Sonde à fibre optique pour la spectroscopie de

TECHNIQUE INSTRUMENTALE
Jérôme WENGER1*, Heykel AOUANI1, Milena MILUTINOVIC2, Frédérique DEISS2, Patrick FERRAND1,
Neso SOJIC2 et Hervé RIGNEAULT1
Sonde à fibre optique pour la spectroscopie
de corrélation de fluorescence :
l’analyse des dynamiques de fluorescence
devient portable
Miniaturisation
RÉSUMÉ
La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique puissante et polyvalente
pour l’analyse biochimique. Elle permet notamment de déterminer différents paramètres comme les
concentrations locales, les modes de diffusion, ou les cinétiques de réaction. Si sa mise en œuvre est à
présent aisée en laboratoire, la forte sensibilité requise du niveau d’une molécule fluorescente individuelle
a jusqu’à présent empêché le développement de la FCS comme outil d’analyse in situ hors du laboratoire.
Nous détaillons ici un dispositif combinant une fibre optique avec une microbille de verre, et montrons
que ce montage étend l’analyse FCS au domaine des capteurs à fibres. Ce dispositif constitue à notre
connaissance le plus petit système d’analyse FCS au monde, et le seul dispositif fibré permettant une
sensibilité suffisante pour résoudre une molécule individuelle fluorescente. Cette avancée technique ouvre
le domaine du diagnostic biomédical comme le domaine environnemental aux techniques d’analyses in situ
de molécules fluorescentes individuelles, in vitro ou in vivo.
MOTS-CLÉS
Spectroscopie de corrélation de fluorescence FCS, capteur à fibre optique, fluorescence, optique intégrée
Optical fiber probe for fluorescence correlation spectroscopy :
the dynamic analysis of fluorescence goes out of the lab
SUMMARY
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a versatile method that would greatly benefit to remote opticalfiber fluorescence sensors. However, the current state-of-the-art struggles with low detection sensitivities that
prevent the extension of fiber-based FCS down to the single-molecule level. Here we describe a novel probe based
on an optical fiber combined with a dielectric microsphere to perform FCS analysis down to the single fluorescent
molecule level. This offers new opportunities for reducing the bulky microscope setup and extends FCS to remote
or in vivo applications.
KEYWORDS
Fluorescence correlation spectroscopy FCS, optical fiber sensors, fluorescence, integrated optics
I- Introduction : la spectroscopie
de corrélation de fluorescence
Dans toute mesure, on souhaite obtenir le
maximum d’informations utiles en un minimum
de temps. Or, bien souvent, les mesures se
focalisent sur la valeur moyenne du signal, passant
sous silence les fluctuations dynamiques. Bien
sûr, mesurer la valeur moyenne est nécessaire,
mais il serait dommage d’en oublier pour autant
toute la richesse d’informations présente dans les
évolutions dynamiques.
Ceci est particulièrement vrai pour la spectroscopie
de fluorescence, qui est devenue une technique
essentielle pour l’analyse biochimique grâce à
sa forte efficacité optique et à sa grande librairie
de sondes différentes. En mesurant seulement
l’intensité moyenne de fluorescence, on obtient
certes une information sur la concentration
globale en émetteurs et sur leur brillance, mais on
perd la capacité de suivre des réactions plus fines
intervenant à l’échelle moléculaire.
La spectroscopie de corrélation de fluorescence,
ou FCS (fluorescence correlation spectroscopy),
Institut Fresnel, CNRS, Université Aix-Marseille, Domaine Universitaire de St Jérôme, 13397 Marseille Cedex 20, France
Institut des Sciences Moléculaires, Université Bordeaux 1, ENSCPB, CNRS, 16 Avenue Pey-Berland, 33607 Pessac, France
*E-mail : [email protected], Web : www.fresnel.fr/mosaic
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2
SPECTRA ANALYSE n° 275 • Septembre - Octobre 2010
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TECHNIQUE INSTRUMENTALE
permet de répondre à cette question en effectuant
une analyse directe des évolutions temporelles du
signal de fluorescence (1-3). Cette technique, qui est
développée depuis le milieu des années 1970, repose
sur le calcul des corrélations temporelles de l’intensité
de fluorescence. La Figure 1 illustre le principe
général de fonctionnement de la FCS. L’intensité de
fluorescence provenant d’un volume d’analyse limité
est mesurée au cours du temps. Du fait par exemple
de la diffusion de molécules dans et hors de ce
volume, l’intensité de fluorescence détectée fluctue
naturellement au cours du temps. L’analyse FCS
porte sur le calcul de la fonction mathématique de
corrélation temporelle de l’intensité de fluorescence
détectée. Aux temps courts (inférieurs à une dizaine
de microsecondes), cette fonction de corrélation
permet d’avoir accès aux paramètres photophysiques
des émetteurs ainsi qu’au nombre moyen de
molécules détectées. Aux temps longs (supérieurs à
quelques dizaines de microsecondes), elle renseigne
Figure 1
Schéma de principe de la spectroscopie par corrélation de fluorescence.
