CMI - CISMED

Cours de DCEM1 - Faculté de Médecine de Créteil
ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE DES
BACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES
Dr Vincent CATTOIR
Laboratoire de Bactériologie-Virologie-Hygiène
Vendredi 17 Novembre 2006 - Amphi 3
Définitions
= atteinte de la croissance bactérienne
= destruction des bactéries
Paramètres de bactériostase
CI50 = Concentration Inhibitrice 50 :
Conc. d’ATB qui ↓ de 50 % le nbre de bactéries
Peu utilisée en pratique
CMI = Concentration Minimale Inhibitrice :
Conc. d’ATB la plus faible inhibant tte croissance
bactérienne visible
Très utilisée en pratique
CMI50 et CMI90 :
Conc. minimales inhibant la croissance de 50 % ou
90 % des souches testées
CMI modale :
Valeur de CMI la plus fréquente dans un panel de
souches testées
Paramètres de bactéricidie
CMB = Concentration Minimale Bactéricide :
Conc. d’ATB laissant subsister moins de 0,01 %
(0,1 % chez les anglo-saxons) de survivants
Soit n.10-4 de bactéries viables survivantes
Rapport CMB/CMI :
Utilisé pour distinguer
- ATB bactéricides (CMB/CMI < 2)
- ATB bactériostatiques (CMB très éloignée de la CMI)
Définit la tolérance d’une souche (CMB/CMI ≥ 32)
Ex. Bactéries à Gram positif et ATB actifs sur la paroi
(Streptocoques et β-lactamines)
Cinétique de bactéricidie :
Epreuve dynamique qui prend en compte du facteur temps
Méthode lourde
Cinétiques de croissance/bactéricidie
ATB temps-dép. : vitesse de bactéricidie indép. de la conc. ; conc. sérique doit être
maintenue élevée en permanence
ATB conc.-dép. : vitesse de bactéricidie dép. de la conc. ; pics sériques élevés
doivent être obtenus régulièrement
Effet post-ATB : Mesuré par le temps mis par une souche à retrouver une croissance
normale après arrêt de l’ATB
Utilité en pratique courante
Evaluation des paramètres de bactériostase :
Suffisante pour les infections aiguës chez les IC
Faite par la mesure directe ou indirecte de la CMI
Evaluation de la bactéricidie :
Parfois nécessaire pour infections sévères (endocardites, septicémies),
chroniques (ostéites) ou sur terrain fragilisé (aplasiques)
NB : ATB les + bactéricides :
 β-lactamines
 Aminosides (rapides +++)
 Quinolones
 Glycopeptides
Catégorisation clinique SIR (1)
Basée sur le choix de valeurs critiques dép. de la CMI
Valeurs proposées par des comités nationaux :
CA-SFM en France, CLSI (ex-NCCLS) aux E-U, BSAC au R-U, DIN en Allemagne…
Selon l’OMS : 2 définitions de la R :
. Souche capable de supporter une conc. d’ATB notablement plus élevée
que celle qui inhibe la majorité des autres souches de la même espèce
 Catégories de populations bactériennes
. Souche capable de supporter une conc. d’ATB notablement plus élevée
que celle qu’il est possible d’atteindre in vivo
 Catégories cliniques
Catégorisation clinique SIR (2)
Critères
1. Bactériologiques :
 Distribution de CMI pour des populations de souches définies et appartenant
à chacune des espèces bactériennes impliquées en pathologie humaine
5. Pharmacocinétiques :
 Conc. sériques et tissulaires obtenues aux posologies usuelles (RCP)
A comparer à la CMI de la souche
9. Cliniques :
 Confrontation des résultats obtenus in vitro et des résultats obtenus in vivo
(essais cliniques) avec notion de succès ou d’échec thérapeutique
 PROPOSITION DE CONCENTRATIONS CRITIQUES :
BASSE (c) ET HAUTE (C)
Catégorisation clinique SIR (3)
 3 catégories de souches :
. Sensible S : Probabilité de succès thérapeutique acceptable dans le cas d’un traitement systémique avec la posologie recommandée (RCP)
