Textbausteine Arbeitsanleitung

Fiche technique
FT4 ELISA
Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de la
thyroxine libre (fT4) dans le sérum ou plasma humains.
RE55241
96
2-8°C
IBL INTERNATIONAL GMBH
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FT4 ELISA (RE55241) FRANÇAIS
1. BUT DU TEST
Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de la FT4 (thyroxine libre) dans le sérum ou
plasma humains.
2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION
L'hormone thyroïdienne, la thyroxine (T4), est produite par la glande thyroïde. L'iode constitue un élément
important de cette synthèse. La principale forme de l'hormone thyroïdienne dans le sang est la thyroxine
(T4). La thyroxine est convertie en T3 active (trois à quatre fois plus puissante que la T4) dans les cellules
par les déiodinases (5'-iodinase). La globuline liant la thyroxine (TGB) est la protéine porteuse principale
pour faire circuler l'hormone thyroïdienne. Seule une très petite fraction de l'hormone circulante est libre
(non liée) - T4 0.03 %. Lorsque l'hormone de la thyroïde est liée, elle n'est pas active, de sorte que c’est la
quantité de FT3/FT4 qui est importante. Pour cette raison, la mesure de la thyroxine totale dans le sang
peut être trompeuse. La concentration des hormones thyroïdiennes libres dans le sang est régulée par un
mécanisme de rétroaction négative impliquant la TSH. La liaison de la T4 par la TBG joue un rôle clé dans
ce mécanisme de rétroaction et les changements les plus importants qui se produisent dans la capacité de
liaison de T4 résultent d’altérations de la TBG. Les modifications des taux circulants de TBG résulteront en
une augmentation ou une diminution proportionnelle de la concentration de T4 totale. Cependant, la mesure
de FT4 sérique n'est pas affectée par des modifications des taux de liaison de T4 aux protéines et corrèle
donc bien avec l'état thyroïdien fonctionnel chez la plupart des individus. Les facteurs responsables d'écarts
entre les taux sériques de T4 totale et les états thyroïdiens réels incluent la concentration de TBG, des
hormones oestrogéniques (grossesse, contraceptifs oraux et oestrogènes) et les médicaments qui se lient à
la TBG empêchant sa liaison à la FT4. Les thyronines agissent sur le corps pour augmenter le taux
métabolique de base, affectent la synthèse des protéines et accroissent la sensibilité de l'organisme aux
catécholamines (comme l'adrénaline) par permissivité. Les hormones thyroïdiennes sont essentielles au
bon développement et à la différenciation de toutes les cellules du corps humain. Ces hormones régulent
aussi le métabolisme des protéines, des lipides et des glucides, affectant la manière dont les cellules
humaines utilisent les composés énergétiques. De nombreux stimuli physiologiques et pathologiques
influencent la synthèse des hormones thyroïdiennes. La thyrotoxicose ou hyperthyroïdie est le syndrome
clinique causé par un excès de thyroxine en libre circulation, de triiodothyronine libre, ou des deux. T3 et T4
sont toutes deux utilisées pour traiter l’insuffisance en hormones thyroïdiennes (hypothyroïdie).
3. PRINCIPE DU TEST
La T4 libre (FT4, antigène) présente dans l’échantillon entre en compétition avec le conjugué enzymatique
T4 couplé à de la peroxydase de raifort (HRP) pour se lier à un nombre limité d’anticorps anti-T4 fixé sur la
microplaque (phase solide).
L'interaction est illustrée par l'équation suivante: Ka
EnzAg + Ag + Abcw AgAbcw + EnzAg Abcw
K-a
Abcw: Anticorps monospécifique immobilisé (quantité constante)
Ag: Antigène natif (quantité variable)
EnzAg.: Antigène conjugué à l’enzyme HRP (quantité fixe)
Ag Abcw: Complexe antigène-anticorps
EnzAg Abcw: complexe antigène-HRP-anticorps
Ka: Taux constant d'association
K-a: Taux constant de dissociation
K = ka /k-a: Constante d'équilibre
Après incubation, un lavage de microplaque permet de séparer la fraction libre de la fraction liée.
