3°EtudeATB 2017

18/02/17
DFGSP3 – 2016/2017
Méthodes d’étude de
l’activité des antibiotiques
Pr Hélène MARCHANDIN
Introduction
• Sensibilité (S) et résistance (R) naturelles des
espèces bactériennes à certains antibiotiques (ATB)
• Nombreux mécanismes de R acquise aux antibiotiques

Etude in vitro de l’activité des ATB
sur bactéries pathogènes
=
Etape nécessaire au choix d’une
antibiothérapie adaptée
2
1
18/02/17
Interactions bactérie-antibiotique
Nombre de bactéries/ml
Ralentissement de la croissance
Bactériostase  CMI
Bactéricidie  CMB
Effet létal de
l’antibiotique
3
Etude de la bactériostase
= détermination de la CMI
(concentration minimale inhibitrice)
plus faible concentration d'antibiotique capable
d'inhiber toute croissance visible de la bactérie in vitro
En milieu liquide
En milieu solide
Dilution en milieu liquide
Dilution en milieu gélosé (réf)
Diffusion en milieu gélosé*
- Méthodes manuelles (réf)
- Disques
- Méthodes automatisées*
- Bandelettes
(réf) : méthodes de référence * méthodes utilisées en routine
4
2
18/02/17
Détermination CMI / DILUTION en milieu liquide
Méthodes manuelles
Inoculum bactérien
standardisé
(sans ATB)
Gamme de
concentration d’ATB
 de raison 2
5
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
Croissance
bactérienne
+ +
Exemple
6
3
18/02/17
Microméthodes
- en microplaques
T
Gamme d’ATB(s)
Etude d’un ou plusieurs :
-  ATB
-  isolats bactériens
par plaque
T
2
4
8
16
32
64 µg/ml
Exemple
Souche d’E. coli
et amoxicilline
CMI 64µg/ml
7
- méthodes automatisées
• cartes / micro-puits :
≠ antibiotiques
à ≠ concentrations
• incubation, lecture de la croissance bactérienne
et interprétation automatisées
 méthodes plus rapides : environ 6-7h
8
4
18/02/17
Détermination CMI / DILUTION en milieu gélosé
Gamme de
concentration
d’ATB
+
inoculum
bactérien
standardisé
(spot)
T
0,5
1
2 µg/ml
Souches 1 et 4 : CMI = > 2 µg/ml
Souche 2 : CMI = 2 µg/ml ; souche 3 : CMI = 1 µg/ml
9
Détermination CMI / DIFFUSION en milieu gélosé
Méthode des disques
Inoculum standardisé
0,5 McFarland ≈ 108 UFC/ml
Milieu de Mueller-Hinton
Lecture d’un diamètre d’inhibition (en mm)
10
5
18/02/17
Correspondance avec la CMI
Courbes de concordance diamètre d’inhibition – CMI
pour chaque ATB
Antibiotique X
11
Evaluation de la CMI par bandelettes
Gradient continu d’ATB sur bandelette
Ex : Méthode Etest
Ellipse d’inhibition CMI de vancomycine
12 mg/L
Lecture directe de la CMI : intersection bandelette - croissance
bactérienne
CMI de teicoplanine
1 mg/L
12
6
18/02/17
L’antibiogramme
- Détermination de la sensibilité d’une souche bactérienne
à un ou plusieurs antibiotiques
- Antibiotiques à tester :
Choix selon :
• le type bactérien (cocci ou bacilles à Gram + ou -)
• le spectre des ATB
Nombre variable
( ∼ 30 : entérobactéries en milieu hospitalier)
  réponse au clinicien : interprétation en termes de
d’activité
13
Interprétation
Classement des souches bactériennes en
Sensibles (S)
Intermédiaires (I)
Résistantes (R)
vis-à-vis d’un antibiotique donné
Définition de la résistance - 1
Une bactérie est dite résistante à un antibiotique si elle est capable
de se multiplier en présence d'une concentration de cet ATB
supérieure à celle que l'on peut atteindre in vivo
14
7
18/02/17
  catégories thérapeutiques ou cliniques
• sensibles : bactéries dont la CMI est inférieure aux concentrations
sériques obtenues avec posologies usuelles (c)
 forte probabilité de succès thérapeutique lors d’un
traitement par voie systémique avec la posologie recommandée
• résistantes : bactéries dont la CMI est > aux taux les plus élevés (C)
 forte probabilité d’échec thérapeutique
• intermédiaires : bactéries dont la CMI est comprise entre c et C
 succès thérapeutique imprévisible
15
≥ D
Ex : 22
Ø en mm
S
CMI en mg/L
< d
18
I
Ex : 4
≤ c
R
8
> C
Concentrations sériques
c
C
 
