Microtubes Marque: Eppendorf
Volume: 1,5 ml
e. Pipettes Marque: Pipetman
Volume (max): 10 μl
Numéro: S 58 794 11
Marque: Pipetman
Volume (max): 10 μl
Numéro: N 67 201 K
Marque: Pipetman
Volume (max): 100 μl
Numéro: E 13 448 G
Saeremans Evyne 50 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Marque: Pipetman
Volume (max): 200 μl
Numéro: S 52 439 A
Marque: Pipetman
Volume (max): 1000 μl
Numéro: E 15 339 G
Marque: Finnpipette
Volume (min/max): 0,5 μl – 10 μl
Numéro: F 26 805
Marque: Finnpipette
Volume (min/max): 0,5 μl – 10 μl
Numéro: J 57 673
Marque: Finnpipette
Volume (min/max): 5 μl – 40 μl
Numéro: J61 479
Marque: Finnpipette
Volume (min/max): 40 μl – 200 μl
Numéro: C75 903
Marque: Finnpipette
Volume (min/max): 40 μl – 200 μl
Numéro: D 53 139
Marque: Finnpipette Campus
Volume (min/max): 5 μl – 40 μl
Numéro: E 76 736
Marque: Finnpipette Campus
Volume (min/max): 40 μl – 200 μl
Numéro: E 76 681
f. Pipette automatique Marque: Drummond
Model: Pipet – Aid XP
g. Pipettes en verre Marque: Falcon
Volume (max): 5 ml
Marque: Falcon
Volume (max): 10 ml
Marque: Falcon
Saeremans Evyne 51 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Matériel et méthodes Volume (max): 25 ml
h. Plaques de vibration Marque: Heidolph
Model: Titramax 1 000
i. Vortex Nom: Vortex Genie 2
Marque: Scientific industries
Saeremans Evyne 52 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 4 Résultats et discussion 4.1 Dosage des protéines Le dosage des protéines est réalisé avec le kit « 2-D Quant Kit ». Les échantillons ont été
séparés en deux groupes parce que la centrifugeuse ne peut contenir que 24 tubes. Une
deuxième explication pour la séparation est lors l’étape, nous devons élimer le surnageant
et cela doit aller vite à la fin de la centrifugation, et s’il y a 32 tubes, cela n’est pas
possible.
Lors du dosage, nous réalisons une duplication pour avoir une bonne moyenne.
4.1.1
Première fois À l'aide du graphique (figure 4.1) que nous recevons avec les résultats d’absorbance de la
gamme étalon (tableau 4.1), nous pouvons calculer la quantité des échantillons (tableau
4.2). Nous devons tenir compte du facteur de dilution, il s’élève à 10.
Tableau 4-1: Résultats de la gamme étalon, première fois
BSA Quantité Absorbance
0 2 5 0,7756 0,7446 0,7248 10 20 40 0,6703 0,5801 0,4288 Tableau 4-2: Résultats des échantillons 480 jusqu'à 487
Numéro échantillons Absorbance Quantité µg/µl 480 481 482 483 484 485 486 487 0,7166 0,7004 0,6388 0,633 0,6141 0,6171 0,6208 0,6216 0,6806 0,6854 0,6033 0,7445 0,6501 0,6418 0,5715 0,5806 0,65 Saeremans Evyne 1,5 1,7 1,66 0,94 1,87 1,38 2,2 53 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
y = -0,0086x + 0,7642
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
µ g B SA
Figure 4-1: Courbe standard acquis la première fois
Ici, nous pouvons constater que tous les résultats sont bons. Nous pouvons travailler avec
les quantités des échantillons.
4.1.2
Deuxième fois Nous calculons la quantité des échantillons en se servant du graphique (figure 4.2) de
part lequel nous recevons avec les résultats d’absorbance de la gamme étalon. Nous
faisons entrer le facteur de dilution, il s’élève à 10. Le tableau 4.3 présente les résultats de
l’absorbance de la gamme étalon, le tableau 4.4 les résultats de l’absorbance des
échantillons 488 jusqu’à 495 et la quantité que nous avons calculé.
