ft3 elisa - IBL international

Fiche technique
FT3 ELISA
Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de
Triiodothyronine libre (fT3) dans le sérum ou plasma humains.
RE55231
96
2-8°C
I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
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FT3 ELISA (RE55231) FRANÇAIS
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1. BUT DU TEST
Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de FT3 (Triiodothyronine libre) dans le sérum ou
plasma humains.
2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION
L'hormone thyroïdienne, la triiodothyronine (T3), est produite par la glande thyroïde. L'iode constitue un
élément important de cette synthèse. La thyroxine est convertie en T3 active (trois à quatre fois plus
puissante que la T4) dans les cellules par des déiodinases (5'-iodinase). La globuline liant la thyroxine
(TGB) est la protéine porteuse principale pour faire circuler l'hormone thyroïdienne. Seule une très petite
fraction de l'hormone circulante est libre (non liée): 0.3 %; cette fraction est biologiquement active. Ainsi, des
mesures des concentrations de triiodothyronine libre permettent une corrélation plus fiable avec le statut
clinique que les taux de triiodothyronine totale. Par exemple, l'augmentation des taux de triiodothyronine
totale associée à la grossesse, aux contraceptifs oraux et à une thérapie par oestrogènes résulte en des
taux plus élevés de T3 totale alors que la concentration en T3 libre (FT3) demeure pratiquement inchangée.
Les concentrations des protéines porteuses sont modifiées dans de nombreuses conditions cliniques,
comme la grossesse. En fonction thyroïdienne normale, au fur et à mesure que les concentrations de
protéines porteuses se modifient, le taux de triiodothyronine totale change de sorte que la concentration de
triiodothyronine libre reste constante. La liaison de la T3 joue un rôle clé dans le contrôle de la rétroaction
de la thyroïde, avec FT3 agissant sur l'hypophyse pour inhiber la sécrétion de l'hormone thyroïdienne. Les
thyronines agissent sur le corps pour augmenter le taux métabolique de base, affectent la synthèse des
protéines et augmentent la sensibilité de l'organisme aux catécholamines (comme l'adrénaline). Les
hormones thyroïdiennes sont essentielles au bon développement et à la différenciation de toutes les cellules
du corps humain. Ces hormones régulent aussi le métabolisme des protéines, des lipides et des glucides,
affectant la manière dont les cellules humaines utilisent les composés énergétiques. De nombreux stimuli
physiologiques et pathologiques influencent la synthèse des hormones thyroïdiennes. La thyrotoxicose ou
hyperthyroïdie est le syndrome clinique causé par un excès de thyroxine en libre circulation, de
triiodothyronine libre, ou des deux. T3 et T4 sont toutes deux utilisées pour traiter l’insuffisance en
hormones thyroïdiennes (hypothyroïdie). Étant donné que les états comme la grossesse, la thérapie par
oestrogènes et d'autres facteurs non thyroïdiens modifient la concentration de TBG, l'évaluation de la
fonction thyroïdienne par la mesure T3 totale peut résulter en un diagnostic erroné, car les taux de FT3 ne
sont pas affectés par les modifications des protéines de liaison.
3. PRINCIPE DU TEST
La T3 libre (FT3, antigène) présente dans l’échantillon entre en competition avec le conjugué enzymatique
T3 couplé à de la peroxydase de raifort (HRP) pour se lier à un nombre limité d’anticorps anti-T3 fixé sur la
microplaque (phase solide).
L'interaction est illustrée par l'équation suivante: K
a
Enz
Ag + Ag + Ab
cw
AgAb
cw
+
Enz
Ag Ab
cw
K
-a
Ab
cw
: Anticorps monospécifique immobilisé (quantité constante)
Ag: Antigène natif (quantité variable)
Enz
Ag.: Antigène conjugué à l’enzyme HRP (quantité fixe)
Ag Ab
cw
: Complexe antigène-anticorps
Enz
Ag Ab
cw
: complexe antigène-HRP-anticorps
K
a
: Taux constant d'association
K
-a
: Taux constant de dissociation
K = k
a
/k
-a
: Constante d'équilibre
Après incubation, un lavage de microplaque permet de séparer la fraction libre de la fraction liée.
