Remerciements

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SaeremansEvyne 1
Remerciements
J’aimerais remercier toutes les personnes qui m’ont aidée, d'une manière ou d'une autre,
dans l’accomplissement de mon stage et de mon mémoire.
Je veux d’abord remercier mes parents pour tous ce qu’ils ont faits pour moi. Merci
maman et papa, pour la chance et la confiance que vous m’avez données, l’opportunité
de me laisser partir en France, pour les bons soins, d’être toujours présent dans les
moments difficiles, … Merci pour tout.
Aussi un grand merci à toute ma famille et à mon compagnon pour l’appui moral qu’ils
m’ont donné pendant ces quatre mois.
Ensuite, je remercie de tout cœur l’équipe complète de Monsieur Lehmann. Grâce à eux
mon stage a été agréable et très instructif. Je me suis directement sentie acceptée dans
l’équipe et ils m’ont toujours soutenu. J’ai toujours pu compter sur eux. Un merci spécial
à Monsieur Stephane Roche et Monsieur Sylvain Lehmann pour la manière dont ils
m’ont guidé pendant mon stage et leurs conseils lors de la rédaction de mon mémoire.
Après je remercie Monsieur Bart Quartier pour la réalisation de mon dossier
« ERASMUS » et Madame Nicole Kellner pour m’avoir aidé à trouver mon stage. Je
tiens également à remercier avec Madame Mieke Demeyere pour la coordination de mon
mémoire.
Bien sûr, je remercie tous mes professeurs de Howest, département Simon Stevin, pour
les connaissances qu’ils m’ont apporté pendant ces trois ans.

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Résumé
Dans ce projet, nous faisons une étude protéomique. L’étude utilise quatre sortes des
cellules de quarte personnes différentes:
1. Monocytes
2. Ostéoclastes dérivés de monocytes (stade terminale de différenciation)
3. Cellules dendritiques
4. Ostéoclastes dérivés de cellules dendritiques (stade terminale de différenciation)
Les cellules viennent des personnes avec la maladie polyarthrite rhumatoïde.
Les protéines proviennent de cellules cultivées dans un laboratoire à Lyon (France).
D’abord nous faisons l’extraction des protéines. Cette extraction est faite grâce à un
tampon de lyse. Ceci évite d’avoir à séparer les cellules du support par une technique
enzymatique qui dégraderait les protéines.
Ensuite, nous pouvons réaliser le dosage des protéines. Il a pour but de déterminer la
concentration en protéines dans chaque échantillon. Notre méthode de dosage utilise une
précipitation préalable des protéines, car le tampon de lyse n’est pas compatible avec le
dosage. Il nécessite en premier lieu la préparation d’un courbe étalon réalisé à partir de
bovine serum albumine (BSA) à différentes concentrations. Cette courbe est décroissante:
plus l’échantillon est concentré, moins il absorbe à 480 nm. Les protéines forment un
complexe avec un colorant. Ce complexe absorbe à 480 nm. La mesure de l’absorbance
des échantillons et la comparaison avec la courbe étalon permettent de déduire la
concentration en protéines.
Pendant la première dimension les protéines vont être séparées dans un champ électrique
selon leur point isoélectrique (pI). Cette séparation s’effectue sur une bandelette
contenant un gel d’immobiline déshydraté (gel d’acryl/bisacrylamide à 4% et un
ampholyte créant un gradient de pH stable). L’ampholyte est un mélange complexe de
molécules tampons amphotères qui permet de créer un gradient continu.
Au départ, les bandelettes de première dimension sont déshydratées, elles sont capables
d’absorber au maximum 250 μl d’échantillon lors de leur réhydratation dans le tampon.
Nous plaçons dans un sarcophage l’échantillon dont le volume a été ajusté à 250 μl et
une bandelette de focalisation. Le volume de protéines à déposer est déduit de la
concentration.
Grâce à la deuxième dimension les protéines vont être séparées selon leur poids
moléculaire apparent.
Les bandelettes de la première dimension sont réhydratées avec un tampon SDS-
équilibration contenant en premier lieu du dithiothreitol (DTT) puis de l’iodoacétamide.
Elles sont ensuite déposées en haut des gels. L’ensemble est scellé avec de l’agarose qui
permet le contact direct avec le tampon de migration.
Les gels sont déposés dans les cuves de migration en présence du tampon de migration.
La séparation selon le poids moléculaire apparent a ensuite lieu dans un champ
électrique.

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Une fois la migration terminée les gels sont placés dans une solution de fixation et sont
maintenus sous agitation jusqu’à la coloration.
Pour l’analyse des gels, nous colorons les gels au nitrate d’argent. Ensuite, ils ont été
digitalisés et analysés par le logiciel Progenisis SameSpots. Cela nous permet de conclure de
les monocytes sont plus différent que tous les autres cellules.
L’identification des protéines est possible si nous colorons les gels au bleu de Coomassie.
Pour cela les cellules identiques de chaque personne ont été mélangées. Nous ne pouvons
encore rien conclure parce que l’identification avec le spectrophotomètre est encore en
cours.

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Abréviationetsymboles
Ac Anticorps
ACR American College of Rheumatology
APS Ammonium persulfate
BSA Bovine serum albumine
CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]1-propanesulfate
CRP C-reactive protein
DDT Dithiothreitol
DMARD's Disease-modifying antirhumatic drugs
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FGF Fibroblast growth factor
GM-CSF Granulocyte-macrophage colony stimulating factor
HLA Human leucocyte antigen
IEF Isoelectric focusing
IL-1 Interleukine 1
IPG Immobilized pH gradient
Lymphocyte B Lymphocyte bone
Lymphocyte T Lymphocyte thymus
NK cells Naturel Killer Cells
NSAID's Non-steroidal anti-inflammatory drugs
PAA Polyacrylamide
pH Potentiel hydrogène
pI Point isoélectrique
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED Tetramethylethylenediamine
TNF-a Tumor necrosis factor alpha
TRIS 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol
VS Vitesse de sédimentation

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Glossaire
Antigènes des leucocytes humains Ce sont des molécules à la surface des cellules
qui permettent l'identification par le système
immunitaire.
Chondrocyte Ce sont les cellules du cartilage.
C-reactive protéine Une protéine de phase aiguë de la réponse
immunitaire exclusivement synthétisée par le
foie.
Cytokine Ce sont des substances solubles de
communication synthétisées par les cellules du
système immunitaire ou par d'autres cellules
et/ou tissus, agissant à distance sur d'autres
cellules pour en réguler l'activité et la fonction.
Effet Peltier C'est un phénomène physique de déplacement
de chaleur en présence d'un courant L'effet se
produit dans des matériaux conducteurs de
natures différentes liés par des jonctions
(contacts). L'une des jonctions se refroidit alors
légèrement, pendant que l'autre se réchauffe.
Un autre nom c'est effet thermoélectrique
électrique.
Facteur de croissance des fibroblastes C'est une famille de 22 protéines identifiées à
ce jour chez l'homme. Ce sont des protéines
qui activent la migration et la multiplication de
cellules cibles.
Facteur nécrosant des tumeurs alpha C’est une importante cytokine impliquée dans
l'inflammation systémique et dans la réaction
de phase aiguë.
Fibroblaste C'est une cellule présente dans le tissu
conjonctif, elle est parfois appelée cellule de
soutien.
Granulocyte-macrophage colony
stimulating factor C'est une cytokine avec les fonctions d’un
globule blanc facteur de croissance. Il stimule
les cellules souches pour produire des
granulocytes et monocytes.