Tableau 4-3: Résultats de la gamme étalon, deuxième fois
BSA Quantité Absorbance
0 0,8674 2 0,7788 5 0,7528 10 1,3363 20 1,3261 40 1,0972 Saeremans Evyne 54 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion Tableau 4-4: Résultats des échantillons 488 jusqu'à 495 (deuxième fois)
Numéro échantillons Absorbance Quantité µg/µl 488 489 490 491 492 493 494 495 0,7735 0,7535 0,6754 0,6676 0,6001 0,6052 0,6285 0,5942 0,7398 0,7433 0,5376 0,6006 0,5638 0,5518 0,647 0,6489 0,4 0,82 1,14 1,10 0,50 1,3 1,34 0,93 1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
µg BS A
Figure 4-2: Courbe standard acquis la deuxième fois
L’absorbance que nous avons acquis par les quantités 10, 20 et 40 μg/μl est trop haute.
Par la suite, nous utilisons seulement les valeurs entre 0,8674 et 0,7528. C’est le cas pour
les échantillons 488 et 492.
Nous pouvons expliquer les résultats: ou il y a quelque chose avec la gamme étalon ou
nous avons mis trop de co–précipitant.
Pour contrôler s’il n’y a rien de fautif avec la gamme étalon, nous refaisons seulement la
gamme étalon (vois: troisième fois).
Saeremans Evyne 55 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 4.1.3
Troisième fois Grace au tableau 4.5 et figure 4.3 nous pouvons dire que la gamme étalon est encore
utilisable.
Alors nous pouvons constater que le protocole « Dosage des protéines » n’a pas été suivi
correctement la deuxième fois.
Tableau 4-5: Résultats de la gamme étalon, troisième fois
BSA Quantité Absorbance
0 0,7436 2 0,7365 5 0,7155 10 0,6601 20 0,5914 40 0,4399 0,8
0,7
0,6
A480
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
µg BSA
Figure 4-3: Courbe standard acquis la troisième fois
Saeremans Evyne 56 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 4.1.4
Quatrième fois À l'aide du graphique (figure 4.4) de part lequel on reçoit avec les résultats d’absorbance
de la gamme étalon (tableau 4.6), nous pouvons calculer la quantité des échantillons
(tableau 4.7). Nous devons tenir compte du facteur de dilution, il s’élève à 10.
Tableau 4-6: Résultats de la gamme étalon, quatrième fois
BSA Quantité Absorbance
0 0,7665 2 0,8049 5 0,7751 10 0,7031 20 0,6254 40 0,5913 Tableau 4-7: Résultats des échantillons 488 jusqu'à 495 (quatrième fois)
Numéro échantillons Absorbance Quantité µg/µl 488 489 490 491 492 493 494 495 0,7735 0,7535 0,6523 0,6727 0,6106 0,6053 0,6194 0,6008 0,7398 0,7433 0,6105 0,5972 0,5876 0,5908 0,6554 0,6562 0,40 Saeremans Evyne 0,65 3,20 3,16 0,50 3,28 3,54 2,24 57 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
y = -0,0053x + 0,7794
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
µ g B SA
Figure 4-4: Courbe standard acquis la quatrième fois
Nous gardons la valeur de concentration des échantillons 488 et 492 parce qu’ils sont
bons. Les résultats des autres échantillons sont acceptables.
Maintenant, nous avons tous les quantités de tous les échantillons.
Saeremans Evyne 58 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 4.2 Analyse des gels 4.2.1
Focalisation isoélectrique La valeur du volt final doit être 8000 V, autrement nous pouvons conclure que la
focalisation n’est pas réussie.
L’ampère final varie à cause du volume d’IPG buffer, ce n’est pas facile pour pipeter un
μl.
Il y a toujours un volume qui est attaché à la pointe de la pipette.
Dans tableau 4.8 nous retrouvons les résultats des gels que nous employons pour
analyser.