Ensuite l’enzyme HRP de la fraction liée réagit avec le substrat (H
2
O
2
) et le substrat TMB pour développer
une couleur bleue qui change au jaune au contact avec la solution d’arrêt (H
2
SO
4
). L’intensité de la couleur
est inversement proportionnelle à la concentration en FT3 dans l’échantillon. La concentration en FT3 est
calculée à partir de la courbe étalon.

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4. PRECAUTIONS D’EMPLOI
1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l’usage professionnel.
2. Certains réactifs contiennent de petites quantités de Proclin 300® comme conservateur. Eviter tout
contact avec peau et les muqueuses .
3. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version
valide de la fiche technique incluse dans le kit. S’assurer que tout a été bien compris.
4. Dans le cas de dommages importants de l’emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur
sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N’utilisez pas les composants
abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte.
5. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas
utiliser de réactifs périmés.
6. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de
laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire.
7. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le
MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce
produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL.
8. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord
avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque.
9. Eviter tout contact avec la solution d’arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées.
10. Le Chromogène TMB contient un irritant qui peut être nocif si inhalé, ingéré ou absorbé à travers la
peau. Pour empêcher des lésions, éviter toute inhalation ou ingestion par la peau ou les yeux et tout
contact cutané ou oculaire.
11. Éviter d’exposer le réactif TMB/H
2
O
2
à la lumière directe du soleil, aux métaux ou aux oxydants.
12. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs
à anti-HIV I/II, HbsAg et anti-HCV. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement
contaminants et utilisés en tant que tel.
13. Plusieurs médicaments sont connus pour affecter la liaison de triiodothyronine aux protéines porteuses
d'hormones thyroïdiennes ou son métabolisme en T3 et compliquer l'interprétation des résultats de FT3.
14. Les autoanticorps circulants anti-T3 et les inhibiteurs de liaison hormonale peuvent interférer. Il a été
rapporté que l'héparine a des effets in vivo et in vitro sur la concentration de FT3. Par conséquent il ne
faut pas prélever des échantillons dans lesquels cet anti-coagulant a été utilisé.
15. Dans la maladie non thyroïdienne (NTI) sévère, l'évaluation de l'état thyroïdien devient très difficile. Des
mesures de TSH sont recommandées afin d’identifier une dysfonction thyroïdienne.
16. Une pathologie dysalbuminémique familiale peut produire des résultats erronés sur les tests directs de
FT3.
17. Non destiné au dépistage des nouveau-nés.
5. STOCKAGE ET STABILITE
Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké à 2-8 °C. Les exceptions sont clairement
marqués. Une fois ouverts, les étalons sont stables pendant 6 mois stockés à 2-8 °C. À conserver à l’abri de
la chaleur ou de la lumière directe. Avant ouverture, les réactifs sont stables jusqu'à la date d'expiration
indiquée. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres
correspondants.
6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS
Sérum, Plasma
Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l’intégrité chimique
d’un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu’à son analyse. Ne pas utiliser d’échantillons fortement
hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d’apparence turbide doivent être centrifugés avant
analyse pour éliminer toutes particules gênantes.
Stockage: 2-8 °C -20 °C (Aliquots)
Stabilité: 48 h 1 mois
À conserver à l’abri de la chaleur ou de la lumière directe.
Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés.

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7. MATERIEL FOURNI
Quantité Symbole Composant
1 x 12 x 8 MTP Microplaque
Prêt(e) à l’emploi. Barrettes sécables. Recouvert d’anticorps anti-T3 IgG.
1 x 12 mL ENZCONJ Conjugué Enzymatique
Prêt(e) à l’emploi. Contient: Conjugué T3 HRP.
1 x 6 x 1 mL
CAL A-F
Etalon A-F
Prêt(e) à l’emploi. Env. 0, 0.4, 1.2, 4.5, 8.0, 18.0 pg/mL
Contient: Anticorps anti-T3 IgG avec du conservateur.
Voir les étiquettes pour des concentrations exactes.
Pour les unités SI: 1pg/mL x 1.536 = pmol/L
1 x 20 mL WASHBUF CONC Tampon de Lavage, Concentré (50x)
Contient: 45 g/L NaCl; 55 g/L Tween-20.
1 x 12 mL TMB SUBS Solution Substrat TMB
Prêt(e) à l’emploi. Contient: 0.26 g/L H
2
O
2
-TMB.
1 x 12 mL STOP Solution d’Arrêt
Prêt(e) à l’emploi. Contient: 0.15 mol/L acide sulfurique.