Les mouvements de diffusion spatiale (Brownienne ou non) de molécules
fluorescentes dans le volume d’analyse indiqué en pointillés (a) induisent des
fluctuations temporelles dans l’intensité de fluorescence détectée (b). La FCS analyse
ces fluctuations en calculant la fonction mathématique de corrélation temporelle
de l’intensité de fluorescence (c). L’encart (d) indique les principaux domaines
d’application de la corrélation de fluorescence. L’amplitude de la courbe de FCS
est inversement proportionnelle au nombre N d’émetteurs analysés. L’analyse de
l’évolution temporelle de la courbe de corrélation renseigne sur le temps de diffusion td
des émetteurs au travers du volume d’analyse.
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sur le temps de séjour moyen (temps de diffusion)
des molécules et sur leur mode de diffusion au
travers du volume d’analyse. Pour les lecteurs plus
familiers de l’analyse dynamique de diffusion laser
DLS (dynamic light scattering), on peut dire que la
FCS est l’analogue de la DLS pour la fluorescence.
Elle permet généralement un meilleur rapport
signal-à-bruit, et peut atteindre la résolution d’une
molécule individuelle fluorescente sans que celle-ci
soit nécessairement purifiée du reste.
II- Les défis de la FCS portable
Le paramètre essentiel en FCS est l’amplitude des
fluctuations de fluorescence, et non plus seulement
l’intensité moyenne détectée. Des corrélations
non-nulles en FCS seront présentes seulement si
une fraction du signal provient du même émetteur,
l’émission de deux émetteurs indépendants ne
présentant pas de corrélations. Il faut donc que
le dispositif de FCS soit à même d’atteindre une
sensibilité suffisante pour résoudre le signal d’un
émetteur individuel avec un bon rapport signalà-bruit (l’émetteur pouvant correspondre soit à
une molécule fluorescente individuelle, soit à un
agrégat de molécules fluorescentes, soit à une
microparticule portant un marquage fluorescent).
Ainsi, les systèmes commerciaux de FCS reposent
sur des montages de microscopes confocaux équipés
de photodiodes à avalanche de forte sensibilité. En
particulier, pour assurer la détection de molécules
fluorescentes individuelles, les systèmes existants
utilisent des objectifs de microscope de forte
ouverture numérique, valant typiquement autour
de 10 000€. Des systèmes complets de FCS sont
proposés par les principaux constructeurs de
microscopes optiques, avec des prix autour de
200 k€. Ces systèmes sont donc complexes, chers
et encombrants, et il n’est pas possible en l’état
de l’art de transporter la FCS hors du laboratoire.
Des systèmes de spectroscopie utilisant des
cuvettes sont également disponibles, dont le coût
est sensiblement réduit puisqu’ils économisent
l’emploi d’un microscope. Cependant, leur mode
de fonctionnement est identique, et nécessite un
objectif complexe de forte ouverture numérique
pour fournir une sensibilité suffisante pour la FCS.
Pour proposer des systèmes de FCS compacts
et permettant un fonctionnement en mode
endoscopie, il faut introduire une fibre optique
allant vers l’échantillon. Or, les fibres optiques
conventionnelles ne permettent pas d’atteindre
une sensibilité suffisante pour détecter des
molécules individuelles. L’efficacité de couplage
de la fluorescence dans la fibre est bien trop faible
pour garantir un signal FCS viable. Pour améliorer
ce couplage dans la fibre, on peut imaginer
utiliser une lentille en sortie de fibre. Cependant,
l’ouverture numérique limitée de ces lentilles
(typiquement en-dessous de 0,5) ne suffit pas pour
atteindre une efficacité de collection suffisante de
la fluorescence.
Technique instrumentale
Sonde à fibre optique pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence :
l’analyse des dynamiques de fluorescence devient portable
III- Une fibre optique
microstructurée pour remplacer
le microscope
Notre équipe vient de démontrer qu’il est
possible de détecter des molécules fluorescentes
individuelles en sortie d’une fibre optique modifiée
(4). Ce système original comporte à l’extrémité de
la fibre optique une microbille de verre qui agit
comme un minuscule objectif de microscope pour
concentrer la lumière. L’ensemble microbille et
fibre est également utilisé pour collecter le signal de
fluorescence émis par les molécules. De cette façon,
l’encombrant microscope est remplacé par une
sonde de mesure fibrée, le reste de l’appareillage
étant miniaturisé, comme le représente la Figure 2.
Cette invention repose sur le principe physique
de « nanojet photonique », qui est le nom donné
au faisceau lumineux émergeant d’une microbille
(5). La microbille agit comme une lentille pour
focaliser la lumière ; le phénomène intéressant
est que cette focalisation est très particulière : la
tache de focalisation est à la limite de diffraction
(diamètre de la demi longueur d’onde) et s’étend
sur une distance optique de plusieurs longueurs
d’onde, comme on peut le voir sur les modélisations
présentées dans la Figure 3. Cette focalisation
particulièrement efficace de la lumière est utilisée
ici pour concentrer la lumière d’excitation
laser et également pour collecter l’émission de
fluorescence.