Ensuite l’enzyme HRP de la fraction liée réagit avec le substrat (H2O2) et le substrat TMB pour développer
une couleur bleue qui change au jaune au contact avec la solution d’arrêt (H2SO4). L’intensité de la couleur
est inversement proportionnelle à la concentration en FT4 dans l’échantillon. La concentration en FT4 est
calculée à partir de la courbe étalon.
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4. PRECAUTIONS D’EMPLOI
1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l’usage professionnel.
2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version
valide de la fiche technique incluse dans le kit. S’assurer que tout a été bien compris.
3. Dans le cas de dommages importants de l’emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur
sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N’utilisez pas les composants
abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte.
4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas
utiliser de réactifs périmés.
5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de
laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire.
6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le
MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce
produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL.
7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord
avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque.
8. Eviter tout contact avec la solution d’arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées.
9. Éviter d’exposer le réactif TMB/H2O2 à la lumière directe du soleil, aux métaux ou aux oxydants.
10. La concentration totale de thyroxine sérique dépend d'une multitude de facteurs: la fonction de la glande
thyroïde et sa régulation, la concentration de la globuline liant la thyroxine (TBG) et la liaison de la
thyroxine à la TBG (3, 4). Ainsi, la concentration de thyroxine totale seule n'est pas suffisante pour
évaluer l'état clinique. Les valeurs sériques de thyroxine totale peuvent être élevées dans des conditions
comme la grossesse ou l'administration de contraceptifs oraux. Un test de fixation de T3 peut être
effectué pour déterminer la concentration relative de TBG afin de déterminer si la T4 élevée est causée
par une variation de TBG. Un tableau des médicaments interférants et des conditions qui affectent les
valeurs de thyroxine totale a été compilé par le Journal de l'Association américaine des chimistes
cliniques.
11. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs
à anti-HIV I/II, HbsAg et anti-HCV. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement
contaminants et utilisés en tant que tel.
12. Au cas où un automate est utilisé, il appartient à l’utilisateur de s’assurer que le kit a été bien validé sur
ce dernier.
13. Non destiné au dépistage des nouveau-nés.
5. STOCKAGE ET STABILITE
Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké à 2-8 °C. À conserver à l’abri de la chaleur ou
de la lumière directe. Les réactifs sont stables jusqu'à la date d'expiration indiquée. Le stockage et la
stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants.
Stocker tous les composants du kit à 2-8 °C, ne pas utiliser après la date d’expiration..
6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS
Sérum, Plasma (EDTA, Héparine)
Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l’intégrité chimique
d’un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu’à son analyse.
Ne pas utiliser d’échantillons fortement
hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d’apparence turbide doivent être centrifugés avant
analyse pour éliminer toutes particules gênantes.
Stockage:
2-8 °C
-20 °C (Aliquots)
À conserver à l’abri de la chaleur ou de la lumière directe.
Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés.
Stabilité:
48 h
1 mois
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7. MATERIEL FOURNI
Quantité Symbole Composant
1 x 12 x 8 MTP
Microplaque
Prêt(e) à l’emploi. Barrettes sécables. Recouvert d’anticorps Anti-T4 IgG.
1 x 12 mL ENZCONJ
Conjugué Enzymatique
Prêt(e) à l’emploi. Contient: Conjugué T4 HRP.
Evitez toute exposition directe au soleil, conserver à l’abri de la lumière.
1 x 6 x 1 mL CAL A-F
Etalon A-F
Prêt(e) à l’emploi. Env. 0, 0.3, 0.95, 2.1,3.6, 7.0 ng/dL
Contient: Anticorps anti-T4 IgG avec du conservateur.
Les concentrations sont spécifiques au lot et sont indiquées sur les
étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ.
1 x 20 mL WASHBUF CONC
Tampon de Lavage, Concentré (50x)
Contient: 45 g/L NaCl; 55 g/L Tween-20.
1 x 15 mL TMB SUBS
Solution Substrat TMB
Prêt(e) à l’emploi. Contient: 0.26 g/L H2O2-TMB.
1 x 15 mL STOP
Solution d’Arrêt
Prêt(e) à l’emploi. Contient: 0.15 mol/L acide sulfurique.