Tableau 4-8: Résultats de la première dimension
Numéro Série Voltheure Ampère Final (mA) Volt Final (V) Numéro Série Voltheure Ampère Final (mA) Volt Final (V) Numéro Série Voltheure Ampère Final (mA) Volt Final (V) Numéro Série Voltheure Ampère Final (mA) Volt Final (V) 480 481 482 483 47974 76993 37 8000 47976 76993 33 8000 45919 76993 33 8000 47970 76993 37 8000 484 485 486 487 47975 76996 37 8000 47977 76993 33 8000 45920 76993 33 8000 47971 76993 37 8000 488 489 490 491 47978 76993 37 8000 47981 76993 39 8000 45921 76993 43 8000 47972 76993 34 8000 492 493 494 495 45904 76993 37 8000 45 881 76993 44 8000 45908 76993 41 8000 45909 76993 40 8000 Saeremans Evyne 59 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 4.2.2
SDS–PAGE La tension que nous recevons chez le SDS–PAGE est toujours 70 V, sinon on peut
conclure que le SDS–PAGE est raté. Le courant varie entre 16 mA et 19 mA pour quatre
gels et entre 8 mA et 12 mA pour deux gels.
Dans tableau 4.9 nous retrouvons les résultats des gels. Pour les échantillons 494 et 495,
le courant et 10 mA parce que nous l’avons laissé migrer ces deux échantillons seuls.
Tableau 4-9: Résultats de la deuxième dimension
U étape (V) I étape (mA) Durée (h) U étape (V) I étape (mA) Durée (h) U étape (V) I étape (mA) Durée (h) U étape (V) I étape (mA) Durée (h) 480 481 482 483 70 17,8 17 70 17,8 17 70 18,5 17 70 18,1 17 484 485 486 487 70 17,8 17 70 17,8 17 70 18,5 17 70 18,1 17 488 489 490 491 70 18,1 17 70 18,1 17 70 18,5 17 70 18,1 17 492 493 494 495 70 16,9 17 70 16,9 17 70 10 17 70 10 17 4.2.3
Nitrate d’argent Si nous prenons les gels colorés au nitrate d’argent, nous voyons que tous les gels faits
avec les échantillons 492, 493, 494 et 495 ne sont pas réussi. Alors, nous pouvons
conclure que ces échantillons sont inutilisables. Les résultats d’analyse des gels sont
seulement avec les autres échantillons.
Saeremans Evyne 60 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion Si nous prenons figure 4.5 et 4.6 nous voyons que la protéine est plus présente chez les
monocytes que chez les autres cellules.
Figure 4-5: Exemple d’une protéine présente chez les monocytes
Figure 4-6: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les monocytes
Saeremans Evyne 61 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion La protéine suivante est plus présente chez les monocytes et les cellules dendritiques que
chez les ostéoclastes dérivés de monocytes et les ostéoclastes dérivés de cellules
dendritiques (vois figure 4.7 et 4.8).
Figure 4-7: Exemple d’une protéine présente chez les monocytes et les cellules dendritiques
Figure 4-8: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les monocytes et les cellules
dendritiques
Saeremans Evyne 62 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion Les figures 4.9 et 4.10 nous montrons que la protéine est plus présente chez les cellules
dendritiques que chez les autres cellules.
Figure 4-9: Exemple d’une protéine présente chez les cellules dendritiques
Figure 4-10: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les cellules dendritiques
Saeremans Evyne 63 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion La protéine suivante est plus présente chez les ostéoclastes dérivés de monocytes et les
ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques que chez les monocytes et les cellules
dendritique (vois figure 4.11 et 4.12).
Figure 4-11: Exemple d’une protéine présente chez les ostéoclastes dérivés de monocytes et les ostéoclastes
dérivés de cellules dendritiques les cellules dendritiques
Figure 4-12: La graphique d’un exemple d’une protéine présente chez les ostéoclastes dérivés de
monocytes et les ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques les cellules dendritiques
Saeremans Evyne 64 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion La protéine suivante nous montre qu’une protéine peux représentes plusieurs spots (vois
figure 4.13).
Figure 4-13: Un exemple d’une protéine qui est représentées par plusieurs spots
Saeremans Evyne 65 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion Figure 4.14 et 4.16 sont deux protéines stables. Elles sont présente dans les quatre cellules
avec la même intensément. La protéine sur figure 4.16 est l’actine.