CMI critiques et diamètre critiques (= seuils)
déterminés pour chaque ATB
16
8
18/02/17
Exemple : Entérobactéries et pénicillines
17
Interprétation de l’antibiogramme : 3 niveaux
1- Interprétation des diamètres d’inhibition ou des CMIs
selon valeurs critiques
+ Réponse doit aussi tenir compte de l’identification :
2 – de l’espèce bactérienne et de ses R naturelles
3 – du (des) mécanisme(s) de résistance acquise détecté(s)
 LECTURE INTERPRETATIVE de l’antibiogramme
18
9
18/02/17
Exemple 1 : Enterobacter - céphalosporinase naturelle
(groupe 3 EB)
*
*
* Résistances
naturelles
(β-lactamines)
*
*
*
Résultats
interprétés
R
quels que
soient les Ø
d’inhibition
observés
*
19
Exemple 2 : Klebsiella – Pénicillinase naturelle
(groupe 2 des EB)
*
*
*
* Résistances naturelles
20
10
18/02/17
Exemple 3 : Staphylococcus et production de pénicillinase
(R acquise)
c)
Ø > 26 mm
Bordure floue
S
Ø > 26 mm
Bordure nette
Ø < 26 mm
R
R
Lecture
interpré-tative
Seuil
26 mm
+ aspect
de la
bordure
21
Exemple 4 : Staphylococcus aureus méticillino-résistant (R acquise)
Méticillino-résistance (PLP additionnelle) :
- détection par disque de céfoxitine
- seuil : S. aureus (22 mm)
si R
Lecture
interprétative
  Interprétation : résistance à toutes les β-lactamines
sauf ceftaroline et ceftobiprole
22
11
18/02/17
Définition de la résistance - 2
Une bactérie est dite résistante à un ATB si elle peut se développer
à une concentration d’ATB notablement plus élevée que celle qui
inhibe la croissance de la majorité des souches de la même espèce
 catégories de population
• habituellement sensibles
• modérément sensibles
• inconstamment sensibles
• résistantes
Variables :
- selon l'espèce étudiée
- dans le temps en fonction des antibiotiques (récents ou utilisés
depuis longtemps) et selon les souches bactériennes
(hospitalières / communautaires)
23
Exemple : érythromycine (macrolides)
Habituellement sensibles Modérément sensibles

Inconstamment sensibles
Résistant

spectre naturel
d’activité des ATB (cf Vidal)
base des antibiothérapies
probabilistes
24
12
18/02/17
  spectre d’activité des ATB (cf Vidal) - Exemple
25
26
13
18/02/17

base des antibiothérapies probabilistes
- Prescription d'antibiotique(s) réalisée avant que ne soient
connues la nature et/ou la sensibilité du ou des micro-organismes
responsables de l'infection
-  Stratégie de probabilité du meilleur choix de l’antibiotique
basée sur données :
* épidémiologiques : espèces les plus impliquées dans le
type d’infection considéré
* bactériologiques : % de résistance dans ces espèces
+ cliniques, pharmacologiques (biodisponibilité, ...)
27
Etude de la bactéricidie
= détermination de la CMB
(concentration minimale bactéricide)
plus faible concentration d'antibiotique
 ≤ 0,01% de survivants
Gamme de
concentration
d’ATB de
raison 2
+ inoculum
bactérien
sans ATB
28
14
18/02/17
Dénombrement comparatif / à l’inoculum bactérien initial
T
≤ 0,01% de survivants
si 100 colonies sur témoin
Dénombrement à T1h, T2h, ...  cinétique de bactéricidie
29
Recherche de mécanismes de résistance particuliers
 Mécanismes de R de détection délicate
•Ex : Streptococcus pneumoniae de sensibilité diminuée
(bas niveau de R) à la pénicilline (PSDP)
  Dépistage :
Disque d’oxacilline
  CMI Pénicilline G
PSDP si > 0,06 mg/L
(1 µg)
OXA – 1 µg
≥ 20 mm
< 20 mm
 PSDP
30
15
18/02/17
  Mise en évidence d’une enzyme inactivatrice
•Ex 1 : Méthodes rapides de détection de la production
de β-lactamase = test chromogénique
Haemophilus
Moraxella catarrhalis
Coloration
rose si
hydrolyse
Disque de nitrocéfine (Cefinase® )
(β-lactamine chromogène)
31
•Ex 2 : Restauration de l’activité d’1 ATB en
présence d’un inhibiteur de l’enzyme inactivatrice
 Différences de Ø
ex : amoxicilline (AMX)
-/ + acide clavulanique (AMC)
(inhibiteur de β-lactamases)
Ex : Mise en évidence de la production de pénicillinase
AMC
Ø>
AMX
32
16
18/02/17
  Images de synergie (dites en « bouchon de champagne »)
entre disque de C3G et disque contenant ac. clavulanique
  production de β-lactamase à spectre étendu (BLSE)
mécanisme de multirésistance chez bacilles à Gram négatif
AMC
C3G
Diamètre en en présence de BLSE
Δr
AUG
CTX
30 mm
Diamètre en l’absence de BLSE
AUG=AMC : amoxicilline+acide clavulanique
C3G : céphalosporine de 3ème génération, CTX : céfotaxime
33
Exemple : Antibiogramme de Klebsiella pneumoniae productrice de BLSE
*
*
*
C3G
* : Résistances naturelles
+ R acquises (dont C3G) par production de BLSE
Imipénème et céfoxitine S : ATB non hydrolysés par la BLSE
34
17
18/02/17
 Mise en évidence d’une cible insensible à l’ATB
• Ex : technique immunologique / agglutination de particules
sensibilisées par des AC spécifiques de la PLP2a (détecte aussi PLP2c)
staphylocoque
méticillino-résistant + - staphylocoque
méticillinosensible
  Mise en évidence du support génétique de la R
Méthodes moléculaires
T+ 1 2 3 4
5 6 T-
• Nombreuses applications
• Ex : amplification par PCR du gène mecA codant la PLP2a (idem mecC  PLP2c)
35
Etude d’autres paramètres
 Etude de l’activité d’associations d’ATB : diverses méthodes
Exemple
Indifférence
Antagonisme
Synergie
(A+B) > A + B
Addition
(A+B) < A + B
36
18
18/02/17
 Dosage sériques du ou des ATB
Méthodes chromatographiques
 ajustement des posologies (efficacité / toxicité)
37
 ajustement des horaires d’administration Optimiser le temps où concentration ATB > CMI
38
19
18/02/17
Conclusion
Etude de l’activité des ATB importante dans
l’instauration d’un traitement antibiotique efficace
+/- surveillance traitement
Infection bactérienne  antibiothérapie probabiliste
Identification
+
ou
?
  ajustement thérapeutique
39
20