La procédure de fabrication de l’interface
microstructurée est très simple. Elle repose
sur une attaque chimique d’une face de la fibre
optique : le cœur de la fibre est davantage attaqué
que la gaine, ce qui résulte dans la formation d’une
micro-cuvette. Cette cuvette servira de réceptacle
pour une microbille de verre déposée par simple
dispersion de microbilles dans une solution
acqueuse. L’alignement avec la microbille est
particulièrement aisé du fait du centrage obtenu
lors de l’auto-assemblage de fabrication. De
manière surprenante, l’adhésion de la microbille
dans le puits formé par la fibre optique est très
efficace. Aucune préparation ou greffage chimique
n’est nécessaire, et une excellente tenue au temps
a été vérifiée.
IV- Le premier endoscope portable
pour observer des molécules uniques
Nous avons mis en œuvre le dispositif schématisé
en Figure 2, et caractérisé la fluorescence de
molécules d’Alexa Fluor 647 diffusant librement
en solution aqueuse. La Figure 4 présente une
fonction de corrélation FCS typique, mesurée sur
une solution concentrée à 200 nM. L’analyse FCS
indique que 530 molécules sont détectées, avec un
temps de diffusion moyen de 114 µs et un signal
de fluorescence par molécule de 1 000 coups par
Figure 2
Schéma de principe du dispositif fibré pour la FCS. Le laser d’excitation et la lumière de
fluorescence se propagent tous deux dans le cœur de la fibre optique. La photographie
montre le premier prototype réalisé à l’Institut Fresnel.
seconde. Ceci correspond à un volume d’analyse
de 4 femtolitres et à une gamme de concentrations
accessibles en FCS de 1 nM à 2 µM. Ces chiffres sont
tout à fait standard pour la FCS, et démontrent un
fonctionnement du système FCS fibré proche de ce
que l’on peut attendre d’un microscope confocal à
l’état de l’art. On note qu’en l’absence de microbille,
aucun signal de corrélation n’est détecté, la FCS est
inopérante du fait du large volume d’observation
et du faible signal détecté par molécule.
V- Conclusion : avantages
et domaines d’application
La spectroscopie de corrélation de fluorescence
FCS est une technique puissante et polyvalente
pour l’analyse biochimique. Elle donne accès
à une grande variété de données telles que
notamment la concentration, la structure ou la
mobilité des molécules.
SPECTRA ANALYSE n° 275 • Septembre - Octobre 2010
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TECHNIQUE INSTRUMENTALE
Pour faire profiter le domaine des
capteurs à fibres de l’analyse FCS et
pour extraire la FCS du seul usage
en laboratoire, nous proposons
un dispositif combinant une fibre
optique avec une microbille de verre,
et nous montrons que ce montage
dispose d’une sensibilité suffisante
pour effectuer une analyse FCS
sur des molécules fluorescentes
conventionnelles.
Le dispositif décrit ici réalise à notre
connaissance le plus petit système
d’analyse FCS au monde, et le seul
dispositif FCS fibré permettant
une sensibilité suffisante pour
résoudre une molécule fluorescente
individuelle. Grâce à la microbille, il
est possible :
1) de focaliser la source lumineuse
d’excitation pour obtenir une intensité
de fluorescence émergeant du bruit;
2) d’isoler des zones de détection
de très faible volume (de l’ordre du
femtolitre) dans le milieu d’analyse;
3) de collecter efficacement le flux
de lumière émis par les particules à
analyser pour le rediriger via la fibre
vers les détecteurs.
Figure 3
(a) Vue 3D de la microbille insérée en embout de fibre optique.
(b) Sa réalisation expérimentale vue au microscope électronique. (c) Simulation numérique de la
focalisation par une microbille de polystyrène placée sur une fibre optique attaquée chimiquement.
(d) Référence sans microbille. Les zones rouges sont les endroits de forte intensité lumineuse.
Figure 4
Fonction de corrélation de fluorescence pour des molécules d’Alexa Fluor 647 telle que mesurée par
notre prototype, en prenant en compte le bruit de fond.
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Grâce à la fibre optique, l’alignement
est simplifié. Des mesures in situ
sont possibles (mode endoscopie). Le
capteur est jetable du fait du faible
coût de réalisation. De plus, grâce à la
compacité du montage, des dispositifs
hautement parallèles peuvent être
envisagés.
Cette avancée technique, qui a donné
lieu au dépôt d’un brevet, ouvre aux
techniques de molécule individuelle
le domaine du diagnostic biomédical
comme le domaine environnemental.
Comme exemple d’application, on
peut citer le diagnostic précoce de
la maladie d’Alzheimer. Il a en effet
été démontré que l’agglomération de
certaines protéines en plaques était un
phénomène précurseur à l’apparition
des signes cliniques de la maladie
(6). Or, la FCS est toute indiquée
pour détecter et surtout quantifier la
présence de ces agrégats de protéines
dans un mélange inhomogène.
Des premières mesures ont été
réalisées dans le fluide cérébro-spinal
de patients atteints par la maladie
d’Alzheimer (6). Elles montrent
que la FCS peut détecter les signes
précurseurs de la maladie pour des
personnes ne présentant pas de signes
cliniques flagrants. Or, il est évident
qu’un diagnostic précoce permet
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