Figure 4-14: Un exemple d’une protéine qui est stable
Figure 4-15: La graphique d’une protéine stable
Saeremans Evyne 66 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion Figure 4-16: La l’actine est une protéine stable chez les quatre sortes des cellules
Figure 4-17: La graphique de la l’actine, une protéine stable chez les quatre sortes des cellules
Saeremans Evyne 67 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion Figure 4.18 nous mente qui le logiciel peux aussi faire des erreurs. Les cadres blues sont
les cadres du logiciel et les cadres rouge sont les cadres justes.
Figure 4-18: Un exemple d’une protéine ou le logiciel a fait une faute d’association
4.3 Identification des protéines 4.3.1
Focalisation isoélectrique Dans tableaux 4.10, nous retrouvons que la valeur pour la focalisation isoélectrique est
toujours 8000 V. Cela nous disons que la focalisation est bien passée. L’ampère final
varie entre 28 et 41 mA, parce que ce n’est pas facile pour pipeter un μL d’IPG buffer pH
4-7. Il y a toujours un volume qui reste à la pointe de la pipette.
Tableau 4-10: Résultats de la première dimension (gradient pH 4-7)
Numéro série Voltheure Ampère Final (mA) Volt Final (V) MoOC DC DCOC 83466 76993 32 8000 22125 76993 28 8000 21139 76993 41 8000 Saeremans Evyne 68 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 4.3.2
SDS‐PAGE Si nous prenons tableaux 4.11, nous voyons que la tension est toujours 70 V. Le courant
varie entre le 9 et 10 mA, parce que nous avons laissé migrer un gel par cuve.
Tableau 4-11: Résultats de la deuxième dimension (gradient pH 4-7)
MoOC DC DCOC 70 9,7 17 70 10 17 70 10 17 U étape (V)
I étape (mA)
Durée (h)
4.3.3
Blue de Coomassie Pour pouvoir réaliser l’identification des gels, nous avons coloré les gels avec bleu de
Coomassie. Le gel des ostéoclastes dérivés de monocytes est visible dont figure 4.19. Les
autres gels sont visibles dont annexe 2, figure 1 et 2. Sur les gels nous voyons des
différences, mais pour être sur que ce ne sont pas les mêmes protéines, nous piquons les
gels.
Figure 4-19: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de monocytes
(stade terminale de différenciation)
Saeremans Evyne 69 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion Les positions que nous avons piquées dans le gel des ostéoclastes dérivés de monocytes
est visible dont figure 4.20. Les positions dans les autres gels sont visibles dont annexe 3,
figure 1 et 2. Malheureusement les résultats obtenus avec le matrix assisted laser
desorption/ionisation (MALDI) n’étaient pas encore disponible.
Par conséquent nous ne pouvons pas dire quel spot correspond à quelles protéines.
Figure 4-20: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de monocytes
(stade terminale de différenciation) - Positions des protéines piquées
Saeremans Evyne 70 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Résultats et discussion 5 Conclusion Pendant la technique l’électrophorèse bidimensionnelle il est important de travailler
proprement car nous pouvons retrouver des impuretés dans les gels.
Si à la fin de la première dimension est le courant final n’est pas 8000 V, nous pouvons
conclure que la focalisation risque de poser problème.
Avant de commencer à colorer les gels, il faut se laver les mains (avec les gants) avec de
l’eau pure, sans de détergent, sinon les gels vont présenter des traces. Une fois les gels
colorés, il faut faire attention pendant la numérisation des gels. Les gels doivent être mis
de manière qu’il n’a pas des bulles d’air. Pour éviter les bulles nous pouvons les rouler
avec une pipette. S’il y a des bulles d’air, le logiciel va les reconnaître comme des
protéines.
Il est important de jamais mettre de solution de conservation (glycérol) dans les boites de
coloration.
Même si tous les conseils sont suivis, la manipulation peut encore poser problème, car la
préparation d’échantillons est complexe.
En conclusion nous pouvons dire que les monocytes sont différents que les autres
cellules. Pour l’indentification nous ne pouvons rien conclure car elle est encore en cours.