8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI
1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 50 et 100 µL
2. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs
3. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque
4. Lecteur de microplaque capable de lire l’absorbance à 450 nm (longueur d’onde de référence 600-650 nm)
5. Eau bidistillée ou désionisée
6. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre
9. NOTES POUR LA PROCEDURE
1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les
résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d’incubation, températures et étapes de pré-
traitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N’utiliser que des pipettes et appareils
calibrés.
2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S’assurer que
les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les
réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 °C) et mélanger doucement en tournant chaque
flacon de réactif liquide et d’échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse.
3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette
en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours
refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs.
4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d’éventuelles erreurs de
pipetage.
5. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque.
6. Le temps d’incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et
au même intervalle de temps. Il est recommandé d’utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter
une même solution dans tous les puits.
7. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est
recommandé d’utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique.
Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage
ou l’aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits
soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu’aucun reste ne soit ensuite visible.
8. L’humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n’ait atteint la
température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet
refermé avec le dessiccateur.
9. Chaque test doit inclure une courbe étalon.
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10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST
Préparation des composants concentrés
Diluer / dissoudre
Composant
avec
Diluant
Relation
Stockage
Stabilité
20 mL WASHBUF CONC 980 mL eau bidist. 1:50 2-8 °C 1 mois
11. PROCEDURE DU TEST
Comme le substrat est photosensible, éviter toute exposition à la lumière intense.
Avant de procéder au test, tous les réactifs, les standards et les contrôles sériques doivent être amenés à
température ambiante (22-28 °C), au moins 30 minutes auparavant.
Les puits non utilisés doivent être conservés entre 2 °C et 8 °C, dans une pochette en aluminium
hermétiquement fermée, et les puits utilisés dans les cadres fournis.
1.
Pipeter 50 μL de chaque Etalon, Contrôle et échantillon da
ns les puits respectifs de la
Microplaque.
2.
Pipeter 100 μL de Conjugué Enzymatique dans chaque puits.
3. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive.
Agiter la plaque avec précaution pendant
20-30 secondes pour mélanger et couvrir. Incuber 60 min à TA (18-25 °C).
4. Retirer la feuille adhésive.
Jeter la solution d’incubation. Laver la plaque 3 x avec 300 μL de Tampon de Lavage dilué.
Important: lors de chaque étape de lavage, agitez doucement la plaque pendant 5 secondes et videz
la solution de lavage en frappant la plaque retournée sur un papier absorbant.
5. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l’ajout des Solutions Substrat et d’Arrêt. Pipeter
ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d’air.
6. Pipeter 100 μL de Solution Substrat TMB dans chaque puits.
7. Incuber à température ambiante (22°C à 28°C) pendant 15 minutes à l’obscurité.
8. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µL de Solution d’Arrêt TMB
dans chaque puits.
Mélanger rapidement le contenu en agitant la plaque. La couleur vire du bleu au jaune.
9. Bien mélanger pendant 15-20 secondes.
10. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm
(Longueur d’onde de référence:
600-650 nm) dans les 5 min suivant l’ajout de la Solution d’Arrêt.
12. CONTROLE QUALITE
Chaque laboratoire doit tester les contrôles aux taux dans la plage hypothyroïdie, euthyroïdie et
hyperthyroïdie pour surveiller les performances des tests. Ces contrôles doivent être traités comme des
échantillons inconnus et leurs valeurs déterminées au cours de chaque procédure de test réalisée. Des
diagrammes de contrôle qualité doivent être établis afin de suivre la performance des réactifs fournis. Des
méthodes statistiques pertinentes doivent être employées pour vérifier les tendances. Chaque laboratoire
doit fixer les limites acceptables des performances des tests. Les autres paramètres qui doivent être
surveillés comprennent les points à 80, 50 et 20 % de la courbe d’étalonnage pour la reproductibilité de
série à série. De plus, l’absorbance maximum doit être cohérente avec celles des expériences antérieures.
Une déviation significative par rapport à la performance établie peut indiquer une modification passée
inaperçue des conditions expérimentales ou une dégradation des réactifs du kit. Des réactifs frais doivent
être utilisés pour déterminer la raison de ces variations.
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