. Résistante R : Forte probabilité d’échec thérapeutique
. Intermédiaire I : Succès thérapeutique imprévisible (ensemble hétérogène qui sert
de zone tampon)
En pratique :
Catégorie
S
I
R
CMI (µg/ml)
CMI ≤ c
c < CMI ≤ C
CMI > C
Techniques de bactériologie courante (1)
Antibiogramme standard (1)
= Méthode par diffusion en milieu gélosé ou méthode des disques
Technique simple, rapide, fiable et visuelle
Protocole :
Utilisation de disques imprégnés d’une conc. donnée d’ATB (en µg)
Dépôt de ces disques à la surface d’une gélose uniformément
ensemencée avec une suspension calibrée de bactéries à étudier
Diffusion concentrique de l’ATB dans la gélose pendant l’incubation
Lecture à 18-24 h (zones d’inhibition) :
Plus ce Ø est grand, plus la bactérie est S à l’ATB
Plus ce Ø est petit, plus la bactérie est R à l’ATB
Techniques de bactériologie courante (2)
Antibiogramme standard (2)
. Corrélation du Ø avec la CMI
avec une courbe de concordance
. Catégorisation de la souche étudiée selon les Ø critiques (d, D) :
Catégorie
CMI (µg/ml)
Ø (mm)
S
CMI ≤ c
Ø≥D
I
c < CMI ≤ C
d≤Ø<D
R
CMI > C
Ø<d
Techniques de bactériologie courante (3)
Antibiogramme standard (3)
Exemples d’antibiogrammes : Ex. Proteus mirabilis résistant à l’amoxicilline (AMX)
et Ticarcilline (TIC) ; Résistant aux aminosides (KTG), aux cyclines (TE) et au Bactrim
Résistant naturellement à la colistine (CS) et aux furannes (FT)
Techniques de bactériologie courante (4)
Antibiogramme automatisé
 Micro-galeries avec cupules contenant ≠ conc. d’ATB adaptées aux
groupes bactériens (staphylocoques, BGN,…)
 Ensemencement avec inoculum standard
Résultats rapides (ex. 4-6 h pour les entérobactéries)
 Couplage à un système informatique d’expertise
Techniques de bactériologie courante (5)
Détermination de la CMI
3 méthodes principales :
. Dilution en milieu gélosé : Appareil de Steers
. Dilution en milieu liquide :
. Méthode E-Test
(bandelettes imprégnées d’un gradient
de conc. d’ATB)
Macrodilution
Microdilution
CMI = 4 µg/ml
Techniques de bactériologie courante (6)
Recherche de β-lactamase
Détection de β-lactamase par test chromogénique :
Pour la détection de pénicillinase (TEM) de certaines espèces comme Haemophilus,
Neisseria, Moraxella ou Staphylococcus
Utilisation de disque avec substrat chromogénique (si hydrolyse  virage de couleur) :
Ex. Nitrocéfine (Oxoïd), Céfinase (bioMérieux), Padac (Bio-Rad)
Détection de β-lactamases à spectre élargi (BLSE) :
BLSE = Dérivées des pénicillinases capables d’hydrolyser la quasitotalité des β-lactamines (sauf imipénème et céphamycines)
Souvent R associées (plasmide) aux aminosides, phénicolés
Utilisation du test de synergie entre inhibiteurs de
β-lactamases et C3G :
IMAGE EN « BOUCHON DE CHAMPAGNE »
Techniques de bactériologie courante (7)
Lecture interprétative de l’ATBg
 D’après les connaissances des mécanismes de résistance (supports
génétiques et moléculaires) :
. Inactivation enzymatique
. Diminution d’affinité par modification de la cible
. Imperméabilité / Efflux actif
 Existence de phénotypes de résistance bien individualisés
 MAIS nécessite une identification correcte de la bactérie étudiée
 Se déroule en 3 étapes :
- lecture brute des résultats
- détermination des mécanismes de R
- établissement de la R clinique
Associations d’antibiotiques (1)
Indications
 Elargissement du spectre (traitement d’urgence, d’infection mixte)
Infections sévères souvent chez patients en USI, onco-hémato.