Saeremans Evyne 71 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde Références bibliographiques [1] National Institute of Artritis and Musculoskeletal ans Skin Diseases, Rheumatoid
Arthritis [WWW], mei 2004, USA government.
URL: http://www.niams.nih.gov/Health_Info/Rheumatic _Disease/default.asp
Vu le: 8 avril 2009
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[3] Nederlandse Vereniging voor Rheumatologie, Rheumatoïde artritis [WWW], 2009,
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URL: http://www.reumafonds.nl/index.php?option=com_wrapper&Itemid=424
Vu le: 8 avril 2009
[4] Wikipedia, Macrophage [WWW], 15 januari 2009, Wikipedia
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Vu le: 8 avril 2009
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[6] Berkelman, T. (2002). 2–D Electrophoresis using immobilized pH gradients. Principles and
methods. Sweden: Amersham Biosciences AB.
[7] Sillius, A., SDS-PAGE [WWW], 29 maart 2006, University Centre Of Pharmacy
URL: http://coofarm.fmns.rug.nl/celbiologie/ond6_alg.html
Vu le: 27 mars 2009
[8] Davidson, SDS – PAGE (polyacrylamide Gel electrophoresis) [WWW], 2008, Davidson
College
URL:http://www.davidson.edu/academic/biology/courses/Molbio/SDSPAGE/SDSP
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Vu le: 27 mars 2009
[9] Shevchenko, A., (1996). Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver –
Stained Polyacrylamide Gels. Advance ACS Abstracts, 5, 850-858.
[10] Hautekeete, E. (2007) Moleculaire biologie. Partim Exploratie van Eiwitten. Brugge
[11] Davidson, Western Blot Procedure [WWW], 2001, Davidson College
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Vu le: 31 mars 2009
Saeremans Evyne 72 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde [12] GenScript, One-Step Western Blot kit [WWW], 2005, GenScript The Biology CRO
URL:http://www.genscript.com/product_001/western_application/grp_id/60065/op/d
etail/Uvrag_Antibody_Analysis.html
Vue le: 09 mai 2009
Saeremans Evyne 73 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes Annexes Annexe 1 – Préparation des tampons ............. Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Annexe 2 – Résultats : coloration au bleu de Coomassie ......... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Annexe 3 – Résultats : Coloration au bleu de Coomassie; positions des protéines piquées ............ Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd. Saeremans Evyne 74 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes Annexe 1–Préparation des tampons 1. Tampon de lyse Tableau 1: Composition du tampon de lyse
Produit Concentration finale Quantité Urée Thiourée CHAPS DTT H2O 8 M 1M 4,8% 50 mM 9,6 g 1,522 g 0,96 g 0,154 g 20 ml 2. Tampon réhydratation Tableau 2: Composition du tampon réhydratation
Produit Concentration finale Quantité Urée CHAPS DTT H2O 9,8 M 4% 50 mM 11,8 g 0,80 g 0,154 g 20 ml 3. Tampon de migration (3l) Dans un bécher de 3 litres:
ƒ Peser 90 g de Tris (Base).
ƒ Peser 432 g de Glycine.
ƒ Ajouter 2 l d'eau millipore.
ƒ Agiter (environ 30 minutes).
ƒ Peser et ajouter 30 g de SDS.
ƒ Si nécessaire, il est possible de rajouter 400 ml d'eau. Attention à ne pas dépasser
les 3 litres.
ƒ Après dissolution complète, ajuster le volume à 3 litres en utilisant une éprouvette
de 2 litre.
ƒ Il est inutile d'ajuster le pH à 8,3 car celui-ci est toujours correct.
Tableau 3: Composition du tampon de migration
Produit Concentration 10X
Quantité Tris Glycine SDS H2O (qsp) 0,25 M 1% 90 g 432 g 30 g 3 litres Saeremans Evyne 75 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes 4. Tampon ‘Gel Bas’ pH 8,8 Dans un bécher de 250 ml:
ƒ Peser 26,16 g de Tris (Base).
ƒ Peser 13,26 G de Tris HCl.
ƒ Ajouter 196 ml d'eau.
ƒ Ajouter 4 ml de SDS 20%.