8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI
1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 50 et 100 µL
2. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs
3. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque
4. Lecteur de microplaque capable de lire l’absorbance à 450 nm (longueur d’onde de référence 600-650 nm)
5. Eau bidistillée ou désionisée
6. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre
9. NOTES POUR LA PROCEDURE
1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les
résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d’incubation, températures et étapes de pré-
traitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N’utiliser que des pipettes et appareils
calibrés.
2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S’assurer que
les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les
réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 °C) et mélanger doucement en tournant chaque
flacon de réactif liquide et d’échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse.
3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette
en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours
refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs.
4. Au cas où un automate est utilisé, il appartient à l’utilisateur de s’assurer que le kit a été bien validé sur
ce dernier.
5. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d’éventuelles erreurs de
pipetage.
6. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque.
7. Le temps d’incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et
au même intervalle de temps. Il est recommandé d’utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter
une même solution dans tous les puits.
8. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est
recommandé d’utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique.
Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage
ou l’aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits
soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu’aucun reste ne soit ensuite visible.
9. L’humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n’ait atteint la
température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet
refermé avec le dessiccateur.
10. Chaque test doit inclure une courbe étalon.

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10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST
10.1. Préparation des composants concentrés
Diluer /
dissoudre Composant avec Diluant Relation Stockage Stabilité
20 mL WASHBUF CONC 980 mL eau bidist. 1:50 2-8 °C 1 mois
11. PROCEDURE DU TEST
Avant de procéder au test, tous les réactifs, les références et les contrôles sériques doivent être amenés à
température ambiante (18-25 °C).
1.
Pipeter 50 µL de chaque Etalon, Contrôle et échantillon dans les puits respectifs de la
Microplaque.
2.
Pipeter 100 µL de Conjugué Enzymatique dans chaque puits.
3. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Agiter la plaque avec précaution pendant 20-30
secondes pour mélanger et couvrir. Incuber 60 min à TA (18-25 °C).
4.
Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d’incubation. Laver la plaque 3 x avec 300 µL de Tampon
de Lavage dilué. Egoutter l’excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier
absorbant. Il est possible d'utiliser un laveur de plaques automatique ou manuel. Suivre les
instructions du fabricant pour une utilisation appropriée.
5. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l’ajout des Solutions Substrat et d’Arrêt. Pipeter
ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d’air.
6.
Pipeter 100 µL de Solution Substrat TMB dans chaque puits.
7.
Incuber 15 minutes à TA (18-25 °C) à l'abri de la lumière.
8.
Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µL de Solution d’Arrêt TMB dans chaque puits.
9.
Bien mélanger pendant 15-20 secondes.
10.
Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm (Longueur d’onde de référence:
600-650 nm) dans les 30 min suivant l’ajout de la Solution d’Arrêt.
12. CONTROLE QUALITE
Chaque laboratoire doit tester les contrôles aux taux dans la plage hypothyroïdie, euthyroïdie et
hyperthyroïdie pour surveiller les performances des tests. Ces contrôles doivent être traités comme des
échantillons inconnus et leurs valeurs déterminées au cours de chaque procédure de test réalisée. Des
diagrammes de contrôle qualité doivent être établis afin de suivre la performance des réactifs fournis. Des
méthodes statistiques pertinentes doivent être employées pour vérifier les tendances. Chaque laboratoire
doit fixer les limites acceptables des performances des tests.
Les autres paramètres qui doivent être surveillés comprennent les points à 80, 50 et 20 % de la courbe
d’étalonnage pour la reproductibilité de série à série. De plus, l’absorbance maximum doit être cohérente
avec celles des expériences antérieures. Une déviation significative par rapport à la performance établie
peut indiquer une modification passée inaperçue des conditions expérimentales ou une dégradation des
réactifs du kit. Des réactifs frais doivent être utilisés pour déterminer la raison de ces variations.
13. CALCUL DES RESULTATS
Absorbance moyenne
Calculer la moyenne de l’absorbance pour chaque point de la courbe d’étalonnage et pour chaque
échantillon.
Courbe Etalon
Tracer la valeur moyenne de l’absorbance des standards par rapport à la concentration. Tracer la courbe de
meilleur ajustement en suivant les points tracés. (par ex.: logistique à quatre paramètres).
Calcul des Résultats