 Prévention de l’émergence de mutants R
Ex. tuberculose
 Obtention d’une synergie
Ex. endocardites infectieuses, infections sévères à P. aeruginosa, infections à BMR…
 Diminution de la durée du traitement
Ex. endocardites (pénicilline + aminoside vs pénicilline seule)
 Association de 2 ATB pour leur diffusion
Ex. péfloxacine + rifampicine dans infections osseuses
Associations d’antibiotiques (2)
 Nombreuses méthodes (certaines simples et d’autres compliquées)
 Résultats parfois difficiles à interpréter voire discordants
 2 catégories :
. méthodes en point fixé
. méthodes cinétiques
 4 effets antibactériens observables :
- indifférence : AB = A + B
- addition : AB # A + B
- synergie : AB > A + B
- antagonisme : AB < A + B
Associations d’antibiotiques (3)
Techniques d’étude (1)
Méthodes en point fixé :
Diffusion en gélose
(disques ou bandelettes)
Dilution en milieu liquide
(« carré », « échiquier », « damier »)
Associations d’antibiotiques (4)
Techniques d’étude (2)
Méthodes cinétiques :
Dénombrement à intervalles réguliers (2 h)
les bactéries survivantes dans 4 tubes :
. Tube contenant l’association
. 2 tubes contenant un seul ATB
. Tube sans ATB
NB : Synergie = % survivants < 2 log10
Appréciation de la bactéricidie quantitative
et la vitesse de bactéricidie
Ex. d’associations synergiques :
β-lactamines + aminosides
Glycopeptides + aminosides
Sulfamides + Triméthoprime = Cotrimoxazole (BACTRIM)
Méthodes génotypiques
Mise en évidence des gènes de résistance (mais expression ?)
Méthodes basées sur la PCR
Détection par RFLP, séquençage, sonde
Méthodes rapides mais chères et limitées
Intéressantes pour les germes à croissance lente ou difficile
Exemples d’applications :
- Mycobactéries (BK) : R à la rifampicine, à l’isoniazide
- Helicobacter pylori : R à la clarithromycine
- Staphylococcus aureus : R à la méticilline (mecA)
Choix d’une antibiothérapie probabiliste
Choix initial guidé par :
 Données cliniques précoces :
- site du foyer
- sévérité de l’infection
- terrain (ID, n-né, femme enceinte, personnes âgées…)
 Données bactériologiques précoces :
- ED +++ (bactéries, leucocytes, PNN)
 Données de la littérature, recommandations de consensus :
- spectre d’activité (SIR)
SIR
- diffusion
- taux de R
Surveillance bactériologique d’un traitement ATB (1)
Détermination des concentrations sériques et tissulaires :
Prélèvement au pic (30’ après adm. IV) et en résiduelle (5’ avant adm.)
NB : POUR ETRE ACTIF : IL FAUT CONC. LOCALE > CMI +++
o Dosage par méthodes immuno-enzymatiques :
Ex.
Aminoside
Aminosides
Glycopeptides
Pic
(µg/ml)
Résiduelle
(µg/ml)
Amikacine
2x/j
1x/j
25-35
45-60
<4
<2
Gentamicine
2x/j
1x/j
5-12
12-25
<2
<1
Tobramycine
2x/j
5-12
<2
Isépamicine
2x/j
< 35
< 10
Glycopeptide
Situations usuelles
Situations particulières :
. Endocardites
. Méningites
. Ostéites
. Souche de sensibilité
diminuée
(CMI > 4)
Résiduelle (µg/ml)
15-20
20-35
Surveillance bactériologique d’un traitement ATB (2)
Détermination des concentrations sériques et tissulaires (suite) :
o Dosage par méthodes chromatographiques :
Ex. certaines β-lactamines (ceftazidime)
o Dosage par méthodes microbiologiques : moins rapide (18-24 h) mais
adaptée à tous les ATB
Rq : Surveillance de la toxicité (ex. néphrotoxicité pour les aminosides)
NB : Foyers où les ATB ne diffusent pas ou peu : foyers enkystés,
collection purulente (anaérobiose et acidité pour les aminosides)
Surveillance bactériologique d’un traitement ATB (3)
Etude du pouvoir inhibiteur :
Sur le sérum (ex. pouvoir bactéricide du sérum ou PBS)
Sur le LCR
Sur les urines
Série de tubes avec dilutions du sérum (raison 2) + inoculum bactérien
Incubation 18-24 h à 37°C
Détermination de l’effet bactériostatique puis bactéricide
NB : Effet inhibiteur valable si la plus grande dilution ≥ 1/8e
Possibilité d’étude de la cinétique de bactéricidie