ƒ Agiter.
ƒ Il est inutile d'ajuster le pH car il est toujours correct.
Tableau 4: Composition du tampon ‘Gel Bas’ pH 8,8
Produit Concentration Quantité Tris (Base) Tris HCl SDS 20% H2O (qsp) 1,5 M 0.4% 26,16 g 13,26 g 4 ml 196 ml 5. Tampon SDS‐équilibration Dans un becher de 200 ml au moins:
ƒ Peser 72,07 g d'urée.
ƒ Ajouter 6,7 ml de solution Tris / Tris HCl 1,5M pH 8,8.
ƒ Ajouter 69 ml de glycérol 87%.
ƒ Ajouter 50 ml d'eau.
ƒ Ajouter 20 ml de SDS 20% (Lauryl Sulfate).
ƒ Agiter la solution à l'aide d'un barreau magnétique.
La dissolution de l'urée est endothermique. Il est possible de légèrement réchauffer le
tampon dans ces mains, mais il ne faut jamais chauffer l'urée à l'aide d'une plaque
chauffant ou d'eau chaude!
ƒ
ƒ
ƒ
En fin de dissolution, ajuster le volume à 200 ml à l'aide d'une fiole jaugée ou
d'une éprouvette de 250 ml.
Aliquoter le tampon par fraction de 10 ml dans des tubes en polypropylène
(plastique opaque ou laiteux).
Conserver les aliquotes dans le congélateur -80°C.
Tableau 5: Composition du tampon SDS-équilibration
Produit Concentration Quantité Urée Solution Tris / Tris HCl 1,5M pH 8,8
Glycérol 100% Bleu de bromophénol SDS H2O (qsp) 6 M 50 mM 30% Trace 2% 72,07 g 6,7 ml 30 ml Quelques grains 4 g 200 ml Saeremans Evyne 76 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes 6. Solution de fixation Tableau 6: Composition de la solution de fixation
Produit Quantité Ethanol 95% Acide acétique 80% H2O 500 ml 100 ml 400 ml ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
7. Agarose Peser 0,5 g d’agarose.
Ajouter 45 ml d’eau distillée.
Ajouter un barreau magnétique.
Mettre en route l’agitateur magnétique chauffant.
Chauffer et agiter la solution.
Lorsque l’agarose est dissout, enlever le bécher de l’agitateur.
Attendre que l’agarose refroidisse mais ne pas laisser l’agarose figer.
Ajouter 5 ml de tampon de migration 10X.
Ajouter quelques gouttes de bleu de bromophénol.
Aliquoter dans des tubes en verre.
Conserver à 4°C.
Saeremans Evyne 77 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes Annexe 2 – Résultats : coloration au bleu de Coomassie 1. Gel Coomassie: Cellules Dendritiques Figure 1: Gel coloré au bleu de Coomassie: Cellules dendritiques
Saeremans Evyne 78 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes 2. Gel Coomassie: Ostéoclastes dérivés de Cellules Dendritiques (stade terminale de différenciation) Figure 2: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques
(stade terminale de différenciation)
Saeremans Evyne 79 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes Annexe 3 – Résultats : Coloration au bleu de Coomassie, positions des protéines piquées Avec: Gel Coomassie: Ostéoclastes dérivés de Monocytes (stade terminale de différenciation) Gel Coomassie: Ostéoclastes dérivés de Cellules Dendritiques (stade terminale de différenciation) Gel Coomassie: Cellules Dendritiques Saeremans Evyne 80 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes 1. Gel Coomassie: Cellules Dendritiques Figure 3: Gel coloré au bleu de Coomassie: Cellules dendritiques - Positions des protéines piquées
Saeremans Evyne 81 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Annexes 2. Gel Coomassie: Ostéoclastes dérivés de Cellules Dendritiques (stade terminale de différenciation) Figure 4: Gel coloré au bleu de Coomassie: Ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques
(stade terminale de différenciation) – Position des protéines piquées
Saeremans Evyne 82 Etude protéomique de la différenciation des ostéoclastes dans la polyarthrite rhumatoïde – Saeremans Evyne 83